TW202115113A - 抗bcma抗體及其在car-t領域中的應用 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種抗BCMA抗體及其在CAR-T領域中的應用。該抗BCMA抗體包括下列至少之一：（1）具有GYTFTSYV、IIPYNDDT和ARWNYDGYFDV所示氨基酸序列的重鏈可變區，以及具有QSLVHSNGNTY、YKVS和SQITHVPYT所示氨基酸序列的輕鏈可變區；與（1）相比，具有至少一個保守氨基酸取代的氨基酸序列。該抗BCMA抗體能夠和BCMA抗原特異性結合，從而用於腫瘤的靶向性治療。
Description
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種抗BCMA抗體及其在CAR-T領域中的應用。
嵌合抗原受體 T 細胞（CAR-T，Chimeric antigen receptor T cell） 是指通過基因修飾技術轉入嵌合抗原受體（CAR， Chimeric antigen receptor）基因的T細胞。CAR-T免疫治療屬於過繼性免疫細胞療法，抽取病人的外周血淋巴細胞進行體外改造使其表達CAR基因，經過體外擴增後再回輸到病人體內，改造後的CAR-T細胞能以MHC非限制方式識別腫瘤細胞表面的特異性抗原並被啓動，在體內大量擴增，通過釋放穿孔素、顆粒酶素 B 等直接殺傷腫瘤細胞，同時還通過釋放細胞因數IFN-γ， IL-2等募集人體內源性免疫細胞殺傷腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的。
CAR-T細胞發揮作用的關鍵因素在於轉入的嵌合抗原受體（CAR）基因。CAR是一種融合蛋白，包括胞外靶標結合區、胞外鉸鏈區、跨膜區及胞內區。胞外靶標結合區通常來源於識別腫瘤相關抗原（TAA, Tumor-associated antigen）抗體的單鏈可變區片段（scFv, Single-chain variable fragment），其與腫瘤抗原結合的親和力遠高於MHC多肽複合物與T細胞受體（TCR, T cell receptor）的親和力，提高了T細胞的應答能力。胞外鉸鏈區序列來源於IgG的恆定區或CD8等，其序列和長度對於scFv與靶標的結合有不同程度的影響，與結合靶標的抗原表位相關。跨膜區一般來源於CD8，CD28，或CD3等受體的穿膜區，對於CAR結構的穩定性有一定的影響。
將Car-T細胞用於腫瘤的免疫治療還需要進一步改進。
本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種抗BCMA抗體及其在CAR-T領域中的應用。例如，本發明提出了一種抗BCMA抗體或抗原結合片段，分離的多核苷酸、表達載體、重組細胞，包含有抗BCMA抗體或抗原結合片段的試劑盒、藥物組合物，以及一種抗BCMA的嵌合抗原受體和Car-T細胞等，同時提供了一種治療物件體內腫瘤的方法。
B細胞成熟抗原（BCMA, B-cell maturation antigen），亦稱CD269，是腫瘤壞死因數（TNF，Tumor necrosis factor）受體家族一員，可分別與B細胞啟動因數（BAFF，B-cell activating factor）或增殖誘導配體 (APRIL, A proliferation inducing ligand) 兩種配體相結合。BCMA主要表達在正常及病變的漿細胞，某些B細胞亞群表面，而在造血幹細胞及人體主要器官的細胞中檢測不到BCMA RNA或蛋白的表達。BCMA在治療多發性骨髓瘤上是一個有前景的靶目標，在國內外開展的多項使用靶向BCMA的 CAR-T 治療臨床試驗中，均有報告比較高的緩解率。在2017年的美國臨床腫瘤年會（ASCO）上，南京傳奇報告了其研發的一款靶向BCMA的CAR-T療法的臨床資料。根據資料顯示，在一項35例復發性或耐藥性多發性骨髓瘤患者參與的臨床試驗中，該療法的客觀緩解率達到100%。在最早接受治療的19例患者中，南京傳奇對其觀察隨訪4-14個月以上。其中14名患者持續達到嚴格完全反應診斷標準，5位元出現部分緩解。在2018年的ASCO年會上，新基（Celgene）公司與bluebird bio在2018年ASCO大會上宣布了其CAR-T療法bb2121的最新資料，試驗結果表明，這款CAR-T療法為晚期復發性/難治性多發性骨髓瘤患者帶來了深度的持久緩解。在43例接受不同劑量CAR-T治療的病人中，總體緩解率達到33%-95%，特別是在18例接受高劑量CAR-T輸注的病人中，總體緩解率達到94%，中位無進展生存期（PFS）達到了11.8個月。靶向BCMA的CAR-T療法有希望成為繼靶向CD19 CAR-T被批准的第二種CAR-T療法。而篩選到能夠靶向BCMA的抗體也成為Car-T治療的關鍵。
為此，根據本發明提供了一種抗BCMA抗體或其抗原結合片段，以及分離的核苷酸、表達載體、重組細胞等。利用本發明提供的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，能夠特異性和BCMA抗原結合。可以將其應用於腫瘤的靶向性治療，或者製成試劑盒特異性檢測BCMA抗原等，具有重要的價值。
具體而言，本申請提供了如下技術方案：
根據本發明的第一方面，本發明提供了一種抗BCMA抗體或抗原結合片段，包括下列至少之一：（1）具有GYTFTSYV、IIPYNDDT和ARWNYDGYFDV所示氨基酸序列的重鏈可變區，以及具有QSLVHSNGNTY、YKVS和SQITHVPYT所示氨基酸序列的輕鏈可變區；與（1）相比，具有至少一個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在本發明的一些實施例中，以上所述抗BCMA抗體或抗原結合片段可以進一步包括如下技術特徵：
在本發明的一些實施例中，該抗BCMA抗體或抗原結合片段包括下列至少之一：（a）具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重鏈可變區和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的輕鏈可變區；與（a）相比，具有至少一個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
根據本發明的第二方面，本發明提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼本發明第一方面所述的抗體或抗原結合片段。
根據本發明的實施例，以上所述分離的多核苷酸可以進一步包括如下技術特徵：
在本發明的一些實施例中，該多核苷酸為具有下列至少之一的核苷酸序列：SEQ ID NO:3所示的重鏈可變區核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示的輕鏈可變區核苷酸序列；與SEQ ID NO:3所示的重鏈可變區核苷酸序列相比，具有90%以上同源性的序列，任選具有95%以上同源性的序列，較佳為具有98%以上同源性的序列，更佳為具有99%以上同源性的序列；與SEQ ID NO:4所示的輕鏈可變區核苷酸序列相比，具有90%以上同源性的序列，任選具有95%以上同源性的序列，較佳為具有98%以上同源性的序列，更佳為具有99%以上同源性的序列。
根據本發明的第三方面，本發明提供了一種表達載體，該表達載體包含本發明第二方面所述的多核苷酸。
根據本發明的實施例，以上所述表達載體可以進一步包括如下技術特徵：
在本發明的一些實施例中，以上所述表達載體可以進一步包括控制元件，該控制元件與該多核苷酸可操作地連接，用於控制該多核苷酸在宿主細胞中的表達。
在本發明的一些實施例中，該控制元件包括下列至少之一：啟動子、增強子和終止子。
在本發明的一些實施例中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。
根據本發明的第四方面，本發明提供了一種重組細胞，包含本發明第三方面所述的表達載體。
根據本發明的第五方面，本發明提供了一種試劑盒，包括本發明第一方面所述的抗體或抗原結合片段。
在本發明的一些實施例中，該試劑盒用於BCMA抗原的診斷檢測。利用該試劑盒中的抗體或抗原結合片段，可以用於BCMA抗原的診斷檢測，例如可以應用於免疫印漬、免疫沉澱或者ELISA檢測等等。
根據本發明的第六方面，本發明提供了一種藥物組合物，包括：本發明第一方面所述的抗體或抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
根據本發明的第七方面，本發明提供了一種抗體或抗原結合片段在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤，該抗體或抗原結合片段為本發明第一方面所述的抗體或抗原結合片段。
在本發明的一些實施例中，該腫瘤為多發性骨髓瘤。
根據本發明的第八方面，本發明提供了一種抗BCMA的嵌合抗原受體，包括：胞外靶標結合區、胞外鉸鏈區、跨膜區和胞內區，該胞外靶標結合區、該胞外鉸鏈區、該跨膜區和該胞內區依次相連；該胞外靶標結合區包括抗原或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段為單鏈，該抗體或抗原結合片段為本發明第一方面所述的抗體或抗原結合片段。
根據本發明的實施例，以上所述抗BCMA的嵌合抗原受體可以進一步包括如下技術特徵：
在本發明的一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為SEQ ID NO:5所示單鏈片段。
在本發明的一些實施例中，該胞外鉸鏈區進一步包括人CD8胞外鉸鏈區，該人CD8胞外鉸鏈區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO:6所示。
在本發明的一些實施例中，該跨膜區為人CD28跨膜區，該人CD28跨膜區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO:7所示。
在本發明的一些實施例中，該胞內區包括人CD28胞內區和人CD3ζ胞內區，該人CD28胞內區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO:8所示，該人CD3ζ胞內區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO:9所示。
在本發明的一些實施例中，編碼該抗體或抗原結合片段的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；編碼該人胞外鉸鏈區的核酸序列如SEQ ID NO:11所示；編碼該人CD28跨膜區和人CD28胞內區的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；編碼該人CD3ζ胞內區的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
根據本發明的第九方面，本發明提供了一種Car-T細胞，該Car-T細胞表達本發明第八方面所述的抗BCMA的嵌合抗原受體。將本發明提供的抗體或抗原結合片段作為單鏈抗體與胞外鉸鏈區、跨膜區以及胞內區，例如免疫受體酪氨酸活化基序蛋白（可以為CD3ζ）在體外進行基因重組，生成重組質粒，再在體外通過轉染技術轉染到患者的T細胞，使患者T細胞表達腫瘤抗原受體，轉染後經過純化和大規模擴增後的T細胞，即為嵌合抗原受體T細胞（Car-T細胞）。將這些Car-T細胞輸回到病人體內，能夠達到識別、殺死癌細胞的治療效果，如同給病人T細胞裝上了GPS導航系統，實現精准地識別並殺傷癌細胞。
根據本發明的第十方面，本發明提供了一種治療物件體內腫瘤的方法，包括給該物件施用有效量的Car-T細胞，該Car-T細胞為本發明第九方面所述的Car-T細胞。
在本發明的一些實施例中，該腫瘤為多發性骨髓瘤。多發性骨髓瘤（MM，Multiple myeloma）是一種由於骨髓漿細胞惡性克隆性增生導致的惡性B細胞淋巴瘤，伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過度生成，常見臨床表現為貧血、骨痛、腎功能不全、感染、出血、神經症狀、高鈣血症、澱粉樣變等。傳統的治療方法如化療，放療，皮質類固醇激素能緩解病情，但幾乎最終仍會復發，並且五年內生存率僅為20-30%。通過移植造血幹細胞雖能清除骨髓瘤細胞，但是手術的難度及風險並不能適用於各年齡段的病人。通過Car-T技術的免疫治療方式，能夠有效治療多發性骨髓瘤，具有廣闊的應用前景。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，該實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。抗體
本文中，術語“抗體”是能夠與特異性抗原結合的免疫球蛋白分子。包括兩條分子量較輕的輕鏈和兩條分子量較重的重鏈，重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子。其中，肽鏈的氨基端（N端）氨基酸序列變化很大，稱為可變區（V區），羧基端（C端）相對穩定，變化很小，稱為恆定區（C區）。L鏈和H鏈的V區分別稱為VL和VH。
在可變區中某些區域氨基酸組成和排列順序具有更高的變化程度，稱為高變區（Hypervariable region，HVR），高變區為抗原和抗體結合的位置，因此也稱為決定簇互補區（complementarity-determining region，CDR）。重鏈可變區和輕鏈可變區上均有三個CDR區。
本發明提供的抗BCMA抗體能夠BCMA抗原特異性結合，可以用於製備BCMA CAR-T細胞，實現腫瘤的靶向性治療。
在一些實施方案中，本發明提供了一種抗BCMA抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段重鏈可變區上的CDR區分別為 CDR1為GYTFTSYV、CDR2為IIPYNDDT和CDR3為ARWNYDGYFDV；輕鏈可變區上的CDR區分別為CDR1為QSLVHSNGNTY、CDR2為YKVS和CDR3為SQITHVPYT。本文中“抗原結合片段”是指具有特異性結合BCMA抗原能力的氨基酸片段。本文中，抗BCMA抗體也可以稱為BCMA抗體，均是指能夠和BCMA抗原結合的免疫球蛋白分子。
在一些實施方案中，該抗體或抗原結合片段具有SEQ ID NO:1所示的重鏈可變區和SEQ ID NO:2所示的輕鏈可變區。在另一些實施方案中，該抗體或抗原結合片段的重鏈可變區序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相比，具有一個以上保守氨基酸取代，例如具有一個保守氨基酸取代。在一些實施方案中，該抗體或抗原結合片段的輕鏈可變區序列與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，具有一個以上保守氨基酸取代，例如具有一個保守氨基酸取代，具有兩個保守氨基酸取代，甚至是三個保守氨基酸取代。當然這些保守氨基酸取代不會對抗體或者抗原結合片段的生物學功能帶來改變。在一些具體實施方式中，這些保守氨基酸取代可以發生在重鏈可變區和輕鏈可變區中除了CDR區之外的氨基酸上。
本文中，“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸發生生物學上、化學上或者結構上相似的殘基所取代。生物學上相似的指的是該取代不破壞BCMA抗體或者與BCMA抗原的生物學活性。結構上相似指的是氨基酸具有相似長度的側鏈，如丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸，或具有相似大小的側鏈。化學相似性指的是氨基酸具有相同的荷電或者都是親水或者疏水的。例如疏水殘基異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用極性氨基酸例如用精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、穀氨醯胺取代天冬醯胺，絲氨酸取代蘇氨酸等等。
其中，重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:1）
VQLQQSGPELVKSGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGFIIPYNDDTKYNEKFKGKASLTSDKSSSTAFMELSSLTSEDSAVYYCARWNYDGYFDVWGAGTTVTVSS。
輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO:2）
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQITHVPYTFGGGTKLEIRR。多核苷酸、表達載體、重組細胞
在製備或者獲取這些抗體的過程中，可以利用表達這些抗體的多核苷酸，與不同的載體連接，來獲得相應的抗體。
為此，本發明還提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼上述所述的抗體或者抗原結合片段。
編碼重鏈可變區SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO:3）：
GTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGTCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATTTATTATTCCTTACAATGATGATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCTCACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGAATTACGACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO:4）：
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAATTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGACGG
在一些實施方式中，該分離的多核苷酸與上述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列至少具有90%以上的同源性，較佳具有95%以上的同源性，更佳具有98%、99%以上的同源性。在至少一些實施方案中，該分離的多核苷酸與上述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列相比，具有至少90%以上的同源性，較佳具有95%以上的同源性，更佳具有98%、99%以上的同源性。這些與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有同源性的序列，能夠表達與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相似的氨基酸，從而能夠與BCMA抗原特異性結合，實現抗體的靶向性功能。
本發明還提供了一種表達載體，該表達載體包含上述分離的多核苷酸。在將上述分離的多核苷酸連接到載體上時，可以將多核苷酸與載體上的控制元件直接或者間接相連，只要這些控制元件能夠控制多核苷酸的翻譯和表達等即可。當然這些控制元件可以直接來自於載體本身，也可以是外源性的，即並非來自於載體本身。當然，多核苷酸與控制元件進行可操作地連接即可。本文中“可操作地連接”是指將外源基因連接到載體上，使得載體內的控制元件，例如轉錄控制序列和翻譯控制序列等等，能夠發揮其預期的調節外源基因的轉錄和翻譯的功能。當然用來編碼抗體重鏈和輕鏈的多核苷酸，可以分別獨立的插入到不同的載體上，常見的是插入到同一載體上。常用的載體例如可以為質粒、噬菌體、慢病毒等等。
本發明還提供了一種重組細胞，該重組細胞中包含有該表達載體。可以將表達載體導入到哺乳動物細胞中，構建獲得重組細胞，然後利用這些重組細胞表達本發明提供的抗體或者抗原結合片段。通過該重組細胞進行培養，即可以獲得相應抗體。這些可用的哺乳動物細胞例如可以為293F細胞，CHO細胞等。藥物組合物、試劑盒及製藥用途和在製備試劑盒中的用途。
本發明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括上述所述的抗體或者抗原結合片段和藥學可接受的載體。
本文提供的抗BCMA抗體可以摻入適合受試者施用的藥物組合物中。通常，這些藥物組合物包括本文提供的抗BCMA抗體以及藥學上可接受的載體。“藥學上可接受的載體”可以包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等等。具體實例可以是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物中的一種或多種。有許多情況下，藥物組合物中包括等滲劑，例如糖類、多元醇( 如甘露醇、山梨醇) 或氯化鈉等。當然藥學上可接受的載體還可包括微量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，用來延長抗體的保存限期或效力。
例如，本發明的抗體可摻入適用於胃腸外施用( 例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內) 的藥物組合物中。這些藥物組合物可以被製備成各種形式。例如液體、半固體和固體劑型等，包括但不限於液體溶液( 例如，注射溶液和輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。典型的藥物組合物為注射溶液或輸注溶液形式。該抗體可通過靜脉輸注或注射或肌肉內或皮下注射來施用。
當然，本文中的抗BCMA抗體還可以根據需要被製成試劑盒或者其他診斷性試劑的一部分。根據本發明的實施例，本發明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括上述BCMA抗體。應用本發明提供的試劑盒，例如可以用於免疫印漬、免疫沉澱等涉及到利用BCMA抗原和抗體特異性結合性能，來檢測的試劑盒等。這些試劑盒可包含下列中的任意一種或多種：拮抗劑、抗BCMA抗體或者藥物參照材料；蛋白純化柱；免疫球蛋白親和純化緩衝劑；細胞的測定稀釋劑；說明書或者文獻等。抗BCMA抗體可被用於不同類型的診斷測試，例如可以在體外或者體內檢測各種各樣的疾病或者藥物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通過對受試者的血清或者血液進行檢測，用來測試相關疾病。這種相關疾病可包括BCMA相關疾病，例如各種癌症或者腫瘤等等。當然本文提供的抗體也可以用於癌症的放射免疫檢測和放射免疫治療等等。
這些癌症或者腫瘤可以是任何不受調控的細胞生長。具體地，可以是肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌等等。
在利用本發明所提供的抗BCMA抗體治療癌症時，可以將本發明提供的抗BCMA抗體提供給受試者即可。為此，本發明提供了一種用於治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用本發明所提供的的抗體或其抗原結合片段。
下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照産品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生産廠商者，均為可以通過市購獲得的常規産品。
本申請通過如下研究，開發了基於BCMA抗原的抗多種腫瘤細胞甚至是腫瘤幹細胞的基於抗體的免疫治療方法，包括抗BCMA的單克隆抗體，以及基於該抗體的Car-T細胞治療技術。實施例 1
通過用人的BCMA蛋白抗原免疫小鼠，進行單克隆雜交瘤篩選，得到能夠産生抗BCMA抗體的單克隆雜交瘤。對其中的一個單克隆雜交瘤所産生的抗BCMA抗體進行測序，得到重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。對應地，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:1，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:2。實施例 2
實施例2對實施例1獲得的抗BCMA抗體與抗原的親和力，以及與MM細胞系的親和力進行了測定。
1、生物膜層干涉技術檢測抗BCMA 抗體與抗原的親和力
生物膜層干涉技術是將生物分子結合到感測器的表面形成一層生物膜，生物膜會對透過感測器的光波造成干涉現象，這種干涉現象會以相位移動的方式被檢測，從而可以檢測結合到感測器表面分子數量的變化，從而可以用來研究抗體和抗原的作用情況。
使用ForteBio Blitz儀器（ForteBio）檢測抗體與抗原親和力的具體實驗過程為：
1）取4個結合抗鼠恆定區的生物感測器（ForteBio），預先浸泡在緩衝液中（PBS, 0.1% Tween, 0.05%BSA）10分鐘以上。
2）將實施例1中獲得的鼠抗人BCMA抗體在緩衝液中稀釋至0.1mg/mL，與感測器共孵育30分鐘以上，再將感測器放入緩衝液中，洗三次，每次10分鐘。
3）將人BCMA抗原在緩衝液中分別稀釋至25，50，100nM。Control（陰性對照）為不加抗原的緩衝液。
4）在Blitz儀器上選擇“基本動力學”模式，並設置基線時長300秒，結合時長300秒，解離時長900秒。
5）儀器上載入結合了鼠抗人BCMA抗體的生物感測器，使其先與Control按照設置的模式進行孵育，並記錄在感測器上的結合信號；然後將感測器與稀釋至25nM的人BCMA抗原進行孵育300秒（結合），再將感測器放入Control中900秒（解離），記錄整個過程中感測器上的信號。
6）更換新的結合了鼠抗人BCMA抗體的生物感測器，按照5）中的步驟記錄與其它稀釋濃度抗原的結合信號。
7）使用Blitz的配套軟體分析資料，將與抗原結合的信號曲線用Control樣品進行均一化後，對曲線進行擬合和計算。
圖1為用陰性對照（Control）樣品進行均一化後，BCMA抗原在25，50，100nM濃度下，分別與載入了鼠抗人BCMA抗體的生物感測器的結合與解離曲線。其中X軸代表感測器從基線開始到結合，再到解離的整個時間過程。Y軸代表結合信號的強弱。
其擬合計算結果如下表1所示：
表1 抗BCMA抗體與抗原的作用結果
| 樣品名稱 | 濃度（nM） | KD (M) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | Rmax | R equilibrium | R2 |
| 人BCMA抗原 | 25 | 9.986e-9 | 5.276e5 | 5.269e-3 | 0.1203 | 0.08596 | 0.9885 |
| 人BCMA抗原 | 50 | 2.491e-9 | 3.371e5 | 8.395e-4 | 0.2553 | 0.2432 | 0.9895 |
| 人BCMA抗原 | 100 | 2.822e-9 | 1.539e5 | 4.342e-4 | 0.3864 | 0.3758 | 0.994 |
其中表1中，所對應的濃度指的是樣品上樣濃度，KD代表親和力常數，Ka代表結合速率常數，Kd代表解離速率常數，Rmax 代表資料擬合得到的最大回應，R equilibrium 代表達到平衡時的最大回應，R2
代表相關係數。
生物膜層干涉技術檢測結果表明抗BCMA 抗體與抗原的親和力常數值KD 在10-9
M數量級。
2、流動式細胞儀檢測抗BCMA 抗體與MM細胞系及陰性對照細胞系的結合
多發性骨髓瘤（MM，Multiple myeloma）是一種由於骨髓漿細胞惡性克隆性增生導致的惡性B細胞淋巴瘤，伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過度生成，常見臨床表現為貧血、骨痛、腎功能不全、感染、出血、神經症狀、高鈣血症、澱粉樣變等。利用流動式細胞技術檢測抗BCMA抗體對MM細胞系的結合能力。
取MM細胞系及陰性對照細胞系，各2×105
細胞，用流動式緩衝液（PBS+0.1%BSA）洗滌一次後棄上清，加入相應的抗BCMA抗體孵育30分鐘後緩衝液洗滌，重懸，再用螢光標記的二抗抗體避光孵育30分鐘後緩衝液洗滌，重懸，最後流動式細胞儀檢測。
流動式細胞檢測結果如圖2~圖4所示。其中圖2為抗BCMA抗體特異性識別高表達BCMA的細胞系MM.1S；圖3為抗BCMA抗體特異性識別低表達BCMA的細胞系RPMI8226；圖4為抗BCMA抗體不識別不表達BCMA的細胞系K562。圖中用箭頭標出的曲線為抗BCMA抗體與對應細胞系孵育後檢測得到的螢光強度曲線，未用箭頭標出的曲線為同型對照與相應細胞系的染色情況，即使用與抗BCMA抗體提相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用於消除由於抗體非特異性結合到細胞表面而産生的背景染色。
由圖2~圖4顯示的結果可以看出，本發明的抗BCMA 抗體特異性地結合MM細胞系（MM.1S，RPMI8226）但不識別對照細胞系K562。實施例 3
設計靶向BCMA的嵌合抗原受體
本發明設計的靶向BCMA CAR含有依次連接的抗BCMA單鏈抗體、人CD8胞外鉸鏈區、人CD28跨膜區、人CD28胞內區和人CD3ζ胞內區。
其中，抗BCMA 單鏈抗體氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO：5）:
QLQQSGPELVKSGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGFIIPYNDDTKYNEKFKGKASLTSDKSSSTAFMELSSLTSEDSAVYYCARWNYDGYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQITHVPYTFGGGTKLEIRR。
人CD8胞外鉸鏈區氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO：6）:
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASD。
人CD28跨膜區氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO：7）:
KPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
人CD28胞內區氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO: 8）:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。
人CD3ζ胞內區氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO :9）:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
相應地，編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列分別為：
編碼抗BCMA 單鏈抗體氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO :10）：
CAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGTCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATTTATTATTCCTTACAATGATGATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCTCACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGAATTACGACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAATTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGACGG。
編碼人CD8胞外鉸鏈區氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO: 11）:
AAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGAT。
編碼人CD28跨膜區及胞內區氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO: 12）:
AAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC。
編碼人CD3ζ胞內區氨基酸序列的核苷酸序列為（SEQ ID NO: 13）:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC。
2、BCMA CAR慢病毒穿梭質粒構建
合成得到BCMA CAR核酸序列（序列包含BCMA scFv、人CD8胞外鉸鏈區、人CD28穿膜區及胞內區，以及人CD3ζ胞內區，各序列依次連接）約1.5kb，兩端帶有NheI 及EcoRI 限制性內切酶酶切位點，通過雙酶切得到帶有粘性末端的BCMA CAR核酸片段，與用NheI 及EcoRI 限制性內切酶雙酶切pCDH-EF1α-MCS載體（載體來自System Biosciences）得到的載體片段進行連接，轉化DH5α感受態細胞，挑選單克隆進行測序鑒定，選取序列正確的載體。
3、慢病毒載體包裝
1）第一天： 293T細胞應是狀態良好，小於20代，不過分長滿的。以0.3~0.4×106
細胞/mL鋪板，10cm培養皿添加10 mL的DMEM+10%FBS完全培養基，充分混勻細胞，靜置於37℃，5%CO2
培養箱過夜。
2）第二天：293T細胞匯合度達到60~70%左右進行轉染；以Lipofectamine3000轉染試劑為例，一管準備質粒與P3000複合物，各種質粒的量為BCMA CAR穿梭質粒12ug，PsPAX2 7.8ug，pMD2.G 4.2ug，P3000 48uL，加DMEM培養基補至300 uL；另一管用DMEM（無血清）培養基稀釋36 uL Lipofectamine3000 至300 uL。兩管分別混勻後合並，充分混勻，室溫孵育15-20分鐘後，輕柔地將混合物加入到293T培養皿中。37℃培養6小時後，去除培養基，重新加入預熱的新鮮培養基。
3）第4-5天：轉染48-72小時收集上清，3000 rpm離心10分鐘去除漂浮的細胞，再用0.45um濾器過濾，超速離心35000 rpm ，90分鐘，棄上清，用100uL DMEM培養基重懸病毒沉澱，分裝後凍存於-80℃。
4、慢病毒感染人的PBMC
1）用Ficoll-paque plus (GE healthcare)分離獲得較純的PBMC，用含10% FBS AIM-V（Thermo Fisher Scientific）培養基調整細胞密度為1x106/mL，將細胞接種於T25或T75培養瓶，加入50ng/mL 抗人CD3抗體（ebiosciences）和50ng/mL 抗人CD28抗體（ebiosciences）， 再加入200IU/mL的白介素2（Peprotech），刺激培養48小時。
2）T細胞活化後，重新計數細胞，根據計數結果，按2x106個細胞/孔接種於六孔板，每孔加入2ml AIM-V培養基+10%FBS（含50ng/mL 抗人CD3抗體，50ng/mL 抗人CD28抗體，200IU/mL的白介素2）培養基，第8項中製備的病毒液和polybrene （Sigma），吹打混勻。將上述六孔板移入平板離心機，800g離心30min，轉入培養箱中繼續培養。
3）感染12小時後，將六孔板中每孔細胞收集到15ml離心管中，400g離心5min，棄上清。
4）離心後，將細胞按照1x106/ml的密度接種於T25或T75培養瓶中，加入適量含10%FBS的AIM-V培養基，並加入200 IU/mL的白介素2，10ng/mL白介素7（Peprotech），轉入培養箱中繼續培養。每天觀察細胞的密度，適時補加含細胞因數的培養液，使T細胞密度維持在0.5~1 x106
/mL左右，使細胞擴增。
5、流動式細胞儀檢測感染後T細胞表面CAR蛋白的表達
分別離心收集感染後3-5天的上述製備得到的BCMA CAR-T細胞，mock CAR-T細胞（模擬 CAR-T 細胞，即靶向細胞胞內抗原並具有與BCMA CAR相同骨架的CAR-T細胞）及未感染T細胞 (NT)，流動式緩衝液（PBS+0.1%BSA）洗滌一次後棄上清，加入BCMA重組抗原避光30分鐘後緩衝液洗滌，重懸，流動式細胞儀檢測。其結果如圖5所示。流動式結果顯示，BCMA CAR的表達效率達31.1%，BCMA蛋白能特異性地檢測BCMA CAR的表達。實施例 4
1、CAR-T細胞與MM靶細胞共培養後細胞因數分泌檢測
（1）取製備好的BCMA CAR-T細胞，mock CAR-T細胞，NT細胞，分別重懸於不含細胞因數的RPMI1640+10%FBS培養基中，調整細胞濃度為1 x105
/mL。
（2）將三種MM靶細胞（H929，MM.1S ，RPMI8226）及陰性對照細胞（K562）分別重懸於同樣的培養基中，調整細胞濃度為1 x105
/mL.
（3）在一塊V底96孔板中，實驗組每孔含一種靶細胞或陰性對照細胞 1x104
個，CAR-T細胞1 x105
個，每孔體積為200 uL。對照組加NT細胞或mock CAR-T細胞。充分混勻後，37C孵育12小時，收集上清。
（4）按照細胞因數檢測試劑盒說明書，檢測實驗組及對照組上清中細胞因數的含量。
其中，NT細胞和mock CAR-T細胞見實施例3中的定義。檢測結果如圖6、圖7所示。其中圖6代表不同細胞與三種MM靶細胞以及陰性對照細胞共培養後，干擾素－γ（IFN-gamma）的分泌結果；圖7代表不同細胞與三種MM靶細胞以及陰性對照細胞共培養後，白介素-2（IL-2）的分泌結果。其中圖6和圖7中Target cell alone指的是僅僅培養靶細胞或者陰性對照細胞，不利用NT細胞、mock CAR-T細胞或者BCMA CAR-T細胞共培養。檢測結果表明，與對照組相比，實驗組BCMA CAR-T細胞與MM靶細胞孵育後IFN-gamma，白介素-2的分泌顯著增加，而與陰性對照細胞系孵育後細胞因數分泌水準沒有升高，說明BCMA CAR-T細胞能夠特異性地識別靶細胞，並被啟動釋放相應細胞因數。
2、CAR-T細胞與靶細胞共培養後檢測腫瘤特異性細胞殺傷作用
（1）分別取過表達BCMA的CHO細胞（CHO-BCMA細胞）和陰性CHO細胞，重懸於不含細胞因數的1640+10%FBS培養基中，調整細胞濃度為1 x105
/mL，以1 x104
細胞每孔鋪板到E-Plate 96孔板（ACEA Biosciences）上，分實驗組（與BCMA CAR-T共培養），對照組（與mock CAR-T 細胞或NT細胞共培養），每個實驗條件做三個副孔。孔板放回xCELLigence即時細胞分析儀（ACEA Biosciences）中，37C，5%CO2
，使細胞貼壁生長，並記錄細胞指數變化（原理見3）。
（2）24小時後，取製備好的BCMA CAR-T細胞，mock CAR-T細胞，NT細胞，分別重懸於不含細胞因數的RPMI1640+10%FBS培養基中，調整細胞濃度為1 x106
/mL。將鋪了靶細胞和陰性細胞的E-Plate取出，弃上清培養基，按照實驗分組加BCMA CAR-T細胞，mock CAR-T細胞，或NT細胞，每孔1 x105
細胞（效應細胞：靶細胞比例10：1），將E-Plate放回培養儀器中，37C，5%CO2
，與靶細胞或陰性細胞共培養。
（3）即時檢測記錄共培養過程中靶細胞或陰性細胞的貼壁狀態，由於被殺傷的細胞呈漂浮狀態，不再貼壁，通過細胞的貼壁狀態反映其活性，得到共培養前後的細胞指數（Normalized cell index）隨時間變化的圖線（一般記錄共培養後24-70小時的細胞指數）。
如圖8所示，顯示了不同細胞對於CHO-BCMA細胞的殺傷作用結果。圖8的結果顯示靶細胞在未加CAR-T細胞之前細胞指數持續增長，加入BCMA CAR-T細胞之後（圖中箭頭所指），在24小時內大部分CHO-BCMA靶細胞被殺傷，細胞指數持續降低；而對照mock CAR-T細胞或NT細胞則沒有殺傷作用。其中每條圖線顯示的是三孔實驗資料的平均值。
如圖9所示，顯示了不同細胞對於陰性CHO細胞的殺傷作用結果。上圖顯示與對照組相比，BCMA CAR-T對於陰性CHO細胞沒有殺傷作用，對於陰性CHO細胞的生長狀態沒有影響，因此證明瞭BCMA CAR-T對於靶細胞CHO-BCMA的特異性殺傷作用。其中每條圖線顯示的是三孔實驗資料的平均值。
3、BCMA CAR-T體內藥效評價
基於本發明中BCMA CAR-T在體外對多發性骨髓瘤細胞系及工程化表達BCMA的靶細胞的殺傷能力，使用RPMI8226細胞系在多發性骨髓瘤的臨床前動物模型中評價CAR-T的抗腫瘤活性。其中，RPMI8226細胞系是人多發性骨髓瘤細胞株，購自於ATCC。
將15只NSG小鼠（NODscid gamma小鼠，購自於Jackson Laboratory）分為三組，每組5只小鼠，分別皮下接種1×107
RPMI8226腫瘤細胞；腫瘤接種後第18天和第22天，三組小鼠分別靜脉注射PBS（PBS組），2×107
mock CAR-T 細胞（mock CAR-T組）， 2×107
BCMA CAR-T 細胞（BCMA-CAR-T組，按照第8項所述方法感染製備，CAR陽性細胞約25-30%）。每四天測量腫瘤體積（tumor volume，單位 mm3
）。比較對照組、mock CAR-T 組及BCMA-CAR-T 組的腫瘤生長狀況。如圖10所示。
圖10中橫坐標代表RPMI8226腫瘤細胞注射到小鼠體內的天數，橫坐標代表腫瘤體積。圖10的結果顯示與PBS組及mock CAR-T組相比，輸注BCMA CAR-T的小鼠腫瘤生長受到了顯著的抑制，在第36天時檢測各組小鼠的腫瘤大小，PBS組和mock CAR-T組小鼠腫瘤大小達到2500-3000 mm3
左右，而BCMA-CAR-T組小鼠腫瘤沒有生長，並且顯著減小。
此外，術語“第一”、“第二”僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本發明的描述中，“多個”的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
在本發明中，除非另有明確的規定和限定，術語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術語應做廣義理解，例如，可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通或兩個元件的相互作用關係，除非另有明確的限定。當指兩個核酸序列或者核苷酸序列相連時，可以通過3’-5’磷酸二酯鍵連接。對於本領域的普通技術人員而言，可以根據具體情況理解上述術語在本發明中的具體含義。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、 “示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
BCMA:B細胞成熟抗原
CAR-T:嵌合抗原受體 T 細胞
Mock CART-T:模擬 CAR-T
NT:未感染T細胞
圖1是本發明的實施例提供的用陰性對照樣品進行均一化後，BCMA抗原在25，50，100nM濃度下，分別與載入了鼠抗人BCMA抗體的生物感測器的結合與解離曲線圖。
圖2是根據本發明的實施例提供的抗BCMA 抗體與MM.1S細胞系孵育後的流動式檢測結果圖。
圖3是根據本發明的實施例提供的抗BCMA 抗體與RPMI8226細胞系孵育後的流動式檢測結果圖。
圖4是根據本發明的實施例提供的抗BCMA 抗體與陰性對照K562細胞孵育後的流動式檢測結果圖。
圖5是根據本發明的實施例提供的流動式細胞儀檢測感染後T細胞表面CAR蛋白的表達結果。
圖6是根據本發明的實施例提供的不同細胞與三種MM靶細胞以及陰性對照細胞共培養後，IFN-gamma的分泌結果圖。
圖7是根據本發明的實施例提供的不同細胞與三種MM靶細胞以及陰性對照細胞共培養後，IL-2的分泌結果圖。
圖8是根據本發明的實施例提供的不同細胞對於CHO-BCMA細胞的殺傷作用結果圖。
圖9是根據本發明的實施例提供的不同細胞對於陰性CHO細胞的殺傷作用結果圖。
圖10是根據本發明的實施例提供的注射不同細胞後小鼠腫瘤大小的變化圖。
Claims (23)
- 一種抗BCMA抗體或抗原結合片段，包括下列至少之一： （1）具有GYTFTSYV、IIPYNDDT和ARWNYDGYFDV所示氨基酸序列的重鏈可變區，以及具有QSLVHSNGNTY、YKVS和SQITHVPYT所示氨基酸序列的輕鏈可變區； 與（1）相比，具有至少一個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
- 如請求項1所述的抗體或抗原結合片段，包括下列至少之一： （a）具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重鏈可變區和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的輕鏈可變區； 與（a）相比，具有至少一個保守氨基酸取代的氨基酸序列。
- 一種分離的多核苷酸，其中，該多核苷酸編碼請求項1或2所述的抗體或抗原結合片段。
- 如請求項3所述的多核苷酸，其中，該多核苷酸為具有下列至少之一的核苷酸序列： SEQ ID NO:3所示的重鏈可變區核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示的輕鏈可變區核苷酸序列； 與SEQ ID NO:3所示的重鏈可變區核苷酸序列相比，具有90%以上同源性的序列，任選具有95%以上同源性的序列，較佳為具有98%以上同源性的序列，更佳為具有99%以上同源性的序列； 與SEQ ID NO:4所示的輕鏈可變區核苷酸序列相比，具有90%以上同源性的序列，任選具有95%以上同源性的序列，較佳為具有98%以上同源性的序列，更佳為具有99%以上同源性的序列。
- 一種表達載體，包含請求項3或4所述的多核苷酸。
- 如請求項5所述的表達載體，進一步包括一控制元件，該控制元件與該多核苷酸可操作地連接，用於控制該多核苷酸在宿主細胞中的表達。
- 如請求項6所述的表達載體，其中，該控制元件包括下列至少之一：啟動子、增強子和終止子。
- 如請求項6所述的表達載體，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 一種重組細胞，包含請求項5~8中任一項所述的表達載體。
- 一種試劑盒，包括請求項1或2所述的抗體或抗原結合片段。
- 如請求項10所述的試劑盒，其中，該試劑盒用於BCMA抗原的診斷檢測。
- 一種藥物組合物，包括：請求項1或2所述的抗體或抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
- 請求項1或2所述的抗體或抗原結合片段在製備藥物中的用途，該藥物用於治療腫瘤。
- 如請求項13所述的用途，其中，該腫瘤為多發性骨髓瘤。
- 一種抗BCMA的嵌合抗原受體，包括：一胞外靶標結合區、一胞外鉸鏈區、一跨膜區和一胞內區，該胞外靶標結合區、該胞外鉸鏈區、該跨膜區和該胞內區依次相連； 該胞外靶標結合區包括一抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段為單鏈，該抗體或抗原結合片段包括請求項1或2所述的抗體或抗原結合片段。
- 如請求項15所述的抗BCMA的嵌合抗原受體，其中，該抗體或抗原結合片段為SEQ ID NO :5所示單鏈片段。
- 如請求項15或16所述的抗BCMA的嵌合抗原受體，其中，該胞外鉸鏈區進一步包括一人CD8胞外鉸鏈區，該人CD8胞外鉸鏈區氨基酸序列較佳為SEQ ID NO: 6所示。
- 如請求項15~17中任一項所述的抗BCMA的嵌合抗原受體，其中，該跨膜區為人CD28跨膜區，該人CD28跨膜區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO :7所示。
- 如請求項15~18中任一項所述的抗BCMA的嵌合抗原受體，其中，該胞內區包括一人CD28胞內區和人CD3ζ胞內區，該人CD28胞內區氨基酸序列較佳為SEQ ID NO :8所示，該人CD3ζ胞內區氨基酸序列較佳如SEQ ID NO:9所示。
- 如請求項15~19中任一項所述的抗BCMA的嵌合抗原受體，其中，編碼該抗體或抗原結合片段的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；編碼該人胞外鉸鏈區的核酸序列如SEQ ID NO:11所示；編碼該人CD28跨膜區和人CD28胞內區的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；編碼該人CD3ζ胞內區的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
- 一種Car-T細胞，其中，該Car-T細胞表達請求項15~20任一項所述的抗BCMA的嵌合抗原受體。
- 一種治療物件體內腫瘤的方法，包括給該物件施用有效量的請求項21所述的Car-T細胞。
- 如請求項22所述的治療物件體內腫瘤的方法，其中，該腫瘤為多發性骨髓瘤。
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