JP2024508819A - Ｃｘｃｒ２及びｇｐｃ３に対するｓｔａｒを共発現するｔ細胞並びにその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バイオ医薬品の分野、特に、ＣＸＣＲ２とＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現するＴ細胞、並びにその使用に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、バイオ医薬品の分野、特に、ＣＸＣＲ２とＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＳＴＡＲ）とを共発現するＴ細胞、並びにその使用に関する。
細胞療法、とりわけＴ細胞関連療法は、急速に発展しており、中でも、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法及びＴＣＲ－Ｔ療法は、非常に注目されている。
ＴＣＲ－Ｔ療法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をベースとする。ＴＣＲは、Ｔ細胞のアイデンティティであり、Ｔ細胞は、ＴＣＲのタイプに基づいてαβＴ細胞とγδＴ細胞とに分けることができる。発生の間、Ｔ前駆細胞は、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖のＶＤＪ再編成を受けるであろうし、再編成が首尾よく成功した場合には、γδＴ細胞へと発生し、又は再構成が失敗に終わった場合には、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＶＤＪ組換えを受け、次いで、αβ細胞へと発生するであろう。αβＴ細胞は、末梢血Ｔ細胞の９０％～９５％を占めるが、その一方で、γδＴ細胞は、末梢血Ｔ細胞５％～１０％を占める。この２つのタイプのＴ細胞は、それぞれ、ＭＨＣ拘束方式及びＭＨＣ非拘束方式において抗原を認識し、病原菌及び腫瘍に対する免疫において重要な役割を果たす。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体分子は、複数の鎖を含み、そのＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖（又はＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖）は、ＭＨＣポリペプチド分子の認識を担い、他の６つのＣＤ３サブユニットは、ＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ／δ鎖）に結合してシグナル変換の役割を果たす。天然ＴＣＲ複合体は、１０つのＩＴＡＭシグナル配列を含み、それらは、理論上、ＣＡＲより強いシグナルを伝達することができる。天然ＴＣＲのシグナル変換機能を用いることにより、Ｔ細胞の不能を軽減する新しい受容体を構築することが可能であり、それらは、固形腫瘍に対してより良い役割を果たすことができる。ＴＣＲのエクトドメインは、抗体のＦａｂドメインに非常に似ており、そのため、ＴＣＲの可変領域の配列を、抗体の可変領域の配列で置き換えることにより、抗体特異性を有するだけでなくＴ細胞活性化を媒介する際の天然ＴＣＲの優れたシグナル変換機能も有する、合成ＴＣＲ及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を得ることができる。
臨床応用された当分野の細胞療法の数はかなり限られており、そのため、依然として、ＳＴＡＲベースのＴ細胞療法などの改良されたＴ細胞療法が必要とされている。
一態様において、本発明は、ＣＸＣＲ２とＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現する単離された治療用Ｔ細胞を提供し、この場合、ＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、ＧにＰＣ３に対する抗原結合性領域を含み、並びにＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、第１の定常領域を含むα鎖及び第２の定常領域を含むβ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、
ｉ）α鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、第２の定常領域を含むか；又は
ｉｉ）α鎖は、第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み；
ｉｉｉ）α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む。
ｉ）α鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、第２の定常領域を含むか；又は
ｉｉ）α鎖は、第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み；
ｉｉｉ）α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、天然ＴＣＲα鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲα鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲα鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、改変されたＴＣＲα鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、並びに位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、並びに位置１３のアミノ酸Ｋは、Ｒで置換されており、並びに位置１５～１８のアミノ酸は欠失される。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域はマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域はマウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、並びに位置１３のアミノ酸Ｋは、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸は欠失され、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されており、並びに位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシン酸Ｌへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、並びに位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、定常領域のエンドドメインを欠いており、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、例えば、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号３～４及び２８～３０のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の定常領域は、天然ＴＣＲβ鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲβ鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲβ鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、第２の定常領域は、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のＫは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、並びに位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、定常領域のエンドドメインを欠いており、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、例えば、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されている。いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、配列番号７～８及び３１～３３のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域及び前記抗体の軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、並びに第２の抗原結合性領域は、前記抗体の軽鎖可変領域を含み；或いは第１の抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、並びに第２の抗原結合性領域は、前記抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号２２において示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２３において示されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２４において示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２５において示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６において示されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２７において示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号９において示されるアミノ酸配列を含み、並びに軽鎖可変領域は、配列番号１０において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖及び／又はβ鎖は、そのＣ末端に連結された少なくとも１つの外因性細胞内機能的ドメインを有する。いくつかの実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、α鎖及び／又はβ鎖の定常領域のＣ末端に直接的に又はリンカーを介して連結されている。いくつかの実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、エンドドメインを欠失したα鎖及び／又はβ鎖の定常領域のＣ末端にリンカーを介して連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーであり、式中、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である。
いくつかの実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、共刺激性分子のエンドドメイン、好ましくは、ＯＸ４０のエンドドメインであり、例えば、ＯＸ４０のエンドドメインは、配列番号１１において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、配列番号１３、１５、１７、又は１９において示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、β鎖は、配列番号１４、１６、１８、又は２０において示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１３において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含むか；或いは、ＳＴＡＲは、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１６において記載されるβ鎖を含むか；或いは、ＳＴＡＲは、配列番号１７において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含むか；或いは、ＳＴＡＲは、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号２０において記載されるβ鎖を含むか；或いは、ＳＴＡＲは、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含むか；或いは、ＳＴＡＲは、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含む。
一態様において、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞と薬学的に許容できるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、対象におけるがんなどの疾患の治療のための医薬品の調製における、本発明の治療用Ｔ細胞又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、疾患は、ＧＰＣ３関連疾患、例えば、肝臓がん、例えば、肝細胞癌など、肺がん、例えば、肺扁平上皮癌（ＳｑＣＣ）など、胃癌、卵巣がん、黒色腫、又は小児胚芽腫（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｔｕｍｏｒ）である。
特に明記又は定義されない限り、使用される全ての用語は、当業者によって理解されるであろう当技術分野における共通の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ」、及びＲｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）などの標準マニュアル、並びに本明細書において引用される一般的先行技術を参照されたく、さらに、特に明記されない限り、明確に詳述されない全ての方法、工程、技術、及び操作は、当業者によって理解されるであろう、それ自体既知の方式において実行してもよく並びに実行された。さらに、例えば、標準マニュアル、上記の一般的先行技術、及びそれらに列挙される他の参考文献も参照されたい。
本明細書において使用される場合、用語「及び／又は」は、本明細書において別々に一覧されていると考えられる、この用語によって接続される項目の全ての組合せを包含する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ」、「Ａ及びＢ」、及び「Ｂ」を網羅する。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、及び「Ａ及びＢ及びＣ」を網羅する。
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、前記配列からなり得るか、又は前記タンパク質又は核酸の片端又は両端に追加のアミノ酸又はヌクレオチドを有し得るが本明細書において説明される活性を依然として有するような、タンパク質又は核酸の配列を説明するために本明細書において使用される。さらに、当業者は、ポリペプチドのＮ末端において開始コドンによってコードされるメチオニンが、ある実用的な状況（例えば、特定の発現系において発現される場合）において保持されるが、ポリペプチドの機能には実質的に影響を及ぼさないことを理解するであろう。したがって、特定のポリペプチドアミノ酸配列の説明において、それは、そのＮ末端に開始コドンによってコードされるメチオニンを含み得ないが、その時点までに、及び相応に、メチオニンを含む配列を依然として網羅し、それらのコードヌクレオチド配列も、開始コドンを含んでもよく；その逆もまたしかりである。
本明細書において使用される場合、「アミノ酸の番号は配列番号ｘを参照する」（配列番号ｘは、本明細書において一覧される特定の配列である）は、説明される特定のアミノ酸の位置を表す数が、配列番号ｘにおけるそのアミノ酸に対応するアミノ酸の位置を表す数であることを意味する。異なるアミノ酸配列の間のアミノ酸の一致は、当技術分野において既知の配列アラインメント方法によって特定することができる。例えば、アミノ酸の一致は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩオンラインアラインメントツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）によって特定することができ、その場合、２つの配列は、デフォルトのパラメータによりＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用してアライメントすることができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端から始まる位置４６のアミノ酸が、配列番号ｘの位置４８のアミノ酸によって配列アライメントにおいてアライメントされる場合、そのポリペプチドにおけるこのアミノ酸は、「ポリペプチドの位置４８におけるアラニン、アミノ酸の位置は配列番号ｘを参照する」として本明細書において説明され得る。本発明において、α鎖定常領域に関連するアミノ酸の位置に対して、配列番号２が参照される。本発明において、β鎖定常領域に関するアミノ酸の位置に対して、配列番号６が参照される。
ＣＸＣＲ２は、Ｇタンパク質結合受容体ファミリーに属し、多くの場合、好中球に分布し、また、肥満細胞、マクロファージ、内皮細胞、及び様々な腫瘍細胞においても見出すことができる。インターロイキン（ＩＬ）－８特異的結合に対するその高い親和性により、ＩＬ８Ｒβとも呼ばれる。ＣＸＣＲ２コード遺伝子は、染色体２ｑ３３－ｑ３６に位置しており、並びに、受容体タンパク質は、約３５０のアミノ酸からなる。ＣＸＣＲ２のリガンドは、様々なＣＸＣケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＣＸＣＬ８など、である。初期の研究により、ＣＸＣＲ２は、炎症性領域への移動のために好中球をリクルートすることができることが見出され、これは炎症性免疫に関連すると考えられている。近年、ＣＸＣＲ２が、様々な腫瘍の発生、成長、及び治療に関与することが見出された。ＣＸＣＲ２の例示的アミノ酸配列は、配列番号１２において示される。本明細書において説明されるＣＸＣＲ２は、それらの機能的断片又はバリアントも包含する。例えば、当該バリアントは、配列番号１２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＧＰＣ３（グリピカン３）は、細胞分裂、又は発生の間の細胞分裂パターンの調整に関与する。ＧＰＣ３は、ＨＣＣ（肝細胞癌）細胞において高度に発現され、結果として、ＨＣＣのための診断マーカー及び治療標的として使用されてきた。
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３（グリピカン３）を標的にする合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）、とりわけ、定常領域において操作されたＳＴＡＲとを、Ｔ細胞において共発現させることにより、Ｔ細胞の標的致死能力を著しく高めることができ、それらの治療効率を向上させることができることを見出した。
一態様において、本発明は、ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現する単離された治療用Ｔ細胞を提供し、この場合、ＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域を含み、並びにＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、第１の定常領域を含むα鎖及び第２の定常領域を含むβ鎖を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現し、この場合、ＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、α鎖及びβ鎖を含み、α鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、第２の定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現し、この場合、ＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、α鎖及びβ鎖を含み、α鎖は、第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現し、この場合、ＧＰＣ３に対するＳＴＡＲは、α鎖及びβ鎖を含み、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、共発現は、共過剰発現である。例えば、本発明の単離された治療用Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ２の発現は、未改変コントロールＴ細胞（例えば、天然に存在するＴ細胞）と比較して増加され、好ましくは、著しく増加される。
いくつかの実施形態において、抗原結合性領域は、定常領域のＮ末端に直接的に又は間接的に（例えば、リンカーを介して）融合される。
いくつかの実施形態において、α鎖及びβ鎖は、Ｔ細胞での発現の際に機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。例えば、Ｔ細胞での発現において、α鎖及びβ鎖は、内因性ＣＤ３分子（ＣＤ３εδ、ＣＤ３γε、ＣＤ３ζζ）と結合して、８つのサブユニットのＴＣＲ複合体を形成することができ、並びに当該ＴＣＲ複合体は、細胞表面に現れて、標的抗原ＧＰＣ３への結合においてＴ細胞を活性化する。機能的ＴＣＲ複合体は、それが標的抗原に特異的に結合した後にＴ細胞を活性化することができることを意味する。
いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、天然ＴＣＲα鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲα鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲα鎖定常領域である。例示的天然ヒトＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号１において示されるアミノ酸配列を含む。例示的天然マウスＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号２において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、改変されたＴＣＲα鎖定常領域である。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、並びに位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、並びに位置１３のアミノ酸Ｋは、Ｒで置換されており、並びに位置１５～１８のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、並びに位置１３のアミノ酸Ｋは、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸は欠失され、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、は、システインＣへと変異されており、並びに位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシン酸Ｌへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、並びに位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型ＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、並びに、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの特定の実施形態において、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号３～４及び２８～３０のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の定常領域は、天然ＴＣＲβ鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲβ鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲβ鎖定常領域である。例示的天然ヒトＴＣＲβ鎖定常領域は、配列番号５において示されるアミノ酸配列を含む。例示的天然マウスＴＣＲβ鎖定常領域は、配列番号６において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の定常領域は、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域である。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のアミノ酸Ｋは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のＫは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、並びに位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型ＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、並びに定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されている。
いくつかの特定の実施形態において、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、配列番号７～８及び３１～３３のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、配列番号２８において示されるアミノ酸配列を含み、並びに、第２の定常領域は、配列番号７において示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、配列番号２９において示されるアミノ酸配列を含み、並びに第２の定常領域は、配列番号７において示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、配列番号３０において示されるアミノ酸配列を含み、並びに第２の定常領域は、配列番号８において示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書において使用される場合、「抗原結合性領域」は、それが単独で又は別の抗原結合性領域との組合せにおいて標的抗原に特異的に結合することができることを意味する。いくつかの実施形態において、抗原結合性領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体、例えば、任意の市販の抗体など、に由来する。
いくつかの実施形態において、第１の抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、並びに第２の抗原結合性領域は、前記抗体の軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、並びに第２の抗原結合性領域は、前記抗体の重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号２２において示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２３において示されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２４において示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２５において示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６において示されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２７において示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号９において示されるアミノ酸配列を含み、並びに軽鎖可変領域は、配列番号１０において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合性領域は、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖなど）又は単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物の抗体など）であり得る。この場合、例えば、前記第１及び第２の抗原結合性領域は、ＧＰＣ３の同じ又は異なるエピトープに独立的に結合し得る。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲのα鎖は、ＧＰＣ３に対して特異的な抗原結合性領域を含み、並びにβ鎖は、ＧＰＣ３に対して特異的な抗原結合性領域を含まない。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲのα鎖は、ＧＰＣ３に対して特異的な抗原結合性領域を含まず、並びにβ鎖は、ＧＰＣ３に対して特異的な抗原結合性領域を含む。いくつかの実施形態において、α鎖及び／又はβ鎖、好ましくは、α鎖は、そのＣ末端に連結された少なくとも１つの外因性細胞内機能的ドメインを有する。いくつかの実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、α鎖及び／又はβ鎖、好ましくはα鎖の定常領域のＣ末端に直接的に又はリンカーを介して連結されている。いくつかの実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、エンドドメインを欠失したα鎖及び／又はβ鎖、好ましくはα鎖の定常領域のＣ末端に、リンカーを介して連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーであり、式中、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である。
いくつかの実施形態において、第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており、並びに、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されており、並びに、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含み；並びに
第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、並びに、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、シスチンＣへと変異されている。
第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、並びに、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、シスチンＣへと変異されている。
本明細書において使用される場合、「外因性」は、外来種に由来するタンパク質又は核酸配列、或いは同じ種に由来する場合、人間による慎重な介入によって組成及び／又は位置が天然形態から著しく変更されているタンパク質又は核酸配列を意味する。
本明細書において使用される場合、「外因性細胞内ドメイン」は、共刺激性分子の細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７など、であり得；それは、共抑制性分子の細胞内ドメイン、例えば、ＴＩＭ３、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３のものなど、でもあり得；それは、サイトカイン受容体の細胞内ドメイン、例えば、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ－２β受容体、ＩＬ－７α受容体、又はＩＬ２１受容体など）、インターフェロン受容体、腫瘍壊死因子スーパーファミリ受容体、コロニー刺激因子受容体、ケモカイン受容体、成長因子受容体、又は他の膜タンパク質；或いはＮＩＫなどの細胞内タンパク質のドメインでもあり得る。
いくつかの好ましい実施形態において、外因性細胞内機能的ドメインは、共刺激性分子のエンドドメイン、好ましくは、ＯＸ４０のエンドドメインである。いくつかの実施形態において、ＯＸ４０のエンドドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域は、配列番号９において示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており；任意選択により、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域は、配列番号９において示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、位置１３のＫは、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸は欠失されており、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており；任意選択により、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域は、配列番号９において示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており；並びに、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されており；任意選択により、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域は、配列番号９において示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、は、Ｄで置換されており、位置１３のＫは、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸は欠失されており、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており；並びに、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されており；任意選択により、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、配列番号１３、１５、１７、又は１９において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており；任意選択により、β鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のＫは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されており；任意選択により、β鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており；並びに、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されており；任意選択により、β鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、は、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、は、Ｆで置換されており、位置９のＫは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに、位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されており；並びに、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されており；任意選択により、β鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含む。
いくつかの実施形態において、β鎖は、配列番号１４、１６、１８、又は２０において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、α鎖は、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域は、配列番号９において示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第１の定常領域は、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴは、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、はイソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、は、バリンＶへと変異されており；並びに、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、改変されたＴＣＲα鎖定常領域は、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、位置１３６～１３７のアミノ酸は欠失されており；並びに、α鎖は、定常領域のＣ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメイン（例えば、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーなど、によって連結され、この場合、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である）を含み；並びに
β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されている。
β鎖は、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、この場合、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域は、配列番号１０において示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；第２の定常領域は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、は、システインＣへと変異されている。
いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１３において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１６において記載されるβ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１７において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号２０において記載されるβ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＲは、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含む。
別の態様において、本発明は、本発明による治療用Ｔ細胞を調製する方法であって、ＣＸＣＲ２と、本発明の上記において定義されるような、ＧＰＣ３（グリピカン３）に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを、Ｔ細胞においてを共発現させる工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、前記ＣＸＣＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記α鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び前記β鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをＴ細胞に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、コードヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されている。
本発明の「発現ベクター」は、直鎖状核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクター、又は翻訳可能なＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターなど、である。
用語「調節配列」及び「調節エレメント」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、中間、又は下流（３’非コード配列）に位置し、並びに、転写、ＲＮＡのプロセシング又は安定性或いは関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味するために相互互換的に使用される。発現調節エレメントは、目的のヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡのプロセシング又は安定性、或いは翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、これらに限定されるわけではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、及びポリアデニル化認識配列を含み得る。本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、調節エレメント（例えば、これらに限定されるわけではないが、プロモーター配列、転写終結配列など）が、核酸配列（例えば、コード配列又はオープンリーディングフレーム）に連結され、それにより、ヌクレオチド配列の転写が転写制御エレメントによって制御及び調整されることを意味する。調節エレメント領域を核酸分子に作動可能に連結するための技術は、当技術分野において既知である。
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、α鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、異なる発現ベクターであってもよく、又は同じ発現ベクターであってもよい。例えば、当該３つのコードヌクレオチド配列は、それぞれ、３つの異なる発現ベクターに位置していてもよく；又はそれらのうちの２つは同じ発現ベクターに位置し、その一方で、残りの１つは、別の発現ベクターに位置するか；又は全てが同じ発現ベクターに位置する。
いくつかの実施形態において、α鎖をコードするヌクレオチド配列及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列は、フレームにおける同じ発現ベクターに位置し得、並びに、それらの間の自己切断性ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。α鎖をコードするヌクレオチド配列は、β鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に位置し得る。
本明細書において使用される場合、「自己切断性ペプチド」は、細胞において自己切断を達成することができるペプチドを意味する。例えば、自己切断性ペプチドは、認識され細胞においてプロテアーゼによって特異的に切断される、プロテアーゼ認識部位を含み得る。或いは、自己切断性ペプチドは、２Ａポリペプチドであり得る。２Ａポリペプチドは、ウイルス由来の短いペプチドの一種であり、その自己切断は、翻訳の際に生じる。２つの異なる標的タンパク質が、２Ａポリペプチドで連結されて、同じリーディングフレームにおいて発現される場合、当該２つの標的タンパク質は、ほぼ１：１の比率において生じる。一般的な２Ａポリペプチドは、豚テシオウイルス－１由来のＰ２Ａ、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、馬鼻炎（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）Ａウイルス由来のＥ２Ａ、及び口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａであり得る。それらの中で、Ｐ２Ａは、最も高い切断効率を有しており、したがって、好ましい。これらの２Ａポリペプチドの様々な機能的バリアントも、当技術分野において既知であり、本発明においても使用することができる。
いくつかのさらなる実施形態において、α鎖をコードするヌクレオチド配列とβ鎖をコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクターは、ＣＸＣＲ２をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得、この場合、ＣＸＣＲ２をコードするヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって、α鎖をコードするヌクレオチド配列及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列から分離され得る。
本発明のＴ細胞は、いくつかの非限定的な供給源、例えば、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、及び腫瘍など、から、様々な非限定的な方法によって得られ得る。いくつかの実施形態において、細胞は、健康なドナー又はがんと診断された患者から得られ得る。いくつかの実施形態において、細胞は、異なる表現形プロファイルを示す細胞の混合集団の一部であり得る。例えば、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、次いで特異的抗体によって活性化し増幅することによって得ることができる。
本発明の態様のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、対象の自己細胞に由来する。本明細書において使用される場合、「自己」は、対象を治療するために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団がその対象に由来することを意味する。いくつかの実施形態において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞など、は、同種異系細胞、例えば、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に適合するドナーなど、に由来する。ドナーからの細胞は、標準的プロトコルを使用して非アロ反応性細胞に変換することができ、並びに、１人又は複数人の患者に投与することができる細胞を作製する必要がある場合には複製することができる。
別の態様において、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞と薬学的に許容できるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できるキャリア」は、ありとあらゆる生理的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗真菌剤及び防かび剤、等張剤、並びに吸収抑制剤などを含む。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、腸管外、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）にとって好適である。
別の態様において、本発明は、対象におけるがんなどの疾患の治療のための医薬品の調製における、本発明の治療用Ｔ細胞の使用を提供する。
本明細書において使用される場合、「対象」は、本発明の細胞、方法、又は医薬組成物によって治療することができる疾患（例えば、がん）を患うか又はその傾向のある生物体を意味する。その非限定的な例としては、ヒト、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、シカ、及び他の非哺乳動物が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、対象はヒトである。
別の態様において、本発明は、対象におけるがんなどの疾患を治療する方法であって、本発明の治療免疫細胞又は医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本明細書において使用される場合、「治療有効量」又は「治療有効投薬量」又は「有効量」は、少なくとも、対象への投与の後に治療効果を生じるために十分である物質、化合物、材料、又は細胞の量を意味する。したがって、それは、疾患又は障害の症状を予防、治癒、改善、阻害、又は部分的に阻害するのに必要な量である。例えば、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、障害の症状の重症度の減少、障害の無症候性期間の頻度及び継続期間の増加、或いは障害を患うことの結果としての傷害又は不能の予防を、結果として生じ得る。例えば、腫瘍の治療に対して、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、腫瘍細胞増殖又は腫瘍成長を、未治療の対象と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％阻害し得る。腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測し得る動物モデルシステムにおいて推定することができる。或いは、それは、当業者に既知の試験によってインビトロにおいて特定され得る腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を調べることによって、推定を実施することができる。
実際には、患者に対して毒性なく、特定の患者、組成物、及び投与経路に対して所望の治療反応を効率的に達成することができるような量の有効成分を得るために、本発明の医薬組成物における細胞の用量レベルは異なり得る。選択された用量レベルは、様々な薬物動態学的要因、例えば、適用された本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与のタイミング、適用された特定の化合物の排泄速度、治療の継続期間、適用される他の薬物、適用される特定の組成物と組み合わされる化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、状態、治療される患者の健康全般及び病歴、並びに医学の分野おいて既知の同様の因子など、に依存する。
本発明による治療用Ｔ細胞又は医薬組成物又は薬物の投与は、注射、注入、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、又は移植術（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）など、都合の良い方式において実施され得る。本明細書において説明される細胞又は組成物の投与は、静脈内、リンパ内、皮内、腫瘍内、骨髄内、筋肉内、又は腹腔内投与であり得る。一実施形態において、本発明の細胞又は組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
本発明の様々な態様の実施形態において、疾患は、ＧＰＣ３関連疾患、例えば、ＧＰＣ３の異常発現に関連する疾患、例えば、ＧＰＣ３関連がんなど、である。当該がんは、例えば、肝臓がん、例えば、肝細胞癌など、肺がん、例えば、肺扁平上皮癌（ＳｑＣＣ）
など、胃癌、卵巣がん、黒色腫、又は小児胚芽腫である。
など、胃癌、卵巣がん、黒色腫、又は小児胚芽腫である。
実験材料及び方法
ベクターの構築
本願の実施例において使用されるレンチウイルスベクター及びレンチウイルスパッケージングプラスミドは、営利会社から購入したか、又は営利会社によって合成された。本願の実施例において使用される遺伝子断片、例えば、シグナルペプチド、抗体結合性領域、ヒンジ領域、ＴＣＲ定常領域、タグタンパク質などは、営利会社によって合成された。対応する機能的配列を得るために、合成プライマーによるＰＣＲによって、１つ又は複数の標的断片を連結させた。本発明において使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１α－ＲＦＰである。ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＷＰＲＥ－ＡＭＰベクターは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉを使用して得た。断片遺伝子は、合成及びＰＣＲ法によって得た。次いで、完全なベクターは、レコンビナーゼの作用下において相同的組換え法によって得た。
ベクターの構築
本願の実施例において使用されるレンチウイルスベクター及びレンチウイルスパッケージングプラスミドは、営利会社から購入したか、又は営利会社によって合成された。本願の実施例において使用される遺伝子断片、例えば、シグナルペプチド、抗体結合性領域、ヒンジ領域、ＴＣＲ定常領域、タグタンパク質などは、営利会社によって合成された。対応する機能的配列を得るために、合成プライマーによるＰＣＲによって、１つ又は複数の標的断片を連結させた。本発明において使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１α－ＲＦＰである。ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＷＰＲＥ－ＡＭＰベクターは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉを使用して得た。断片遺伝子は、合成及びＰＣＲ法によって得た。次いで、完全なベクターは、レコンビナーゼの作用下において相同的組換え法によって得た。
下記のコンストラクトは、本願の実施例において構築した：３ＲＤ－ＧＣ３３－ＢＢｚＣＡＲ－ＣＸＣＲ２（ＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＸＣＲ２）、並びにＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）に由来するコンストラクト３ＲＤ－ＧＣ３３－ＳＴＡＲ－ ａｂＯＸ４０－ＣＸＣＲ２（ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ＯＸ４０－ＣＸＣＲ２）及び３ＲＤ－ＧＣ３３－ＳＴＡＲ－ＣＸＣＲ２（ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ＣＸＣＲ２）。コンストラクトのマップを図１に示す。ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）を使用したコンストラクトのマップは示されていない。
コントールとしてのＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＸＣＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２１において示される。
ＧＰＣ３を標的にする抗原結合性領域は、抗体ＧＣ３３から得られ、その重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号９において示され；その軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号１０において示される。
α鎖の定常領域は、マウスに由来しており、野生型は、ＴＲＡＣと命名され、その配列は、配列番号２において示される。ＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、位置４８のトレオニンＴがシステインＣに変異され、並びにＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬへの変異を有する、マウスの定常領域を意味する。ＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）のアミノ酸配列は、配列番号３において示される。ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）は、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、がＤで置換され、位置１３のＫがＲで置換され、位置１５～１８のアミノ酸は欠失され、並びに位置４８のトレオニンＴがシスチンＣへと変異され、並びに配列ＬＳＶＭＧＬＲＩＬがＬＬＶＩＶＬＲＩＬに変異されている、マウスの定常領域を意味し、ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）のアミノ酸配列は、配列番号４において示される。
β鎖の定常領域は、マウスに由来しており、野生型は、ＴＲＢＣと命名され、その配列は、配列番号６において示される。ＴＲＢ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、位置５６のセリンＳがシステインＣへと変異されている、マウスの定常領域を意味し、そのアミノ酸配列は、配列番号７において示される。ＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）は、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、はシステインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、はＫで置換されており、並びに位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、はＦで置換されており、位置９のＫは、Ｅで置換されており、位置１１のＳは、Ａで置換されており、位置１２のＬは、Ｖで置換されており、並びに位置１７及び２１～２５のアミノ酸は欠失されている、マウスの定常領域を意味し、そのアミノ酸配列は、配列番号７において示される。
共刺激性分子ＯＸ４０の細胞質領域のアミノ酸配列は、配列番号１１において示される。共刺激性分子ＯＸ４０の細胞質領域は、エンドドメインを欠くα鎖定常領域（ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）又はＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）をベースとする）のＣ末端及びエンドドメインを欠くβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）又はＴＲＢＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）をベースとする）のＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介して連結されている。
レンチウイルスのパッケージング
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を、５×１０５細胞／ｍＬにおいて１０ｃｍの培養皿に播種し、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて３７℃で培養し、細胞密度が約８０％に達したとき（顕微鏡下において観察）にトランスフェクトした。３つのプラスミドを、ＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：トランスファープラスミド＝１：２：３の比率において５００μＬの無血清ＤＭＥＭと均等に混合した。５４μＬのＰＥＩ－ｍａｘを、５００μＬの無血清ＤＭＥＭと均等に混合し、室温で５分間静置した（ＰＥＩ－Ｍａｘとプラスミドの体積質量比は３：１であった）。ＰＥＩ－ｍａｘ混合物を、プラスミド混合物にゆっくりと加え、穏やかにピペッティングしてよく混合し、室温で１５分間静置した。最終混合物を、ゆっくりと培養培地に加え、よく混合し、インキュベーターに戻して１２時間～１６時間培養し、次いで、培養のために６％のＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に代えて、ウイルス液体を、４８時間及び７２時間において採取する。
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を、５×１０５細胞／ｍＬにおいて１０ｃｍの培養皿に播種し、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて３７℃で培養し、細胞密度が約８０％に達したとき（顕微鏡下において観察）にトランスフェクトした。３つのプラスミドを、ＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：トランスファープラスミド＝１：２：３の比率において５００μＬの無血清ＤＭＥＭと均等に混合した。５４μＬのＰＥＩ－ｍａｘを、５００μＬの無血清ＤＭＥＭと均等に混合し、室温で５分間静置した（ＰＥＩ－Ｍａｘとプラスミドの体積質量比は３：１であった）。ＰＥＩ－ｍａｘ混合物を、プラスミド混合物にゆっくりと加え、穏やかにピペッティングしてよく混合し、室温で１５分間静置した。最終混合物を、ゆっくりと培養培地に加え、よく混合し、インキュベーターに戻して１２時間～１６時間培養し、次いで、培養のために６％のＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に代えて、ウイルス液体を、４８時間及び７２時間において採取する。
Ｔ細胞の培養及び感染
１）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。培養密度は、３×１０５／ｍｌであり、最も高い密度は、３×１０６／ｍｌを超えなかった。この細胞を、１～２日毎に継体培養した。細胞をカウントした後に、必要な量の細胞を取り、培地を加えて上記の密度に調節し、ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
１）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。培養密度は、３×１０５／ｍｌであり、最も高い密度は、３×１０６／ｍｌを超えなかった。この細胞を、１～２日毎に継体培養した。細胞をカウントした後に、必要な量の細胞を取り、培地を加えて上記の密度に調節し、ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
２）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の感染
細胞をカウントした後、培地を交換するために１×１０６／ｍｌの細胞を遠心分離し、１０％のＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させ、２４ウェルプレートに加え、ウイルス溶液を加え（ＭＯＩ＝１）、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離して、ＣＯ２インキュベーターに位置させた。感染の１２時間後、培地を、１０％のＦＢＳを含む新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地と完全に交換し、陽性率を７２時間以内に検出した。
細胞をカウントした後、培地を交換するために１×１０６／ｍｌの細胞を遠心分離し、１０％のＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させ、２４ウェルプレートに加え、ウイルス溶液を加え（ＭＯＩ＝１）、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離して、ＣＯ２インキュベーターに位置させた。感染の１２時間後、培地を、１０％のＦＢＳを含む新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地と完全に交換し、陽性率を７２時間以内に検出した。
３）ヒト一次Ｔ細胞の培養
一次Ｔ細胞をフィコール分離法によって得た後、それらを、１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地において培養した。初期培養密度は、１×１０６／ｍｌであった。細胞を、ＣＤ３及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）でプレコーティングしたプレートに加えた。その後の段階において、培養密度は５×１０５／ｍｌであり、最も高い密度は、３×１０６／ｍｌを超えず、並びに、当該細胞を、１～２日毎に継体培養した。
一次Ｔ細胞をフィコール分離法によって得た後、それらを、１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地において培養した。初期培養密度は、１×１０６／ｍｌであった。細胞を、ＣＤ３及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）でプレコーティングしたプレートに加えた。その後の段階において、培養密度は５×１０５／ｍｌであり、最も高い密度は、３×１０６／ｍｌを超えず、並びに、当該細胞を、１～２日毎に継体培養した。
４）ヒト一次Ｔ細胞の感染
一次Ｔ細胞を４８時間培養した後、ウイルス溶液を加え（ＭＯＩ＝２０）、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離して、培養のためにＣＯ２インキュベーターに位置させた。感染の２４時間後、１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地を補い、別のウェルに移し、感染効率を、７２時間の時点においてタグタンパク質又は抗体によって検出した。
一次Ｔ細胞を４８時間培養した後、ウイルス溶液を加え（ＭＯＩ＝２０）、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離して、培養のためにＣＯ２インキュベーターに位置させた。感染の２４時間後、１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地を補い、別のウェルに移し、感染効率を、７２時間の時点においてタグタンパク質又は抗体によって検出した。
５）感染効率の検出
感染の７２時間後、細胞を均等にブローし、カウントして、遠心分離のために５×１０５／ｍｌを取り、上清を捨てた。染色溶液は、ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋２ ｍＭのＥＤＴＡであり、対応する抗体を加え、３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、機械で検出した。
感染の７２時間後、細胞を均等にブローし、カウントして、遠心分離のために５×１０５／ｍｌを取り、上清を捨てた。染色溶液は、ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋２ ｍＭのＥＤＴＡであり、対応する抗体を加え、３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、機械で検出した。
ＣＸＣＲ２を発現するＳＴＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ機能の試験
陽性Ｔ細胞を、特定の効果対標的比においてルシフェラーゼ発現標的細胞（ＧＰＣ３の低発現のＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＧＰＣ３の中発現のＨｕｈ－７、ＧＰＣ３の高発現のＨｅｐＧ２）と共に共培養した。
陽性Ｔ細胞を、特定の効果対標的比においてルシフェラーゼ発現標的細胞（ＧＰＣ３の低発現のＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＧＰＣ３の中発現のＨｕｈ－７、ＧＰＣ３の高発現のＨｅｐＧ２）と共に共培養した。
２４時間の共培養の後、細胞懸濁液を穏やかに均等にブローし、各ウェルの１５０μＬの細胞懸濁液を、それぞれ２つのレプリケートウェルを備えるホワイト９６ウェルプレートに加え、ルシフェラーゼ基質を加えた。この混合物を振盪し（低速で）、１０分間インキュベートし、多機能マイクロプレートリーダーを使用して化学発光値を検出した。細胞致死の計算：殺細胞効率＝１００％－（エフェクター細胞－標的細胞ウェルの値／コントロール細胞－標的細胞ウェルの値）。或いは、共培養の２４時間後、細胞培養上清を収集し、サイトカインの含量を市販のキットによって検出した。
ＣＸＣＲ２を発現するＳＴＡＲ－Ｔ細胞のインビボ機能の試験
１．マウス腫瘍モデルの確立
（１）５～６週齢及び約２０ｇの体重の１０匹のＮＣＧマウスを購入し、動物飼育室で３～５日間飼育した。
１．マウス腫瘍モデルの確立
（１）５～６週齢及び約２０ｇの体重の１０匹のＮＣＧマウスを購入し、動物飼育室で３～５日間飼育した。
（２）マトリゲルを氷上において３～５時間かけて解凍した。さらにＰＢＳ、ピペットチップなどを予備冷却した。
（３）ＨｕＨ７－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、カウントして、５つのグループに分け、それぞれ、１×１０６／ｍＬ、５×１０６／ｍＬ、１×１０７／ｍＬ、５×１０７／ｍＬ、１×１０８／ｍＬに希釈し、各グループに対して２５０μＬを調製した。
（４）解凍したマトリゲルを氷上において各グループの細胞に加え（２５０μＬ／グループ）、穏やかにブローし、ピペット（予備冷却したピペットチップ）を用いて混合し、ＰＢＳを加えて５００μＬにした。
（５）全て（細胞、注射器、ピペット、チップ）を氷上に置き、滅菌処理し、腫瘍接種のために動物飼育室に持ち込んだ。
（６）マウスをイソフルランガス麻酔装置で麻酔し、各グループに２匹ずつ５つのグループに分けた。腫瘍細胞を、１００μＬ／マウスにおいて、マウスの後背の皮下に接種させた。この日を０日目として記録した。
（７）３日目、６日目、９日目、及び１２日目に、マウスの腫瘍を、ライブイメージングによって測定及び検出した。後続の実験のために、適切な腫瘍接種用量及び生育時間を選択した。
２．インビボでのＴ細胞の腫瘍致死機能の分析
（１）対応する数のマウスを、実験クループに従って、各グループに５～６匹のマウスを設定した。Ｔ細胞を感染させ、陽性細胞は、あらかじめ選別し、７～１０日間培養した後、再注入した。
（１）対応する数のマウスを、実験クループに従って、各グループに５～６匹のマウスを設定した。Ｔ細胞を感染させ、陽性細胞は、あらかじめ選別し、７～１０日間培養した後、再注入した。
（２）腫瘍細胞を、予備実験によって得られた腫瘍接種量に従って、マウス１匹あたり３×１０６ＨｕＨ－７－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種させた。
（３）腫瘍サイズが約１００ｃｍ３まで成長したとき（７日間）、インビボ蛍光イメージングを実施し、マウスを、腫瘍サイズに従っていくつかのグループに分け、コントロールＴ細胞、従来のＳＴＡＲ－Ｔ細胞、及び改良されたＳＴＡＲ－Ｔ細胞などのＴ細胞を尾静脈に再注入した。マウス１匹あたりの再注入の量は、１×１０６～３×１０６陽性Ｔ細胞であった。
（４）再注入後、３～４日毎に腫瘍のサイズを、インビボ画像表示装置によって検出し、マウスの末梢血を採取して、インビボでのＴ細胞の増殖を分析した。
（５）腫瘍接種の３５日後、各グループのマウスを殺し、腫瘍を剥ぎ取り、Ｔ細胞の分布、Ｔ細胞のタイプ、及び腫瘍浸潤細胞の消耗を分析するために、マウスの末梢血、脾臓、及び他の組織を採取した。
３．マウスのインビボイメージング
マウスをイソフルランで麻酔した後、それらの体重を測定して記録し、２００μＬのＤ－フルオレセインカリウム塩を腹腔内注射した。５～７分後、撮像のためにマウスをインビボ画像表示装置に位置させた。撮像時間は１分であった（注：撮像時間は、腫瘍のタイプ及びサイズから決定されるが、実験を通して一定であることが必要である）。撮像後、撮像写真を保存し、腫瘍エリアを円で囲み、各マウスの腫瘍エリアの総蛍光値を記録した。
マウスをイソフルランで麻酔した後、それらの体重を測定して記録し、２００μＬのＤ－フルオレセインカリウム塩を腹腔内注射した。５～７分後、撮像のためにマウスをインビボ画像表示装置に位置させた。撮像時間は１分であった（注：撮像時間は、腫瘍のタイプ及びサイズから決定されるが、実験を通して一定であることが必要である）。撮像後、撮像写真を保存し、腫瘍エリアを円で囲み、各マウスの腫瘍エリアの総蛍光値を記録した。
４．インビボＴ細胞移動分析
（１）３６匹のマウスを購入した。Ｔ細胞を感染させ、陽性細胞をあらかじめ選別し、７～１０日間培養した後、再注入した。
（１）３６匹のマウスを購入した。Ｔ細胞を感染させ、陽性細胞をあらかじめ選別し、７～１０日間培養した後、再注入した。
（２）マウス１匹あたり３．５×１０６ＨｕＨ－７－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞において、腫瘍細胞を接種させた。
（３）腫瘍サイズが約１００ｃｍ３まで成長したとき（７日間）、インビボ蛍光イメージングを実施し、マウスを、腫瘍サイズに従って３つのグループに分け（各グループに１２匹のマウス）、コントロールＴ細胞、従来のＳＴＡＲ－Ｔ細胞、及び新規のＣＸＣＲ２改変されたＳＴＡＲ－Ｔ細胞などのＴ細胞を尾静脈に再注入した。各マウスの再注入量は、２×１０６陽性Ｔ細胞であった。
（４）Ｔ細胞の再注入後の１日目、３日目、５日目、及び７日目に、マウスを取り出して腫瘍浸潤細胞を分析した。各グループの３匹のマウスを犠牲にし、腫瘍を剥ぎ取り、腫瘍の重量を測定した。腫瘍の半分を切除し、免疫組織化学染色のために４％のＰＦＡにおいて固定した。
（５）残りの１／２の腫瘍を秤量し、細かく刻んで、細砕し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、６０μＬ／試料の染色溶液を加え（染色プロトコルについては下記の表を参照されたい）、染色のために９６ウェルプレートに移し、暗所において氷上で３０分かけて染色した。
マウス腫瘍でのＴ細胞染色のプロトコル
（６）細胞を、４℃において１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
（７）２００μＬの４％のＰＦＡを加えた後に細胞を再懸濁させ、２００メッシュのフィルターを通してフロー管へと濾過し、４℃の冷蔵庫に入れ、２４時間以内に機械で試験した。腫瘍組織の単位重量あたりの浸入Ｔ細胞の数を、カウント及び腫瘍重量により計算した。
実施例１．ＳＴＡＲ構造の最適化
本発明において、定常領域のマウス化、システイン点変異、及びα鎖の定常領域の疎水性アミノ酸変異は、ＳＴＡＲの機能を向上させる。
本発明において、定常領域のマウス化、システイン点変異、及びα鎖の定常領域の疎水性アミノ酸変異は、ＳＴＡＲの機能を向上させる。
定常領域のマウス化改変：ヒト、霊長類、及びマウスＴＣＲα／β鎖の定常領域配列は高い機能的保存を有し、重要なアミノ酸配列は同じであるため、それらはお互いに交換することができる。交換の後、一方では、ＳＴＡＲ分子の正しい対合の効率は増加し、他方では、ミスマッチングによって生じる未知の特異性の可能性は減少し、安全性を増加させる。
ジスルフィド結合を導入するためのシステイン点変異：マウス化ＴＣＲα鎖の定常領域の位置４８のトレオニンＴをシステインＣへと変異させ、並びに、マウス化ＴＣＲβ鎖の定常領域の位置５６のセリンＳをシステインＣへと変異させた。これらの２つの新たに加えられたシステインは、ＳＴＡＲの２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成するであろうし、ＳＴＡＲの２つの鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間のミスマッチを減らし、ＳＴＡＲ分子がより安定な複合体を形成するのに役立つ。
ＳＴＡＲの膜貫通領域における疎水性アミノ酸置換の設計：１１１～１１９のＴＣＲα鎖の定常領域の膜貫通領域における３つのアミノ酸部位を変異させ、位置１１２のセリンＳをロイシンＬへと変異させ、並びに、位置１１４のメチオニンＭをイソロイシンＩへと変異させ、位置１１５のグリシンＧをバリンＶへと変異させた。この領域のアミノ酸配列全体を、ＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬへと変異させた。この設計は、膜貫通領域の疎水性を増加させ、ＴＣＲ膜貫通領域によって運ばれる正電荷によって生じる不安定性を減少させ、ＳＴＡＲ分子が細胞膜上により安定して存在することを可能にし、それにより、より良い機能を得ることを可能にする。
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するため、より良い効果を得るために、定常領域のマウス化、システイン点変異、及びα鎖定常領域の疎水性アミノ酸変異に基づいて、ＳＴＡＲ分子の定常領域のＮ末端の特定の再構成を実施した。再構成は、配列の一部を削除し、同時に、配列の一部においてヒト化変異を実施することを意味する。ヒト化変異の意義は、臨床用途においてＳＴＡＲ－Ｔ細胞が受容体によって拒絶される可能性を最大限に回避するために、ＳＴＡＲ分子の機能を確保しつつ、可能な限りＳＴＡＲ分子における非ヒト配列を減少させることである。
このために、ＴＣＲα鎖の定常領域のＮ末端における１８のアミノ酸を、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、をＤで置換し、位置１３のＫをＲによって置換し、並びに位置１５～１８のアミノ酸を削除するなど、さらに改変した。得られたα鎖の定常領域を、ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）と命名した。ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端における２５のアミノ酸を、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、をＫで置換し、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、をＦで置換し、位置９のＫをＥで置換し、並びに、位置１１のアミノ酸ＳをＡで置換し、位置１２のＬをＶで置換し、並びに、位置１７及び２１～２５のアミノ酸を削除するなど、さらに改変し、結果として生じるβ鎖定常領域を、ＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）と命名した。
さらに、共刺激性分子、例えば、ＯＸ４０の細胞質領域など、をα鎖定常領域のＣ末端及び／又はβ鎖定常領域のＣ末端に連結させることにより、さらにＳＴＡＲの機能を高めることができる。当該共刺激性分子は、α鎖定常領域のＣ末端及び／又はβ鎖定常領域のＣ末端に、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介して連結され得る。上記において言及した改変に加えて、共刺激性分子に連結された定常領域は、野生型の定常領域と比べて、天然のエンドドメインも欠くことができ、それは、ＳＴＡＲの機能をさらに向上させる。例えば、アミノ酸１３６～１３７が、α鎖定常領域から欠失され得；及び／又はアミノ酸１６７～１７２が、β鎖定常領域から欠失され得る。
実施例２．ＣＸＣＲ２を共発現するＧＰＣ３ターゲッティングＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＸＣＲ２を共発現するＧＰＣ３ターゲッティングＳＴＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ標的致死能力及びサイトカイン分泌能力の比較
ＧＰＣ３ターゲッティングＣＡＲを、ＧＰＣ３に対する抗体ＧＣ３３のｓｃＦｖを使用して構築した。ＣＡＲは、ＣＤ８ａヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む。
ＧＰＣ３ターゲッティングＣＡＲを、ＧＰＣ３に対する抗体ＧＣ３３のｓｃＦｖを使用して構築した。ＣＡＲは、ＣＤ８ａヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む。
ＧＰＣ３を標的にするＳＴＡＲを、抗体ＧＣ３３の軽鎖及び重鎖可変領域を使用して、実施例１において最適化された定常領域に基づいて構築した（図２Ａ及びＣにおける定常領域：Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ；図２Ｂ及びＤにおける定常領域：Ｃｙｓ－ＴＭ）。
得られたＣＡＲ及びＳＴＡＲ構造を、Ｔ細胞においてＣＸＣＲ２と共に共発現させることにより、対応するＧＰＣ３ ＣＡＲ－ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞を得た。
次いで、得られたＴ細胞の標的致死効果を、ＧＰＣ３を異なる程度において発現する肝臓がん細胞株を使用して試験した（低ＧＰＣ３発現のＳＫ－Ｈｅｐ－１、中ＧＰＣ３発現のＨｕｈ－７、及び高ＧＰＣ３発現のＨｅｐＧ２）。結果は図２に示される。ＣＸＣＲ２を発現する場合、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲは、より高い標的細胞致死能力及びＩＦＮγ分泌能力を有し、並びに、ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＧＰＣ３ ＳＴＡＲの効果は、最良であった。
実施例３．ＣＸＣＲ２を共発現するＧＰＣ３ターゲッティングＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＸＣＲ２を共発現するＧＰＣ３ターゲッティングＳＴＡＲ－Ｔ細胞（最適化されたＮｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域構造を有する）のインビボ腫瘍浸潤及び腫瘍抑制能力の比較
ＨｕＨ７－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞をマウスに接種させることによって腫瘍モデルを確立して、異なる治療用Ｔ細胞のインビボ腫瘍浸潤及び腫瘍抑制能力を試験した。実験結果は図３に示され、ＣＸＣＲ２共発現は、腫瘍への治療ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤を著しく向上させることができる。図４に示されるように、ＣＸＣＲ２を発現する場合、ＧＰＣ３－ＳＴＡＲは、より高い腫瘍抑制能力を有し、ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＧＰＣ３－ＳＴＡＲ（最適化されたＮｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域構造を有する）は、最良の効果を有した。この実験において説明されるＳＴＡＲは、ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）に由来する。
ＨｕＨ７－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞をマウスに接種させることによって腫瘍モデルを確立して、異なる治療用Ｔ細胞のインビボ腫瘍浸潤及び腫瘍抑制能力を試験した。実験結果は図３に示され、ＣＸＣＲ２共発現は、腫瘍への治療ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤を著しく向上させることができる。図４に示されるように、ＣＸＣＲ２を発現する場合、ＧＰＣ３－ＳＴＡＲは、より高い腫瘍抑制能力を有し、ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＧＰＣ３－ＳＴＡＲ（最適化されたＮｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域構造を有する）は、最良の効果を有した。この実験において説明されるＳＴＡＲは、ＴＲＡＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｎｒｅｃ－Ｃｙｓ－ＴＭ）に由来する。
実施例４．ＣＸＣＲ２を共発現するＧＰＣ３標的化ＳＴＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域の最適構造を有し、共刺激ドメインを有するα鎖のみが加えられる）のインビボ及びインビトロ有効性の分析
この実施例において、Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域の最適構造に基づき、並びにＯＸ４０共刺激ドメインを有するα鎖のみが加えられた（エンドドメインを欠失するα鎖のＣｙｓ－ＴＭ定常領域にＯＸ４０を加えた）、ＣＸＣＲ２を共発現するＳＴＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ及びインビボ有効性を分析した。
この実施例において、Ｃｙｓ－ＴＭ定常領域の最適構造に基づき、並びにＯＸ４０共刺激ドメインを有するα鎖のみが加えられた（エンドドメインを欠失するα鎖のＣｙｓ－ＴＭ定常領域にＯＸ４０を加えた）、ＣＸＣＲ２を共発現するＳＴＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ及びインビボ有効性を分析した。
１．ＣＸＣＲ２を共発現しない対応するＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔと比較して、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、より良いインビトロ機能及び移動能を有する
ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）の構築戦略が、図５Ａに示される。ＳＴＡＲは、ＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）に由来した。
ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）の構築戦略が、図５Ａに示される。ＳＴＡＲは、ＴＲＡＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＴＲＢＣ（Ｃｙｓ－ＴＭ）に由来した。
最初に、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞でのＣＸＣＲ２の発現レベルを、フローサイトメトリーによって検出した。結果は、図５Ｂに示される。ウイルスを感染させたＴ細胞において、ｍＴＣＲβ抗体染色は、細胞膜上のＳＴＡＲ受容体を検出し、ＣＸＣＲ２－ＡＰＣ抗体は、ＣＸＣＲ２受容体の発現を検出し、それは、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）が、ＧＰＣ３－ＳＴＡＲ及びＣＸＣＲ２の良好な共発現レベルを有することを確認する。
次に、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞を、それぞれ、（１：５）効果対標的比においてＨｕｈ－７と共に共培養した。標的細胞上の３つのＴ細胞の殺細胞レベルを、２４時間後に検出した。結果は、図５Ｃに示される。結果は、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）が、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＧＰＣ３ ＣＡＲ－Ｔより高い殺細胞活性を有することを示した。
次いで、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞の走化性運動を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌによって検出した。１Ｅ５ ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）を含む２００μＬの完全培地を、Ｔｒａｎｗｅｌｌの上部チャンバーに加え、６００μＬの培地を下部チャンバーに加え、そこに、示された勾配濃度のＣＸＣＲ２リガンドケモカインを加え；別の下層を、肝臓がん腫瘍細胞株Ｈｕｈ－７の培養上清グループとして設定し、並びに培養培地のみをコントロールとして使用した。指定された時間においてインキュベートした後、フローサイトメーターにおいて、下層に移動する細胞の数を検出するために下層の培養培地を収集し、移動細胞の割合を計算した。結果は図６に示される。ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）の移動能は、ケモカインの濃度及び時間と正に相関し；ＧＰＣ３－ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、基礎的に、低い移動能を維持した。
２．ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）と比較して、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は改良されたインビボでの腫瘍方向性移動能を有する
実験プロトコルは図７Ａに示される。ＮＳＧマウスに、ＨｕＨ－７腫瘍細胞を皮下接種させ、腫瘍形成後６日目に、Ｍｏｃｋ Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞を尾静脈により再注入した。次いで、腫瘍形成後９日目及び１４日目に、腫瘍組織を、それぞれ収集し、腫瘍浸潤Ｔ細胞の数及び割合を検出した。
実験プロトコルは図７Ａに示される。ＮＳＧマウスに、ＨｕＨ－７腫瘍細胞を皮下接種させ、腫瘍形成後６日目に、Ｍｏｃｋ Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞を尾静脈により再注入した。次いで、腫瘍形成後９日目及び１４日目に、腫瘍組織を、それぞれ収集し、腫瘍浸潤Ｔ細胞の数及び割合を検出した。
図７Ｂは、Ｍｏｃｋ Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞再注入グループの腫瘍組織重量の比較を示している。Ｔ細胞の再注入後３日目及び８日目に、腫瘍を有するマウスを安楽死させ、腫瘍組織を取り出して秤量し、記録した。結果は、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）が腫瘍を効率的に除去することができ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）と比較して、腫瘍致死速度が速いことを示している。
図７Ｃは、腫瘍組織における浸潤Ｔ細胞の比較を示している。秤量した腫瘍組織をすりつぶして単個細胞浮遊液にし、抗体染色の後に、腫瘍細胞中のＴ細胞の数を、フローサイトメーターで検出した。図７Ｄは、フローサイトメトリーによって検出された腫瘍組織における浸潤ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合（左側パネル）及び定量的統計解析（右側パネル）を示す。結果は、Ｔ細胞の再注入後の３日間、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞がより高い腫瘍浸潤の数及び割合を示したことを示している。
３．ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）の抗腫瘍活性はＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）の抗腫瘍活性より強い
この実験では、ルシフェリン基質で触媒されたルミネセンスによって腫瘍成長を検出した。ルシフェラーゼを安定して発現するＨｕＨ－７細胞株を、ＮＳＧマウスに皮下注射し、腫瘍形成の７日後に、Ｍｏｃｋ Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）を、尾静脈により再注入し、その後に、ルシフェリン基質で触媒されたルミネセンスによって腫瘍成長を定期的に検出した。蛍光値によって反映される腫瘍サイズの統計は、図８の右側パネルに示される。結果は、より低い再注入用量において、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞を再注入されたマウスは、基本的に、無腫瘍を達成することができた。ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）と比較して、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、より速くより強い腫瘍致死効率を有した。
この実験では、ルシフェリン基質で触媒されたルミネセンスによって腫瘍成長を検出した。ルシフェラーゼを安定して発現するＨｕＨ－７細胞株を、ＮＳＧマウスに皮下注射し、腫瘍形成の７日後に、Ｍｏｃｋ Ｔ、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）、及びＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）を、尾静脈により再注入し、その後に、ルシフェリン基質で触媒されたルミネセンスによって腫瘍成長を定期的に検出した。蛍光値によって反映される腫瘍サイズの統計は、図８の右側パネルに示される。結果は、より低い再注入用量において、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）細胞を再注入されたマウスは、基本的に、無腫瘍を達成することができた。ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）と比較して、ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ－ａＯＸ４０－ＣＸＣＲ２－Ｔ（Ｃｙｓ－ＴＭ）は、より速くより強い腫瘍致死効率を有した。
配列表：
配列番号1 ヒトT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号2 マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号3 システイン置換及び疎水性領域の改変を含むマウスT細胞受容体α鎖定常領域(TRAC-Cys-TM)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号4 N末端改変、システイン置換、及び膜貫通疎水性領域の改変を含むマウスT細胞受容体α鎖定常領域(TRAC-Nrec-Cys-TM)
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号5 ヒトT細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号6 マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号7 システイン置換を含むマウスT細胞受容体β鎖定常領域(TRBC-Cys-TM)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号8 N末端改変及びシステイン置換を含むマウスT細胞受容体β鎖定常領域(TRBC-Nrecc-Cys-TM)
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号9 抗GPC3 GC33VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号10 抗GPC3GC33 VL L
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号11 OX40エンドドメイン
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号12 CXCR2アミノ酸配列
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号13 GPC3STAR-CXCR2(TRAC-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号14 GPC3STAR-CXCR2(TRBC-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号15 GPC3STAR-OX40-CXCR2 (TRAC-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号16 GPC3STAR-OX40-CXCR2(TCRbC-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号17 GPC3STAR-CXCR2(TRAC-Nrec-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号18 GPC3STAR-CXCR2(TRBC- Nrec-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号19 GPC3STAR-OX40-CXCR2 (TRAC- Nrec-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号20 GPC3STAR-OX40-CXCR2(TRBC- Nrec-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号21 GPC3CAR-CXCR2
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSSRSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号22 重鎖可変領域CDR1アミノ酸配列
GYTFTDYE
配列番号23 重鎖可変領域CDR2アミノ酸配列
LDPKTGDT
配列番号24 重鎖可変領域CDR3アミノ酸配列
TR
配列番号25 軽鎖可変領域CDR1アミノ酸配列
QSLVHSNRNTY
配列番号26 軽鎖可変領域CDR2アミノ酸配列
KVS
配列番号27 軽鎖可変領域CDR3アミノ酸配列
SQNTHVP
配列番号28 エンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号29 システイン置換及び疎水性改変を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号30 N末端改変、システイン置換、及び膜貫通疎水性領域の改変を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号31 エンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号32 システイン置換を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号33 N末端改変及びシステイン置換を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号34 (G4S)3リンカー
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号1 ヒトT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号2 マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号3 システイン置換及び疎水性領域の改変を含むマウスT細胞受容体α鎖定常領域(TRAC-Cys-TM)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号4 N末端改変、システイン置換、及び膜貫通疎水性領域の改変を含むマウスT細胞受容体α鎖定常領域(TRAC-Nrec-Cys-TM)
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号5 ヒトT細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号6 マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号7 システイン置換を含むマウスT細胞受容体β鎖定常領域(TRBC-Cys-TM)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号8 N末端改変及びシステイン置換を含むマウスT細胞受容体β鎖定常領域(TRBC-Nrecc-Cys-TM)
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号9 抗GPC3 GC33VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号10 抗GPC3GC33 VL L
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号11 OX40エンドドメイン
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号12 CXCR2アミノ酸配列
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号13 GPC3STAR-CXCR2(TRAC-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号14 GPC3STAR-CXCR2(TRBC-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号15 GPC3STAR-OX40-CXCR2 (TRAC-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号16 GPC3STAR-OX40-CXCR2(TCRbC-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号17 GPC3STAR-CXCR2(TRAC-Nrec-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号18 GPC3STAR-CXCR2(TRBC- Nrec-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号19 GPC3STAR-OX40-CXCR2 (TRAC- Nrec-Cys-TM)α鎖
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号20 GPC3STAR-OX40-CXCR2(TRBC- Nrec-Cys-TM)β鎖
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号21 GPC3CAR-CXCR2
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSSRSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号22 重鎖可変領域CDR1アミノ酸配列
GYTFTDYE
配列番号23 重鎖可変領域CDR2アミノ酸配列
LDPKTGDT
配列番号24 重鎖可変領域CDR3アミノ酸配列
TR
配列番号25 軽鎖可変領域CDR1アミノ酸配列
QSLVHSNRNTY
配列番号26 軽鎖可変領域CDR2アミノ酸配列
KVS
配列番号27 軽鎖可変領域CDR3アミノ酸配列
SQNTHVP
配列番号28 エンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号29 システイン置換及び疎水性改変を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号30 N末端改変、システイン置換、及び膜貫通疎水性領域の改変を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体α鎖定常領域
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
配列番号31 エンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号32 システイン置換を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号33 N末端改変及びシステイン置換を伴うエンドドメイン欠失マウスT細胞受容体β鎖定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
配列番号34 (G4S)3リンカー
GGGGSGGGGSGGGGS
Claims (35)
- ＣＸＣＲ２と、ＧＰＣ３に対する合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）とを共発現する単離された治療用Ｔ細胞であって、
ＧＰＣ３に対する前記ＳＴＡＲが、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域を含み、かつ、
ＧＰＣ３に対する前記ＳＴＡＲが、第１の定常領域を含むα鎖及び第２の定常領域を含むβ鎖を含む、
単離された治療用Ｔ細胞。 - ｉ）前記α鎖が、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、前記β鎖が、第２の定常領域を含む；
ｉｉ）前記α鎖が、第１の定常領域を含み、前記β鎖が、ＧＰＣ３に対する抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む；或いは、
ｉｉｉ）前記α鎖が、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、前記β鎖が、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含む、
請求項１に記載の単離された治療用Ｔ細胞。 - 前記第１の定常領域が、天然ＴＣＲα鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲα鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲα鎖定常領域である、請求項１又は２に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記第１の定常領域が、改変されたＴＣＲα鎖定常領域である、請求項１又は２に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、が、システインＣへと変異されている、請求項４に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、がイソロイシンＩへと変異されており、かつ、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、が、バリンＶへと変異されている、請求項４又は５に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、が、Ｄで置換されており、かつ、位置１３のアミノ酸Ｋが、Ｒで置換されており、かつ、位置１５～１８のアミノ酸が欠失されている、請求項４～６のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、が、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、が、イソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、が、バリンＶへと変異されている、請求項４～７のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、が、Ｄで置換されており、位置１３のアミノ酸Ｋが、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸が欠失しており、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴなど、が、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、ロイシン酸Ｌへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、が、イソロイシンＩへと変異されており、かつ、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、が、バリンＶへと変異されている、請求項４～８のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来し、かつ、定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸が欠失されている、請求項４～９のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、配列番号３～４及び２８～３０のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記第２の定常領域が、天然ＴＣＲβ鎖定常領域、例えば、天然ヒトＴＣＲβ鎖定常領域又は天然マウスＴＣＲβ鎖定常領域である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記第２の定常領域が、改変されたＴＣＲβ鎖定常領域である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、かつ、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、システインＣへと変異されている、請求項１３に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、が、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、が、Ｆで置換されており、位置９のアミノ酸Ｋが、Ｅで置換されており、位置１１のＳが、Ａで置換されており、位置１２のＬが、Ｖで置換されており、かつ、位置１７及び２１～２５のアミノ酸が欠失されている、請求項１３又は１４に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、が、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、が、Ｆで置換されており、位置９のＫが、Ｅで置換されており、位置１１のＳが、Ａで置換されており、位置１２のＬが、Ｖで置換されており、かつ、位置１７及び２１～２５のアミノ酸が欠失されている、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、前記マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来し、かつ、前記定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸は欠失されている、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、配列番号７～８及び３１～３３のうちの１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- ｉ）ＧＰＣ３に対する前記抗原結合性領域が、前記標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域及び前記抗体の軽鎖可変領域を含み、例えば、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、リンカーによって連結されており；
ｉｉ）前記第１の抗原結合性領域が、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、かつ、前記第２の抗原結合性領域が、前記抗体の軽鎖可変領域を含み；又は、
ｉｉｉ）前記第１の抗原結合性領域が、標的抗原ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、かつ、前記第２の抗原結合性領域が、前記抗体の重鎖可変領域を含む、
請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。 - 前記重鎖可変領域が、配列番号２２において示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２３において示されるＶＨ ＣＤＲ２、及び配列番号２４において示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２５において示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２６において示されるＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号２７において示されるＶＬ ＣＤＲ３を含むか、或いは、
前記重鎖可変領域が、配列番号９において示されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が、配列番号１０において示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１９に記載の単離された治療用Ｔ細胞。 - 前記α鎖及び／又はβ鎖が、そのＣ末端に連結された少なくとも１つの外因性細胞内機能的ドメインを有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記外因性細胞内機能的ドメインが、前記α鎖及び／又はβ鎖の前記定常領域の前記Ｃ末端に直接的に又はリンカーを介して連結され、
好ましくは、前記外因性細胞内機能的ドメインが、リンカーを介して、エンドドメインを欠失した前記α鎖及び／又はβ鎖の前記定常領域の前記Ｃ末端に連結され、
好ましくは、前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーであり、式中、ｎは、１～１０の整数を表し、好ましくは、ｎは３である、
請求項２１に記載の単離された治療用Ｔ細胞。 - 前記外因性細胞内機能的ドメインが、共刺激性分子のエンドドメイン、好ましくは、ＯＸ４０のエンドドメインであり、例えば、ＯＸ４０の前記エンドドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記α鎖が、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、ＧＰＣ３に対する前記第１の抗原結合性領域が、配列番号９において示される前記重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；前記第１の定常領域が、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴが、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、が、イソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、が、バリンＶへと変異されており；任意選択により、前記α鎖が、前記定常領域の前記Ｃ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメインを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記α鎖が、ＧＰＣ３に対する第１の抗原結合性領域及び第１の定常領域を含み、ＧＰＣ３に対する前記第１の抗原結合性領域が、配列番号９において示される前記重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；前記第１の定常領域が、マウスＴＣＲα鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲα鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置６のアミノ酸、例えば、Ｅなど、が、Ｄで置換されており、位置１３のＫが、Ｒで置換されており、位置１５～１８のアミノ酸が欠失しており、位置４８のアミノ酸、例えば、トレオニンＴが、システインＣへと変異されており、位置１１２のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、ロイシンＬへと変異されており、位置１１４のアミノ酸、例えば、メチオニンＭなど、が、イソロイシンＩへと変異されており、位置１１５のアミノ酸、例えば、グリシンＧなど、が、バリンＶへと変異されており；任意選択により、前記α鎖が、前記定常領域の前記Ｃ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメインを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲα鎖定常領域が、前記定常領域の前記エンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲα鎖定常領域と比較して、位置１３６～１３７のアミノ酸が欠失されている、請求項２４又は２５に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記α鎖が、配列番号１３、１５、１７、又は１９において示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記β鎖が、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、ＧＰＣ３に対する前記第２の抗原結合性領域が、配列番号１０において示される前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；前記第２の定常領域が、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、システインＣへと変異されており；任意選択により、前記β鎖が、前記定常領域の前記Ｃ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメインを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記β鎖が、ＧＰＣ３に対する第２の抗原結合性領域及び第２の定常領域を含み、ＧＰＣ３に対する前記第２の抗原結合性領域が、配列番号１０において示される前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み；前記第２の定常領域が、マウスＴＣＲβ鎖定常領域に由来する改変されたＴＣＲβ鎖定常領域であり、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置５６のアミノ酸、例えば、セリンＳなど、が、システインＣへと変異されており、位置３のアミノ酸、例えば、Ｒなど、が、Ｋで置換されており、位置６のアミノ酸、例えば、Ｔなど、が、Ｆで置換されており、位置９のＫが、Ｅで置換されており、位置１１のＳが、Ａで置換されており、位置１２のＬが、Ｖで置換されており、かつ、位置１７及び２１～２５のアミノ酸が欠失されており；任意選択により、前記β鎖が、前記定常領域の前記Ｃ末端に連結されたＯＸ４０のエンドドメインを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記改変されたＴＣＲβ鎖定常領域が、前記定常領域のエンドドメインを欠いており、例えば、野生型マウスＴＣＲβ鎖定常領域と比較して、位置１６７～１７２のアミノ酸が欠失されている、請求項２８又は２９に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記β鎖が、配列番号１４、１６、１８、又は２０において示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 前記ＳＴＡＲが、配列番号１３において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含むか；又は、前記ＳＴＡＲが、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１６において記載されるβ鎖を含むか；又は、前記ＳＴＡＲが、配列番号１７において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含むか；又は、前記ＳＴＡＲが、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号２０において記載されるβ鎖を含むか；又は、前記ＳＴＡＲが、配列番号１５において記載されるα鎖及び配列番号１４において記載されるβ鎖を含むか；又は、前記ＳＴＡＲが、配列番号１９において記載されるα鎖及び配列番号１８において記載されるβ鎖を含む、請求項１に記載の単離された治療用Ｔ細胞。
- 請求項１～３２のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞と薬学的に許容できるキャリアとを含む医薬組成物。
- 対象におけるがんなどの疾患の治療のための医薬品の調製における、請求項１～３２のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞又は請求項３３に記載の医薬組成物の使用。
- 前記疾患が、ＧＰＣ３関連疾患、例えば、肝臓がん、例えば、肝細胞癌など、肺がん、例えば、肺扁平上皮癌（ＳｑＣＣ）など、胃癌、卵巣がん、黒色腫、又は小児胚芽腫である、請求項３４に記載の使用。
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