CN110627909B - 一种特异性活化nk细胞的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是一种针对NK细胞信号转导特点特异性优化的嵌合抗原受体及其用途，所述的嵌合抗原受体scFv由轻链和重链可变区构成，通过CD8铰链结构连接在NKp44跨膜区上，胞内段活化信号转导结构域由CD3ζITAM基序、2B4活化基序、DNAM1活化基序与DAP10活化基序串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰自然杀伤(NK)细胞，修饰后的NK细胞(CAR‑NK)能用于肿瘤特异性抗原阳性的肿瘤治疗。在杀伤试验中，该结构相较于经典的第三代T‑CAR结构明显加强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在体内模型中展现出良好的抗肿瘤活性。

Description

一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，是一种根据NK细胞活化信号转导机制改良而来的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
自宾夕法尼亚大学Carl June教授发明CAR-T细胞疗法后(CTL-019)，国际上已有多家生物技术公司开展了对CAR-T的进一步探索。最早进行CAR-T细胞治疗开发的三巨头为诺华、KitePharma以及JunoTherapeutics，最初对CAR-T的研究多集中于血液相关肿瘤。随着研究进一步深入，更多新靶点、新技术、新治疗领域的探索层出不穷，在取得令人振奋的临床试验疗效的同时，安全性也成为困扰CAR-T进步的一大难题：细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，已经病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的广泛应用。2017年初，因治疗患者出现多例脑水肿死亡，Juno不得不终止对其核心品种JTC015的开发。因此寻找高效低毒的CAR载体细胞成为肿瘤免疫中关注的热点问题。
NK细胞是固有免疫系统的重要效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受MHC限制性；成熟NK细胞不分泌IL-6，生理周期短，不引起GVHD反应。NK细胞是固有免疫系统的重要效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受MHC限制性；成熟NK细胞不分泌IL-6，生理周期短，不引起GVHD反应。骨髓移植中的研究表明，血液系统肿瘤可以有效的被同种异体的NK细胞识别和杀伤，可显著增加的疾病控制、降低复发率。
尽管如此许多肿瘤细胞常通过表达非经典HLA I类分子、表达免疫抑制性配体、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力，NK过继性治疗的临床表现不佳。所以在NK细胞中引入CAR修饰，引导NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤成为改进NK过继性治疗的重要策略。这新疗法有望对传统手术、化疗和放疗无效的患者提供全新的治疗方案，为肿瘤患者提供了新的治愈希望。
目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，虽然NK细胞的诸多生物学行为与T细胞类似，但也有其独特的信号转导模式，其中多种激活型受体可以通过多种途径活化NK细胞，且信号之间具有叠加效应。NK细胞活化受体主要包括NCR家族、自然杀伤细胞2家族、共受体家族、杀伤细胞免疫球蛋白样受体家族等。
NK细胞裂解功能激活受体被称之为“自然细胞毒活性受体”(NCR)，其在肿瘤和病变细胞的非MHC限制性细胞毒活性中发挥关键作用。目前已经鉴定了三种NK细胞激活表面受体，包括NKp46、NKp30和NKp44，NCR与特异性抗体相互作用可以显著增强NK细胞的杀伤活性。NCR丰度也决定了NK细胞的杀伤活性
自然杀伤细胞2家族(NKG2family)受体属于C型凝集素样受体超家族，其分子结构均由由C型凝集素样结构域，跨膜结构域和细胞质片段组成；根据NKG2受体的细胞质结构域中是否存在ITAM基序，NKG2受体分类为活化或抑制受体；识别HLA-E后分别通过ITAM或ITIM基序向NK细胞内传递不同信号。该家族成员不仅表达于NK细胞表面，也表达与T细胞。
NK细胞细胞毒活性的激活还有其他重要的分子，如DNAM-1、NKp80、2B4和CRACC等。上述分子属于共受体，共受体无法单独活化NK细胞，它们的活化功能依赖于其他活化型受体，在活化过程放大活化信号，更有效促进NK细胞活化。以白细胞粘附分子DNAM-1为例，具有两个Ig样结构域的胞外部分，胞质部分含有三个酪氨酸残基；DNAM-1交联后，酪氨酸发生磷酸化并激活NK细胞的细胞毒活性。
NK细胞的活化受经典MHC I类分子的调节，杀伤细胞免疫球蛋白样受体是参与这一过程主要的NK细胞表面分子。KIR家族包含激活和抑制性成员：抑制性KIR的特征在于携带两个ITIM的长胞质尾；激活受体缺乏ITIM，并且含有可与携带ITAM基序的衔接分子交联短胞质尾。
这些活化的细胞表面受体能够通过胞浆内免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，或通过跨膜区电荷作用与带有ITAM基序的接头分子相互作用，促进NK细胞的活化。目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，目前针对NK细胞活化信号转导的CAR结构改造尚缺乏研究。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种针对NK细胞信号转导特点特异性优化的嵌合抗原受体结构，在第三代CAR的结构基础上，对嵌合抗原受体的胞内段与跨膜区进行了优化。该CAR在以NK细胞为载体的情况下可以极大程度提高细胞的杀伤活性。
为了实现上述目的，本发明提供一种全新的、以NK细胞活化信号为生物学基础的嵌合抗原受体结构。具体来说是在第三代CAR的结构基础上，对胞内段进行了改良，串联了多个活化结构域，并将CD28跨膜区分别替换为可以与接头蛋白作用的活化受体跨膜区，组合成为最适用于NK的嵌合抗原受体结构。
本发明的第一方面，提供一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体scFv-CD8hinger-NKp44TM-CD3ζ△1-2B4-DNAM1-DAP10，所述的嵌合抗原受体scFv由轻链和重链可变区构成，通过CD8铰链结构连接在NKp44跨膜区上，胞内段活化信号转导结构域由人CD3ζITAM基序、人2B4活化基序、人DNAM1活化基序与人DAP10活化基序串联构成。
进一步的，所述的嵌合抗原受体包含：出膜蛋白信号肽、单链抗体轻链可变区、连接肽、单链抗体重链可变区、人CD8分子铰链区、人NKp44分子跨膜区、人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。
进一步的，所述的出膜蛋白信号肽分子可以使用人胰岛素信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)、人IL-2信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)、人胰蛋白酶原信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的出膜蛋白信号肽为人IL-2信号肽(核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)。
进一步的，单链抗体序列可以根据靶细胞不同选取针对性抗体序列。
在本发明的一个优选实施方式中，单链抗体序列使用了针对GPC3的抗体序列。即，所述的单链抗体轻链可变区为抗GPC3单链抗体轻链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述的单链抗体重链可变区为抗GPC3单链抗体重链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
进一步的，单链抗体轻链可变区序列与单链抗体重链可变区序列之间通过柔性肽段连接，即所述的连接肽，肽段序列为(G4S)n，根据抗体的生物活性差异，n的范围为1～4。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的连接肽的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
进一步的，所述的人CD8分子铰链区对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14所示。
进一步的，跨膜区可以使用经典的CD8跨膜区(对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示)，也可以使用NKp44、NKG2D、NKp30、CD16等跨膜区序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的跨膜区为人NKp44分子跨膜区，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。
进一步的，所述的胞内段活化信号转导结构域串联了人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。
所述的人CD3ζITAM序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20所示。
所述的人2B4胞内段活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.21和SEQID No.22所示。
所述的人DNAM1胞内段活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示。
所述的人DAP10YxxM活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.25和SEQID No.26所示。
进一步的，将上述的特异性活化NK细胞的核酸片段进行优化组合，构成特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体序列CAROpti，其氨基酸序列如SEQ ID No.27所示。
本发明的第二方面，提供一种慢病毒载体，其包含如上所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体。
本发明的第三方面，提供一种自然杀伤细胞(NK细胞)，其包含如上所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，或慢病毒载体。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体在制备治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。
本发明的第五方面，提供一种如上所述的慢病毒载体在制备治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。
本发明的第六方面，提供一种如上所述的自然杀伤细胞在制备治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。
进一步的，所述的肿瘤以GPC3阳性的肝细胞肝癌为代表，也可为GPC3阳性的卵巢卵黄囊瘤、黑色素瘤、尿路上皮癌、肝母细胞瘤和肺鳞状细胞癌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Anti-GPC3CAROpti-NK相较于传统的T-CAR可以有效体外杀伤GPC3阳性的肝细胞肝癌细胞系HepG2。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Anti-GPC3CAROpti-NK在杀伤靶细胞后，相较于传统的T-CAR-NK，载体细胞本身活化程度更高。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Anti-GPC3CAROpti-NK在杀伤靶细胞后，相较于传统的T-CAR-NK，载体细胞本身分泌了更多的IFN-γ。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Anti-GPC3CAROpti-NK回输肝脏原位成瘤小鼠可以显著抑制HepG2移植瘤生长、并在一个月内致肿瘤完全缓解。
在本发明的一个具体实施方式中，所述Anti-GPC3CAROpti-NK回输肝脏原位成瘤小鼠可以显著抑制Hep3B移植瘤生长、并在一个月内致肿瘤完全缓解。
本发明还提供了上述Anti-GPC3CAR Opti-NK的制备方法，具体如下：
①合成CAROpti序列，将其克隆至慢病毒载体；
②包装并扩增慢病毒；
③将上述慢病毒按MOI＝1～50侵染NK-92细胞，分单克隆得到CAROpti细胞。
本文中出现的英文名称不区分大小写；Anti-GPC3CAR-NK与GPC3CAR-NK表示的含义相同，表示以GPC3为靶点的、嵌合抗原受体修饰的NK细胞的统称；Anti-GPC3CAROpti-NK与GPC3CAROpti-NK含义相同，均属于Anti-GPC3CAR-NK的一个特定类型，其中Anti-GPC3表示嵌合抗原受体以GPC3为靶点，CAROpti特指本发明中优化过的嵌合抗原受体结构，Anti-GPC3CAROpti-NK则表示以GPC3位靶点的、优化过的嵌合抗原受体所修饰的NK细胞；NK-92、NK92均表示NK92细胞细胞系。
本发明所述NK细胞可以为人正常NK细胞、脐带血来源NK细胞、ES或iPS诱导分化来源的NK细胞或NK细胞系。NK细胞系包括NK-92、YT、NKL、SNK6和IMC-1等。本发明具体实施案例均以NK-92细胞系为例。
本发明优点在于：
本发明公开了一种针对NK细胞信号转导特点特异性优化的嵌合抗原受体结构scFv-CD8hinger-NKp44TM-CD3ζ△1-2B4-DNAM1-DAP10及其用途，所述的嵌合抗原受体scFv由轻链和重链可变区构成，通过CD8铰链结构连接在NKp44跨膜区上，胞内段活化信号转导结构域由CD3ζITAM基序、2B4活化基序、DNAM1活化基序与DAP10活化基序串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰自然杀伤(NK)细胞，修饰后的NK细胞(CAR-NK)能用于肿瘤特异性抗原阳性的肿瘤治疗。在杀伤试验中，该结构相较于经典的第三代T-CAR结构明显加强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在体内模型中展现出良好的抗肿瘤活性。
附图说明
图1.(A)FACS检测CAR-NK细胞中嵌合抗原受体的表达情况；(B)FACS检测连续传代的CAR-NK细胞中嵌合抗原受体表达的稳定性。
图2.(A)载体细胞NK-92、T-CAR-NK与CAROpti-NK按效靶比1:1或1:2对靶细胞HepG2的裂解效率；(B)载体细胞NK-92、T-CAR-NK与CAROpti-NK按效靶比1:2杀伤靶细胞HepG2后细胞活化比例；(C)载体细胞NK-92、T-CAR-NK与CAROpti-NK按效靶比1:2杀伤靶细胞HepG2后杀伤上清中IFN-γ的产量。
图3.(A)相关细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测Fyn-PLC信号通路活化；(B)相关细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测Syk-Erk信号通路活化；(C)相关细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测NF-κB信号通路活化。(D)相关细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测PI-3K-Akt信号通路活化。(E)Western-Blot检测CAR的表达与内参表达。
图4.活体成像展示CARopti-NK92及NK-92对HepG2原位种植瘤的抑制效果。
图5.活体成像展示CARopti-NK92及NK-92对Hep3B原位种植瘤的抑制效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：CAR-NK细胞系的构建与稳定性检测
实验方法：
1.CAR慢病毒包装：将嵌合抗原受体序列克隆至慢病毒载体，同包装质粒一同转染Lenti-X-293细胞系，连续培养72小时，收集病毒上清并过滤。20000rpm(82700g)离心2.5小时浓缩病毒，重悬病毒颗粒后对滴度进行定量。
2.CAR-NK细胞系建系：慢病毒按MOI＝1～50侵染NK-92细胞，使用FLAG-APC流式抗体分选CAR阳性细胞；第一次分选后细胞扩大培养后，二次分选。二次分选细胞分单克隆，扩大培养。
3.CAR-NK细胞稳定性检测：CAR-NK细胞在完全培养基中连续培养传代，每7天试用FLAG-APC流式抗体检测建系细胞中CAR的阳性率。
实验结果：
建系后的CAR-NK细胞细胞系分群均一，CAR呈现阳性表达且表达丰度较好(图1A)。在连续8周的培养周期中，建系后的CAR-NK细胞稳定性较好，嵌合抗原受体的阳性率稳定在95％以上(图1B)。
实施例2：CAROpti结构显著提升NK细胞的杀伤活性
实验方法：
细胞杀伤实验：CAR-NK细胞的效靶比(E:T)一般为1:1和1:2。杀伤时间为2hrs。靶细胞为HCC细胞系，均为贴壁细胞，需要制备成单细胞悬液。细胞消化前PBS洗去多余培养基后，加入0.25％胰酶消化2-5min。计数效应细胞：根据效靶比例，效应细胞每管或每孔为4万和8万；取一定量的CAR-NK细胞，离心重悬并计数后，调整浓度为40000cell/250μL或80000cell/250μL。靶细胞使用CSFE(sigma，150347)进行标记，每106个靶细胞中加入50μM的CSFE 10μL，37度避光孵育15min。冰冷PBS洗2次，使用杀伤培养基重悬细胞，调整浓度为80000cell/250μL。效应细胞/靶细胞混合：按效靶比将250μL的CAR-NK细胞与靶细胞充分混匀，在细胞培养箱中杀伤2hrs。两小时之后，5000rpm离心5min，100μL PBS重悬细胞，加入5μL 7-AAD(eBioscience，00-6993-50)，室温避光孵育15min，用冰冷的PBS洗涤一遍后，FACS检测消亡细胞比例、NK细胞活化情况(CD107a％)和杀伤上清中的IFN-γ产量。
实验结果：
结果表明两种CAR-NK细胞皆可对靶细胞HepG2发挥特异性杀伤效果，但相较于传统的T-CAR结构，CAROpit结构可以显著提高载体细胞的杀伤活性(图2A)。检测杀伤细胞的中CD107a阳性细胞的比例，结果表明CAROpti的结构相比如T-AR结构对NK细胞的活化能力更强(图2B)，且杀伤上清中IFN-γ的产量显著升高(图2C)。
实施例3：CAROpti结构对NK细胞杀伤相关信号通路活化的研究
实验方法：
Western-blot：取杀伤后的NK细胞5×106，3000rpm，离心5分钟，转移至1.5mL EP管内；向细胞沉淀内加入200μL蛋白抽提试剂(Thermo ScientificPierce，78505)重悬，冰浴30分钟，每5分钟振荡一次；4℃、13000rpm离心20分钟，将上清小心转移至干净EP管内，并使用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific Pierce，A53225)进行蛋白定量。定量后调整各组样品蛋白浓度至一致，向蛋白样品内加入5×上样缓冲液(碧云天，P0015)后混匀，100℃水浴煮沸5分钟，冷却后上样(10～20μL protein/lane)，同时上样蛋白Marker(Invitrogen，26625)；用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质；用转膜系统(Bio-Rad)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；常温下用含5％BSA(BBI，A600903)TBST封闭2小时；TBST洗脱，两次，每次20分钟；GPC3抗体(abcam，ab95363)按1:500稀释，Luciferase抗体(abcam，ab16466)按1:500稀释，β-actin抗体(abcam，ab179467)按1:1000稀释，4℃孵育过夜；TBST洗脱三次，每次15分钟；加入辣根过氧化物酶偶联的第二抗体室温孵育1～2小时；TBST洗脱三次，每次15分钟；将ECL发光检测试剂(Thermo ScientificPierce，32109)中的A液和B液等体积混匀，室温孵育1～5分钟，于成像分析仪上进行检测。
实验结果：
我们进一步对比了T-CAR与CARopti之间对与相关信号活化的差异，包括Fyn-PLC、Syk-ERK、NF-κB和AKT。结果表明在与肝癌细胞HepG2相互作用后，相比于T-CAR，CARopti中激酶Fyn的磷酸化水平显著上调，进而介导了PLC-γ1和PLC-γ2的活化(图3A)；CARopti中Syk磷酸化水平高于T-CAR，介导了更强的Vav和ERK1/2的活化(图3B)；在NF-κB通路中，CARopti显著促进了IKKα/β的活化，进而激活IκB，从而促进了p65的磷酸化(图3C)；ATK途径中CARopti轻度促进了PI-3K p85亚基的活化，进而介导了ATK的活化增强(图3D)；内参使用β-actin，使用anti-FLAG抗体检测CAR的表达(图3E)。
实施例4：CAROpti-NK细胞对HepG2体内原位肿瘤杀伤效果
实验方法：
1.Lucferase稳转HepG2构建：Liberase慢病毒MOI＝20，polybrene终浓度为2μg/mL侵染细胞后扩大培养，流式分选GFP阳性细胞，扩增后进行二次分选。待细胞扩增后分单克隆建系。
2.活体成像检测肿瘤生长情况：处于对数生长期的荧光素酶基因标记的HCC细胞株消化并用HBSS制备成5×107cell/mL细胞悬液，NOD/SCID小鼠麻醉后于剑突下横向开腹1cm左右，左右挤压腹腔暴露部分肝脏，用1ml胰岛素注射针取准备好的细胞100μL注射于肝脏内，抽针同时助手使用VetbondTissue Adhesive(3M，1469SB)一滴快速封闭针孔，防止出血与肿瘤细胞流出形成腹腔种植。用生理盐水湿润的棉棒将肝脏轻柔推回腹腔，使用Vetbond粘合伤口。肿瘤在肝内生长情况使用活体成像检测，成像将小鼠放入麻醉箱中使用异氟烷麻醉10min，腹腔注射4mg Luciferase底物D-Luciferin钾盐(Yeasen，40902ES03)，底物注射10分钟后进行荧光活体成像检测。
实验结果：
结果表明单纯的NK-92回输有一定的肿瘤控制作用，小鼠在第一个治疗周期内肿瘤大小无显著变化；但在第二个治疗周期中肿瘤开始逐步生长，但与未治疗组相比进展较慢。CARopti-NK抑瘤效果明显，第一个治疗周期肿瘤显著缩小；第二个治疗周期后肝内肿瘤被全部清除(图4)。
实施例5：CAR-NK细胞对Hep3B体内原位肿瘤杀伤效果
实验方法：
1.Lucferase稳转Hep3B构建：Liberase慢病毒MOI＝20，polybrene终浓度为2μg/mL侵染细胞后扩大培养，流式分选GFP阳性细胞，扩增后进行二次分选。待细胞扩增后分单克隆建系。
2.活体成像检测肿瘤生长情况：处于对数生长期的荧光素酶基因标记的HCC细胞株消化并用HBSS制备成5×107cell/mL细胞悬液，NOD/SCID小鼠麻醉后于剑突下横向开腹1cm左右，左右挤压腹腔暴露部分肝脏，用1ml胰岛素注射针取准备好的细胞100μL注射于肝脏内，抽针同时助手使用VetbondTissue Adhesive(3M，1469SB)一滴快速封闭针孔，防止出血与肿瘤细胞流出形成腹腔种植。用生理盐水湿润的棉棒将肝脏轻柔推回腹腔，使用Vetbond粘合伤口。肿瘤在肝内生长情况使用活体成像检测，成像将小鼠放入麻醉箱中使用异氟烷麻醉10min，腹腔注射4mg Luciferase底物D-Luciferin钾盐(Yeasen，40902ES03)，底物注射10分钟后进行荧光活体成像检测。
实验结果：
结果表明单纯的NK-92回输有一定的肿瘤控制作用，小鼠在第一个治疗周期内肿瘤大小无显著变化；但在第二个治疗周期中肿瘤开始逐步生长，但与未治疗组相比进展较慢。CARopti-NK抑瘤效果明显，第一个治疗周期肿瘤显著缩小；第二个治疗周期后肝内肿瘤被全部清除(图5)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体及其应用
<130> /
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atggccctgt ggatgcgcct gctgcccctg ctggccctgc tggccctgtg gggccccgac 60
cccgccgccg cc 72
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala
20
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atgtaccgca tgcagctgct gagctgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc 60
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atgaacctgc tgctgatcct gaccttcgtg gccgccgccg tggcc 45
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgcc gcagcagcca gagcctggtg cacagcaacg ccaacaccta cctgcactgg 120
tacctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acaaggtgag caaccgcttc 180
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaacac ccacgtgccc 300
cccaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc ctggacccca agaccggcga caccgcctac 180
agccagaagt tcaagggccg cgtgaccctg accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcac ccgcttctac 300
agctacacct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 14
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
ctggtgcccg tgttctgcgg cctgctggtg gccaagagcc tggtgctgag cgccctgctg 60
gtg 63
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Val
20
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
cgcgtgaagt tcagccgcag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120
cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240
cgccgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgc 336
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
tggcgccgca agcgcaagga gaagcagagc gagaccagcc ccaaggagtt cctgaccatc 60
tacgaggacg tgaaggacct gaagacccgc cgcaaccacg agcaggagca gaccttcccc 120
ggcggcggca gcaccatcta cagcatgatc cagagccaga gcagcgcccc caccagccag 180
gagcccgcct acaccctgta cagcctgatc cagcccagcc gcaagagcgg cagccgcaag 240
cgcaaccaca gccccagctt caacagcacc atctacgagg tgatcggcaa gagccagccc 300
aaggcccaga accccgcccg cctgagccgc aaggagctgg agaacttcga cgtgtacagc 360
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
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Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
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<210> 23
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 23
aaccgccgcc gccgccgcga gcgccgcgac ctgttcaccg agagctggga cacccagaag 60
gcccccaaca actaccgcag ccccatcagc accagccagc ccaccaacca gagcatggac 120
gacacccgcg aggacatcta cgtgaactac cccaccttca gccgccgccc caagacccgc 180
gtg 183
<210> 24
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 24
Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp
1 5 10 15
Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val
35 40 45
Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
50 55 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 25
ctgtgcgccc gcccccgccg cagccccgcc caggaggacg gcaaggtgta catcaacatg 60
cccggccgcg gc 72
<210> 26
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 26
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 27
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 27
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys Asp Val Val Met Thr
20 25 30
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile
35 40 45
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr
50 55 60
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
100 105 110
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro
115 120 125
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
145 150 155 160
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
165 170 175
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys
195 200 205
Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu
210 215 220
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
225 230 235 240
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr
245 250 255
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Leu Val Pro Val Phe Cys
305 310 315 320
Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu Ser Ala Leu Leu Val Arg
325 330 335
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
340 345 350
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
355 360 365
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
370 375 380
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
385 390 395 400
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
405 410 415
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
420 425 430
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Trp
435 440 445
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
450 455 460
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
465 470 475 480
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
485 490 495
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
500 505 510
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
515 520 525
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
530 535 540
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
545 550 555 560
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg
565 570 575
Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr
580 585 590
Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp
595 600 605
Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro
610 615 620
Lys Thr Arg Val Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu
625 630 635 640
Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
645 650

Claims (10)

1.一种特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，由以下结构组成：出膜蛋白信号肽、单链抗体轻链可变区、连接肽、单链抗体重链可变区、人CD8分子铰链区、人NKp44分子跨膜区、人CD3ζITAM序列、人2B4胞内段活化序列、人DNAM1胞内段活化序列和人DAP10YxxM活化序列。
2.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的出膜蛋白信号肽选自人胰岛素信号肽、人IL-2信号肽、人胰蛋白酶原信号肽。
3.根据权利要求2所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的出膜蛋白信号肽为人IL-2信号肽，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的单链抗体轻链可变区为抗GPC3单链抗体轻链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；所述的单链抗体重链可变区为抗GPC3单链抗体重链可变区，对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；所述的单链抗体轻链可变区序列与单链抗体重链可变区序列之间通过柔性肽段连接，即所述的连接肽，肽段序列为(G4S)n，n的范围为1～4。
5.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的人CD8分子铰链区对应的核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示。
6.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的人NKp44分子跨膜区，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。
7.根据权利要求1所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的人CD3ζITAM序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；所述的人2B4胞内段活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；所述的人DNAM1胞内段活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24所示；所述的人DAP10YxxM活化序列，其核苷酸与氨基酸序列分别如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示。
8.一种慢病毒载体，其包含编码如权利要求1-7任一所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体的核苷酸。
9.一种自然杀伤细胞，其包含如权利要求1-7任一所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体，或权利要求8所述的慢病毒载体。
10.如权利要求1-7任一所述的特异性活化NK细胞的嵌合抗原受体、如权利要求8所述的慢病毒载体、或如权利要求9所述的自然杀伤细胞在制备治疗肝脏肿瘤的药物或制剂中的应用。
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