CN110330567A

CN110330567A - 双特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110330567A
Application number: CN201910588127.2A
Authority: CN
Inventors: 代红久; 李艳云
Original assignee: Nanjing Kaidi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Kaidi Medical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110330567B

Abstract

本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体T细胞，其制备方法和应用。本发明基于人NKG2D和人SIRPα分子构建的双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体以及其修饰的免疫应答细胞，该新型的修饰的免疫应答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤细胞，尤其是表达NKG2DL和CD47的阳性肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂。本发明的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞制备方法步骤简单，获得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤率高。

Description

双特异性嵌合抗原受体T细胞，其制备方法和应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药技术领域，涉及特异性嵌合抗原受体T细胞，具体地，涉及一种双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的、包含人NKG2D和人SIRPα蛋白或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)，其修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫检验点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，嵌合抗原受体修饰的免疫细胞(特别是ChimericAntigen Receptor T-Cell,CAR-T)疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。相对于常规免疫细胞，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性都更高，并且可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。该以CAR-T细胞为代表的修饰免疫细胞疗法在白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

然而，90％的癌症是实体瘤，更多种类的实体瘤以及更多的肿瘤表面特异性靶点抗原有待进一步确认。CAR-T免疫疗法应用于实体瘤治疗的最大难点在于CAR-T细胞对于肿瘤细胞上抗原表达的特异性要求非常高，容易造成T细胞持续激活而杀伤正常细胞，或释放大量细胞因子引起严重毒副作用，但肿瘤特异的靶向抗原可选择性并不多，并且，肿瘤表达的大多数抗原不具备肿瘤特异，以肿瘤相关抗原作为靶点的CAR-T免疫疗法存在“脱靶”等问题。研究更广谱、高效、安全的CAR-T免疫治疗方法是时急需解决的问题。

发挥嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞技术应用的关键在于确定至少一种肿瘤相关的抗原，这种抗原在肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞表面无表达或低表达。近年来，NKG2DL蛋白和CD47蛋白成为备受关注的两个实体瘤标志性靶标。

NKG2DL蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的表达，NKG2D-NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，NKG2D通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。NKG2DL的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，激活NKG2DL蛋白-NKG2D配体系统为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，为相关新疗法和药物的开发提供了启示。

此外人体有两个不同的免疫系统，一个是以T细胞为代表的获得性免疫系统，另一个是以巨噬细胞为代表的先天性免疫系统。巨噬细胞在细胞吞噬、抗原呈递、免疫应答、维持细胞稳态、病原体防御以及抗肿瘤免疫调节等方面发挥重要功能。然而肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤的关系似乎比较复杂：肿瘤组织之外的巨噬细胞可以直接杀伤肿瘤细胞；肿瘤组织中的巨噬细胞可分泌生长因子滋养肿瘤细胞，促进肿瘤的血管生成，导致肿瘤侵袭转移，而在肿瘤组织内部的巨噬细胞越多对肿瘤杀伤效果越差。

巨噬细胞介导的细胞程序化细胞清除以“吃我”信号为基础，是细胞程序性死亡之前清除疾病及受损细胞的一种重要机制。与之相对的是“不要吃我”信号，例如CD47/SIRPα信号。CD47是一种广泛表达于细胞膜表面的免疫球蛋白样蛋白质，又称为整合素相关蛋白(integrin-association protein,IAP)。研究还揭示了巨噬细胞是如何通过“来吃我”信号与“不要吃我”信号识别和吞噬肿瘤细胞的：肿瘤大多表达钙网织蛋白(calreticulin,CRT)，可招募巨噬细胞吞噬和杀死肿瘤细胞，是“吃我”信号的成员。部分肿瘤细胞还同时还表达另一种“不要吃我”信号分子CD47。在循环造血干细胞及白血病细胞中显示CD47表达上调，细胞表面的CD47与巨噬细胞上的受体SIRPα结合抑制正常的吞噬作用，从而逃逸被巨噬细胞吞噬，抵消钙网织蛋白“来吃我”的信号。由此可见，当肿瘤细胞中“不要吃我”信号的代表CD47表达上调时，身处于肿瘤组织中的巨噬细胞会被“蒙蔽双眼”发挥免疫逃逸作用。

近年来，越来越多的研究表明，在体外，利用抗体阻断CD47与SIRPα结合，可促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，并诱导肿瘤细胞凋亡。在体内，利用抗体阻断CD47可抑制肿瘤生长，已经在多个小鼠模型中取得显著成效。尽管目前仍并不完全清楚潜在的分子机制，因此，利用CD47靶标在众多肿瘤细胞表面高表达特性以及它与SIRPα配体的结合能力，促使CD47逐渐成为肿瘤治疗的新靶点，在肿瘤细胞表面表达CD47与T细胞表面表达的SIRPα的高度特异性结合系统能在攻克恶性肿瘤的治疗过程中提供全新的手段。

综上所述，我们构建了基于NKG2D-NKG2DL系统的激活性靶标NKG2D和基于CD47-SIRPα结合活性的双特异性嵌合抗原受体修饰的新型高特异性杀伤力的免疫应答细胞用于肿瘤的治疗。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明的目的是为了克服现有肿瘤临床技术中面临的肿瘤微环境中T细胞结合并杀死肿瘤细胞的靶向特异性不强，杀伤效率低的问题，提供靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体、靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体或其功能性变体、及其编码核苷酸序列和其表达载体、工程化的靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其应用。本发明的工程化的靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能够地提高肿瘤细胞的特异性杀伤效率，避免脱靶带来的治疗毒性安全问题，从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。

第一方面，本申请提供了一种双特异性靶向结合多肽结构域T或其功能性变体，其包含第一靶向结合氨基酸序列T1和第二靶向结合氨基酸序列T2，或为由羧基端的第一靶向结合氨基酸序列T1和氨基端的第二靶向结合氨基酸序列T2通过氨基酸连接而成的-T1-T2-结构，

其中，所述第一靶向结合氨基酸序列T1为靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域，所述第二靶向结合氨基酸序列T2为靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域，或所述第一靶向结合氨基酸序列T1为靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域，所述第二靶向结合氨基酸序列T2为靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域，其中各“-”独立地为连接肽或肽键；

其中，所述连接氨基酸序列为式(GGGGS)n或(EAAAK)n表示的结构，1≤n<10，优选3≤n<8。

根据已有研究，靶向结合人NKG2DL的肽的是基于配体人NKG2D蛋白的氨基酸序列，靶向结合人CD47的肽是基于配体人SIRPα蛋白的氨基酸序列。

根据已有研究，如果以NKG2D或SIRPα的全长氨基酸序列来构建CAR，效果较差，首先NKG2D胞内区等功能域是自然杀伤细胞属性的，与T细胞并不一定兼容，SIRPα存在多个抗原结合部分，如没有准确筛选和CD47有效结合的结构域，所构建CAR功能效果比较差。于是发明人基于NKG2D和SIRPα的全长氨基酸序列，通过蛋白序列分析和功能结构域优化预测工具等手段来筛选分析了靶标人NKG2DL/CD47靶标和NKG2D/SIRPα片段，进一步设计构建包含改进的NKG2D和SIRPα的双靶向人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor,CAR)分子的氨基酸序列；其中如何选择适宜的、与之匹配的铰链区、跨膜区、T细胞的胞内信号激活区的氨基酸序列，对于本领域普通技术人员来说也是一个难解的技术问题。

发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列筛选，对数十余条双特异性CAR分子的序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体，以及进一步感染T细胞，获得修饰的T细胞，并检测所得修饰的T细胞的体外杀伤活性等试验)，之后根据多个随机组合的结果比对，再进行序列调整，最终筛选出效果最好的序列，获得了本发明的高效价双特异性靶向人NKG2DL和CD47的人NKG2D和SIRPα氨基酸序列及其功能性变体。

在一些非限制性实施方式中，所述功能性变体的产生方式包括但不限于式氨基酸修饰、氨基酸的取代、缺失和添加，所述功能性变体为靶向人NKG2DL和CD47的人NKG2D和SIRPα氨基酸序列的高度同源性的氨基酸序列。

所述高度同源性氨基酸序列为相对于参考氨基酸序列，在这里是指与靶向人NKG2DL靶标的NKG2D或靶向人CD47靶标的SIRPα具有≥85％，优选≥90％或优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的多肽。

在一些非限制性实施方式中，所述氨基酸修饰包括但不限于氨基酸侧链的化学修饰、天然或非天然氨基酸取代、突变、缺失、插入或翻译后修饰。

本申请第一方面公开的主题的氨基酸片段可以通过本领域普通技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工策略产生非蛋白质类似物，非蛋白质类似物具有设计为模拟本发明蛋白质的功能活性的化学结构。此类类似物根据本发明公开的主题的方法施用。此类类似物可能具有超过原始多肽的生理活性。模拟设计的方法是本领域公知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，使得当在免疫应答细胞中表达时，所得的类似物增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代替代的R基团和改变参考多肽的特定碳原子的饱度。蛋白质类似物可以对体内降解相对耐受，导致施用时更长的治疗效果。

用于测量第一方面所述的肽或其功能性变体的功能活性的试验包括但不限于下文实施例中描述的试验方法。

本发明的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体中，所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域的氨基酸序列具有(1)、(2)、(3)或(4)所示的氨基酸序列中的任意一条：

(1)具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6中的任一条所示的氨基酸序列；

(2)与(1)的序列具有≥85％，优选≥90％或优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(3)(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(4)(1)所示的氨基酸序列经至少一个但不超过30个氨基酸修饰，优选不超过10个氨基酸修饰，较优选不超过5个氨基酸修饰，更优选不超过3个氨基酸修饰，最优选1个氨基酸修饰获得的氨基酸序列；

所述靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域的氨基酸序列具有(1)、(2)、(3)或(4)所示的氨基酸序列中的任意一条：

(1)具有如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9中的任一条所示的氨基酸序列；

(4)(1)所示的氨基酸序列经至少一个但不超过30个氨基酸修饰，优选不超过10个氨基酸修饰，较优选不超过5个氨基酸修饰，更优选不超过3个氨基酸修饰，最优选1个氨基酸修饰获得的氨基酸序列。

第二方面，本申请提供了一种基于第一方面所述双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体。

其中所述双特异性嵌合抗原受体包含引导肽氨基酸序列L、第一方面所述的双特异性靶向结合多肽结构域T或其功能性变体的氨基酸序列-T1-T2-、铰链区的氨基酸序列Z1、跨膜区的氨基酸序列TM、胞内信号转导结构区的氨基酸序列C，或

所述双特异性嵌合抗原受体为从氨基端到羧基端由引导肽氨基酸序列L、第一方面所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的氨基酸序列-T1-T2-、铰链区的氨基酸序列Z1、跨膜区的氨基酸序列TM、胞内信号转导结构区的氨基酸序列C顺次连接的而成的如式L-T-Z1-TM1-C1所示结构，其中可选的，所述铰链区Z1有或无。其中所述式L-T-Z1-TM-C中各“-”独立地为连接肽或肽键。其中由所述嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞在效靶比为10:1时对肿瘤细胞杀伤效率达60％～90％。所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D和靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白优选人NKG2DL和CD47的受体。

在本发明第二方面的双特异性嵌合抗原受体中一些实施方式中，所述细胞外识别抗原的结构域包含将新生蛋白质导入内质网的前导序列或信号肽。信号序列或前导序列可以是存在于新合成的蛋白质的N-末端的肽序列，其指导蛋白质进入分泌通路。如果CAR将被糖基化并锚定在细胞膜中，信号肽或前导序列可能是必需的。

在某些实施方式中，所述双特异性CAR包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔物区(spacer)Z2。间隔物区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。一些间隔物区包含CD8α铰链区或包含整个或部分的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区。间隔物区可以是来自IgG1的铰链区、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分或免疫球蛋白CH3域或CH3域和CH2域两者。

在一些实施方式中，所述铰链区Z1为不存在。

在一些实施方式中，所述铰链区优选为CD8α铰链区。。

胞外识别结构域T含有的识别元件由包含特异性结合靶细胞的细胞表面上存在的分子的识别元件构成。

跨膜结构域的功能是锚定结合细胞膜。在某些实施方式中，CAR的跨膜结构域包含跨越膜的至少一部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域产生不同的受体稳定性。在抗原识别之后，受体簇和信号被跨膜结构域传递到细胞。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域的氨基酸序列TM包含选自CD8跨膜结构区、CD28跨膜结构区、CD3ζ跨膜结构区、CD4跨膜结构区、4-1BB跨膜结构区、OX40跨膜结构区、ICOS跨膜结构区中的任一种的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述胞内信号结构域的氨基酸序列C包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述免疫受体酪氨酸活化基序包含人CD3ζ链的胞内信号结构域或人FcεRIγ胞内信号结构的任一种的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述共刺激信号域包含人CD28胞内信号结构域、人CD137/4-1BB胞内信号结构域、人CD134/OX40胞内信号结构域、人ICOS胞内信号结构域中的至少一种或多种的氨基酸序列组合。在一些实施方式中所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列、所述C包括人CD28胞内结构域的氨基酸序列、人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列和CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列；

在一些实施方式中所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列，所述C包括人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列和人CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列；

在一些实施方式中或\所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列，所述C包括人CD28胞内结构域的氨基酸序列和人CD3ζ的氨基酸序列。

在一实施方式中，所述引导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人CD47的人SIRPα的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人CD47的人SIRPα的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

在一实施方式中，所述靶向结合人CD47的人SIRPα的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

在一些实施方式中，所述铰链区为人CD8铰链区多肽的结构域。

在一些实施方式中，所述跨膜区为人CD8跨膜区多肽的结构域。

在一实施方式中，所述人CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；

在一实施方式中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；

在一些实施方式中，所述CAR的细胞内结构域的共刺激信号传导区包含两种共刺激分子：人CD28和人4-1BB或人CD28和人OX40或人4-1BB和人ICOS。

在一实施方式中，本申请的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的CAR细胞内结构域包含4-1BB多肽。

在一实施方式实施例中，所述人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；

在一实施方式中，所述人CD28胞内结构域多肽具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的人CD3ζ多肽。CD3ζ包含3个ITAM，并且在结合抗原后将激活信号传递到细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。

在一实施方式中，所述人CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

在一实施方式中，所述人CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。

在一实施方式中，所述双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体是重组表达或由重组表达载体表达。在一实施方式中所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载、腺病毒、腺联病毒或优选γ-逆转录病毒载体中的任一种。

第三方面，本申请提供了一种本发明第二方面所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列，该编码核苷酸序列选自：(1)式CL-CT1-CT2-CZ1-CTM-CC所示的核苷酸序列；和(2)(1)所述核苷酸序列的互补序列。

其中所述CL为编码所述引导序列L的核苷酸序列，所述-CT1-CT2-为编码权利要求1所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的核苷酸序列，所述CT1为编码所述靶向人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域的核苷酸序列，所述CT2为编码所述靶向人CD47的人SIRPα蛋白结构域的核苷酸序列，所述CZ1为编码所述铰链区的核苷酸序，所述CTM为编码所述跨膜结构域的核苷酸序列，所述CC为编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列，所述CC包括编码所述免疫受体酪氨酸活化基序的核苷酸序列CC1和编码所述共刺激信号域的核苷酸序列CC2和编码所述共刺激信号域的核苷酸序列CC3中的至少一种。

在一实施方式中，编码所述铰链区氨基酸序列Z1的核苷酸序列CZ1不存在。

在一些实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化结构域和共刺激信号域。

在一些实施方式中所述CC1为人CD28胞内结构域的编码核苷酸序列，所述CC2为人4-1BB胞内结构域的编码核苷酸序列，所述CC3为人CD3ζ胞内结构域的编码核苷酸序列；或

在一些实施方式中所述CC1不存在，所述CC2为人4-1BB胞内结构域编码核苷酸序列，所述CC3为人CD3ζ胞内结构域的编码核苷酸序列；

在一些实施方式中所述CC1为人CD28胞内结构域的编码核苷酸序列，所述CC2不存在，所述CC3为人CD3ζ序列胞内结构域的编码核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述CZ1为编码人CD8铰链区的核苷酸序列。

在一实施方式中，所述CTM为编码人CD8跨膜区的核苷酸序列。

在一实施方式中，编码所述引导序列的核苷序列CL如SEQ ID No.16所示。

在一些实施方式中，所述编码人NKG2D的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

在一实施方式中，所述编码人NKG2D的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。

在一实施方式中，所述编码人NKG2D的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。

在一实施方式中，所述编码人SIRPα的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。

在一实施方式中，所述编码人SIRPα的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。

在一实施方式中，编码所述人SIRPα的核苷酸序列如SEQ ID No22所示。

在一实施方式中，编码所述人CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。

在一实施方式中，编码所述人CD8跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。

在本申请第三方面所述的核苷酸序列的一实施方式中，编码所述人4-1BB胞内结构域的核苷酸如SEQ ID No.25所示。

在本申请第三方面所述的核苷酸序列的一实施方式中，编码所述CD28胞内结构域的核苷酸序列、如SEQ ID No.26所示。

在本申请第三方面所述的核苷酸序列的一实施方式中，编码所述CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.27。

在本申请第三方面所述的核苷酸序列的一实施方式中，编码所述CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。

编码双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的细胞外识别结构域的核苷酸可以通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产力。涉及蛋白质表达的不同阶段的因子包括密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译中的各种顺式元件。

第四方面，本申请提供了一种重组表达载体，其包含本申请第三方面所述的核苷酸序列的。

在一些实施方式中，所述重组表达载体可以是重组DNA或RNA构建体。

免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的靶向CAR修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导基本上同源的细胞组合物来实现。

在一些实施方式中，所述重组表达载体为病毒载体。

在一些实施方式中，所述病毒载体选自慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体中的任一种。

在一实施方式中，所述重组所述表达载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)或转基因表达。

第五方面，本申请提供了一种启动子，用于构建本申请第四方面所述的重组表达载体和表达本申请第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体，所述启动子包括但不限于核苷酸序列如SEQ No.29所示的EF1alpha启动子和SEQNo.30所示的EFS启动子。

在一优选实施例中，所述用于构建本申请第四方面所述的重组载体和表达本申请第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的启动子是如SEQ No.30所示的EFS启动子。

在一优选实施例中，所述用于用于构建本申请第四方面所述的重组载体和表达本申请第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的启动子是如SEQ No.29所示的EF1alpha启动子。

第六方面，本申请提供了一种重组病毒，其是能够表达本发明第二方面所述双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、且能够侵染免疫应答细胞的病毒。

本申请的重组病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒。在本申请的重组病毒一些实施方式中，所述重组病毒为本申请第二方面所述的双特异性嵌合抗原受体表达载体与包装辅助质粒psPAX2和pCMV-VSVG(Addgene,USA)共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或辅助性T细胞等中的任一种。

在一实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞。

第七方面，本申请提供了一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含本申请第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体，其由本发明第五方面所述的表达载体转染所得，其中所述双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体通过其携带编码第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列转染到免疫细胞中表达。

免疫应答细胞的修饰流程包括经过PCR全基因合成含有编码双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性CAR分子的核苷酸序列，通过分子克隆方式重组连接到慢病毒载体lentiGuide-Puro，构建包含编码人NKG2D的核苷酸序列和编码人SIRPα的核苷酸序列的全长CAR序列的慢病毒表达载体，转化感受态细胞，培养大量制备双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR表达质粒，和病毒包装辅助质粒psPAX2和VSVG共转染哺乳动物细胞，获得浓缩病毒液，再进一步感染从患者采集的免疫细胞，可得到本申请第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞。然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。对于免疫细胞的后续修饰可以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，

可能的免疫应答细胞转染方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养。转染病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1BBL和IL-12)。

优选地，选择的载体应表现出高的感染效率和稳定的整合和表达。

优选地，所述至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、ICOS及其组合，或更优选地，所述共刺激配体是4-1BBL。

在一实施方式中，所述哺乳动物细胞为293T细胞。

本申请第七方面公开的修饰免疫应答细胞可以表达双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的细胞外靶向识别结构域，用于治疗或预防瘤形成、免疫性疾病，或抗衰老。在实施方式中，利用用于CAR表达的载体转导从患者分离的多个T细胞亚群。

在一实施例中，其中所述修饰的免疫应答细胞为CAR-T细胞。

在一实施例中，可以利用靶向结合人NKG2DL的人NKG2D和靶向结合人CD47的人SIRPα双特异性嵌合抗原受体制备修饰的遗传修饰的中央记忆型T细胞，然后冷藏保存。

第八方面，本申请提供了本申请的第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞的制备方法，其包括以下步骤：

首先，将本申请第三方面所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列通过分子克隆的方式连接到表达载体中，获得本申请第四方面所述的表达靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的重组表达载体；

然后将获得的所述靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR的重组表达核酸构建转染293T细胞，获得重组病毒液；

最后用所述重组病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的细胞中获得表达第二方面的靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的第七方面的修饰的免疫应答细胞。

在一些实施方式中，本发明修饰的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自B、T和自然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等功能。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。

T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中心记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。在一些实施方式中，用于修饰表达CAR的免疫应答细胞为T细胞，表达CAR的T细胞表达Foxp3以实现和维持T调节表型。

本申请的修饰的免疫应答细胞可以进一步包含至少一种外源性共刺激性配体，使得免疫应答细胞外源性地共表达或被诱导为外源性地共表达基于NKG2D和SIRPα，双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗体和至少一种外源性共刺激性配体。双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性CAR和至少一种共刺激配体之间的相互作用提供了对于免疫应答细胞(例如，T细胞)的完全激活而言重要的非抗原特异性信号。

在一些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、ICOSL，及其组合。在一个实施方式中，共刺激性配体是4-1BBL。

在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为T细胞。

所述分离的修饰的免疫应答细胞(例如T细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)、或在体外衍生自工程化的体细胞或干细胞。

在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为自然杀伤(NK)细胞。

第九方面，本申请提供了一种治疗或预防疾病、不适或健康失调的药物组合物，其包含有效量的如本发明第一方面所述的靶向结合人NKG2DL的人NKG2D和靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白配体的或其功能性变体、第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、第三方面所述的核苷酸序列，第四方面所述的重组表达载体，或第七方面的所述的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂，

所述药物组合物的施用可以是自体的或非自体的。例如，表达双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的相容受试者。

在本申请的治疗或预防疾病、不适或健康失调的药物组合物中，所述疾病、不适或健康失调与人NKG2DL靶标及其配体人NKG2D和人CD47靶标及其配体人SIRPα蛋白的特异性相互作用有关，所述疾病、不适或健康失调包括病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥和衰老。

第十方面，本申请提供了一种用于治疗或预防疾病、不适或健康失调的受试者的瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、同种异体移植、或移植排斥或抗衰老的试剂盒，其包含本发明第一方面所述的靶向结合人NKG2DL的人NKG2D和靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白的双特异性靶向结合多肽结构域T或其功能性变体，或第二方能所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、或第三方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸、或第四方面所述的重组表达载体、或第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞中的任一种或多种的组合。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含使用免疫应答细胞治疗或预防疾病、不适或健康失调的受试者的书面说明书。

如果需要，免疫应答细胞与将细胞施用于具有或有风险发生瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植或衰老的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括关于组合物用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植的用途的信息。

在其它实施方案中，说明书包括以下中的至少一个：治疗剂的说明；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的剂量方案和施用方法；注意事项；禁忌；适应症；非适应症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(当存在时)、或作为标签贴到容器上、或作为单独的页、小册子、卡片或折叠式印刷品，在容器中或与容器一起提供。

在一些实施方式中，所述疾病、不适或健康失调与人NKG2DL靶标及其配体人NKG2D蛋白的特异性相互作用有关。

在一些实施方式中，本申请的用于治疗或预防疾病、不适或健康失调的受试者的瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、同种异体移植、或移植排斥或抗衰老的试剂盒中，所述疾病、不适或健康失调包括病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥和衰老。

第十一方面，本申请提供了本发明第一方面所述的靶向结合人NKG2DL的人NKG2D和靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体及其功能性变体、第二方面所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的重组表达载体，第五方面所述的启动子、第六方面所述重组病毒、第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞，第九方面的组合物在制备治疗，或预防疾病、不适或健康失调的产品中的应用，其中，所述治疗或预防包括步骤向患有与NKG2DL和NKG2D及其CD47和SIRPα配体蛋白的特异性相互作用引起的疾病的患者施用对治疗或预防为有效量的本申请第七方面所述的包含靶向NKG2DL和CD47的分离的修饰的免疫应答细胞。

其中，所述疾病、健康失调、不适或衰老是与人NKG2DL靶标及其配体人NKG2D蛋白的特异性相互作用和人CD47靶标及其配体人SIRPα蛋白的特异性相互作用有关，所述疾病、健康失调、不适包括NKG2DL和CD47在病灶部位细胞表面高表达的肿瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥；其中，所述肿瘤表达人的NKG2DL和人CD47抗原蛋白。

在一些实施方式中，所述瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥或衰老与NKG2DL和NKG2D及CD47和SIRPα蛋白的特异性相互作用有关。

在一些实施方式中，所述治疗或预防瘤形成包括减少受试者中肿瘤负荷、增加或延长患有瘤形成的受试者的存活或响应受试者的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子产生。

在一些实施方式中，所述肿瘤或瘤形成选自所述肿瘤或瘤形成选自胶质瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肝癌、急性髓细胞白血病、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、及其组合。

在一示例性实施例中，所述肿瘤或瘤形成为胶质瘤。在一示例性实施例中，所述肿瘤或瘤形成为髓母细胞瘤。在一示例性实施例中，所述肿瘤或瘤形成为急性髓细胞白血病。在一示例性实施例中，所述肿瘤或瘤形成为肝癌。

本发明基于人NKG2D和SIRPα分子构建了靶向人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体(CAR)以及该双特异性CAR修饰的免疫应答细胞(如CAR-T细胞)。该新型双特异性CAR修饰的免疫应答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂，尤其是阳性表达NKG2DL和CD47的肿瘤的药物制剂。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术员通常理解的含义。

本申请的发明人在研究中意外发现，采用本发明构建的包含特异性识别人NKG2DL的NKG2D和特异性识别人CD47的SIRPα的双特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞，制备方法步骤简单，在效靶比为10:1时，具有高达60％～90％的肿瘤细胞杀伤率，可明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞双特异性靶向结合肿瘤细胞特别是表达NKG2DL和CD47的肿瘤的能力，加强对所述肿瘤或瘤形成选自胶质瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肝癌、急性髓细胞白血病、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、及其组合的特异杀伤活性。本发明的双特异性靶向NKG2DL嵌合人NKG2D和CD47嵌合人的SIRPα修饰的免疫应答细胞为治疗肿瘤提供了一种新的方案选择，具有良好的产业应用前景。

附图说明

图1作为示例的本发明使用的慢病毒载体结构示意图。

图2为实施例1步骤一和步骤二双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体示意图，其中

1为人CD3ζ结构域的氨基酸序列，2为人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列，3为人CD8跨膜区的氨基酸序列，4为人CD8铰链区的氨基酸序列，5为双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的人NKG2D和人SIRPα氨基酸序列二者通过氨基酸序列(G4S)所连接的形成的结构，1≤n≤10或优选3≤n≤8；6为引导序列，7为EF1alpha启动子，8为EFS启动子；A为采用EF1alpha启动子的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体，B为采用EFS启动子的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体。

图3为实施例2中T细胞纯度流式细胞检测结果。

图4为实施例5中对CAR-T细胞活性的流式细胞检测结果，其中

(A).空白对照组：没有感染病毒液的T细胞；(B).KD-019对照组:靶向CD19的特异性CAR-T细胞；C.KD-080:双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR-T细胞。

图5为实施例5中对KD-080CAR分子表达的流式细胞检测结果。

(A).空白对照组：没有感染病毒液的T细胞人NKG2D和人SIRPα表达流式细胞图；(B).KD-019对照组:靶向CD19的特异性CAR-T细胞人NKG2D和人SIRPα表达流式细胞图；(C).KD-080双特异性靶向人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR-T细胞人NKG2D和人SIRPα表达流式细胞图。

图6为以胶质瘤细胞U251为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤率测试结果。

图7为以髓母细胞瘤细胞HTB186为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤率测试结果。

图8为以急性髓细胞白血病U937为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞肿瘤细胞杀伤率测试结果。

图9为以肝癌细胞SMMC7721为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤率测试结果。

图10为以胶质瘤细胞U251为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞对肿瘤动物模型杀伤测试结果，其中，

(A).为移植瘤在裸鼠中生长检测图；(B).接种本申请的修饰T细胞后肿瘤荧光强度值检测图。

图11为以髓母细胞瘤细胞HTB186为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞肿瘤动物模型杀伤测试结果，其中，

(A).移植瘤在裸鼠中的生长检测图；(B).显示接种本申请的修饰T细胞后肿瘤荧光强度值检测图。

图12为以急性髓细胞白血病U937为靶细胞测定本申请的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性KD-080CAR-T细胞肿瘤动物模型杀伤测试结果，其中，

(A).移植瘤在裸鼠中的生长检测图；(B).接种本申请的修饰T细胞后肿瘤荧光强度值检测图。

图13为双特异性KD-080CAR-T靶向U251胶质瘤细胞(图13A)、SMMC7721肝癌细胞(图13B)、HTB186髓母细胞瘤细胞(图13C)、U937急性髓细胞白血病细胞(图13D)的细胞因子IFN-γ释放检测图。

实施例

下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.制备双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的表达质粒

步骤一.双特异性靶向人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列的检索

从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到NKG2DL蛋白的受体——NKG2D的全长氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)；从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到SIRPα(CD47蛋白的受体)的全长氨基酸序列(如SEQ ID No.2所示)

步骤二.构建双特异性靶向结合NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体

双特异性靶向结合NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和编码核苷酸序列的设计。

具体如下：

双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子的氨基酸序列：自氨基端到羧基端，由引导肽的氨基酸序列(如SEQ ID No.3所示)、人NKG2D氨基酸序列(如SEQ IDNo.4所示)、或人SIRPα氨基酸序列(如SEQ ID No.7所示)、人CD8铰链区的氨基酸序列(如SEQ ID No.10所示)、人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.11所示)、人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.12所示)、和人CD3ζ结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.14所示)依次串联而成。

双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子的核苷酸序列：从5’端到3’端，由编码引导序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.16所示)、或编码人NKG2D序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.17所示)、或编码人SIRPα序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.20所示)、编码人CD8铰链区的核苷酸序列(如SEQ ID No.23所示)、编码人CD8跨膜区的核苷酸序列(如SEQ ID No.24所示)、编码人4-1BB胞内结构域的核苷酸序列(如SEQ ID No.25所示)、和编码人CD3ζ结构域的核苷酸序列(如SEQ ID No.27所示)依次串联而成。步骤三.双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子的表达质粒构建和鉴定。

全基因合成双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的包含人NKG2D和人SIRPα特异性结合结构域的双特异性CAR分子的编码核苷酸序列，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体lentiGuide-Puro(Addgene，爱迪基因货号52963，图1)，构建双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47双靶点的全长CAR序列表达框，利用EF1alpha启动子(序列表SEQ ID No.29所示)进行表达。具体操作步骤如下：

委托南京一道生物科技有限公司全基因合成含有启动子、引导序列、人NKG2D序列和人SIRPα序列、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人4-1BB胞内结构域、和人CD3ζ结构域的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47双特异性CAR分子的核苷酸序列，通过PCR扩增人工合成CAR分子序列。所用引物包括：

引物1：5’-cactttggcgccggctcgagggggcccgggtgcaaagatggataaagttttaaacagagagga-3’(如序列表SEQ ID No.31所示)或

引物2：5’-cactttggcgccggctcgagggggcccgggtaggtcttgaaaggagtgggaattggctcc-3’(如SEQ ID No.32所示)和

引物3：5'-tccagaggttgattgtcgacttaacgcgtttagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3'(如SEQ ID No.33所示)，

所述引物由南京一道生物科技有限公司合成。

PCR扩增由南京一道生物科技有限公司完成。

经Axygen胶回收试剂盒(杭州泽衡生物科技有限公司)回收(按照回收试剂盒说明书的体系和步骤)，与经过限制性内切酶SmaI(美国NEB公司SmaI限制性内切酶R0141L/R0141S)和MluI(Fermentas Thermo货号:ER0561)消化的载体lentiGuide-Puro进行同源重组连接。具体重组连接反应的体系和条件如下：

重组连接体系：

胶回收的PCR产物5μl，胶回收的SmaI和MluI(南京一道生物科技有限公司)酶切lentiGuide-Puro质粒(Addgene)3μl；4X 1402QuickCloning Kit(南京基诺美生物科技有限公司)5μl；去离子水7μl；连接反应体系体积20μl；

重组连接条件：将上述反应体系置于50℃水浴中，反应15min后置冰上1min。

取10ul重组连接产物经感受态Stbl3转化，具体转化操作步骤如下。

将5μl连接产物加入到50μl的感受态细胞(Stbl3，购买自美国Invitrogen公司)中，冰浴30min，42℃45s，冰浴2min，然后加入500μl无抗LB液体培养基后，37摄氏度，200rpm震荡培养40min，涂布氨苄抗性的LB固体平板，在37摄氏度培养箱中过夜。等待单菌落出现后，挑取5个大小适中的菌落，提取质粒，并送往商业测序公司测序(南京一道生物科技有限公司)，将测序结果与拟合成的NKG2D和SIRPα双特异性CAR分子序列比对证实序列完全正确，证明获得了表达双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子的质粒(简称KD-080CAR慢病毒载体，EFS启动子)。

步骤四.双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR表达质粒的提取和纯化；

将步骤三构建的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子表达质粒转化的Stbl3菌株(上海泽叶生物科技有限公司，货号ZY12)在LB培养基中大量培养，采用Qiagen PlasmidMidi Kit(德国Qiagen公司，货号12163)进行高纯度无内毒素抽提，已备感染。具体操作步骤如下：

1.取150ml过夜培养的菌液，加入离心管中，6000×g离心15分钟，尽量吸除上清(菌液过多时可以通过多次离心将菌液沉淀收集到一个离心管中)。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入4ml溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，搅动或震荡彻底悬浮细菌沉淀。

3.向离心管中加入4ml溶液P2，温和地上下翻转4-6次使菌体充分裂解，室温(15-25℃)孵育5分钟。

4.向离心管中加入4ml预冷的溶液P3，立即温和地上下翻转4-6次，充分混匀，冰上孵育5分钟。

5.将离心管放入4℃，20000×g超速离心10分钟。

6.柱平衡：向吸附柱加入4ml平衡液QBT,静置，直至液体完全流出。

7.将步骤5中收集的上清液转移到吸附柱中，静置，直至液体完全进入树脂介质。

8.向吸附柱中加入10ml的漂洗液QC，静置，直至液体完全流出，重复操作1次。

9.向吸附柱中加入5ml的洗脱液QF，收集到15ml离心管中。

10.向离心管中加入3.5ml的异丙醇，混匀，≥15000×g 4℃离心30分钟，弃去上清。

11.向留有DNA沉淀的离心管中加入2ml 70％的乙醇溶液，高于15000×g条件离心10分钟，弃去上清。

12.将留有DNA沉淀的离心管开盖，室温放置5-10分钟，加入合适体积的溶液重新溶解DNA，将含有DNA的溶液全部转移到新的1.5ml离心管中，-20℃保存。

实施例2.T细胞的分离培养

取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞；再利用偶联了抗-CD3抗体和抗-CD28抗体磁珠(购买自美国Invitrogen公司，产品信息为Human T-Activator CD3/CD28，货号：11161D)来富集CD3⁺T细胞，具体来说，将外周血单核细胞稀释至浓度为(10～30)×10⁶个单个细胞/ml，再将磁珠与细胞以3:1的比例在培养皿中混合，室温下共孵育2～3小时，利用磁微粒收集器(Magnetic particlesconcentrator，简称MPC，货号：12301D，购买自美国Invitrogen公司)富集CD3+T细胞。最后将富集的CD3+T细胞重悬于培养液(购买自美国Life Technologies公司，产品信息为OpTmizer^TM T-Cell Expansion SFM，A1048503)，调至细胞溶度为1×10⁶个/ml，最后在37℃、5％CO2培养箱中培养2天。T细胞纯度通过流式细胞术，利用抗PE anti-human CD3抗体(购买自美国BioLegend公司，货号：300408)进行检测，结果显示经过磁珠富集后的T细胞纯度超过97％(图3为外周血T细胞的检测图，对照组为Raji细胞)。

实施例3.病毒液的制备

将实施例1的步骤三分别获得的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异CAR表达质粒，以及病毒包装辅助质粒psPAX2和VSVG，按照10：8：5的比例用聚乙烯亚胺转染试剂(408727，Sigma)转染试剂，共转染293T细胞(为ATCC产品，产品编号为：CRL-3216TM)；具体的包装质粒的制备方法参见Lenti-X Packaging Single Shots(Takara)说明书；具体的转染操作过程参见Sigma转染说明书。

转染后6小时更换为完全培养基(购买自Life Technologies公司，产品货号：11995-065)，培养48小时和72小时后，分别收集病毒上清液，于4℃，3000rpm离心10～15分钟后经0.45μm滤膜过滤，最后于4℃，25000rpm超离心2～3小时，浓缩病毒，将收集的病毒浓缩液转入-80℃保存。

实施例4.双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR-T细胞的制备

取实施例2获得的CD3+T细胞，接种到24孔板，接种浓度为1×10⁵个细胞/ml，在37℃、5％CO2环境培养24小时(培养时间依据具体实践而定，一般来说，保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。取实施例3获得的病毒浓缩液，第二天按照MOI＝1～10的值将病毒液加入细胞培养瓶后，封好口，放入平角离心机后，低速(500g-1000g/min)离心30～60分钟,然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后获得表达包含人NKG2D和人SIRPα的双特异性CAR分子的CAR-T细胞(命名为KD-080)，即新型双特异性靶向CAR-T细胞(命名为KD-080)，所得双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR分子结构如图2所示，可以用于进行下一步的功能实验。

其中，A为含EF1a长启动子CAR分子结构；B为含EFS短启动子CAR分子结构。

实施例5.鉴定

1.利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购买自Biovision公司，货号：K315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书对制备好的CAR-T细胞进行细胞活性测试。流式细胞结果显示KD-080细胞活性均大于96％(图4)。

2.利用流式细胞术分析检测感染后包含人NKG2D和人SIRPα的结合结构域的CAR分子的表达，具体操作如下。

空白对照组：未感染病毒液的T细胞。

KD-019对照组：靶向CD19的特异性CAR-T细胞。

KD-080组：双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性CAR-T细胞。

细胞的制备过程中所收集的待检测细胞。

将上述实验组和对照组，PBS清洗两次后重悬于FACS液(含0.1％叠氮化钠和0.4％BSA的PBS)中。

按照抗体说明书分别将APC标记的抗人NKG2D抗体(APC Mouse Anti-HumanNKG2D,BD Pharmingen，货号558071)；PE标记的抗人SIRPα抗体(PE anti-human-CD172α，Biolegend，货号320806)加入到待检测细胞组和对照组的细胞悬液中，4℃孵育60分钟。采用流式细胞仪(BD FacsCanto II)获取染色细胞，并采用FlowJo软件分析结果。流式结果如图5所示(另注：图5中，横坐标PE-A表示APC受激发后发射出来的荧光(被PMT接收到的那部分)的荧光强度；纵坐标SSC-A代表细胞的颗粒度)，对照组中几乎检测不到CAR分子的表达，KD-080CAR-T组同时表达NKG2D 13.6％，SIRPα15.9％。

从图5的流式结果可以看出，实施例4的收集的待检测细胞同时表达了靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体。

实施例6.应用例以其效果数据

供试肿瘤细胞系(也称靶细胞系)：胶质瘤细胞U251(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)、髓母细胞瘤细胞HTB186(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)、急性髓细胞白血病细胞U937(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)、肝癌细胞SMMC7721(购自南京科佰生物科技有限公司)。

一、细胞毒性测试

利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购买自Biovision公司，货号：K315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估实施例4所得的靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞(KD-080)对上述靶细胞系的杀伤情况。

具体来说，每一种靶细胞系经过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)荧光染色后，以每孔2×10⁴个/ml的接种浓度铺于培养板中。

每一种靶细胞系对应地设置一个实验组和两个对照组，其中，实验组添加的是实施例4所得的靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞的细胞悬液；空白对照组添加的是没有感染病毒的T细胞(即实施例二获得的CD3+T细胞)；KD-019对照组添加的是靶向CD19的无关CAR-T细胞。

上述的实验组，按照三个不同的效靶比(10：1、5：1和1：1)，将实施例4所得的靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞与靶细胞混合。此处，术语“效靶比”是指效应细胞(双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞)与靶细胞(肿瘤细胞)的数量比。

同样的，空白对照组和KD-019对照组，也各自按照三个不同的效靶比将T细胞与靶细胞混合。

培养20小时后离心去上清，将细胞沉淀物清洗之后用7AAD染色，采用流式细胞仪(BD FacsCanto II)获取染色细胞，并采用FlowJo软件分析结果。

图6所示为以胶质瘤细胞U251为靶细胞的肿瘤细胞杀伤率测试结果。从图6可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对胶质瘤细胞U251具有明显的杀伤作用(明显高于两个对照组)，并且效靶比10:1对应的肿瘤细胞杀伤率超过60％。

图7所示为以髓母细胞瘤细胞HTB186为靶细胞的肿瘤细胞杀伤率测试结果。从图7可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对髓母细胞瘤细胞HTB186具有明显的杀伤作用(明显高于两个对照组)，并且效靶比10:1对应的肿瘤细胞杀伤率超过80％。

图8所示为以急性髓细胞白血病细胞U937为靶细胞的肿瘤细胞杀伤率测试结果。从图8可以看出，实施例4的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对急性髓细胞白血病细胞U937具有明显的杀伤作用(明显高于两个对照组)，并且效靶比10:1对应的肿瘤细胞杀伤率超过90％。

图9所示为以肝癌细胞SMMC7721为靶细胞的肿瘤细胞杀伤率测试结果。从图9可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对肝癌细胞SMMC7721具有明显的杀伤作用(明显高于两个对照组)，并且效靶比10:1对应的肿瘤细胞杀伤率超过80％。

图10所示为CAR-T细胞对胶质瘤U251移植瘤裸鼠的肿瘤抑制测试结果。从图10可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对胶质瘤U251移植瘤具有明显的抑制作用，在接种14天后，肿瘤基本消失(图10A)，肿瘤荧光强度明显低于三个对照组(图10B)。

图11所示为CAR-T细胞对髓母细胞瘤细胞HTB186移植瘤裸鼠的肿瘤抑制测试结果。从图11可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对髓母细胞瘤细胞HTB186移植瘤具有明显的抑制作用，在接种14天后，肿瘤抑制较为明显(图11A)，肿瘤荧光强度明显低于三个对照组(图11B)。

图12所示为CAR-T细胞对急性髓细胞白血病细胞U937移植瘤裸鼠的肿瘤抑制测试结果。从图12可以看出，实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080对急性髓细胞白血病细胞U937移植瘤具有明显的抑制作用，在接种7天后，肿瘤完全消失，14天肿瘤存在轻微的复发(图12A)，肿瘤荧光强度明显低于三个对照组(图12B)。

二、细胞因子释放检测：

实施例4所得双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞(命名为KD-080)，分别和靶细胞(包括靶细胞U251、SMMC7721、HTB186、U937)共培养，步骤同前，区别是效靶比为5:1和5:0，且接种杀伤时用不含IL-2的T细胞培养基将CAR-T细胞(命名为KD-080)与靶细胞共培养12～16小时，用标示量ddH2O溶解细胞因子标准品(标示量因细胞因子而定)，室温放置15～20min保证充分溶解，将标准品按推荐梯度倍比稀释，抽取样品细胞上清，用ddH2O稀释10倍，分别将标准品和实验样品加入相应反应孔中，每孔100μL，室温孵育1～3小时，配置1×清洗液，每孔用360ul清洗液清洗4次，并将孔中液体拍干，每孔加入200μL酶标检测抗体，室温孵育1～3小时，重复操作步骤6)，每孔加入200μL显色底物，室温避光孵育30～60分钟，每孔加入50ul终止液，450nm测定吸光值，图13显示，与没有加入靶细胞及对应的对照组比较，KD-025/045组在加入靶细胞U251(图13A)、SMMC7721(图13B)、HTB186(图13C)、U937(图13D)后，IFN-γ表达水平明显上调。

从上述图6到图12的结果可以看出，本发明实施例4所得的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞KD-080能够特异性识别NKG2DL和CD47阳性的肿瘤细胞，具有靶向杀伤力。

因此，本发明所构建的靶向NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、以及经其病毒载体感染的得到的双特异性靶向NKG2DL和CD47的双特异性CAR-T细胞可以应用于治疗胶质瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肝癌、急性髓细胞白血病、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、及其组合。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京凯地生物科技有限公司

<120> 双特异性嵌合抗原受体T细胞，其制备方法和应用

<130> 20190613

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser

1 5 10 15

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Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu

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Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly

50 55 60

Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn

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Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys

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Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln

100 105 110

Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met

115 120 125

Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp

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Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile

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Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro

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Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

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50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

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Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

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Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

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Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

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Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

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Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

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Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

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Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

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Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<212> PRT

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Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln

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Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp

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Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile

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Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala

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Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Ile Trp Ser Ala Val Phe

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Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser

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Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys

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Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser

65 70 75 80

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115 120 125

Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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115

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

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165 170 175

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180 185 190

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340

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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<212> DNA

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<400> 16

atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60

ccg 63

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<212> DNA

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<400> 17

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aaaaataact gctaccaatt ttttgatgag agtaaaaact ggtatgagag ccaggcttct 240

tgtatgtctc aaaatgccag ccttctgaaa gtatacagca aagaggacca ggatttactt 300

aaactggtga agtcatatca ttggatggga ctagtacaca ttccaacaaa tggatcttgg 360

cagtgggaag atggctccat tctctcaccc aacctactaa caataattga aatgcagaag 420

ggagactgtg cactctatgc ctcgagcttt aaaggctata tagaaaactg ttcaactcca 480

aatacgtaca tctgcatgca aaggactgtg 510

<210> 19

<211> 408

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tctctgttca accaagaggt gcagatacca cttaccgaat catattgtgg cccctgccca 60

aagaactgga tatgttacaa aaataattgc taccagtttt tcgacgagtc caagaattgg 120

tatgaatcac aagccagctg catgtcccaa aatgcgtcat tgttgaaggt atattctaag 180

gaggaccaag atttgttgaa gttggttaaa tcctatcatt ggatggggtt ggtccatata 240

cctacaaatg gttcatggca gtgggaagat ggatctatac tgagcccaaa tcttctgaca 300

ataattgaaa tgcaaaaagg cgattgtgcc ctttacgcta gtagcttcaa aggttatatt 360

gagaactgta gcacaccgaa cacttatatc tgtatgcaga gaacggtt 408

<210> 20

<211> 744

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60

gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120

aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 180

atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 240

aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 300

aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360

tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 420

gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 480

acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 540

accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 600

gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 660

gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 720

cgtgggactg ccaacttgtc tgag 744

<210> 21

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gaagaattgc aagtaattca accagataaa tcagttctgg ttgcagcggg ggaaactgcc 60

accctcagat gcactgcaac atctttgata cctgttggcc ctatccaatg gtttcgagga 120

gcaggaccag gccgcgaact tatatacaat cagaaggagg ggcatttccc tcgcgtgaca 180

acggtctcag atctgaccaa acgcaacaat atggattttt ccatacgcat aggcaacata 240

actcctgctg atgctggcac atattactgt gtcaaatttc ggaagggctc accggatgat 300

gtcgagttta agtccggggc tggtacggag ttgtccgtca gggcaaaa 348

<210> 22

<211> 1029

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60

gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120

ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180

acaactgttt cagacctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240

atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300

gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc 360

cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc acacctcagc acacagtgag cttcacctgc 420

gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag 480

ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac 540

agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg 600

gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc 660

cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat 720

gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc cagagactac agctgacctg gttggagaat 780

ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca accgttacag agaacaagga tggtacctac 840

aactggatga gctggctcct ggtgaatgta tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc 900

tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca 960

gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc gccgctgaga acactggatc taatgaacgg 1020

aacatctat 1029

<210> 23

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 24

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 25

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120

tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300

gacttcgcag cctatcgctc c 321

<210> 27

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 28

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 29

<211> 1259

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg 60

tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 120

cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc 180

gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 240

gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 300

ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 360

gcccttgcgt gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc 420

ttcgggttgg aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc 480

gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc 540

ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg 600

ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg 660

gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt 720

cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg 780

gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa 840

ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg 900

cagggagctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac 960

aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg 1020

cgccgtccag gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg 1080

gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc 1140

cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt 1200

tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1259

<210> 30

<211> 256

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

taggtcttga aaggagtggg aattggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg 60

cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gatccggtgc ctagagaagg 120

tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt 180

gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt 240

gccgccagaa cacagg 256

<210> 31

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

cactttggcg ccggctcgag ggggcccggg tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga 60

gga 63

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cactttggcg ccggctcgag ggggcccggg taggtcttga aaggagtggg aattggctcc 60

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

tccagaggtt gattgtcgac ttaacgcgtt tagcgagggg gcagggcctg catgtgaag 59

Claims

1.一种双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体，其包含第一靶向结合氨基酸序列T1和第二靶向结合氨基酸序列T2，或由羧基端的第一靶向结合氨基酸序列T1和氨基端的第二靶向结合氨基酸序列T2通过连接氨基酸连接序列而成-T1-T2-结构，

其中，所述第一靶向结合氨基酸序列T1为靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域，所述第二靶向结合氨基酸序列T2为靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域，或所述第一靶向结合氨基酸序列T1为靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域，所述第二靶向结合氨基酸序列T2为靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域，其中，其中各“-”独立地为连接肽或肽键，所述连接氨基酸序列为式(GGGGS)n或(EAAAK)n表示的结构，其中1≤n≤10。

2.根据权利要求1所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体，其中，所述连接氨基酸序列为式(GGGGS)n，其中，3≤n≤8；

其中，所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域的氨基酸序列具有(1)、(2)、(3)或(4)所示的氨基酸序列中的任意一条：

3.一种基于权利要求1或2所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述双特异性嵌合抗原受体包含引导肽氨基酸序列L、权利要求1或2所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的氨基酸序列-T1-T2-、铰链区的氨基酸序列Z1、跨膜区的氨基酸序列TM、胞内信号转导结构区的氨基酸序列C，或所述双特异性嵌合抗原受体为从氨基端到羧基端由引导肽氨基酸序列L、权利要求1或2所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的氨基酸序列-T1-T2-、铰链区的氨基酸序列Z1、跨膜区的氨基酸序列TM、胞内信号转导结构区的氨基酸序列C顺次连接而成的如式L-T-Z1-TM-C所示结构，其中可选的，所述铰链区Z1有或无；

所述式L-T-Z1-TM-C中各“-”独立地为连接肽或肽键，其中由所述嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞在效靶比为10:1时对肿瘤细胞杀伤效率达60％～90％，所述双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的人NKG2D和SIRPα蛋白优选人NKG2DL和人CD47的受体。

4.如权利要求3所述的双特异性嵌合抗原受体，其中，

所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列、所述C包括人CD28胞内结构域的氨基酸序列、人4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列；或

所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列，所述C包括人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列和人CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列；或

或所述Z1为人CD8铰链区的氨基酸序列，所述TM为人CD8跨膜区的氨基酸序列，所述C包括人CD28胞内结构域的氨基酸序列和CD3ζ胞内结构域序列的氨基酸序列。

5.如权利要求3或4任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，其中

所述引导序列如SEQ ID No.3所示；和/或

所述靶向结合人NKG2D结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6中任意一条所示，和/或

所述靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9中任意一条所示；和/或

所述人CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；和/或

所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；和/或

所述人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；和/或

所述人CD28结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；和/或

所述人CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示。

6.如权利要求3-5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体(CAR),其是重组表达或由载体表达；可选的，所述载体选自慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体或优选γ-逆转录病毒载体中的任一种。

7.一种权利要求3～5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列，该编码核苷酸序列选自：(1)式CL-CT1-CT2-CZ1-CTM-CC所示的编码权利要求3～5任一项所述的核苷酸序列和(2)(1)所述核苷酸序列的互补序列，其中所述CL为编码所述引导序列L的核苷酸序列，所述-CT1-CT2-为编码权利要求1或2所述的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体的核苷酸序列，所述CT1为编码所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域的核苷酸序列，所述CT2为编码所述靶向结合人CD47的人SIRPα蛋白结构域的核苷酸序列，所述CZ1为编码所述铰链区的核苷酸序列，所述CTM为编码所述跨膜结构域的核苷酸序列，所述CC为编码所述胞内信号结构域C的核苷酸序列，所述CC包括编码所述免疫受体酪氨酸活化基序的核苷酸序列CC1和编码所述共刺激信号域的核苷酸序列CC2和编码所述共刺激信号域的核苷酸序列CC3中的至少一种。

8.如权利要求7所述的核苷酸序列，其中

所述CC1为编码所述人CD28胞内结构域的编码核苷酸序列，所述CC2为编码所述人4-1BB胞内结构域的编码核苷酸序列，所述CC3为编码所述人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列；或

所述CC1不存在，所述CC2为编码所述人4-1BB胞内结构域核苷酸序列，所述CC3为编码所述人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列；或

所述CC1为编码所述人CD28胞内结构域的核苷酸序列，所述CC2不存在，所述CC3为编码所述人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列，

其中，

所述编码所述引导序列的核苷序列CL如SEQ ID No.16所示，和/或

所述编码所述特异性靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白结构域的核苷序列如SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18，SEQ ID No.19中任一条所示，所述编码所述特异性靶向结合人CD47的SIRPα蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.20、SEQ ID No.21，SEQ ID No.22任一条所示；和/或

所述编码所述人CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，和/或

所述编码所述人CD8跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，和/或

所述编码所述人4-1BB胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，和/或

所述编码所述人CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，和/或

所述编码所述人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.27或SEQ ID No.28所示。

10.一种重组表达载体，其包含权利要求7-9中任一项所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列。

11.一种启动子，用于构建权利要求10所述的表达载体和表达权利要求3～5任一项所述的双特异性的嵌合抗原受体，所述启动子为选自SEQ No.29所示的EF1α长启动子或如SEQNo.30所示的EFS短启动子中的任一个，或优选地，所述启动子为SEQ No.30所示的EFS短启动子。

12.一种重组病毒，其中：

所述重组病毒为能够表达权利要求3～5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，且能够侵染免疫应答细胞的病毒；

优选的，所述重组病毒为权利要求10所述的双特异性嵌合抗原受体表达载体载体与病毒包装辅助质粒psPAX2和pCMV-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；其中，所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。

13.一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含前述权利要求3～5中任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，其由权利要求11所述的重组病毒转染所得，所述双特异性嵌合抗原受体通过其携带的编码权利要求3～5中任一项所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列的重组病毒转染到免疫细胞中表达。

14.如权利要求13所述的分离的修饰的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，或选自T细胞和自然杀伤细胞或优选为T细胞。

15.权利要求13或14所述的分离的修饰的免疫应答细胞的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

首先，将权利要求7-9任一项所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列，通过分子克隆的方式连接到初始表达载体中，获得表达所述双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体的重组表达载体；

然后，将获得的所述双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体的重组表达载体转染哺乳动物细胞，获得重组病毒液；

最后用所述重组病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的免疫应答细胞中获得表达双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。

16.一种治疗或预防疾病、不适或健康失调的药物组合物，其特征是包含有效量的如权利要求13或14所述的分离的修饰的免疫应答细胞，权利要求3-5任一项所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和CD47的双特异性嵌合抗原受体、权利要求7--9任一项所述的核苷酸序列，权利要求10所述的重组表达载体，或权利要求13或14任一项所述的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂，所述疾病、不适或健康失调与人NKG2DL靶标及其配体人NKG2D和人CD47靶标及其配体人SIRPα蛋白的特异性相互作用有关，所述疾病、不适或健康失调包括病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥和衰老。

17.一种用于治疗或预防瘤疾病、不适或健康失调或衰老的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的双特异性靶向结合多肽结构域T或其功能性变体，或权利要求3-5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，或权利要求7-9任一项所述的核苷酸序列、或权利要求10所述的重组表达载体、或权利要求13或14中任一项所述的分离的修饰的免疫应答细胞中的任一种或多种的组合；其中所述疾病、不适或健康失调与人NKG2DL靶标及其配体人NKG2D蛋白的特异性相互作用有关，

可选的，所述试剂盒还包含使用免疫应答细胞治疗患有肿瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、或移植排斥或衰老的受试者的书面说明书。

18.权利要求1或2任一项所述的靶向结合NKG2DL的NKG2D和靶向结合CD47的SIRPα蛋白的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体、权利要求3-5任一项所述的双特异性靶向结合人NKG2DL和人CD47的双特异性嵌合抗原受体、权利要求7-9任一项所述的核苷酸序列、权利要求10所述的重组表达载体、权利要求11所述的启动子，权利要求12所述重组病毒，权利要求13或14任一项所述的分离的修饰的免疫应答细胞和权利要求16所述的组合物在制备治疗或预防疾病、健康失调或不适或衰老的产品中的应用，其中，所述治疗或预防包括步骤向患有与NKG2DL和NKG2D及其CD47和SIRPα配体蛋白的特异性相互作用引起的疾病的患者施用对治疗或预防为有效量的权利要求14或15所述的包含靶向NKG2DL和CD47的分离的修饰的免疫应答细胞，

19.如权利要求18所述的应用，其中，所述治疗或预防瘤形成包括减少受试者中肿瘤负荷、增加或延长患有瘤形成的受试者的存活或响应受试者的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子；和/或所述肿瘤表达人NKG2DL和人CD47蛋白，所述肿瘤或瘤形成选自胶质瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肝癌、急性髓细胞白血病、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、及其组合；

和/或所述分离的修饰的免疫应答细胞是通过静脉回输的方式治疗所述肿瘤或瘤形成，或所述分离的修饰的免疫应答细胞是通过肿瘤内部注射的方式治疗所述肿瘤或瘤形成。