CN105473731B - 自身癌抗原特异性cd8+ t细胞的分离及增殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法，详细地涉及如下方法及利用其的CD8+T细胞的大量增殖方法，在上述方法中，从存在于癌症患者每个人的血液内的自身癌抗原筛选由CD8+T细胞识别的表位，并利用已筛选的表位的肽来分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。根据本发明，利用作为非外来抗原的存在于癌症患者的每个人的血液的自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽来可分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。因此，若利用识别自身癌抗原的T细胞，则可有效地选择来源于癌症患者本人的细胞的癌细胞来去除，因而可无副作用地应用于癌症的治疗及改善。
Description
技术领域
本发明涉及自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法，详细地涉及如下方法及利用其的CD8+T细胞的大量增殖方法，在上述方法中，从存在于癌症患者每个人的血液内的自身癌抗原筛选由CD8+T细胞识别的表位，并利用已筛选的表位的肽来分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。
背景技术
CD8+T细胞与树突细胞、CD4+T、自然杀伤细胞(NK细胞)之类的其他细胞相比，具有比较单纯的功能，因而当进行抗癌免疫治疗时，产生未期待的副作用的可能性小。通常，利用主要组织相容性复合体-I类/肽多聚体(MHC class I/peptide multimer)来分离抗原特异性CD8+T细胞，但在这种方法的情况下，存在细胞分离之后由细胞自杀导致的死亡率高，从而为了生产充分量的抗原特异性CD8+T细胞，有需要长时间进行培养的缺点。因而代替刺激T细胞受体 (TCR，T cell receptor)的主要组织相容性复合体多聚体(MHC multimer)，需要可分离抗原特异性CD8+T细胞的替代标记(surrogate marker)，对此本发明人很长时间进行了与作为免疫调节蛋白的4-1BB(CD137)相关的研究。
众所周知，4-1BB在由诱导性共刺激分子活性化的T细胞中表达，尤其，不仅增进CD8+T细胞的活性，而且增加Bcl-2、Bcl-XL、Bfl-1等之类的抗-细胞死亡分子(anti-apoptotic molecules)的表达，来呈现抑制活化诱导的细胞死亡(AICD，activation-induced cell death)的功能。这种4-1BB刺激的多个特性是适合于癌症治疗的多个特性，基于此，利用动物模型对利用抗-4-1BB mAb 的癌症治疗效果进行验证。对此，本发明人利用在以前研究中，以抗原特异性活性化的CD8+T细胞的4-1BB的表达来确立了利用抗-4-1BB抗体的抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法(韩国登录特许第10-0882445号)，但在抗体的情况下，体外(in vitro)及体内(in vivo)半衰期长，并且通过Fc受体的信号传递结果和通过抗体识别的靶蛋白质的信号传递的效果被合并，从而呈现整体结果。并且，对相同的抗原存在多种抗体的情况多，并且这些呈现相互稍不同的效果。为了克服这种局限点，利用作为五聚合体的COMP-4-1BBL蛋白质来成功开发过分离及增殖抗原特异性CD8+T细胞的方法(韩国登录特许第 10-1103603号)。
这两种专利作为外来抗原的病毒抗原(EBV/LMP2A，CMV/pp65)特异性 CD8+T细胞分离/大量培养的技术，在体内这些细胞的比率高，从而可比较容易体现。但大部分癌细胞由构成我们身体的细胞形成，因而虽然是构成我们身体的蛋白质，但在正常细胞中以低的比率存在，并且在癌细胞中需要将识别过表达的自身癌抗原(self tumor Ag)的CD8+T细胞选择性分离及大量培养。
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的在于，提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法，上述自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法可在31天内选择性地分离并大量培养在体内以极低的比率存在的自身癌抗原特异性CD8+T 细胞。
解决问题的手段
为了达成上述目的，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法，上述自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法包括：步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌抗原CD8+T细胞表位；步骤b)，与上述自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽及白细胞介素-2(IL-2)一同在培养基中培养从癌症患者的血液中分离的外周血单个核细胞(PBMC，peripheralblood mononuclear cell)；步骤c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同的肽来诱导4-1BB表达；以及步骤d)，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中培养诱导了4-1BB表达的细胞之后，去除未附着的细胞。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，上述步骤a)的自身癌抗原可选自由人端粒酶逆转录酶(hTERT)、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3(MAGE-A3)组成的组中。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，在上述步骤b) 中，自身癌抗原CD8+T细胞表位可以为包含选自由序列1至序列15组成的组中的氨基酸序列的肽。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中的特征在于，上述步骤c)中，表达诱导培养12至36小时。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，上述步骤d)中，可培养1至20分钟。
并且，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法，上述自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法包括如下步骤：利用包含白细胞介素-2、抗-CD3抗体及自体血浆的培养基，来使通过上述方法分离的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和放射线照射的同种异体(allogeneic)外周血单个核细胞悬浮之后，注入于培养用袋，追加注入上述培养基来进行培养。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法中，上述外周血单个核细胞可从正常供体分离。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法中，上述培养可执行4至15天。
发明的效果
根据本发明，利用作为非外来抗原的存在于癌症患者的每个人的血液中的自身癌抗原CD8+T细胞表位的肽来可分离对自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。因此，若利用以本发明的方法分离的用于识别在正常人中以极低的比率存在的自身癌抗原的T细胞，则可有效地选择来源于癌症患者自身的癌细胞来去除。
附图说明
图1为说明本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的选择性分离及大量培养过程的图。
图2为表示本发明的表位筛选过程的工序流程图的图。
图3为示出利用从正常人(healthy doner)取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果的图。
图4为示出利用从正常人取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选结果的图。
图5至图7为示出利用分别从胃癌(gastric cancer)、肺癌(lung cancer) 及胰腺癌(pancreatic cancer)患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果的图。
图8及图9为示出利用分别从脑肿瘤(glioblastoma)、肺癌患者取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选结果的图。
图10及图11为示出利用分别从卵巢癌(ovarian cancer)及肉瘤(sarcoma) 患者取得的外周血单个核细胞的NY-ESO1表位筛选结果的图。
图12及图13为示出利用分别从肉瘤及肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3(MAGE-A表位筛选结果的图。
图14为用于说明人端粒酶逆转录酶T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图15为用于说明WT1T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图16为用于说明NY-ES01 T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图17为用于说明黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产过程的图。
具体实施方式
癌细胞来源于构成我们身体的细胞，因而为了选择性地去除癌细胞，需要从癌细胞中过表达的自身癌抗原(self tumor Ag)特异性CD8+T细胞的选择性分离及大量培养。但是，用于识别自身癌抗原的T细胞在正常人的情况下，不仅以比率极低的方式存在，而且以因免疫耐受(immune tolerance)而抑制活性的状态存在。因此，尚未开发从癌症患者的血液中选择性地分离自身癌抗原特异性CD8+T细胞来大量培养的规格化的工序。对此，本发明人开发了如下规格化的工序技术，即，利用抗4-1BB抗体来在31天内可选择性地分离并大量培养在体内以极低的比率存在的人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3之类的自身癌抗原特异性的CD8+T细胞。
因此，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法。具体地，本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法包括：步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌抗原CD8+T细胞表位；步骤b)，与上述自身癌抗原 CD8+T细胞表位的肽及白细胞介素-2一同在培养基中培养从癌症患者的血液中分离的外周血单个核细胞(PBMC，peripheral bloodmononuclear cell)；步骤 c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同的肽来诱导4-1BB 表达；以及步骤d)，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中培养诱导了4-1BB表达的细胞之后，去除未附着的细胞。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法中，上述步骤a)中，自身癌抗原可以为存在于癌症患者自身的体内的一种癌抗原，根据癌瘤可选择适合的自身癌抗原来使用。优选地，作为利用于抗癌免疫治疗的代表性自身癌抗原可使用人端粒酶逆转录酶(基因库：BAC11010.1)、WT1(基因库： AAO61088.1)、NY-ESO1(基因库：CAA05908.1)及黑素瘤抗原-A3(NCBI 参考序列：NP_005353.1)等。众所周知，上述人端粒酶逆转录酶作为在染色体末端合成端粒脱氧核糖核酸(telomeric DNA)的酶，癌细胞使该酶过度活性化来可回避端粒依存性细胞死亡来起到作用，并且是包括肺癌、胃癌及胰腺癌的多种实体癌的靶抗原(Kim NW,et al.Science.1994；266:2011-2015)，众所周知，上述WT1作为与肾母细胞瘤(Wilms tumor)相关的基因，是对锌指(zinc finger) 转录因子加密来参与细胞的增殖和分化、死亡及器官的产生的蛋白质，是脑脊髓癌、肺癌等的靶抗原(Call KM,et al.,Cell.1990.60:509-520；Nakahara Y,et al., Brain Tumor Pathol.2004.21:113-6)。并且，众所周知，上述NY-ESO1作为属于癌睾丸抗原(CTA，cancer testis antigen)的蛋白质之一，主要表达于包含生殖细胞(germ cell)、肉瘤(sarcoma)及乳腺癌的多种癌细胞，但未知在这些细胞中起到什么功能(Gnjatic S,et al.,Adv Cancer Res.2006；95:1-30)。上述黑素瘤抗原-A3作为属于黑色素瘤相关抗原家族(melanoma-associated antigen family)的蛋白质，未公开在正常细胞中执行什么功能，但是，众所周知，在包括肺癌、肉瘤及黑色素瘤的多种癌细胞中过表达，从而评价为适合癌症的免疫治疗的靶抗原(Decoster L,etal.,Ann Oncol.2012Jun；23(6):1387-93)。
本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，在上述步骤b)中，表位为包含选自由序列1至序列15组成的组中的氨基酸序列的肽。
本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，上述步骤 b)中，培养基为包含自体血浆的培养基，并且，上述步骤b)中，培养12至 16天。
本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离方法的特征在于，上述步骤 c)中，表达诱导培养12至36小时，上述步骤d)中，培养1至20分钟。
并且，本发明提供自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法，上述自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法包括如下步骤：利用包含白细胞介素-2、抗-CD3抗体及自体血浆的培养基，来使通过上述分离方法分离的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和放射线照射的同种异体(allogeneic)外周血单个核细胞悬浮之后，注入于培养用袋，追加注入上述培养基来进行培养。
在本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养方法的特征在于，上述外周血单个核细胞从正常供体分离，上述培养执行4至15天。尤其，在执行上述培养期间，在培养第4天、第7天、第9天、第11天及第14天追加可注入培养基。
以下，按步骤说明本发明的自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离及增殖方法。
(1)表位筛选(Epitope screening)(预先筛选检查)
本发明利用肽来选择性增殖及分离自我衍生的癌抗原特异性CD8+T细胞。通过CD8+T细胞识别的自身癌抗原的多个表位(epitope)根据每个患者的人类白细胞抗原(HLA)-A型及状态各不相同，因而通过表位筛选来筛选存在于癌症患者每个人的血液内的自身癌抗原CD8+T细胞表位，从而筛选3-4种类的T 细胞治疗剂制备用肽。
(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖
自身癌抗原特异性CD8+T细胞在血液内以0.1％以下的方式存在，因而向从血液中分离的外周血单个核细胞添加3-4种制备用肽及白细胞介素-2来培养 14天，从而诱导对来源于自身癌抗原的肽特异性的CD8+T细胞的增殖。在培养第14天收集全部细胞来由相同的多个肽再活性化24小时，来使多个肽-特异性CD8+T细胞同时表达4-1BB。
(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的选择性分离
向涂敷有抗4-1BB抗体的培养板接种由肽再活性化的细胞来培养10分钟，从而附着表达4-1BB的多个CD8+T，并且未附着的多个细胞全部通过清洗而去除。之后添加包含白细胞介素-2的培养基来培养两天，从而使分离的多个T细胞与增殖一同向培养板滴落。
(4)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养
混合分离于1L培养用袋(culture bag)的CD8+T细胞5×105细胞、照射放射线(irradiated allogeneic)的多个外周血单个核细胞1×108细胞、1000U/ml的白细胞介素-2、40ng的抗-CD3mAb，来定期添加培养基14天，从而以～109细胞/L水平大量培养细胞来以可向癌症患者给药的水平增殖。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，这些实施例用于更详细地说明本发明，本发明的范围并不限制于这些实施例。
实验例.表位筛选工序
通过算法筛选了自身癌抗原的多个CD8+T细胞表位(epitope)。为了确认存在于癌症患者的血液内的多个T细胞与哪种CD8+T细胞的表位发生反应，从癌症患者的血液分离外周血单个核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)来清洗之后，以1×106细胞/ml悬浮于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养基(RPMI1640培养基+4mM L-谷氨酰胺+12.5mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)+50μM的2-巯基乙醇+3％的自体血浆)，并以每次1ml的方式向 14ml的管(round tube)接种。向各个管以1μg/ml的浓度添加通过算法进行分析来筛选的各个表位的多个肽(peptides)，来在CO2培养箱中开始培养。培养第二天，将包含50U/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基以每次 1ml的方式向各个管接种。培养第7天、第9天、第11天及第13天去除1ml 的培养基之后，添加了包含50U/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基。培养第14天，向各个管添加RPMI1640培养基，来在1400rpm条件下离心分离5分钟，从而将细胞清洗3次。向清洗的细胞悬浮1ml的细胞毒性T淋巴细胞培养基之后，以5μg/ml的浓度添加相同的肽来进行培养。24小时之后，收集各管的细胞来利用抗-CD8-PE-Cy5及抗-4-1BB-PE抗体进行染色，从而进行流式细胞分析，并且分析表达4-1BB的CD8+T细胞的比率，从而分析了与哪种肽发生反应来将CD8+T细胞活性化。图2为示出本发明的表位筛选过程的工序流程图的图。
从圣地亚哥联科生物公司(eBioscience，San Diego，CA)购买了使用于实验的抗-CD8-PE-Cy5及抗-4-1BB-PE。从圣地亚哥英杰生命科技有限公司 (Invitrogen，San Diego，CA)购买了RPMI1640、L-谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸及2-巯基乙醇。
实施例1.自身癌抗原筛选及CD8+T细胞表位筛选
基于按各个不同癌瘤评价哪种癌抗原对癌症的免疫治疗适合的多个论文(Scanlan MJ,et al.,Immunol Rev.2002 Oct.188:22-32；Ramakrishnan S,et al.,Cancer research.1998.58:622-625；Nakahara Y,et al.,Brain Tumor Pathol. 2004.21(3):113-6)，筛选了适合韩国人的好发癌及难治性癌(胃癌、肺癌、胰腺癌等)的免疫治疗的自身癌抗原。人端粒酶逆转录酶(基因库：BAC11010.1)、 WT1(基因库：AAO61088.1)、NY-ESO1(基因库：CAA05908.1)及黑素瘤抗原-A3(NCBI参考序列：NP_005353.1)作为以多种方式利用于抗癌免疫治疗的代表性的自身癌抗原，筛选可适用这些四种癌抗原的癌瘤来在下列表1中进行了整理。
表1
通过算法分析筛选的自身癌抗原的氨基酸序列，来确定推定为CD8+T细胞表位的氨基酸序列(CTLPred:http://www.imtech.re s.in/raghava/ctlpred/,NetCTL:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetC TL/,SYFPEITHI:http://www.syfpeithi.de/)，并将筛选的表位作为对象来将肽进行化学合成(Peptron Inc；www.peptron.com)，从而使用于表位筛选(epitope screening)。从各个自身癌抗原筛选的CD8+T细胞表位如下列表2至表5。
表2
表3
表4
表5
实施例2.将临床癌症患者作为对象的表位筛选
为了验证在实施例1中筛选的人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3自身癌抗原的多个CD8+T细胞表位能否诱导存在于临床癌症患者的血液内的CD8+T细胞增殖，执行了示意于图2的表位筛选。人端粒酶逆转录酶的表位筛选将胃癌、肺癌及胰腺癌作为主要对象来执行，并且WT1表位筛选将脑脊髓癌及肺癌作为主要对象来执行，NY-ESO1表位筛选将卵巢癌及肉瘤作为主要对象来执行，黑素瘤抗原-A3表位筛选将肉瘤及肺癌作为主要对象来执行。
图3为示出利用从正常人(healthy doner)取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果的图。
图4为示出利用从正常人取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选结果的图。
由图3及图4可知，人端粒酶逆转录酶及WT1的多个CD8+T细胞表位由从正常人的血液分离的外周血单个核细胞未诱导T细胞反应。因此，确认为本发明的筛选的多个表位无法由正常人的T细胞识别。
图5至图7为示出利用分别从胃癌(gastric cancer)、肺癌(lung cancer) 及胰腺癌(pancreatic)患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选结果的图。
图8及图9为示出利用分别从脑肿瘤(glioblastoma)及肺癌患者取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选结果的图。
图10及图11为示出利用分别从卵巢癌(ovarian cancer)及肉瘤(sarcoma) 患者取得的外周血单个核细胞的NY-ESO1表位筛选结果的图。
图12及图13为示出利用分别从肉瘤及肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3表位筛选结果的图。
由图5至图13可知，将由临床癌症患者的血液分离的外周血单个核细胞作为对象执行表位筛选来调查对人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3的CD8+T细胞反应性，最终确认与正常人不同，呈现高的对选择的多个自身癌抗原的T细胞反应。因此，将胃癌、肺癌、胰腺癌、肉瘤、卵巢癌等作为对象反复执行表位筛选来确认了对各个自身癌抗原的反应性。
并且，为了客观分析上述自身癌抗原CD8+T细胞表位筛选结果，如下列表 6所示地制作了评分系统(scoring system)。
表6
根据上述表6的基准，分析表位筛选结果，其结果在下列表7至表15中示出。
下列表7为利用从胃癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选的分析结果。
表7
下列表8为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选的分析结果。
表8
下列表9为利用从胰腺癌患者取得的外周血单个核细胞的人端粒酶逆转录酶表位筛选的分析结果。
表9
下列表10为利用从脑肿瘤患者取得的外周血单个核细胞的WT1 表位筛选的分析结果。
表10
下列表11为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选的分析结果。
表11
下列表12为利用从卵巢癌患者取得的外周血单个核细胞的NY-E SO1表位筛选的分析结果。
表12
下列表13为利用从肉瘤患者取得的外周血单个核细胞的WT1表位筛选的分析结果。
表13
下列表14为利用从肉瘤患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3表位筛选的分析结果。
表14
下列表15为利用从肺癌患者取得的外周血单个核细胞的黑素瘤抗原-A3表位筛选的分析结果。
表15
如上述表7至表13，以3分以上，CD8+T细胞因肽的刺激而表达4-1BB 的情况下，利用抗4-1BB抗体来可有效地分离这些细胞。在各癌瘤中以3分以上，T细胞与自身癌抗原发生反应的比率为40-50％水平，因而判断为利用筛选的自身癌抗原的多个表位可制备T细胞治疗剂。被筛选的多个肽如下：人端粒酶逆转录酶肽为CLKELVARV(序列1)、PLFLELL(序列2)及AAVTPAA(序列3)；WT1肽为SLGEQQVSV(序列4)、RMFPNAPVL(序列5)、CMTWNQMNL (序列6)及VLDFAPPGA(序列7)；NY-ESO1肽为SISSCLQQL(序列8)、 RLLEFYLAM(序列9)、GVLLKEFTV(序列10)及ILTIRLTAA(序列11)；以及黑素瘤抗原-A3肽为LLIIVLAII(序列12)、KIWEELSVL(序列13)、 LVFGIELMEV(序列14)及SLPTTMNYPL(序列15)。
实施例3.自身癌抗原特异性T细胞治疗剂的试验制备
通过表位筛选来筛选适合制备T细胞治疗剂的对各个自身癌抗原的3-4种的表位的肽之后，利用这些肽来执行了人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3特异性T细胞治疗剂的试生产。T细胞治疗剂的生产由自我衍生抗癌T细胞的第一次增殖、分离及大量培养这三个步骤构成。
(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖
通过表位筛选，从确认存在一个以上的3分以上的表位的癌症患者中分离了50ml的血液。
1)从患者的血液分离外周血单个核细胞：向填满了7ml的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)的15ml的管(cornical tube)慢慢流出7ml的血液，来覆盖(overlay)于聚蔗糖溶液的上层。在常温且2000rpm的条件下，将管离心分离20分钟，并且只收集位于聚蔗糖和血浆之间的白色的细胞层来清洗之后使用为外周血单个核细胞。
2)以1×106细胞/ml将分离的外周血单个核细胞悬浮于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养基(RPMI1640培养基+4mM L-谷氨酰胺+12.5mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+50μM的2-巯基乙醇+3％的自体血浆)中，并且以使通过表位筛选来在本发明中筛选的3-4种的多个肽的浓度分别成为1μg/ml 的方式添加。以每次1ml的方式将这些细胞悬浮液接种于14ml的管(round tube) 来在CO2培养箱中培养。
3)培养第二天，以每次1ml的方式将包含50U/ml的白细胞介素-2(诺华公司阿地白介素(Proleukin，Novatis))的细胞毒性T淋巴细胞培养基添加于各个管中。
4)培养第7天、第9天、第11天及第13天，去除1ml的上层培养基之后，添加了包含50U/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基。
5)培养第14天，向50ml的圆锥管(cornical tube)收集各个管的细胞之后，添加RPMI1640培养基，从而在1400rpm条件下离心分离5分钟来清洗细胞。还将上述过程反复两次。
6)以2×106细胞/ml的浓度，利用细胞毒性T淋巴细胞培养基悬浮清洗的细胞之后，分别以5μg/ml的浓度添加3-4种的相同的肽来培养。
(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选
1)培养第24小时，收集再活性化一天的外周血单个核细胞来利用 RPMI1640培养基清洗两次之后，以5×106细胞/ml的浓度悬浮细胞毒性T淋巴细胞培养基，并添加了50U/ml的白细胞介素-2。
2)以每次1ml的方式向以50μg/ml的浓度涂敷一天的6孔板或12孔板 (cultureplate)添加这些细胞，在CO2培养箱中，将抗4-1BB抗体培养10分钟。
3)培养10分钟后，全部清洗未附着于板的细胞来去除，之后，向各个孔添加了2-4ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2的细胞毒性T淋巴细胞培养基，来在CO2培养箱中培养两天。
(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养
1)全部收集利用抗4-1BB抗体分离来培养两天的细胞，从而利用RPMI1640 培养基清洗两次来进行计数。
2)从正常供体分离外周血单个核细胞来以1×108细胞/ml悬浮之后，以 3000rad放射线照射来诱导细胞的死亡之后，使用为可对T细胞的增殖诱导提供需要的共同刺激(costimulation)的培养添加物。
3)向50ml的圆锥管添加分离的CD8+T细胞5×105细胞和照射的同种异体(irradiated allogeneic)多个外周血单个核细胞1×108细胞之后，将包含1000U/ml 的白细胞介素-2、40ng/ml的抗-CD3 mAb(BD Bioscience)及3％的自体血浆 (autoplasma)的ALyS505N培养基(株式会社细胞科学研究所 (CELLSCIENCE&TECHNOLOGY INST.,INC.(CSTI)))添加至50ml。
4)向1L的培养用袋(culture bag)注入50ml的细胞悬浮液之后，在CO2培养箱中培养。
5)培养第4天，向1L的培养用袋追加注入了50ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2及3％的自体血浆的ALyS505N培养基。
6)培养第7天，向1L的培养用袋追加注入了100ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2及3％的自体血浆的ALyS505N培养基。
7)培养第9天，向1L的培养用袋追加注入了300ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2及3％的自体血浆的ALyS505N培养基。
8)培养第11天，向1L的培养用袋追加注入了500ml的包含1000U/ml的白细胞介素-2及3％的自体血浆的ALyS505N培养基。
9)培养第14天，收集1L的培养用袋的所有细胞，来用注射用生理食盐水清洗三次，并且在包含5％的白蛋白的注射用生理食盐水中悬浮细胞来充电完成品T细胞治疗剂。
如上所述，通过本发明的表位筛选从临床癌症患者筛选可诱导T细胞反应的3-4种的3分以上的肽之后，利用50cc的血液来执行人端粒酶逆转录酶、 WT、NY-ESO1、黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产，其结果在表6至表9 中进行整理。
图14为用于说明人端粒酶逆转录酶T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图14为从50cc的具有人类白细胞抗原-A*24等位基因(allele)的胃癌患者的血液中分离外周血单个核细胞，来分别以1μg/ml的浓度添加三种人端粒酶逆转录酶肽(peptide)[CLKELVARV(序列1)、PLFLELL(序列2)及AAVTPAA (序列3)]之后，根据在上述实施例3的“(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖”中记述的过程进行了培养。培养第14天，收集全部细胞来根据“(2) 自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选”过程，与人端粒酶逆转录酶肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过“(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养”过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定 TCRVb型的T细胞。
图15为用于说明WT1T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图15为从50cc的具有人类白细胞抗原-A*24等位基因的恶性神经胶质瘤患者的血液中分离外周血单个核细胞，来分别以1μg/ml的浓度添加四种WT1 肽(WT1 peptide)[SLGEQQVSV(序列4)、RMFPNAPVL(序列5)、 CMTWNQMNL(序列6)、VLDFAPPGA(序列7)]之后，根据在上述实施例 3的“(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖”中记述的过程进行培养。培养第14天，收集全部细胞，来根据“(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选”过程，与WT1肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过“(3) 自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养”过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
图16为用于说明NY-ES01 T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图16为从50cc的具有人类白细胞抗原-A*24等位基因的卵巢癌患者的血液中分离外周血单个核细胞，来分别以1μg/ml的浓度添加四种NY-ES01肽 (NY-ES01 peptide)[SISSCLQQL(序列8)、RLLEFYLAM(序列9)、 GVLLKEFTV(序列10)、ILTIRLTAA(序列11)]之后，根据在上述实施例3 的“(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖”中记述的过程进行培养。培养第14天，收集全部细胞，来根据“(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选”过程，与NY-ES01肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过“(3) 自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养”过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
图17为用于说明黑素瘤抗原-A3T细胞治疗剂的试生产过程的图。
图17为从50cc的具有人类白细胞抗原-A*24等位基因的肉瘤患者的血液中分离外周血单个核细胞，来分别以1μg/ml的浓度添加四种黑素瘤抗原-A3肽 (MAGE-A3 peptide)[LLIIVLAII(序列12)、KIWEELSVL(序列13)、 LVFGIELMEV(序列14)、SLPTTMNYPL(序列15)]之后，根据在上述实施例3的“(1)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖”中记述的过程进行培养。培养第14天，收集全部细胞，来根据“(2)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的筛选”过程，与黑素瘤抗原-A3肽发生反应，从而分离/增殖了已增殖的T细胞。通过“(3)自身癌抗原特异性CD8+T细胞的大量培养”过程，分离的T细胞以可给药到癌症患者的水平进行大量培养，并且根据流式细胞分析，最终培养的细胞为具有低的老化度和作用功能的特定TCRVb型的T细胞。
以上，以优选的多个实施例为中心对本发明进行了观察。本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的本质特性的范围内能够以变形的形态来实现本发明。因而所公开的实施例不应从限定的观点考虑，而应从说明的观点考虑。本发明的范围未示于上述说明中，而示于发明要求保护范围中，在与其等同的范围内的所有差异应解释为包含于本发明中。
Claims (10)
1.一种自身癌抗原特异性CD8+T细胞的分离和大量培养的方法，其特征在于，包括：
步骤a)，筛选存在于癌症患者血液内的自身癌抗原的CD8+T细胞表位，其中所述自身癌抗原选自由人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3组成的组中；
步骤b)，与上述表位的肽及白细胞介素-2一同，在培养基中培养从癌症患者的血液中分离的外周血单个核细胞；
步骤c)，在培养的上述外周血单个核细胞中添加与步骤b)相同的肽来诱导4-1BB表达；
步骤d)，在涂敷有抗-4-1BB抗体的培养板中孵育诱导了4-1BB表达的细胞之后，去除未附着的细胞；
步骤e)，将在步骤d)中分离的自身癌抗原特异性CD8+T细胞和经照射的同种异体的外周血单个核细胞，悬浮在含白细胞介素-2、抗-CD3的抗体和自体血浆的培养基中；以及
步骤f)，通过追加注入培养基，大量培养步骤e)中的自身癌抗原特异性CD8+T细胞，
其中，步骤a)的筛选表位包括：
a-1)，在由人端粒酶逆转录酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3组成的组中，筛选步骤a)的患者的适当的自身癌抗原类型；
a-2)，收集步骤a)的患者的HLA-A型或状态的数据；
a-3)，使用来自步骤a-1)和步骤a-2)的信息，通过算法选择适当的CD8+T细胞表位；
a-4)，合成在步骤a-3)中的各表位的肽；
a-5)，在含步骤a-4)中的各肽和IL-2的CTL培养基中，培养患者的外周血单个核细胞；
a-6)，通过添加与步骤a-4)中相同的肽，诱导所培养的细胞中的4-1BB的表达；
a-7)，使用流式细胞仪，分析在步骤a-6)中收集的细胞上的4-1BB+和CD8+的比率；及
a-8)，选择诱导高4-1BB表达的一种或多种肽作为步骤a)中的患者的CD8+T细胞表位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤a-8)中的选择表位是使用评分系统进行的，所述评分系统包括：
按照所收集的细胞中的4-1BB+和CD8+的表达比率来确定得分，其中，0-3％的得分被确定为1，4-10％的得分被确定为2，11-15％的得分被确定为3，16-20％的得分被确定为4，20％以上的得分被确定为5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在上述步骤b)中，表位是由选自由序列1至序列15组成的组中的氨基酸序列形成的肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤b)中，培养基为包含自体血浆的培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤b)中，培养进行12至16天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤c)中，表达诱导通过培养进行12至36小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤d)中，培养进行1至20分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中的外周血单个核细胞分离自正常供体。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)中的大量培养执行4至15天。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在执行步骤f)中的大量培养期间，在培养第4天、第7天、第9天、第11天及第14天追加注入培养基。
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