CN113302285A - 癌抗原特异性cd8+t细胞的制备及冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；(c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞；以及(e)解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。

Description

癌抗原特异性CD8+T细胞的制备及冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及分离、增殖和冷冻保存抗原特异性CD8+T细胞的技术。
背景技术
由于CD8+T细胞与树突细胞、CD4+T、NK细胞等其它细胞相比功能相对简单，因而在抗肿瘤免疫治疗中意外的副作用发生的可能性较小。一般来说， MHCⅠ类/肽多聚体用于分离抗原特异性CD8+T细胞，但这种方法的缺点是，由于细胞分离后细胞凋亡导致的细胞死亡率很高，因此需要长期培养才能产生足够数量的抗原特异性CD8+T细胞。因此，需要一种替代标志物，能够通过替换刺激T 细胞受体(TCR)的MHC多聚体来分离抗原特异性CD8+T细胞；为此，使用蛋白4-1BB(CD137)。
4-1BB是一种可诱导的共刺激分子，在活化的T细胞中表达；特别是，已知通过4-1BB进行刺激不仅可以增强CD8+T细胞的活性，而且可以通过增加抗凋亡分子(如Bcl-2、Bcl-XL和Bfl-1等)的表达来抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)。
本发明人先前公开了使用活化的CD8+T细胞表达4-1BB或使用抗4-1BB 抗体或五聚体COMP-4-1BBL蛋白分离和增殖抗原特异性CD8+T细胞的方法(韩国注册专利号100882445、101103603、101503341)。本说明书的背景技术是与上述专利披露的相同的T细胞或其生产方法。
这些专利参考文献公开了分离和大规模培养用于以病毒抗原 (EBV/LMP2A、CMV/pp65)或自体抗原(WT-1、hTERT、NY-ESO-1等)形式的外来抗原的抗原特异性CD8+T细胞的技术。然而，在现有的采用被覆有抗4-1BB 抗体的平板分离抗原特异性CD8+T细胞的技术中，分离细胞的纯度随操作人员的技能不同而有很大差异，细胞的培养过程也非常复杂。此外，由于生产过程需要 30天或更长时间，因此需要持续的努力来尽可能缩短生产用于临床应用的细胞疗法所需的时间。
另外，在制备CD8+T细胞时，虽然由于患者的治疗计划和反复治疗等原因，有必要对细胞进行冷冻保存，必要时进行解冻，但迄今为止，T细胞的存活率、增殖能力，以及癌抗原特异性活性都在T细胞冻融后降低。
因此，为了更有效地治疗患者，有必要在短时间内更容易地分离出抗原特异性CD8+T细胞并获得高纯度，以缩短整个培养过程使其快速增殖，并开发一种冷冻保存T细胞的方法，以尽量减少T细胞性能的退化。
发明详述
要解决的问题
本发明旨在提供一种产生癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，该方法即使在所产生的CD8+T细胞被冷冻保存之后也能够维持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。
本发明旨在提供一种通过包含冷冻保存步骤的方法制备的含有CD8+T 细胞的药物组合物。
本发明旨在提供一种方法，其中解冻冷冻的抗原特异性CD8+T细胞并再次进行大规模培养，从而可获得抗原特异性更强的CD8+T细胞，同时其保持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。
解决问题的手段
1.一种制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞； (c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
2.根据第1项制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
3.根据第1项所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中所述癌抗原是从由hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1和EBV组成的组中选择的至少一种。
4.根据第1项制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中步骤(b)使用封闭系统流式细胞仪执行。
5.根据第1项所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中在步骤(d)中，当表达共刺激因子的CD8+T细胞的数量大于或等于预定的每毫升细胞数量时，进行冷冻。
6.根据第1项所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中，在步骤(d)中，当所述CD8+T细胞的数量至少为预定的每毫升细胞数量，并且表达所述共刺激因子的CD8+T细胞的比例至少为预定比例时进行冷冻。
7.根据第1项的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中步骤(d) 包括检测CD8+T细胞的数量和表达共刺激因子的CD8+T细胞的比例的步骤。
8.根据第2项的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，还包括增加步骤(e)中获得的CD8+T细胞数量的步骤(f)。
9.根据第1项所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中所述共刺激因子是选自下组的一种或多种：CD28、CTLA-4、ICOS、PD1、BTLA、HVEM、 CD27、OX40、4-1BB、CD30和SLAM。
10.一种制备癌症治疗组合物的方法，包括(a)从包括癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)激活的细胞中选择表达共同刺激因子的CD8+T细胞；(c) 增加步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和(d)冷冻步骤(c)中获得的CD8+T 细胞。
11.根据第10项的制备癌症治疗组合物的方法，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
12.一种包含癌抗原特异性CD8+T细胞的癌症治疗组合物，其通过以下步骤制备：(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；(c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
13.根据第12项的癌症治疗组合物，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d) 中冷冻的CD8+T细胞。
14.一种癌症治疗方法，包括步骤：施用药物学有效量的包含癌抗原特异性CD8+T细胞的癌症治疗组合物，其通过以下步骤制备：(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞； (c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和(d)冷冻在步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
15.根据第14项的癌症治疗方法，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d) 中冷冻的CD8+T细胞。
发明效果
本发明的CD8+T细胞生产方法使得能够在不降低CD8+T细胞性能的情况下，对其进行冷冻保存。
本发明的CD8+T细胞生产方法使得即使CD8+T细胞已被冷冻保存，也能够维持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。
本发明的CD8+T细胞生产方法使得选择性分离和大规模培养高纯度的癌抗原特异性CD8+T细胞成为可能。
本发明的CD8+T细胞生产方法使快速产生癌抗原特异性CD8+T细胞成为可能。
本发明的CD8+T细胞生产方法可应用于GMP过程。
本发明的含CD8+T细胞的药物组合物使得即使在冷冻保存后也能够维持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。
本发明的含CD8+T细胞的药物组合物能包含高纯度的癌抗原特异性 CD8+T细胞。
附图简要说明
图1示意性地描绘了产生癌抗原特异性CD8+T细胞的过程。
实施发明的最佳方式
本发明涉及一种冷冻保存T细胞的方法以及通过这种方法产生的T细胞。
本发明涉及一种产生癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，该方法使得在所产生的CD8+T细胞即使被冷冻保存之后也能够维持高水平的细胞活力和癌抗原特异性活性。
本发明的药物组合物包含对癌抗原(例如，EBV、CMV、hTERT、 NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3、Neo抗原等)具有特异性的细胞毒性T细胞；从初次增殖到完成最终T细胞大规模培养后冷冻所用的时间可为31天；改进的生产工艺可以是29天，26天，20天或15天。
本发明的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；(c)增加在步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；(d)冷冻在步骤(c) 中获得的CD8+T细胞；以及(e)解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
CD8+T细胞通过以下方式激活：
为了激活CD8+T细胞，PBMC从血液中被分离并与从癌抗原衍生的相应肽一起培养，并且周期性地用来自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组的至少一种细胞因子处理。
CD8+T细胞的共刺激因子是属于CD28家族的蛋白质，例如CD28、 CTLA-4、ICOS、PD1和BTLA；属于TNFR家族的蛋白质，例如HVEM、CD27、 0X40、4-1BB、GITR和CD30；属于SLAM家族的蛋白质，例如SLAM、2B4、 CD2、CD48、CD84、CD229、CRACC、NTB-A；和属于TIM家族的蛋白质，例如TIM-1和TIM-3；但它们不限于此(K.C.Beier等人，European Respiratory Journal，2007 29:804-812)。在本发明的一个实施方式中，共刺激因子是4-1BB。
表达共刺激因子的活化CD8+细胞也可通过以下制备方法制备。
一个实施方式包括：a)步骤：首先用衍生自癌抗原的相应肽培养从癌症患者血液中分离的PBMC(外周血单核细胞)，以及筛选活化T细胞以筛选癌抗原CD8+T细胞表位；和b)步骤：在包含从由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组中选择的至少一种细胞因子和筛选的表位的培养基中培养从癌症患者的血液中分离的PBMC，由此诱导PBMC中的4-1BB表达。
在根据本申请的方法中，CD8+T细胞表位分选或筛选的步骤旨在增加对癌细胞的亲和力或增加存在于血液中的0.1％或更低的低浓度癌抗原特异性CD8+T 细胞的浓度，并且是实现选择性增殖和分离癌抗原特异性CD8+T细胞的第一步。
在该步骤中，可使用CD8+细胞能够识别的各种癌抗原(例如EBV、CMV、 hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3等)源性的表位。然而，这取决于个体患者的情况。换句话说，即使多种癌抗原中相同类型的癌抗原，例如EBV、CMV、 hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3等，可作为表位的部分取决于每个患者的 HLA-A类型和状况。因此，即使在相同的癌抗原内，通过表位筛选选择和使用个体癌症患者血液中存在的癌抗原CD8+T细胞表位很重要，因为对于每个癌症患者，可作为抗原表位的肽部分是不同的。一般来说，为了用于制备T细胞治疗剂，选择3-4种类型的肽作为表位。
本申请的方法从多种癌抗原中选择最适合于在个体中选择和增殖CD8+T 细胞的表位；可以使用能够实现此目的的各种癌抗原，包括自体(自身)和非自身抗原。
例如，来源于患者自身基因的自体癌抗原包括hTERT(GenBank： BAC11010.1)、WT1(GenBank：AAO61088.1)、NY-ESO1(GenBank：CAA05908.1)、 MAGE-A3(NCBI参考序列：NP_005353.1)和癌症特异性突变抗原，例如新抗原 (neoantigens)、突变的P53、RAS等，可包括肿瘤抑制物或促进基因(trigger gene)，以及外源癌抗原，例如致癌病毒抗原，例如CMV、EBV、HPV等。
然而，本申请公开的本发明特征不限于本文，本发明从针对每种类型的癌症具有特异性的各种不同的癌抗原中为每个个体选择最佳表位，并使用它们产生 T细胞。已知的自体癌抗原包括例如WT1、hTERT、NY-ESO1、间皮素、MAGE 等。例如，hTERT是一种自体型癌抗原，其是一种在染色体末端合成端粒DNA的酶，癌细胞对其过度激活以逃避端粒依赖性细胞死亡，其已知是肺癌、胃癌和胰腺癌等多种实体癌的靶抗原(Kim NW,等.Science.1994；266:2011-2015)；WT1是一种与肾母细胞瘤(Wilms)相关的基因，编码一种锌指转录因子，一种参与细胞增殖、分化、凋亡和器官发育的蛋白质，已知是脑脊液癌、肺癌等的靶抗原(CallKM 等.,Cell.1990.60:509-520；Nakahara Y等,Brain Tumor Pathol.2004.21:113-6)。此外，前述NY-ESO1是属于癌-睾丸抗原(CTA)的蛋白质之一，并且已知主要在生殖细胞、肉瘤和包括乳腺癌在内的各种癌细胞中表达(Gnjatic S等，Adv cancer Res.2006；95:1-30)。MAGE-A3是一种属于黑色素瘤相关抗原家族的蛋白，其在健康细胞中的功能尚不清楚，但已知其在多种癌细胞，包括肺癌、肉瘤和黑色素瘤中过度表达，并且已被评估为癌症免疫治疗的合适靶抗原(Decoster L等人，Ann Oncol，2012年6月；23(6)：1387-93)。因此，在本申请的方法中，已知与特定癌症相关的癌抗原可用于产生个体癌抗原CD8+T细胞。
此外，已知病毒癌抗原，包括例如EBV、HPV、MC多瘤病毒、HBV、 HCV、和CMV；已知艾巴氏(Epstein-Barr)病毒抗原作为霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤和NK/T淋巴瘤的靶抗原，而人乳头瘤病毒抗原是子宫癌和头颈癌的靶抗原，而MC多瘤病毒被称为默克尔(Merkel)细胞癌的靶抗原。还已知乙型和丙型肝炎病毒是肝癌的靶细胞。
作为组织特异性癌抗原，酪氨酸酶、GP100和MNRT-1被称为黑色素瘤靶抗原，PSMA、PAP和PSA被称为前列腺癌靶抗原。
使用来自癌抗原的两种、三种、四种、五种或更多种肽。特别是，考虑用作为表位的3-4种肽制备T细胞疗法，所使用的来自癌抗原的肽数目至少为4 或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多，或更多，但不限于此，并且鉴于本申请的方法的特征和相关领域的技术，可以留给本领域技术人员来确定。
本申请的方法包含的表位筛选步骤与传统表位筛选过程的不同之处在于，在筛选过程中，可通过筛选活化T细胞(例如，4-1BB+CD8+T细胞)的方法来选择表位。例如，在抗原刺激后，选择活化的T细胞，并且可以通过检测所存在的活化T细胞(例如，4-1BB+CD8+T细胞)的存在和量来选择能够诱导此类细胞的抗原表位。可使用自动细胞分选机筛选活化的T细胞(例如，4-1BB+CD8+T 细胞)。自动细胞分选机可用于GMP法。例如，可以是封闭系统自动细胞分选机。
在下一步中，通过在包含所选表位和细胞因子的组合的培养基中培养这些PBMC，在从癌症患者血液中分离的PBMC中诱导4-1BB表达。
在根据本申请的一个实施方式中，细胞因子可以是从由IL-2、IL-7、IL-15 和IL-21组成的组中选择的任何一种。在另一实施方式中，细胞因子可以是从由 IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组中选择的至少两种的组合。例如，细胞因子可以是IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-7和IL-15、IL-7和IL-21或IL-15 和IL-21的组合。
常规癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖在培养14天内进行，在培养的第 14天，需另再活化24小时，以诱导抗原特异性CD8+T细胞4-1BB表达。
在本实施例中，本申请的步骤b)可在7、8、9、10、11、12、13或14 天期间进行。
鉴于本申请的目的，在根据本申请的方法的第一和第二步骤中使用的外周血单核细胞(PBMC)来自同一患者。可以使用本领域已知的方法从全血分离 PBMC。
接下来，在用抗共刺激因子抗体和抗CD8抗体染色后分离在活化的 CD8+T细胞中表达共刺激因子的CD8+T细胞。可使用例如自动细胞分选机进行分离。
用自动细胞分选机分离表达抗原特异性共刺激因子的CD8+T细胞，可改善使用涂有共刺激因子的平板的传统方法所引起的若干问题，例如纯度和工作难度。利用共刺激分子，对于抗CD8抗体，和仅在抗原刺激的CD8+T细胞表面表达的标志物染色(与荧光标记剂偶联)后，可有效分离具有两种荧光的抗原特异性 CD8+T细胞。
如上所述，使用自动细胞分选机选择表达共刺激因子的CD8+T细胞的制备方法可用于制备对诸如EBV、hTERT、NY-ESO-1、WT1和MAGE-A3等癌抗原具有特异性的CD8+T细胞。如上所述，通过使用自动细胞分选机选择表达共刺激因子的CD8+T细胞的方法制备的药物组合物可包括至少90％的癌抗原特异性细胞毒性T细胞(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％)。更优选地，其可包含至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％)。
通过使用如上所述的自动细胞分选机选择表达共刺激因子的CD8+T细胞的制备方法制备药物组合物(例如，包含对EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、 WT1或MAGE-A3具有特异性的细胞毒性T细胞的组合物)，其具有高纯度的癌抗原特异性细胞毒性T细胞，并且因此具有作为T细胞治疗剂的优越临床疗效(例如抗癌疗效等)。
在上述筛选步骤中使用的自动细胞分选机可以用于GMP法。例如，可以是封闭系统自动细胞分选机。
可通过培养增加筛选的CD8+T细胞的数量，并且可使用本领域已知的培养CD8+T细胞的方法：例如，在本发明的一个实施例中，将T细胞铺板在涂有抗 CD3和抗CD28抗体的6孔板RPMI培养基(灭活的FBS、1-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、2-巯基乙醇、1％ITS：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)上，并且孵育一定时间，并且在添加IL-7和IL-2孵育后回收细胞，并在含有IL-7和IL-2的新鲜培养基上重新孵育。然而，上述方法是一个说明性示例，本发明不限于此。
在本申请的另一个实施方式中，可通过培养增加CD8+T细胞数量，所述培养包括：(a)步骤：首先用源自癌抗原的相应肽培养从癌症患者血液中分离的 PBMC(外周血单核细胞)，和，筛选活化的T细胞以筛选癌抗原CD8+T细胞表位；b)步骤：在包含筛选的表位和从由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组中选择的至少一种细胞因子的培养基中培养从癌症患者血液中分离的PBMC，从而在 PBMC中诱导4-1BB表达；以及c)步骤：用抗-4-1BB抗体和抗CD8抗体其中4-1BB 表达被诱导的细胞进行染色，然后对其进行分离。
将在下面逐步描述本发明用于筛选抗原表位以产生抗原特异性CD8+T 细胞以及分离和增殖抗原特异性CD8+T细胞的方法。
在根据本申请的方法中，表位分选或筛选的步骤旨在增加对癌细胞的亲和力或增加存在于血液中的0.1％或更低的低浓度癌抗原特异性CD8+T细胞的浓度，并且是实现选择性增殖和分离癌抗原特异性CD8+T细胞的第一步。
在该步骤中，可使用衍生自CD8+细胞能够识别的多种不同的癌抗原(例如EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3等)的表位。然而，这取决于个体患者的情况。换句话说，即使多种癌抗原中相同类型的癌抗原，例如EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3等，可作为表位的部分取决于每个患者的HLA-A类型和状况。因此，即使在相同的癌抗原内，通过表位筛选选择和使用个体癌症患者血液中存在的癌抗原CD8+T细胞表位很重要，因为对于每个癌症患者，可作为抗原表位的肽部分是不同的。一般来说，为了用于制备T细胞治疗剂，选择3-4种类型的肽作为表位。
本申请的方法包括从多种癌抗原中选择最适合于在个体中选择和增殖 CD8+T细胞的表位；可以使用能够实现此目的的各种癌抗原，包括自体(自身)和非自身抗原。
例如，来源于患者自身基因的自体癌抗原包括hTERT(GenBank： BAC11010.1)、WT1(GenBank：AAO61088.1)、NY-ESO1(GenBank：CAA05908.1)、 MAGE-A3(NCBI参考序列：NP_005353.1)和癌症特异性突变抗原，例如新抗原 (neoantigens)、突变的P53、RAS等，可包括肿瘤抑制物或促进基因(trigger gene)，以及外源癌抗原，例如致癌病毒抗原，例如CMV、EBV、HPV等。
然而，本申请公开的本发明特征不限于本文，其从针对每种癌症的各种癌抗原中为每个个体选择一个最佳表位，并使用这些抗原产生T细胞。已知的自体癌抗原包括例如WT1、hTERT、NY-ESO1、间皮素、MAGE等。例如，hTERT 是一种自体型癌抗原，其是一种在染色体末端合成端粒DNA的酶，癌细胞对其过度激活以逃避端粒依赖性细胞死亡，其已知是肺癌、胃癌和胰腺癌等多种实体癌的靶抗原(Kim NW,等.Science.1994；266:2011-2015)；WT1是一种与肾母细胞瘤 (Wilms)相关的基因，编码一种锌指转录因子，一种参与细胞增殖、分化、凋亡和器官发育的蛋白质，已知是脑脊液癌、肺癌等的靶抗原(Call KM等,Cell.1990.60: 509-520；Nakahara Y等,Brain Tumor Pathol.2004.21:113-6)。此外，前述NY-ESO1 是属于癌-睾丸抗原(CTA)的一种蛋白，并且已知主要在生殖细胞、肉瘤和包括乳腺癌在内的各种癌细胞中表达(Gnjatic S等，Adv cancer Res.2006；95:1-30)。 MAGE-A3是一种属于黑色素瘤相关抗原家族的蛋白，其在健康细胞中的功能尚不清楚，但已知其在多种癌细胞，包括肺癌、肉瘤和黑色素瘤中过度表达，并且已被评估为癌症免疫治疗的合适靶抗原(Decoster L等人，Ann Oncol，2012年6月； 23(6)：1387-93)。因此，在本申请的方法中，已知与特定癌症相关的癌抗原可用于产生个体癌抗原CD8+T细胞。
此外，已知病毒癌抗原，包括例如EBV、HPV、MC多瘤病毒、HBV、 HCV、和CMV；已知艾巴氏(Epstein-Barr)病毒抗原作为霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤和NK/T淋巴瘤的靶抗原，而人乳头瘤病毒抗原是子宫癌和头颈癌的靶抗原，而MC多瘤病毒被称为默克尔(Merkel)细胞癌的靶抗原。还已知乙型和丙型肝炎病毒是肝癌的靶细胞。
作为组织特异性癌抗原，酪氨酸酶、GP100和MNRT-1被称为黑色素瘤靶抗原，PSMA、PAP和PSA被称为前列腺癌靶抗原。
使用来自癌抗原的两种、三种、四种、五种或更多种肽。特别是，考虑用作为表位的3-4种肽制备T细胞疗法，所使用的来自癌抗原的肽数目至少为4 或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多，或更多，但不限于此，并且鉴于本申请的方法的特征和相关领域的技术，可以留给本领域技术人员来确定。
本申请的方法包含的表位筛选步骤与传统表位筛选过程的不同之处在于，在筛选过程中，可通过筛选活化T细胞(例如，4-1BB+CD8+T细胞)的方法来选择表位。例如，在抗原刺激后，选择活化的T细胞，并且可以通过检测所存在的活化T细胞(例如，4-1BB+CD8+T细胞)的存在和量来选择能够诱导此类细胞的抗原表位。可使用自动细胞分选机筛选活化的T细胞(例如，4-1BB+CD8+T 细胞)。自动细胞分选机可用于GMP法。例如，可以是封闭系统自动细胞分选机。
在下一步中，通过在包含所选表位和细胞因子的组合的培养基中培养这些PBMC，在从癌症患者血液中分离的PBMC中诱导4-1BB表达。
由于癌抗原特异性CD8+T细胞在血液中以低浓度(0.1％或更低的浓度)存在，因而可以通过向从血液中分离的PBMC添加一种或多种细胞因子和3-4种肽 (通过表位筛选选择)，然后孵育7至9天，使对癌抗原衍生的肽具有特异性的 CD8+T细胞增殖(图1B-1，B-2)并诱导4-1BB表达。因此，总孵育期可减少到 29天或更短、26天或更短、20天或更短、18天或更短，特别是15天。
在根据本申请的一个实施方式中，细胞因子可以是从由IL-2、IL-7、IL-15 和IL-21组成的组中选择的任何一种。在另一实施方式中，细胞因子可以是从由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组中选择的至少两种的组合。例如，细胞因子可以是IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-7和IL-15、IL-7和IL-21或IL-15 和IL-21的组合。
常规癌抗原特异性CD8+T细胞的增殖在培养14天内进行，在培养的第 14天，需另再活化24小时，以诱导抗原特异性CD8+T细胞4-1BB表达。
在本实施例中，本申请的步骤b)可在7、8、9、10、11、12、13或14 天期间进行。
鉴于本申请的目的，在根据本申请的方法的第一和第二步骤中使用的外周血单核细胞(PBMC)来自同一患者。可以使用本领域已知的方法从全血分离 PBMC。
在第三步中，使用抗-4-1BB抗体和抗CD8抗体染色后，分离经诱导以具有4-1BB表达的抗原特异性细胞。可使用例如自动细胞分选机进行分离。使用自动细胞分选机分离抗原特异性4-1BB+CD8+T细胞可改善使用涂有4-1BB抗体的平板的传统方法所引起的若干问题，例如纯度和工作难度。利用4-1BB蛋白，在使用抗CD8抗体和4-1BB抗体对仅在抗原刺激的CD8+T细胞表面表达的标志物(并与荧光标记剂偶联)染色后，可有效分离同时具有两种荧光的抗原特异性CD8+T 细胞。
如上所述，使用自动细胞分选机选择表达4-1BB+的CD8+T细胞的制备方法可用于制备对诸如EBV、hTERT、NY-ESO-1、WT1和MAGE-A3等癌抗原具有特异性的CD8+T细胞。如上所述，通过使用自动细胞分选机选择表达4-1BB+ 的CD8+T细胞的方法制备的药物组合物可包括至少90％的癌抗原特异性细胞毒性 T细胞(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。
通过使用如上所述的自动细胞分选机选择表达4-1BB+的CD8+T细胞的制备方法制备的药物组合物(例如，包含对BV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1 或MAGE-A3具有特异性的细胞毒性T细胞的组合物)具有高纯度的癌抗原特异性细胞毒性T细胞，并且因此具有作为T细胞治疗剂的优越临床疗效(例如抗癌疗效等)。
在上述筛选步骤中使用的自动细胞分选机可以用于GMP法。例如，可以是封闭系统自动细胞分选机。
根据本申请的方法还包括大量增殖这些分离的4-1BB+CD8+T细胞的步骤。
大规模生产步骤可包括在包含IL-2、抗CD3抗体和自体血浆(autologous plasma)的培养基中培养分离的癌抗原特异性CD8+T细胞和经辐照的同种异体 PBMC的步骤。在一个实施方式中，4-1BB+CD8+T细胞(5x105-3x106细胞)、分离于1L培养容器(培养袋或G-Rex装置)中的经辐射的同种异体PBMC(1x108-3 x108细胞)、1000U/mL IL-2和30ng抗CD3mAb经混合并以7到11天的常规间隔添加到培养基中，然后对细胞进行大规模培养，以使其稳定增殖到超过1x109个细胞/升的水平，在这个水平上可以对癌症患者给药。在本发明的一个实施方式中，进行增殖，以使所含细胞处于约1x106细胞/mL或更多、约2x106细胞/mL 或更多、约3x106细胞/mL或更多、约4x106细胞/mL或更多，约5x106细胞/mL 或更多，约6x106细胞/mL或更多，约7x106细胞/mL或更多，约8x106细胞/mL 或更多，约9x106细胞/mL或更多，约1x107细胞/mL或更多，约2x107细胞/mL 或更多，约3x107细胞/mL或更多，约4x107细胞/mL或更多，约5x107细胞/mL 或更多，约6x107细胞/mL或更多，约7x107细胞/mL或更多，约8x107细胞 /mL或更多，约9x107细胞/mL或更多，约1x108细胞/mL或更多，约2x108细胞/mL或更多，约3x108细胞/mL或更多，约4x108细胞/mL或更多，约5x108细胞/mL或更多，约6x108细胞/mL或更多，约7x108细胞/mL或更多，约8x108细胞/mL或更多，或约9x108细胞/mL或更多的水平。
根据本申请的方法包括冷冻增殖(扩增)的癌抗原特异性CD8+T细胞的步骤。
当通过共刺激分子的表达在前一步骤中增殖的细胞中预先选择的CD8+T 细胞的数量达到预定的每毫升细胞数时，可通过添加冷冻保护剂(例如，DMSO) 来进行冷冻步骤。预定细胞数可为1×106细胞/mL、2×106细胞/mL、3×106细胞 /mL、4×106细胞/mL、5×106细胞/mL、6×106细胞/mL、7×106细胞/mL、8×106细胞/mL、9×106细胞/mL、1×107细胞/mL、2×107细胞/mL、3×107细胞/mL、4 ×107细胞/mL、5×107细胞/mL、6×107细胞/mL、7×107细胞/mL、8×107细胞/mL，或9×107细胞/mL。然而，本领域技术人员可以根据需要调整冷冻时间。例如， DMSO的添加量为10％、7.5％、5％或2.5％。表达共刺激分子的CD8+T细胞可以是例如在抗原刺激步骤中表达共刺激分子的细胞，并且也可以是例如在增殖步骤中表达共刺激分子的细胞。
在本发明的一个实施方式中，当CD8+T细胞的数量至少为预定的每毫升细胞数，而选择用于共刺激因子表达的CD8+T细胞的比例至少为预定比例时，可进行冷冻步骤。
预定细胞数可为1×106细胞/mL、2×106细胞/mL、3×106细胞/mL、4 ×106细胞/mL、5×106细胞/mL、6×106细胞/mL、7×106细胞/mL、8×106细胞/mL、 9×106细胞/mL、1×107细胞/mL、2×107细胞/mL、3×107细胞/mL、4×107细胞 /mL、5×107细胞/mL、6×107细胞/mL、7×107细胞/mL、8×107细胞/mL，或9 ×9细胞/mL。然而，本领域技术人员可以根据需要调整冷冻时间。表达共刺激因子的CD8+T细胞的百分比可为例如1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至 40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至 100％。为此，在本发明的一个实施方式中，根据本发明的冷冻步骤可以包括检测CD8+T细胞的数量和表达共刺激因子的CD8+T细胞的比例的步骤。本文中范围内的所有数值被认为是在本说明书中公开的。
根据本申请的方法包括解冻冷冻的癌抗原特异性CD8+T细胞的步骤。
根据本申请的方法还包括增殖解冻的癌抗原特异性CD8+T细胞的步骤。例如，解冻后增殖步骤可以与冷冻前增殖步骤相同或类似的方式进行。在解冻后的增殖步骤中，细胞可以>1×109细胞/mL的水平大量培养，以增殖到可给予癌症患者的水平。
在本发明的一个实施方式中，癌抗原可以是自体癌抗原、病毒癌抗原或组织特异性癌抗原。
例如，来源于患者自身基因的自体癌抗原包括hTERT(GenBank： BAC11010.1)、WT1(GenBank：AAO61088.1)、NY-ESO1(GenBank：CAA05908.1)、 MAGE-A3(NCBI参考序列：NP_005353.1)和癌症特异性突变抗原，例如新抗原 (neoantigens)、突变的P53、RAS等，可包括肿瘤抑制物或促进基因，以及外源癌抗原，例如致癌病毒抗原，例如CMV、EBV、HPV等。
然而，本申请公开的本发明特征不限于本文，本发明从针对每种类型的癌症具有特异性的各种不同的癌抗原中为每个个体选择最佳表位，并使用它们产生 T细胞。已知的自体癌抗原包括例如WT1、hTERT、NY-ESO1、间皮素、MAGE 等。例如，hTERT是一种自体型癌抗原，其是一种在染色体末端合成端粒DNA的酶，癌细胞对其过度激活以逃避端粒依赖性细胞死亡，其已知是肺癌、胃癌和胰腺癌等多种实体癌的靶抗原(Kim NW,等.Science.1994；266:2011-2015)；WT1是一种与肾母细胞瘤(Wilms)相关的基因，编码一种锌指转录因子，一种参与细胞增殖、分化、凋亡和器官发育的蛋白质，已知是脑脊液癌、肺癌等的靶抗原(CallKM 等,Cell.1990.60:509-520；Nakahara Y等,Brain Tumor Pathol.2004.21:113-6)。此外，前述NY-ESO1是属于癌-睾丸抗原(CTA)的一种蛋白，并且已知主要在生殖细胞、肉瘤和包括乳腺癌在内的各种癌细胞中表达(Gnjatic S等，Adv cancer Res.2006；95:1-30)。MAGE-A3是一种属于黑色素瘤相关抗原家族的蛋白，其在健康细胞中的功能尚不清楚，但已知其在多种癌细胞，包括肺癌、肉瘤和黑色素瘤中过度表达，并且已被评估为癌症免疫治疗的合适靶抗原(Decoster L等人，Ann Oncol，2012年6月；23(6)：1387-93)。因此，在本申请的方法中，已知与特定癌症相关的癌抗原可用于产生个体癌抗原CD8+T细胞。
此外，已知病毒癌抗原，包括例如EBV、HPV、MC多瘤病毒、HBV、 HCV、和CMV；已知艾巴氏(Epstein-Barr)病毒抗原作为霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤和NK/T淋巴瘤的靶抗原，而人乳头瘤病毒抗原是子宫癌和头颈癌的靶抗原，而MC多瘤病毒被称为默克尔(Merkel)细胞癌的靶抗原。还已知乙型和丙型肝炎病毒是肝癌的靶细胞。
作为组织特异性癌抗原，酪氨酸酶、GP100和MNRT-1被称为黑色素瘤靶抗原，PSMA、PAP和PSA被称为前列腺癌靶抗原。
本发明的组合物包含药物学有效量的T细胞。有效量可由本领域普通技术人员基于本说明书中的公开内容容易地确定。一般而言，通过首先施用低浓度的活性成分，然后逐渐增加浓度来确定药物学有效量，直到在没有任何副作用的情况下在对象中获得所需效果(例如，与癌症相关的症状减轻或消除)。例如，在Goodman和Gilman的《治疗剂的药理学基础》(Pharmacological Basis of Therapeutics)，Goodman等编，第11版，麦格劳·希尔公司(McGraw-Hill)2005 和《雷明顿：药学的科学与实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，第20版和第21版，Gennaro和费城科学大学编，LWW出版公司(Lippencott Williams and Wilkins)(2003年和2005年)中描述了确定用于施用根据本发明的组合物的给药的适当剂量或施用间隔的方法。
根据本发明的组合物的给药方法可以基于各种因素来确定，例如对象的癌症类型、年龄、体重、性别、医疗状况、疾病的严重程度、给药途径和其他单独给药的药物。因此，尽管给药方法变化很大，但是可以根据常用方法来确定。
对对象施用的根据本发明的组合物的量可由多种因素确定，例如施用方法、对象的健康状况、体重和医疗建议；所有这些因素均在本领域普通技术人员的知识范围内。
包含根据本发明的癌抗原特异性细胞毒性T细胞的用于癌症预防或治疗的药物组合物可包含约1x106细胞/mL或更多、约2x106细胞/mL或更多、约3x 106细胞/mL或更多、约4x106细胞/mL或更多，约5x106细胞/mL或更多，约6x 106细胞/mL或更多，约7x106细胞/mL或更多，约8x106细胞/mL或更多，约9x 106细胞/mL或更多，约1x107细胞/mL或更多，约2x107细胞/mL或更多，约3x 107细胞/mL或更多，约4x107细胞/mL或更多，约5x107细胞/mL或更多，约6x107细胞/mL或更多，约7x107细胞/mL或更多，约8x107细胞/mL或更多，约9x107细胞/mL或更多，约1x108细胞/mL或更多，约2x108细胞/mL或更多，约3x108细胞/mL或更多，约4x108细胞/mL或更多，约5x108细胞/mL或更多，约6x108细胞/mL或更多，约7x108细胞/mL或更多，约8x108细胞/mL 或更多，或约9x108细胞/mL或更多，但本领域普通技术人员能够在可获得相同效果的范围内调节细胞毒性T细胞的浓度。
癌抗原至少是从OY-TES-1、hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1、PSMA、 TARP、间皮素、酪氨酸酶、GP100、MNRT-1、PAP、PSA、CMV、HCV、HBV、 MC多瘤病毒、HPV和EBV组中选择的至少一种。在本发明的一个实施例中，癌抗原可选自由hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1和EBV组成的组。
本发明公开的“组合物”是指根据本发明的细胞毒性T细胞作为活性成分和非活性成分(例如天然或人工运载体、标记物或检测物)，以及活性成分(例如佐剂、稀释剂、偶联剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂和防腐剂)的组合，且包括药学上可接受的载体。运载体还可包括药物学上的赋形剂和额外的蛋白质、肽、氨基酸、脂类和糖类(例如单糖；二糖；三糖；四糖；寡聚糖；醛糖醇、醛酸、糖源多糖(如酯化糖或糖聚合物等)，单独或组合时，在1至99.99wt％或体积％下。蛋白质赋形剂包括例如人血清白蛋白、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白等，但不限于此。可起缓冲作用的代表性氨基酸组分包括例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等，但不限于此。碳水化合物赋形剂还包括例如，单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖；多糖，如棉籽糖、麦芽糊精、葡聚糖和淀粉；以及醛糖，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨醇等，和肌醇；但不限于此。
本领域技术人员将能够通过本领域已知的方法来配制本发明的药物组合物。例如，根据需要，可以与水或其它药学上可接受的液体以注射无菌溶液或悬浮液的形式胃肠外使用。例如，可适当地与药学上可接受的运载体或介质组合，特别是无菌水或盐溶液、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、运载体、防腐剂、粘合剂等；可按公认的药剂学规范要求的单位剂型混合配制。配方中使用的活性成分量可获得指示范围内的合适剂量。
此外，注射用无菌组合物可使用赋形剂液体(例如注射用蒸馏水)根据常规配制规程调配。对于注射用水溶液，可使用例如生理盐水的组合；等渗溶液，包括葡萄糖或其他辅助剂，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠和合适的助溶剂，例如醇，尤其是乙醇和多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇和非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50。油性液体包括例如芝麻油和豆油，并且可与苯甲酸苄酯和苯甲醇组合作为溶解助剂。
注射制剂可例如通过静脉注射、动脉内注射、选择性动脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、脑室内注射、颅内注射、髓内注射等给药；然而，优选地，通过静脉注射给药。
也可与缓冲剂，例如磷酸盐缓冲溶液或醋酸钠缓冲溶液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苯甲醇、苯酚和抗氧化剂组合。制备的注射溶液通常装入合适的安瓿中。
悬浮液和乳液可包含例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为运载体。用于肌肉内注射的悬液或溶液与活性化合物一起是医药上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)，以及(如有必要)适量的盐酸利多卡因。
包含本发明的细胞毒性T细胞的药物组合物可例如通过静脉注射(丸剂注射)或连续输注给对象。例如，根据本发明的药物组合物可在1小时或更短时间内、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少8小时、至少5 小时至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少 6天，至少7天，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少3个月，至少6个月，或按照临床判断确定的间隔连续或以指定时间间隔施用至少1次、至少 2次、至少3次、至少4次或至少5次。可注射制剂可以安瓿形式或单位剂型用多剂量容器配制。然而，本领域的普通技术人员将理解，根据本发明的药物组合物的剂量可取决于各种因素，例如对象的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和先前的治疗史。
根据本发明的药物组合物可以以持续释放形式配制，并且可以通过使用可与要给药的细胞毒T细胞复合或可能包含细胞毒性T细胞的聚合物制备缓释制剂。例如，聚(乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)的基质或硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质可用作生物合成聚合物。
在本发明中，术语“癌症”是指由异常、不受控制的细胞生长引起的众多疾病或紊乱中的任何一种。可能致癌的细胞称为癌细胞，具有不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖等独特的类型特征。通常，癌细胞可能以肿瘤的形式存在，但这种细胞可能在哺乳动物中单独存在，也可能是非肿瘤细胞，如白血病细胞。癌症可通过以下检测：通过检测肿瘤存在的临床或放射学方法；通过检测肿瘤细胞或通过活检等方式获得的其他生物样本；通过检测癌症血液标志物，如 CA125、PAP、PSA、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、LDH和NSE；或通过检测癌症标志物基因型，如TP53和ATM。然而，上述方法的阴性发现并不一定意味着非癌症诊断：例如，一个被发现已经从癌症中完全康复的对象可能仍然患有癌症，正如以复发形式所证实的那样。
在本说明书中，术语“约”可指本领域常用的范围，例如，在平均值的 2个标准偏差内。“约”可理解为在所示值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、 3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％之内。
本发明公开的“组合物”是指根据本发明的细胞毒性T细胞作为活性成分和非活性成分(例如天然或人工载体、标记物或检测物)，以及活性成分(例如佐剂、稀释剂、偶联剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂和防腐剂)的组合，且包括药学上可接受的运载体。运载体还可包括药物学上的赋形剂和额外的蛋白质、肽、氨基酸、脂类和糖类(例如单糖；二糖；三糖；四糖；寡聚糖；醛糖醇、醛酸、糖源多糖(如酯化糖或糖聚合物等)，单独或组合时，在1至99.99wt％或体积％下。蛋白质赋形剂包括例如人血清白蛋白、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白等，但不限于此。可起缓冲作用的代表性氨基酸组分包括例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等，但不限于此。碳水化合物赋形剂还包括例如，单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖；多糖，如棉籽糖、麦芽糊精、葡聚糖和淀粉；以及醛糖，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨醇等，和肌醇；但不限于此。
本领域技术人员将能够通过本领域已知的方法来配制本发明的药物组合物。例如，根据需要，可以与水或其它药学上可接受的液体以注射无菌溶液或悬浮液的形式胃肠外使用。例如，可适当地与药学上可接受的载体或介质组合，特别是无菌水或盐溶液、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、运载体、防腐剂、粘合剂等；可按公认的药剂学规范要求的单位剂型混合配制。配方中使用的活性成分量可获得指示范围内的合适剂量。
此外，注射用无菌组合物可使用赋形剂液体(例如注射用蒸馏水)根据常规配制规程调配。对于注射用水溶液，可使用例如生理盐水的组合；等渗溶液，包括葡萄糖或其他辅助剂，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠和合适的助溶剂，例如醇，尤其是乙醇和多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇和非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50。油性液体包括例如芝麻油和豆油，并且可与苯甲酸苄酯和苯甲醇组合作为溶解助剂。
注射制剂可例如通过静脉注射、动脉内注射、选择性动脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、脑室内注射、颅内注射、髓内注射等给药；然而，优选地，通过静脉注射给药。
本发明的组合物包含药物有效量的T细胞。有效量可由本领域普通技术人员基于本说明书中的公开内容容易地确定。一般而言，通过首先施用低浓度的活性成分，然后逐渐增加浓度来确定药物有效量，直到在没有任何副作用的情况下在对象中获得所需效果(例如，与癌症相关的症状减轻或消除)。例如，在Goodman 和Gilman的《治疗剂的药理学基础》(Pharmacological Basis of Therapeutics)， Goodman等编，第11版，麦格劳·希尔公司(McGraw-Hill)2005和《雷明顿：药学的科学与实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，第20 版和第21版，Gennaro和费城科学大学编，LWW出版公司(Lippencott Williams and Wilkins)(2003年和2005年)中描述了确定用于施用根据本发明的组合物的给药的适当剂量或施用间隔的方法。
根据本发明的组合物的给药方法可以基于各种因素来确定，例如对象的癌症类型、年龄、体重、性别、医疗状况、疾病的严重程度、给药途径和其他单独给药的药物。因此，尽管给药方法变化很大，但是可以根据常用方法来确定。
对对象施用的根据本发明的组合物的量可由多种因素确定，例如施用方法、对象的健康状况、体重和医疗建议；所有这些因素均在本领域普通技术人员的知识范围内。
包含根据本发明的癌抗原特异性细胞毒性T细胞的用于癌症预防或治疗的药物组合物可包含约1x106细胞/mL或更多、约2x106细胞/mL或更多、约3x 106细胞/mL或更多、约4x106细胞/mL或更多，约5x106细胞/mL或更多，约6x 106细胞/mL或更多，约7x106细胞/mL或更多，约8x106细胞/mL或更多，约9x 106细胞/mL或更多，约1x107细胞/mL或更多，约2x107细胞/mL或更多，约3x 107细胞/mL或更多，约4x107细胞/mL或更多，约5x107细胞/mL或更多，约6x107细胞/mL或更多，约7x107细胞/mL或更多，约8x107细胞/mL或更多，约9x107细胞/mL或更多，约1x108细胞/mL或更多，约2x108细胞/mL或更多，约3x108细胞/mL或更多，约4x108细胞/mL或更多，约5x108细胞/mL或更多，约6x108细胞/mL或更多，约7x108细胞/mL或更多，约8x108细胞/mL 或更多，或约9x108细胞/mL或更多，但本领域普通技术人员能够在可获得相同效果的范围内调节细胞毒性T细胞的浓度。
也可与缓冲剂，例如磷酸盐缓冲溶液或醋酸钠缓冲溶液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苯甲醇、苯酚和抗氧化剂组合。制备的注射溶液通常装入合适的安瓿中。
悬浮液和乳液可包含例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为运载体。用于肌肉内注射的悬液或溶液与活性化合物一起是医药上可接受的运载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)，以及(如有必要)适量的盐酸利多卡因。
包含本发明的细胞毒性T细胞的药物组合物可例如通过静脉注射(丸剂注射)或连续输注给对象。例如，根据本发明的药物组合物可在1小时或更短时间内、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少8小时、至少5 小时至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少 6天，至少7天，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少3个月，至少6个月，或按照临床判断确定的间隔连续或以指定时间间隔施用至少1次、至少 2次、至少3次、至少4次或至少5次。可注射制剂可以安瓿形式或单位剂型用多剂量容器配制。然而，本领域的普通技术人员将理解，根据本发明的药物组合物的剂量可取决于各种因素，例如对象的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和先前的治疗史。
根据本发明的药物组合物可以以持续释放形式配制，并且可以通过使用可与要给药的细胞毒T细胞复合或可能包含细胞毒性T细胞的聚合物制备缓释制剂。例如，聚(乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)的基质或硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质可用作生物合成聚合物。
在本发明中，术语“癌症”是指由异常、不受控制的细胞生长引起的众多疾病或紊乱中的任何一种。可能致癌的细胞称为癌细胞，具有不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖等独特的类型特征。通常，癌细胞可能以肿瘤的形式存在，但这种细胞可能在哺乳动物中单独存在，也可能是非肿瘤细胞，如白血病细胞。癌症可通过以下检测：通过检测肿瘤存在的临床或放射学方法；通过检测肿瘤细胞或通过活检等方式获得的其他生物样本；通过检测癌症血液标志物，如 CA125、PAP、PSA、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、LDH和 NSE；或通过检测癌症标志物基因型，如TP53和ATM。然而，上述方法的阴性发现并不一定意味着非癌症诊断：例如，一个被发现已经从癌症中完全康复的对象可能仍然患有癌症，正如以复发形式所证实的那样。
在本发明中，优选根据欧洲药典2.7.24(流式细胞术)进行确认试验，并且如果至少65％的CD8+T细胞被确认并且至少80％的CD8+T细胞被确认具有 CD45RO标志物，则认为确认已经发生。
在本发明中，最好根据欧洲药典2.7.24(流式细胞术)进行纯度测试， CD8+T细胞的CD45RA百分比设置为20％或更低，CD57比率设置为35％或更低， PD-1设置为20％或更低。
本发明中的细胞功能试验或效价试验优选根据欧洲药典2.7.24(流式细胞术)进行试验，其中CD8+T细胞中的IFN-Y表达率为至少10％，或根据欧洲药典2.7.24(流式细胞术)进行试验，其中CD8+T细胞中LAMP1的表达率为10％或更多。
本发明中的细胞活力试验最好按照欧洲药典2.7.29(有核细胞计数和活力)中的人工染料排除法进行，其中活细胞的比例为至少70％。
本发明中，总细胞计数试验优选按照欧洲药典2.7.29(有核细胞计数和活力)中的手动染料排阻方法进行，其中100mL成品中的细胞计数为1.4×109细胞/100mL±20％(1.12-1.68×109细胞/100mL)。
在本发明中，质量试验可以优选地通过细胞治疗药物的原料药和成品药的标准和试验方法中规定的试验来确定，但不必通过相关法规或指南来确定。
如本文所用，术语“抗癌”包括“预防”和“治疗”；“预防”是指通过施用包含本发明抗体的组合物抑制或延缓癌症的任何行为，“治疗”是指通过施用本发明抗体改善或有益地改变癌症症状的任何行为。
下面，参照以下实施例详细说明本发明。这些实施例旨在更具体地说明本发明，并且它们不限制本发明的范围。
实践实施例1：根据本申请方法的EBV特异性CD8+T细胞治疗剂的中试生产 (20天过程)
1-1.EBV特异性CD8+T细胞的增殖
如下所示从EBV阳性健康个体的血液中分离PBMC。使10毫升血液缓慢地流入15毫升的装有5毫升Ficoll(通用电气健康护理有限公司(GE Healthcare)， Ficoll paqueplus，17144002)的试管中，并覆盖在Ficoll溶液的顶部。试管在室温和800xg下离心20分钟(制动速度：0)；仅收获Ficoll和血浆之间的白色层，洗涤并用作PBMC。从PBMC上方的浅黄色层中分离出自体血浆(autologous plasma)，在使用前通过过滤器过滤。
将分离的PBMC以1×106细胞/mL悬浮于含有3％自体血浆的CTL培养基(WELGENE，LM011-77)中，并添加EBV肽(Peptron)以达到2μg/mL的浓度。.然后将细胞悬浮液以各1mL的量等分置于14mL圆管中，并在CO2培养箱 (Nuaire，NU-5841)中开始培养。
在培养的第二天，向每个试管中添加含有100U/mL IL-2(Novatis，阿地白介素(Proleukin))+3％自体血浆的1mL CTL培养基。在培养的第7天，去除1mL 上层培养基，加入含有100IU/mL IL-2和3％自体血浆的1mL新鲜CTL培养基，再孵育2天。
1-2.EBV特异性CD8+T细胞的选择性分离
在培养第9天，收获培养物中的PBMC并在RPMI培养基(WELGENE, LM011-01)中洗涤。洗涤后的PBMC在4℃下用抗4-1BB抗体(Biolegend，309818) 和抗CD8抗体(Biolegend，560347)染色30分钟，然后用RPMI培养基洗涤两次。使用自动细胞分选机(BD Biosciences，FACSMelody)从表达4-1BB和CD8的细胞中选择性分离染色后洗涤的PBMC。用RPMI培养基洗涤选择性分离的细胞，并用自动细胞计数器(Logos Biosystems，LUNA-FL)计数。在使用ALyS505N培养基(株式会社细胞科学研究所(CELL SCIENCE&TECHNOLOGY INSTITUTEINC.)， 1020P10)悬浮分离细胞后，进行以下步骤。
1-3.抗原特异性CD8+T细胞的大规模培养
辐照正常供体血液以诱导细胞死亡，分离PBMC，以1×107细胞/mL悬浮并冷冻。经辐照的PBMC(同种异体PBMC)用作培养添加剂，以提供诱导T 细胞增殖所需的共刺激。然后从PBMC层上方的浅黄色层中分离出同种血浆 (alloplasma)，使用滤膜过滤，然后使用。
在50mL试管中，将选择性分离的EBV肽特异性CD8+T细胞和以200 倍分离细胞计数制备的经辐照同种异体PBMC悬浮在30mL含有3％同种血浆 (alloplasma)的ALys505N培养基中。加入1000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3 抗体(BD Biosciences,555336)。然后将30mL细胞悬浮液置于75T培养瓶中，并在 CO2培养箱中开始培养。
在培养的第3天，将含有1000IU/mL IL-2、3％同种血浆的20mL ALys505N培养基添加到75T培养瓶中。在培养的第5至11天，每隔2至3天，添加等量的ALys505N培养基(包含1000IU/mL IL-2，3％同种血浆)。培养第11 天收集所有培养细胞。
实践实施例2：根据本申请方法的EBV特异性CD8+T细胞治疗剂的中试生产 (26天过程)
2-1.EBV特异性CD8+T细胞的增殖
以等同方式进行实施例1的过程1-1。
2-2.EBV特异性CD8+T细胞的选择性分离
在培养第14天，收获培养物中的PBMC并在RPMI培养基中洗涤。
用自动细胞计数仪计数洗涤后的外周血单核细胞，将细胞悬浮于CTL培养基中，以2×106个细胞/mL的浓度孵育。将3％的自体血浆和100IU/mL的IL-2 加入其中悬浮细胞的CTL培养基中，然后将悬浮细胞以每1ml 2×106个细胞的比例置于24孔板的每个孔中。在培养的第一天加入EBV肽，使其浓度达到2ng/mL，并在CO2培养箱中培养。
在培养第15天，收获培养物中的PBMC并在RPMI培养基中洗涤。洗涤后的PBMC在4℃下用抗4-1BB抗体和抗CD8抗体染色30分钟，然后用RPMI 培养基洗涤两次。使用自动细胞分选机从表达4-1BB和CD8的细胞中选择性分离染色后洗涤的PBMC。用RPMI培养基洗涤选择性分离的细胞，用自动细胞计数仪计数。用ALyS505N培养基悬浮分离的细胞，然后进行下一步。
2-3.抗原特异性CD8+T细胞的大规模培养
辐射正常供体血液以诱导细胞死亡，分离PBMC，以1×107细胞/mL悬浮并冷冻储藏。经辐照的PBMC(同种异体PBMC)用作培养添加剂，以提供诱导T细胞增殖所需的共刺激。然后从PBMC层上方的浅黄色层中分离出同种血浆，使用滤膜过滤，然后使用。
在50mL管中，将选择性分离的EBV肽特异性CD8+T细胞和以200倍分离细胞计数制备的经辐照同种异体PBMC悬浮在30mL含有3％同种血浆 (alloplasma)的ALys505N培养基中。加入1000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3 抗体。然后将30mL细胞悬浮液置于75T培养瓶中，并在CO2培养箱中开始培养。
在培养的第3天，将含有1000IU/mL IL-2、3％同种血浆的20mL ALys505N培养基添加到75T培养瓶中。在培养的第5至11天，每隔2至3天，添加等量的ALys505N培养基(包含1000IU/mL IL-2，3％同种血浆)。培养第11 天收集所有培养细胞。
如上所述，26天过程产生的抗原特异性CD8+T细胞的确认和纯度测试结果证实满足表1所示的所有标准。
[表1]
Figure BDA0003013637780000251
Figure BDA0003013637780000261
此外，功效试验结果证实满足表1的功效试验标准，如下表所示。
实践实施例3：在20天过程的第15天冷冻半成品细胞
在整个过程的第15天，收集一半的大量培养(mass-cultured)细胞，在 RPMI培养基中洗涤，并用自动细胞计数器计数。将细胞在室温下以1800rpm离心5分钟以去除上清液并以5×105细胞/mL等分，然后将细胞悬浮在CS-5冷冻培养基(Biolife溶液，205102)中。
将细胞以5×105细胞/毫升置于细胞冷冻管中，置于细胞冷冻容器 (Biocision，BCS-170)中，并保存在-80℃低温冷冻箱(ThermoFisher，IU2886D) 中一天。再次取出冷冻一天的细胞，并将其储存在-196℃液氮罐(Chart,10650197) 中，直至过期。
实践实施例4：20天过程终产物的冷冻
孵育结束时，收集所有培养的细胞，在RPMI培养基中洗涤，用自动细胞计数仪计数，保存2×107细胞，用于表型分析和功效检测，以检验T细胞治疗剂的质量。其余细胞悬浮于5ml CS-5冷冻培养基中，用自动细胞计数仪计数，分到50ml管中，分别以3×107细胞/mL和5×106细胞/mL冷冻。将3×107细胞/mL 和5×106细胞/mL的细胞冷冻管中的细胞置于细胞冷冻容器中，并置于-80℃低温冰箱中一天。再次取出冷冻一天的细胞，并将其储存在-196℃液氮罐(Chart, 10650197)中，直至过期。
实践实施例5：26天过程终产物的冷冻
孵育结束时，收集所有培养的细胞，在RPMI培养基中洗涤，用自动细胞计数仪计数，保存2×107细胞，用于表型分析和功效检测，以检验T细胞治疗剂的质量。其余细胞悬浮于5ml CS-5冷冻培养基中，用自动细胞计数仪计数，分到50ml管中，分别以3×107细胞/mL和5×106细胞/mL冷冻。将3×107细胞/mL 和5×106细胞/mL的细胞冷冻管中的细胞置于细胞冷冻容器中，并置于-80℃低温冰箱中一天。再次取出冷冻一天的细胞，并将其储存在-196℃液氮罐(Chart, 10650197)中，直至过期。
实践实施例6：解冻冷冻的细胞
6-1.20天过程制备的T细胞治疗剂冷冻后的解冻
取出储存在-196℃液氮罐中的细胞，将细胞浸泡在37℃恒温水浴中解冻(WB-2，大瀚科学有限公司(Daehan Science，Ltd.),DH.WB000122)2分30秒到3分钟。将解冻后的细胞转移到15ml管中，用自动细胞计数仪计数，并检查解冻细胞的细胞计数和存活率。将10ml温RPMI培养基缓慢地覆盖在解冻的细胞上。将管在室温下以1800rpm离心5分钟以去除上清液，并将细胞悬浮于1mL ALys505N培养基中。使用自动细胞计数仪再次计数悬浮在1ml中的细胞数量和存活率，并使用所需的细胞数量。
进行实践实施例1的程序，并且在2、4、8和12周后，按照上述方法解冻用实践实施例4的程序冷冻的细胞，并且测量回收率和存活率；此外，进行验证、纯度和功效试验。
如下表2所示，解冻20天过程终产物后，确认回收率为至少64％，最低存活率为约77.0％。
[表2]
冷冻期 回收率(％) 存活率(％)
2周 75+10 87+5
4周 72+10 83+5
8周 66+10 81+5
12周 64+10 77+5
此外，验证和纯度试验结果证实，所有相关标准均通过，如下表3所示。
[表3]
Figure BDA0003013637780000281
Figure BDA0003013637780000291
除上述试验外，还确认效价试验结果通过了相应标准(表4)。
[表4]
冷冻期 LAMP-1(％)(>10％) IFN-g(％)(>10％)
0周 15.15 16.33
1: 12.34 15.08
2周 23.22 23.24
3周 18.07 20.42
4周 22.26 34.75
8周 28.62 15.75
12周 19.28 14.86
6-2.26天过程制备的T细胞治疗剂的冷冻后解冻
进行实践实施例2的程序，并且在2和4周后，使经实践实施例5的程序冷冻的细胞经历实践实施例6的程序，以测量回收率和存活率；此外，进行验证、纯度和功效试验。
在26天终产物解冻后，如下表5所示，确认回收率为80％，存活率为至少91％。
[表5]
冷冻期 回收率(％) 存活率(％)
2周 80+10 91+10
4周 80+10 91+10
此外，验证和纯度试验结果证实，所有最初标准均通过，如下表6所示。
[表6]
Figure BDA0003013637780000301
还确认效价测试结果通过了下表7所示的相应标准。
[表7]
冷冻期 LAMP-1(％)(>10％) IFN-g(％)(>10％)
0周 22.28 24.19
2周 15.7 21
4周 15.3 24
实践实施例7：使用冷冻细胞的大规模培养过程
辐照正常供体血液以诱导细胞死亡，分离PBMC，以1×107细胞/mL悬浮并冷冻储藏。经辐照的PBMC(同种异体PBMC)用作培养添加剂，以提供诱导T细胞增殖所需的共刺激。
按照上述实践实施例6的冷冻细胞解冻方法解冻细胞，计数并悬浮于含有3％同种血浆的30mL ALys505N培养基中。为此，以200倍于解冻细胞数量的量加入包含同种异体PBMC的经辐射的细胞，并添加1000IU/mL IL-2和30ng/mL 抗CD3抗体。所有添加了添加剂的细胞转移到一个75T培养瓶中，并在CO2培养箱中孵育。在培养的第3天，将含有1000IU/mLIL-2和3％同种血浆的20mL ALys505N培养基添加到75T培养瓶中。在培养的第5天，将含有1000IU/mL IL-2 和3％同种血浆的50mL ALys505N培养基添加到75T培养瓶中。在培养第7天，制备100mL ALys505N培养基，其中包括1000U/mL IL-2、3％同种血浆，并与培养细胞一起转移至175T培养瓶。在培养的第9天，将含有1000IU/mL IL-2和3％同种血浆的200mLALys505N培养基添加到两个175T培养瓶中并培养。培养第 11天收集所有培养细胞。
执行实践实施例7的程序后，在执行实践实施例3的程序后1、2和3个月，如下表8所示，经大规模培养后，确认细胞存活率为至少92％，并且发现细胞增殖已经达到至少4800的倍数。
[表8]
Figure BDA0003013637780000311
此外，验证和纯度测试显示，所有相关标准均通过，如下表9所示。
[表9]
Figure BDA0003013637780000312
此外，功效测试的结果都通过了下表10所示的相应标准。
[表10]
Figure BDA0003013637780000313
执行实践实施例4的程序后，在执行实践实施例7的程序后4、8和12 周，如下表所示经大规模培养后，确认细胞存活率为89％或更高，并且发现细胞增殖已经达到至少175倍。
[表11]
冷冻期 存活率(％) 细胞增殖倍数
4周 89.1 175.4
8周 96.27 1291
12周 93.52 988
此外，验证和纯度测试显示，所有相关标准均通过，如下表12所示。
[表12]
Figure BDA0003013637780000321
此外，效价测试的结果都通过了下表13所示的相应标准。
[表13]
冷冻期 LAMP-1(％)(>10％) IFN-g(％)(>10％)
4周 22.11 41.28
8周 20.43 21.51
12周 26.29 30.00
例如，为了构建权利要求的目的，并不打算以比其文字更窄的方式来解释下面陈述的权利要求，因此也不打算将说明书中的示例性实施例读入权利要求。因此，应当理解，本发明是通过说明而不是通过限制权利要求的范围来描述的。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有出版物、已授权专利、专利申请、书籍和期刊文章均通过引用整体并入本申请。

Claims (15)

1.制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，包括：
(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；
(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；
(c)增加步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和
(d)冷冻步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
2.如权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，还包括步骤(e)：解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
3.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中所述癌抗原是从由hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1和EBV组成的组中选择的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中步骤(b)使用封闭系统流式细胞仪进行。
5.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中在步骤(d)中，当表达共刺激因子的CD8+T细胞的数量大于或等于预定的每毫升细胞数量时，进行冷冻。
6.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中，在步骤(d)中，当CD8+T细胞的数量至少为预定的每毫升细胞数量并且表达所述共刺激因子的CD8+T细胞的比例至少为预定比例时进行冷冻。
7.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中步骤(d)包括检测CD8+T细胞的数量和表达共刺激因子的CD8+T细胞的比例的步骤。
8.根据权利要求2所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，还包括步骤(f)：增加步骤(e)中获得的CD8+T细胞数量。
9.根据权利要求1所述的制备癌抗原特异性CD8+T细胞的方法，其中所述共刺激因子是选自由CD28、CTLA-4、ICOS、PD1、BTLA、HVEM、CD27、OX40、4-1BB、CD30和SLAM组成的组的一种或多种。
10.制备癌症治疗组合物的方法，包括：
(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；
(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；
(c)增加步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和
(d)冷冻步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
11.根据权利要求10所述的制备癌症治疗组合物的方法，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
12.包含通过以下步骤制备的癌抗原特异性CD8+T细胞的癌症治疗组合物：
(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；
(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；
(c)增加步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和
(d)冷冻步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
13.根据权利要求12所述的癌症治疗组合物，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
14.癌症治疗方法，包括给予药物学上有效量的癌症治疗组合物的步骤，所述癌症治疗组合物包含通过以下步骤制备的癌抗原特异性CD8+T细胞：
(a)从包含癌抗原特异性CD8+T细胞的PBMC中激活CD8+T细胞，然后表达这些CD8+T细胞的共刺激因子；
(b)在步骤(a)中激活的细胞中选择表达共刺激因子的CD8+T细胞；
(c)增加步骤(b)中选择的CD8+T细胞的数量；和
(d)冷冻步骤(c)中获得的CD8+T细胞。
15.根据权利要求14的癌症治疗方法，还包括步骤(e)，解冻在步骤(d)中冷冻的CD8+T细胞。
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