LT6677B - Citokinais indukuotų / aktyvuotų kilerinių ląstelių (cik) gavimo iš periferinio kraujo, kaulų čiulpų arba aferezės produkto būdas ir jų panaudojimas - Google Patents
Citokinais indukuotų / aktyvuotų kilerinių ląstelių (cik) gavimo iš periferinio kraujo, kaulų čiulpų arba aferezės produkto būdas ir jų panaudojimas Download PDFInfo
- Publication number
- LT6677B LT6677B LT2019512A LT2019512A LT6677B LT 6677 B LT6677 B LT 6677B LT 2019512 A LT2019512 A LT 2019512A LT 2019512 A LT2019512 A LT 2019512A LT 6677 B LT6677 B LT 6677B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- cells
- medium
- blood
- tubes
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 abstract 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 33
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 31
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 9
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 101100181099 Mus musculus Klra1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000036590 Maladministrations Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- -1 NCR Proteins 0.000 description 1
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001337451 Polyblastus cancer Species 0.000 description 1
- 102100034308 Potassium voltage-gated channel subfamily C member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710144499 Potassium voltage-gated channel subfamily C member 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000000235 effect on cancer Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000007944 immunity cancer cycle Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 210000003049 pelvic bone Anatomy 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005851 tumor immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Išradimas skirtas medicinos sričiai, konkrečiai – citokinais indukuotų kilerinių ląstelių išgavimui iš periferinio kraujo arba kaulų čiulpų arba aferezes produkto, jų aktyvavimui, dauginimui ir panaudojimui imunoterapijoje, siekiant sunaikinti arba sumažinti onkologinį procesą ar jo metastazavimą, taip pat naikinti metastazes, užkertant kelią naujų navikinių darinių susiformavimui, pasitelkiant kilerines ląsteles ir jų produkuojamus imunologiškai aktyvius baltymus. Periferinis kraujas arba kraujo aferezatas arba kaulų čiulpų aspiratas yra separuojamas, išskiriant tik mononuklearinių ląstelių frakciją, ši frakcija yra išsėjama ląstelių auginimo terpėje ant specialaus bioreaktoriaus, kuriame auginama iki 17-20 parų. Auginant ląsteles reaktoriuje, matuojamas gliukozės suvartojimas, tai atspindi ląstelių augimo aktyvumą ir parodo laiką kada jau galima stabdyti gamybą ir rinkti ląsteles šaldymui ir tolesniam naudojimui. Terpė nupilama, surenkamos ląstelės, jos yra skaičiuojamos ir šaldomos dozėmis po 0,5-5,0 mlrd. ląstelių šaldymo terpėje su autologiniu paciento serumu.
Description
IŠRADIMO SRITIS
Išradimas skirtas medicinos sričiai, konkrečiai - citokinais indukuotų kilerinių ląstelių išgavimui iš periferinio kraujo arba kaulų čiulpų arba aferezes produkto, jų aktyvavimui, dauginimui ir panaudojimui imunoterapijoje, siekiant sunaikinti arba sumažinti onkologinį procesą ar jo metastazavimą, taip pat naikinti metastazes, užkertant kelią naujų navikinių darinių susiformavimui, pasitelkiant kilerines ląsteles ir jų produkuojamus imunologiškai aktyvius baltymus.
TECHNIKOS LYGIS
Prieš daugiau nei du dešimtmečius, įrodžius, kad imuninė sistema gali atpažinti ir eliminuoti vėžines ląsteles, didelis dėmesys skirtas imuninių ląstelių tyrimams, mėginant išsiaiškinti kokį poveikį jos turi vėžio genezei. Dabar jau yra žinoma, kad su vėžiu kovoja tiek įgimtas, tiek įgytas imunitetas [Teng MWL, Swann JB, Koebel CM, Schreiber RD, Smyth MJ. Immune-mediated dormancy: An equilibrium with cancer. Journal of Leukocyte Biology 2008; 84: 988-93]. Nepaisant didelės kovojančių ląstelių įvairovės, vėžys, pasitelkdamas savo gynybinius mechanizmus, išvengia sunaikinimo [Dunn GP, Old LJ, and Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annual Review of Immunology 2004a; 22: 329-60].
Dėl imuninės sistemos spaudimo, vėžys, norėdamas išlikti, įgyja savybių, mažinančių jo imunogeniškumą, ir (arba) slopina imuninės sistemos komponentus [Chen DS and Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013; 39: 1-10]. Pastebėjus, kad geresnę prognozę turi pacientai, kuriems dėl infekcijos buvo sužadinta imuninė sistema, pradėta taikyti imunoterapija [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr William Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80], kurios tikslas yra aktyvinti imunines ląsteles ar tikslingai jas nukreipti j vėžinių ląstelių sunaikinimą.
Imunoterapija turi didelį pranašumą prieš tradicinius gydymo metodus, kadangi yra didesnio specifiškumo ir nesukelia sveikų ląstelių žūties [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65]. Vienas iš ląstelinės imunoterapijos komponentų yra natūralūs kileriai (NK). Tai ląstelinio imuniteto ląstelės, kurių funkcija yra tiek tiesiogiai, tiek per prisijungusias signalines molekules (antikūnai) atpažinti pakitusias savas ląsteles ir jas sunaikinti. Ši savybė gali būti pritaikoma kovoje su vėžiniais susirgimais. Kadangi vėžinė ląstelė yra ta pati nuosava ląstelė, tik su pasikeitusiais MHC I komplekso antigenais, NK ląstelės geba jas atskirti, identifikuoti ir sunaikinti [Kuby Immunology 8th edition 2019; ISBN-10: 1-4641-8978-1], Pačios NK ląstelės nėra priskiriamos T ląstelių grupei. Natūralūs citotoksiškumo receptoriai tiesiogiai gali dalyvauti apoptozės proceso paleidime po to, kai prisijungia prie taip vadinamo FAS ligando, kuris parodo, kad ląstelė pakitusi (infekuota virusu ar vėžinė). MHC priklausomi receptoriai dalyvauja apoptozės proceso paleidime. NK lątelė pati susireguliuoja, priklausomai nuo esamų ant ląstelės-taikinio signalų kiekio ir stiprumo, kaip jai elgtis: ar žudyti, ar ignoruoti ląstelę-taikinį [Terunuma H, Deng X, Dewan Z, Fujimoto S, Yamamoto N. Potential role of NK cells in the induction of immune responses: implications for NK cell-based immunotherapy for cancers and viral infections. Int Rev Immunol. 2008;27(3):93110]. Todėl NK ląstelės elgsenoje yra svarbios aktyvacinės ir inhibitorinės molekulės, tokios kaip: Ly49, NCR, CD16 (aktyvacinės), ir inhibitorinės: KIR, CD94/NGK2, ILT arba LIR, Ly49 ir kt. [lannello A, Debbeche O, Samarani S, Ahmad A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 2008 Jul;84(1): 1 -26. doi: 10.1189/jlb.0907650. Epub 2008 Apr 3],
Funkciškai NK ląstelės gali lizuoti savo taikinį per citolitinių granulių išskyrimą. Savo citoplazmoje NK ląstelės turi granules, kuriose yra uždarytos įvairios proteazės ir perforinai, žinomi kaip granzimai. Šios medžiagos paleistos į išorę gali lizuoti šalia esančias ląsteles arba sukelti šalia esančių ląstelių apoptozę. Ližės ir apoptozės sunaikinimo būdai taip pat yra svarbūs imunologiniu požiūriu, toliau priklausomai nuo vykstančio proceso pasijungia kitos imuninės sistemos ląstelės, tokios kaip neutrofilai, makrofagai [Smyth MJ, Hayakawa Y, Takeda K, Yagita H. New aspects of natural-killer-cell surveillance and therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 2002 Nov;2(11):850-61]. Kitas būdas - atpažinti taikinį yra per prisijungusius antikūnus, ši savybė svarbi taikant NK ląsteles kartu su monokloniniais antikūnais, jų terapinis poveikis tokiu atveju gali tik sustiprėti. Prisijungusį antikūną NK ląstelės atpažįsta per CD16 receptorių, kurį pačios ir ekspresuoja. Šis receptorius, susijungęs su antikūno Fc galu, aktyvuoja NK ląsteles ir jos pradeda ližės procesą atpalaiduodamos granzimus. Taip pat NK ląstelės yra jautrios citokinams, tokios molekulės kaip 1L-12/15/18/2 ir CCL5 aktyvuoja NK ląsteles in vivo ir in vitro, taip pat interferonai - tiek gama, tiek alfa - aktyvuoja NK ląsteles priešvirusiniam atsakui. NK ląsteles pačios išskiria interferonus ir TNF alfa molekulę, kuri yra svarbi priešvėžinio imuniteto reguliacijoje. NK ląstelės pasižymi ir tikslia savas-svetimas reguliacija per MHC I atpažinimo mechanizmus. Jeigu ląstelė aptikta NK, ląstelės sekretuoja mažesnius nei įprasta MHC I kiekius, NK ląstelės tokias ląsteles sunaikina. Manoma, kad ši funkcija evoliucionavo iš būtinybės kompensuoti T limfocitų funkciją, kuriai sutrikus ar išsekus, nesant NK ląstelių, organizmas gali žūti, todėl NK ląstelės yra labai svarbi įgimto imuniteto dalis, užtikrinanti tvarkingą visų imuninių grandžių reguliaciją ir darbą. Jos yra neatsiejama imuninės sistemos dalis, taip pat jos pasižymi labai gera savybe, jog esant taikiniui ar pereinant į gynybinę funkciją jos nesekretuoja didelių kiekių biologiškai aktyvių citokinų, todėl taikant jas didelėmis terapinėmis dozėmis, tiek kaip padauginus natyvias ląsteles, tiek modifikuotas genetiškai, nebus sukeliamas citokinų atpalaidavimo sindromas, kas būdinga taikant T limfocitų terapijas ar CAR-T ląsteles. Todėl NK ląstelės yra labai patogus įrankis, kuriant genetiškai modifikuotų ląstelių gydymo metodus [vadovėlis: DOI 10.1007/sl 1523-017-0489-2]. NK ląstelės dažnai neturi tiksliai išreikšto antigeno receptoriaus ir yra dalis įgimto imuniteto, tai reiškia, kad jos gali labai greitai reaguoti į antigeną, be išankstinio apsimokymo prieš jį. Moksliniai duomenys rodo, jog ši savybė yra labai svarbi vėžio išgyvenamumo ir sunaikinimo balanse. Jos gali greitai aptikti pakitusias ląsteles ir jas sunaikinti be išankstinio žinojimo kas jose pakito. Nes, pavyzdžiui, T ląstelėms, kad atpažintų ir reaguotų į taikinį, yra būtina prieš tai būti su juo susidūrus [Vivier E, Raulet DH, Moretta A, Caligiuri MA, Zitvogel L, Lanier LL, Yokoyama WM, Ugolini S. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 2011 Jan 7;331 (6013):44-9. doi: 10.1126/science. 1198687], Tuo atveju jeigu vėžinė ląstelė nesukelia uždegimo, tai T ląstelės jos neatpažins ir eigoje vystysis vėžinis susirgimas, NK ląstelės šioje grandyje gali pradėti elgtis kaip imunosupresoriai, nes nėra aktyvacijos signalo, tylint T ir kitoms imuninės sistemos ląstelėms (makrofagai, dendritinės, neutrofilai), tačiau pačios NK ląstelės turi ne tik bendrus receptorius citokinams ir įvarioms signalinėms molekulėms, užkuriančioms arba supresuojančioms imuninę funkcija, jos turi alternatyvius receptorius, kurie yra specifiniai vėžinių ląstelių ližei (NKG2D, NKp44, NKp46, NKp30 ir DNAM). Būtent per juos N K ląstelės geba tiesiogiai dalyvauti vėžinio proceso kontrolėje. Jos taip pat sąveikauja su dendritinėmis ląstelėmis, formuodamos kompleksinį imuninį atsaką [Vadovėlis: doi:10.5772/intechopen.78804, Terunuma H, Deng X, Dewan Z, Fujimoto S, Yamamoto N. Potential role of NK cells in the induction of immune responses: implications for NK cell-based immunotherapy for cancers and viral infections. Int Rev Immunol. 2008,27(3):93-110. doi: 10.1080/08830180801911743]. Šią funkciją labai svarbu paminėti, turint omenyje mūsų išradime minimą produktą kaip dendritinėmis ląstelėmis praimuotos NK ląstelės. Šios ląstelės yra praėjusios apmokymo etapus in vitro ir gali būti taip, jog jų suleidimas pacientui bus naudingas ūmia reakcija į jo vėžines ląsteles, tačiau šiuo atveju visada išlieka nepataikymo tikimybė, todėl praimuotos NK ląstelės nėra išskiriamos į atskirą produktą, geriausiai yra taikyti mišrią technologiją, tuo metu šansai paveikti naviką tiesiog yra padidinami.
Nepaisant didelės pažangos moksle, naujų vaistų sukūrime ir naviko biologijos pažinime, vėžys vis dar išlieka viena iš pagrindinių mirties priežasčių ne tik tarp besivystančių, bet ir išsivysčiusiose šalyse. Šiuo metu svarbiausi vėžio gydymo metodai yra trys: chirurgija (naviko pašalinimas), chemoterapija (vaistų vartojimas) ir radioterapija (spindulinis gydymas). Kiekvienas būdas turi apribojimų ar pašalinių poveikių, pvz.: chirurginis gydymas gali būti taikomas, tik šalinant kietą, apčiuopiamą naviką, o problemų kyla dėl nepašalintų pradinio naviko liekanų ar metastazių. Chemoterapija yra grįsta sparčiai besidalijančių ląstelių naikinimu įvairiais citostatikais, tačiau organizme greitai proliferuoja ne tik vėžinės ląstelės, bet ir plaukų folikulų, žarnyno epitelio, kaulų čiulpų ląstelės ir kt. [Aly HAA. Cancer therapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382: 1-23]. Imuninės sistemos ląstelės, pvz.: makrofagai, gali slopinti chemoterapijos efektyvumą priklausomai nuo naviko rūšies. Vienas pirmųjų tyrimų, siekiant išsiaiškinti makrofagų įtaką chemoterapijai, parodė, kad vėžio gydymui skiriamas preparatas doksorubicinas pelėse, susargdintose leukemija ar limfoma, sustiprina priešvėžinį makrofagų poveikį. Kitas pavyzdys yra B ląstelės, kurios netiesiogiai skatina ortotopinės epitelinio audinio karcinomos progresavimą. Chemoterapija, neinhibuojant B ląstelių, yra neveiksminga. Tik kartu su anti-CD20 antikūnais, vaistas paklitakselis yra veiksmingas prieš šios rūšies vėžį [Coffelt SB and de Visser KE. Immune-mediated mechanisms influencing the efficacy of anticancer therapies. Trends in Immunology 2015; 36 (4): 198-216],
Norint pasiekti geresnių rezultatų, yra taikomas kombinuotas kelių metodų gydymas. Gydymas tradiciniais chemoterapijos metodais yra kenksmingas, kadangi yra pažeidžiamos ir sveikos ląstelės, todėl tikimasi didelių pasiekimų, pradėjus plačiai taikyti imunoterapiją, specifiškai nukreiptą prieš vėžines ląsteles. Imunoterapija vėžio gydymo metodas, kuomet imuninės sistemos komponentai yra aktyviai arba pasyviai suaktyvinami ir nukreipiami piktybinių ląstelių sunaikinimui. Dėl didesnio specifiškumo yra išvengiama pašalinių poveikių, kuriuos sukelia įprasti gydymo metodai [Eggermont LJ, Paulis LE, Tel J, Figdor CG. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology 2014; 32 (9): 456-65],
Pirmosios imunoterapijos užuomazgos siekia XIX a. pabaigą, kai W. Coley pastebėjo, kad pacientas, pasiekęs visišką naviko remisiją, prieš tai persirgo ūmia streptokokų sukelta infekcija. Vėliau, sukūręs vakciną iš negyvų Streptococcus pyogenes ir Serratia marcescens bakterijų, pradėjo gydyti neoperuotinu vėžiu (dažniausiai sarkoma) sergančius žmones. Vakcinos paskirtis buvo sužadinti imuninę sistemą [Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr William Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80; Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13]. Maždaug tuo pat metu R. Pearl pranešė, kad tuberkuliozė turi priešvėžinį poveikį, todėl sugalvota vėžio gydymui panaudoti vakciną, taikomą tuberkuliozės gydymui - BCG (baccile Calmette-Guėrin). BCG vakcina šiuo metu yra vienintelė bakterinės kilmės vakcina, taikoma imunoterapijoje neinvazinio šlapimo pūslės vėžio gydyme [Mayer G. Immunology chapter one: innate (non-specific) immunity. Microbiology and Immunology On-Line Textbook. University of South Carolina School of Medicine. http://pathmicro.med.sc.edu/ghaffar/innate.htm [cituota 2015 05 01].; Cann SAH, van Netten JP, van Netten C. Dr William Coley and tumour regression: A place in history or in the future. Postgraduate Medical Journal 2003; 79: 672-80]. Plaučių vėžio imunoterapijoje BCG yra taikoma tik kaip adjuvantas imuninės sistemos stimuliavimui [Raez LE, Fein S, Podack ER. Lung Cancer Immunotherapy. Clinical Medicine & Research 2005; 3 (4): 221-8],
Antigenų, susijusių su naviku (TAA), atradimas paskatino specifinės imunoterapijos vystymą [Parish CR. Cancer immunotherapy: the past, the present and the future. Immunology and Cell Biology 2003; 81: 106-13; Wayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. A personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352: 113-25], kurios tikslas yra sužadinti imuninės sistemos atsaką į naviką [Bluestone JA, Small EJ. The future of cancer treatment: Will it include immunotherapy? Cancer Cell 2012; 22: 7-8], žinant, kad efektyvus imuninis atsakas neišsivysto dėl sumažėjusio imuninių ląstelių atpažinimo, silpno naviko imunogeniškumo ir imunosupresinės naviko aplinkos [Kumar S and Mason M. Principles of cancer treatment by immunotherapy. Surgery 2012; 30 (4): 198-202],
Pagal veikimą naviko imunoterapija yra skirstoma į pasyviąją ir aktyviąją. Pasyvioji imunoterapija apima visas imunologiškai aktyvias medžiagas, imunomoduliuojančias ląsteles ir nepriklauso nuo paties paciento imuninės sistemos funkcionavimo, kadangi jam yra pateikiamos ląstelės, pasižyminčios priešvėžiniu poveikiu [Aly HAA. Cancer therapy and vaccination. Journal of Immunological Methods 2012; 382: 1-23], Toliau pasyviąją imunoterapiją galima smulkiau suskirstyti į terapiją monokloniniais antikūnais, stimuliuojančiais citokinais ir adoptyviomis T ląstelėmis [Wayteck L, Breckpot K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K. A personalized view on cancer immunotherapy. Cancer Letters 2014; 352. 113-25]. Pagal kito šaltinio skirstymą prie pasyviosios imunoterapijos dar yra priskiriama kaulų čiulpų transplantacija [Zavala VA and Kalergis AM. New clinical advances in immunotherapy for the treatment of solid tumours. Immunology 2015],
Aktyviajai imunoterapijai yra būtina tinkamai funkcionuojanti paciento imuninė sistema, kadangi gydymo metu kovai su vėžinėmis ląstelėmis yra sužadinami recipiento imuniniai mechanizmai. Aktyviajai imunoterapijai yra priskiriamos įvairios vakcinos: BCG, peptidinės, DNR, dendritinių ląstelių ir kt, kurios turėtų būti kiek galima mažiau toksiškos organizmui, galėtų sukelti priešvėžinį imuninį atsaką ne tik prieš pirminį naviką, bet ir prieš metastazes, kurių poveikyje susidarytų imuninė atmintis, apsauganti nuo ligos atsinaujinimo [Moingeon P. Cancer vaccines. Vaccine 2001; 19: 1305-26.; Yannelli JR and Wroblewski JM. On the road to a tumor cell vaccine: 20 years of cellular immunotherapy. Vaccine 2004; 23: 97-113].
TRUMPAS IŠRADIMO APRAŠYMAS
Citokinais indukuotų ląstelių dauginimas yra globali problema, šios ląstelės labai priklauso nuo donoro, jo esamos būklės, taikytų ankstesnių gydymo schemų ir kitų neapibrėžtų / nežinomų parametrų. Mūsų sukurtas ląstelių dauginimo metodas yra išskirtinis tuo, kad gaunamas ganėtinai stabilus ląstelių skaičius preparate su dideliu NK ląstelių kiekiu jame. Taip pat ląstelių gamybai naudojamas unikalus mišinys aktyvuojančių molekulių, išlaikomas specifinis aktyvacijos periodas ir proliferacijos periodas, skirtas ląstelių kryptingam dalinimuisi ir brendimui.
Periferinis kraujas arba kraujo aferezatas arba kaulų čiulpų aspiratas yra separuojamas, išskiriant tik mononuklearinių ląstelių frakciją, ši frakcija yra išsėjama ląstelių auginimo terpėje ant specialaus bioreaktoriaus arba flakono, kuriame auginama iki 17-20 parų. Auginant ląsteles reaktoriuje, matuojamas gliukozės suvartojimas, tai atspindi ląstelių augimo aktyvumą ir parodo laiką kada jau galima stabdyti gamybą ir rinkti ląsteles šaldymui ir tolesniam naudojimui. Terpė nupilama, surenkamos ląstelės, jos yra skaičiuojamos ir šaldomos dozėmis po 0,5-5,0 mlrd. ląstelių šaldymo terpėje su autologiniu paciento serumu. Atliekamas sterilumo tyrimas ir kiti privalomi tyrimai.
IŠSAMUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
I. Mononuklearinių ląstelių išskyrimas iš kraujo, aferezato, kaulų čiulpų aspirato
Kraujas skiedžiamas hidroetilkrakmolo tirpalu, skirtu infuzijoms kaip plazmos pakaitalas, skiedžiama santykiu 1:1. Sumaišytas tirpalas paliekamas nusistovėti kambario temperatūroje 20-40 min., per tiek laiko paprastai išsiskiria du sluoksniai, apatinis, turtingas eritrocitais, ir viršutinis, kuriame yra eritrocitų, plazmos bei branduolinių kraujo elementų. Viršutinis sluoksnis yra surenkamas į centrifuginius mėgintuvėlius ir centrifuguojamas prie 1000-1500 G 5-15 min. kambario temperatūroje, po centrifugavimo supernatantas yra nupilamas, o nuosėdos suspenduojamos druskos tirpale arba likusiame viršutiniame kraujo / hidroksietilkrakmolo tirpalo mišinyje. Paprastai, esant 50-300 ml kraujo, centrifugatas yra skiedžiamas iki 40 ml baigtinio tūrio. Jeigu kraujo yra daugiau, atitinkamai proporcingai yra skiedžiamas ir centrifugatas. Tuomet j 15 arba 50 ml mėgintuvėlius yra pripilama fikolo arba perkolo tirpalo, kurio tankis yra nuo 1,0 iki 1,12 g/ml. Tirpalo pilama ne daugiau kaip 1/3 mėgintuvėlio tūrio. Ant šio tirpalo pipete iš lėto, palenkus mėgintuvėlį, kuo gulsčiau atsargiai pilamas skiestas ląstelių centrifugatas iki mėgintuvėlio viršaus. Mėgintuvėliai centrifuguojami prie 1100-1500 G 10-20 min. kambario temperatūroje, stabdis nenaudojamas. Po centrifugavimo mėgintuvėliuose matomos trys frakcijos: apačioje - eritrocitų frakcija, virš eritrocitų - mononuklearų sluoksnis, plaukiojantis aukščiau fikolo skaidraus sluoksnio, virš mononuklearų skluoksnio - trombocitai kartu su praskiesta hidroksietilkrakmolu plazma. Pipete atsargiai yra surenkamas mononuklearų sluoksnis ir supilamas j naujus mėgintuvėlius, kuriuose yra įpilta druskos tirpalo arba ląstelių auginimo terpės. Vyksta ląstelių plovimo nuo gradiento medžiagos (fikolo arba perkolo) etapas. Ląstelės gerai išmaišomos ir centrifuguojamos prie 500-850 G 10-20 min. kambario temperatūroje. Stabdis nenaudojamas. Procedūra gali būti kartojama kelis kartus. Po plovimo ląstelės suskaičiuojamos ir išsėjamos j ląstelių auginimo reaktorių (tūris 1L) arba flakonus (175 cm2 ploto), tokiu santykiu: 20-100 milijonų ląstelių ir 100 ml indukuojamosios terpės, skirtos NK ląstelėms, T limfocitams arba dendritinėms ląstelėms auginti su papildomais priedais, kurie gali būti anti CD3 ir (arba) antiCD28 ir (arba) antiCD127 ir (arba) antiCD335 molekulė, bei interferonais, tokie kaip interferonas alfa ir (arba) interferonas gamma, įskaitant visus jų pogrupius. Bioreaktorius / flakonai yra inkubuojami ląstelių kultūroms skirtuose inkubatoriuose 37 °C temperatūroje ir 5-15 % CO2 aplinkoje 12-24 valandas. Po inkubacijos, jeigu auginama bioreaktoriuje, pridedama proliferacinės terpės, kurioje yra citokinai, tokie kaip IL-2 ir (arba) IL-15 ir (arba) IL-18. Jeigu dirbama su flakonais, proliferaciją skatinantys citokinai dedami tiesiai į terpę, papildant ją auginimo terpe 25 % nuo viso terpės tūrio. Ląstelės auginamos iki 17-20 parų, stebimas gliukozės ir (arba) laktato kiekis. Auginant flakonuose, terpė keičiama nauja, papildant ją tiek aktyvacinėmis, tiek proliferaciją aktyvuojančiomis molekulėmis. Terpės keičiamas kiekis nusprendžiamas pagal metabolitų suvartojimą / atsiradimą (gliukozė / laktatas). Auginant flakonuose, ląstelės resuspenduojamos pipete (išvengiant didelių ląstelių agregatų). Auginant bioreaktoriuje, matuojami tik metabolitai, ir vizualiai stebimas ląstelių augimas ant reaktoriaus pagrindo. Kuomet gliukozės ar laktato koncentracijos pasiekia kritines ribas (12-13±2 mmol), auginimas yra stabdomas ir ląstelės yra renkamos bei šaldomos. Gaminant praimuotas NK ląsteles, 5-7 auginimo dienoje į ląstelių kultūrą įpilamas 1-10 min. Autologinių / alogeninių su specifiniu antigenu brandintų denritinių ląstelių. Toliau auginimas nesikeičia. Ląstelės šaldomos koncentracijoje nuo 0,5-5,0 mlrd. Ląstelių / 25 ml terpės skirtos šaldymui. Šaldymo terpė sudaryta iš 10 % DMSO (dimetilsulfoksidas) autologinio paciento serumo arba plazmos. DMSO niekada nėra įmaišomas kaip grynas tirpalas į ląstelių suspensiją, jis maišomas tik praskiestas su serumu. Tirpalai, maišant su DMSO kaista, todėl visi tirpalai atšaldomi, prieš pradedant ląstelių šaldymo procedūrą. Su šaldymo terpe sumaišytos ląstelės yra išpilstomos j šaldymo mėgintuvėlius, kurie dedami j šaldymo dėžutę arba šaldymo įrenginį ir šaldomi pagal standartinį protokolą -1 °C/min., patalpinant juos j -80 °C temperatūrą porai valandų. Užšaldytas preparatas yra saugomas iki jo sunaudojimo -80 °C arba -196 °C temperatūroje.
Iš specialiai atskirai surinkto mėginio yra atliekami būtini ląstelių kokybinių parametrų tyrimai (bakterinės, grybelinės infekcijos, paviršiaus žymenys (CD3/16/56/8/4/69 gali būti pildoma pagal mokslinį progresą), gyvybingumo analizė, endotoksinų ir mikoplazmos tyrimas).
II. CIK atšildymas ir suleidimas
Užšaldytas mėgintuvėlis / maišelis ištraukiamas iš šaldymo vietos ir nedelsiant yra patalpinamas į indą su šiltu +37 °C temperatūros vandeniu. Atšildoma iki kol ledas visiškai ištirps ir pripilamas toks pats tūris fiziologinio skysčio arba autologinio serumo, jeigu yra vietos maišelyje, jeigu maišelis yra 25 ml, tai lašinama tiesiai iš maišelio į veną, likus 5-10 % tūrio j maišelį steriliai pripilama dar 20 ml fiziologinio skysčio, preparatas toliau sulašinamas kol maišelyje neliks skysčio. Lašinama intraveniškai 5 ml/min greičiu. Stebima paciento būsena, pasireiškus galvos skausmams ar pykinimui, lašinimimo greitis sumažinamas iki 2 ml/min. Neigiamos reakcijos į CIK preparato taikymą pasireiškia retai, dažniausiai tai būna aukšta temperatūra, galvos skausmas, kas praeina be papildomo vaistinio įsikišimo per 30-45 minutes. Esant labai aukštai temperatūrai, reikia naudoti acetaminofeną (500 mg tab. peros) iškarto po lašinimo, jeigu tai pirmas kartas, jeigu antras kartas tai 30 minučių iki lašinimo. Lašinama per sistemą su tinkleliu ir ne plonesne nei 23 G adata.
CIK taikymo indikacijos ir gydymo pavyzdžiai
Indikacijos procedūrai atlikti:
Karcinomų, sarkomų ir kraujo vėžių (skystųjų navikų) 1-os, 2-os, 3-ios, 4-os stadijų onkologiniai susirgimai.
Ligoniams taikyto gydymo CIK ląstelėmis pavyzdžiai ir jų rezultatai:
Ligonė A.A. IV stadijos metastazuojanti kolorektalinė karcinoma, taikomas gydymas chemoterapija, tirozinkinazės inhibitoriais, paciento išgyvenamumo prognozė - 2-3 mėn. Taikytas gydymas autologinėmis CIK ląstelėmis nuo 2018 metų. Atlikti 7 CIK kursai po 1,0 mlrd. Ląstelių i.v. CIK taikoma tarpuose tarp chemoterapijų. Pacientas yra stabilioje būsenoje, liga neprogresuoja, dingo ascitas, būklė gera.
Ligonė R.P., 2014 m. diagnozuotas krūties vėžys, taikytas chirurginis gydymas, chemoterapija, 2017 metais navikas metastazavo j plaučius ir kepenis, 2018 į smegenis, prognozė bloga, navikai operuoti kur chirurgiškai įmanoma, 2018 metais pradėtas taikyti imunoterapinis gydymas CIK preparatu. Suleista iki 2019 metų balandžio mėnesio 8 CIK kursai po 1,0 mlrd. ląstelių i.v. Šiai dienai pacientė stabili, liga neprogresuoja, vėžio žymenys “tyli, būklė gera.
Ligonė R.R., 2011 metais diagnozuota sarkoma, plitimas labai greitas, auglys išplito į kaulus, kepenis, plaučius, gydymas chemoterapija, radioterapija ligą sulaikė, 2017 prasidėjo aktyvus ligos progresas. Nuo 2018 metų taikyta CIK terapija. 8 kursai po 1,0 mlrd. ląstelių i.v., ligos progresavimas apstojo, metastazės plaučiuose kalcifikavosi, progresavimas visur liovėsi, išskyrus dubens kaulo vieną metastazę, kitos metastazės pradėjo nykti, stebimi daugybiniai uždegiminiai procesai metastazėse. 2019 metų balandžio mėnesį liga laikoma stabilia, paciento būklė gera.
Ligonis V.S., 2018 metais diagnozuota skrandžio karcinoma G3, IV stadija, metastazės pilvaplėvėje. Taikyta operacinis gydymas ir chemoterapija, tarpuose CIK imunoterapija. Atlikti 9 CIK kursai po 1,0-1,5 mlrd. ląstelių i.v. Pacientas 2019 metų balandžio mėnesiui yra stabilus, metastazių plitimas ir naujų atsiradimas nestebimas, pilvaplėves metastazės nyksta.
Claims (7)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Citokinais indukuotų / aktyvuotų ląstelių (CIK) gavimo iš periferinio kraujo, aferezės produkto ar kaulų čiulpų aspirato būdas, apimantis NK (natūralių kilerių) ląstelių išgavimą ir brandinimą, besiskiriantis tuo, kad:a) išskiriama tik mononuklearinių ląstelių frakcija, separuojant periferinį kraują arba kraujo aferezatą arba kaulų čiulpų aspiratą,b) ši frakcija išsėjama ląstelių auginimo terpėje į bioreaktorius arba ląstelių kultūrų flakonus ir inkubuojama parą aktyvacinėje terpėje,c) po inkubacijos bioreaktoriai arba flakonai užpilami proliferacine terpe ir kultivuojami iki 20 parų,d) po 5-7 parų ląstelės praimuojamos dendritinėmis paciento ląstelėmis tikslesniam taikinio identifikavimui,e) baigus auginimą, ląstelės praplaunamos ir užšaldomos naudojimui paruoštomis dozėmis šaldymo terpėje su autologiniu paciento serumu,f) prieš naudojimą, užšaldytas maišelis / mėgintuvėlis patalpinamas į indą su šiltu +37 °C temperatūros vandeniu, atšildomas iki ledas visiškai ištirps ir pripilamas toks pats tūris fiziologinio skysčio arba autologinio serumo.
- 2. Būdas pagal 1 punkto stadiją a), besiskiriantis tuo, kad- praskiedžia kraują hidroetilkrakmolo tirpalu santykiu 1:1 ir palieka nusistovėti kambario temperatūroje 20-40 min., kol išsiskiria du sluoksniai: apatinis, turtingas eritrocitais, ir viršutinis, kuriame yra eritrocitų, plazmos bei branduolinių kraujo elementų;- viršutinį sluoksnį surenka į centrifuginius mėgintuvėlius ir centrifuguoja prie 1000-1500 g pagreičiu 5-15 min. kambario temperatūroje, po centrifugavimo susidariusį supernatantą nupila, o nuosėdas suspenduoja druskos tirpale arba likusiame viršutiniame kraujo / idroksietilkrakmolo tirpalo mišinyje, 50-300 ml kraujo praskiedžiant iki 40 ml tūrio;- į 15 ml arba 50 ml tūrio mėgintuvėlius pripila fikolo arba perkolo tirpalo, kurio tankis yra 1,0-1,12 g/ml, tirpalo pilama ne daugiau kaip 1/3 mėgintuvėlio tūrio;- ant šio tirpalo pipete iš lėto, palenkus mėgintuvėlį, kuo gulsčiau pila skiestą ląstelių centrifugatą iki mėgintuvėlio viršaus;- mėgintuvėlius centrifuguoja 1100-1500 g pagreičiu 10-20 min. kambario temperatūroje, nenaudojant stabdžio;- atsargiai pipete surenka mononuklearų sluoksnį, po centrifugavimo susidariusį tarp apatinio eritrocitų sluoksnio ir viršutinio trombocitų sluoksnio, ir supila į naujus mėgintuvėlius, kuriuose yra įpilta druskos tirpalo arba ląstelių auginimo terpės,- praplauna ląsteles nuo gradiento medžiagos, gerai išmaišo ir centrifuguoja prie 500-850 g pagreičiu 10-20 min. kambario temperatūroje, nenaudojant stabdžio;- procedūrą, reikalui esant, kartoja kelis kartus.
- 3. Būdas pagal 1 punkto stadiją b), besiskiriantis tuo, kad- praplautas ląsteles suskaičiuoja ir išsėja į bioreaktorių arba ląstelių auginimo flakonus santykiu 100 000-500 000 ląstelių/cm2 ir užpila 100 ml terpe, skirta auginti T limfocitus;- flakonus inkubuoja ląstelių kultūroms skirtuose inkubatoriuose 37 °C temperatūroje ir 5-15 % CO2 aplinkoje 24 valandas su aktyvacine terpe.
- 4. Būdas pagal 1 punkto stadiją c), besiskiriantis tuo, kad po inkubacijos su aktyvacine terpe bioreatoriai / flakonai užpilami proliferacine terpe ir auginami iki 20 parų.
- 5. Būdas pagal 1 punkto stadiją d), besiskiriantis tuo, kad praimuojant ląsteles, 5-7 parą ląstelės gali būti papildomai alyvuojamos su autologinėmis dendritinėmis ląstelėmis, įpilant j flakoną ar bioreaktorių 1-10 min. subrandintų dendritinių ląstelių.
- 6. Būdas pagal 1 punkto stadiją e), besiskiriantis tuo, kad- surenka terpę į mėgintuvėlius, ant flakonų užpila PBS tirpalo ir atplauna ląsteles;ląsteles surenka, flakonus praskalauja du kartus PBS arba druskos tirpalu, viską surenka j mėgintuvėlius ir centrifuguoja 450-800 g pagreičiu 10 min. +4 °C temperatūroje;- išcentrifuguotas ląsteles suskaičiuoja ir užšaldo naudojimui paruoštomisLT 6677 B dozėmis po 0,5-5,0 mlrd. ląstelių / 25 ml šaldymo terpės, sudarytos iš 10 % DMSO (dimetilsulfoksido) autologinio paciento serumo arba plazmos;- ląsteles, sumaišytas su šaldymo terpe, išpūsto į šaldymo mėgintuvėlius / maišelius, kurie dedami į šaldymo dėžutę ir šaldomi porą valandų -80 C temperatūroje -1 °C/min. greičiu.
- 7. CIK ląstelės, gautos būdu pagal 1-6 punktus, skirtos panaudoti imunoterapijoje karcinomų, sarkomų ir kraujo vėžių (skystųjų navikų) 1-os, 2-os, 3ios, 4-tos stadijų onkologinių susirgimų gydymui.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2019512A LT6677B (lt) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Citokinais indukuotų / aktyvuotų kilerinių ląstelių (cik) gavimo iš periferinio kraujo, kaulų čiulpų arba aferezės produkto būdas ir jų panaudojimas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2019512A LT6677B (lt) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Citokinais indukuotų / aktyvuotų kilerinių ląstelių (cik) gavimo iš periferinio kraujo, kaulų čiulpų arba aferezės produkto būdas ir jų panaudojimas |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2019512A LT2019512A (lt) | 2019-10-25 |
| LT6677B true LT6677B (lt) | 2019-11-11 |
Family
ID=68318654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2019512A LT6677B (lt) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Citokinais indukuotų / aktyvuotų kilerinių ląstelių (cik) gavimo iš periferinio kraujo, kaulų čiulpų arba aferezės produkto būdas ir jų panaudojimas |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LT (1) | LT6677B (lt) |
-
2019
- 2019-04-18 LT LT2019512A patent/LT6677B/lt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT2019512A (lt) | 2019-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2862433T3 (es) | Uso de linfocitos infiltrantes de médula ósea alogénicos tratados con ciclofosfamida postrasplante para aumentar la inmunidad antitumoral | |
| US8206702B2 (en) | Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer | |
| HK1248523A1 (zh) | 用电穿孔向细胞负载抗原 | |
| CN101506356A (zh) | 用于免疫治疗的活化淋巴细胞的制备方法 | |
| CN104357391B (zh) | 同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3‑CD56+NK细胞的方法 | |
| US20150320798A1 (en) | Use of Post-Transplant Cyclophosphamide Treated Allogeneic Marrow Infiltrating Lymphocytes to Augment Anti-Tumor Immunity | |
| Jiraviriyakul et al. | Honokiol-enhanced cytotoxic T lymphocyte activity against cholangiocarcinoma cells mediated by dendritic cells pulsed with damage-associated molecular patterns | |
| KR20180094903A (ko) | 소분자 절제 화합물을 이용한 암 면역 요법에 대한 면역 세포 활성의 생체외 향상 방법 | |
| KR101299299B1 (ko) | 암면역 요법용 세포의 제조방법 | |
| AU2019240420A1 (en) | Prostate cancer specific marrow infiltrating lymphocytes and uses thereof | |
| El-Ashmawy et al. | A new strategy for enhancing antitumor immune response using dendritic cells loaded with chemo-resistant cancer stem-like cells in experimental mice model | |
| CN108245673A (zh) | 表达Th1特性和溶细胞性质的细胞 | |
| JP2023546143A (ja) | 抗癌関連遺伝子の発現が調節されたナチュラルキラー細胞およびその用途 | |
| CN113260369B (zh) | 癌抗原特异性细胞毒性t细胞 | |
| WO2017147894A1 (zh) | 增强对异常细胞杀伤力的组合物及其应用 | |
| JP2024519691A (ja) | 腫瘍浸潤ｔリンパ球（ｔｉｌ）の産出方法およびヒト腫瘍治療のための細胞治療薬としてのその使用方法 | |
| KR20030081056A (ko) | 종양, 감염증 및 자기면역질환의 예방/치료용ｈｌａ일치타인유래의 활성화림프구, 이 림프구를 사용한치료방법, 이 림프구를 주성분으로 하는 제제, 이 제제의제조방법 및 이 제제를 위한 조제용키트 | |
| Kroon et al. | 4-1BB costimulation of effector T cells for adoptive immunotherapy of cancer: involvement of Bcl gene family members | |
| UA128783C2 (uk) | Т-клітини зі зниженим поверхневим фукозилуванням і способи їх отримання і застосування | |
| CN114058580A (zh) | 体外增殖自然杀伤细胞及自然杀伤t细胞的方法 | |
| CN114072158A (zh) | 肺癌特异性骨髓浸润淋巴细胞及其用途 | |
| CN116617222B (zh) | 小分子离子通道阻滞剂mk-801在制备治疗肿瘤或抗感染药物的应用 | |
| NZ569105A (en) | A method for the expansion of tumor-reactive CD4 positive T-helper and CD positive T-lymphocytes | |
| KR100569609B1 (ko) | 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법 | |
| CN113302285A (zh) | 癌抗原特异性cd8+t细胞的制备及冷冻保存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Patent application published |
Effective date: 20191025 |
|
| FG9A | Patent granted |
Effective date: 20191111 |