KR20180094903A - 소분자 절제 화합물을 이용한 암 면역 요법에 대한 면역 세포 활성의 생체외 향상 방법 - Google Patents
소분자 절제 화합물을 이용한 암 면역 요법에 대한 면역 세포 활성의 생체외 향상 방법 Download PDFInfo
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Abstract
"유도된 면역 항암제"가 숙주 동물의 고형 암성 종양에 할로겐화된 잔텐 종양-절제 화합물의 병소내(IL) 투여에 의해 그러한 동물 숙주에서 유도된 후에 단리되는 암 면역치료 방법이 개시된다. 유도된 면역 항암제의 샘플은 종양을 지닌 숙주로부터 제거(수집)되고, 요망되는 경우에, 뱅킹되고(banked), 배양되고, 우선적으로 확장되어 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성한다. 그러한 조성물은 선행 유도된 면역 항암제가 얻어진 숙주에게 또는 필요로 하는 다른 면역학적으로 적합한 숙주 내로 재도입된다.
Description
본 발명은 포유동물의 말초 혈액, 종양 조직 또는 림프 조직 내에 면역계 성분들을 유도하기 위해 소분자 할로겐화된 잔텐 종양-절제 화합물의 병소내 주사로 면역 세포 활성을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 유도된 면역계 성분들의 구성원들은 수집되고, 생체외(ex vivo)에서 확장되고, 이후에, 이로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물로서 유래한 포유동물에 재도입된다.
종양 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 병소내(intralesional: IL) 치료법을 도입하는 면역치료 전략은 피부 신생물에 대한 비-외과적 옵션으로서 역할을 할 수 있다. 이러한 전략은 국소 종양 퇴행 및 전신 종양 퇴행 둘 모두를 유발시키는 것으로 나타났다. 수지상 세포(dendritic cell: DC), IL-2, 및 GM-CSF의 종양내 주사 및 애주번트 바실리 칼메트-궤린(Bacille Calmette-Guerin, BCG) 또는 톨-유사 수용체(toll-like receptor: TLR) 효능제로의 치료는 흑색종 종양을 지닌 마우스 그리고 진행 흑색종을 갖는 환자 둘 모두에서 전신 항-종양 면역력을 향상시키는 것으로 나타났다[Triozzi et al., Cancer 89:2646-2654 (2000); Pilon-Thomas et al., J Immunother 29:381-387 (2006); Guo et al., Int J Cancer 120:2418-2425 (2007); Kaufman et al., Ann Surg Oncol 17:718-730 (2010); Kidner et al., J Immunother 35:716-720 (2012)]. 수지상 세포는 가장 강력한 항원 표출 세포(antigen presenting cell, APC)이고, 이전에 항원에 노출되지 않은 T 세포에 의한 면역 반응을 프라이밍할 수 있다[Small et al., J Clin Oncol 18:3894-3903 (2000)].
20세기에, 플루오레세인 유사체의 여러 용도가 나타났다. 이러한 화합물은 텍스타일 염료, 생물학적 염색, 비-휘발성 메모리 소자용 빌딩 블록, 열적이미징 기판(thermoimaging substrate) 및 식품 및 화장품 착색제로서 사용되었다. 예를 들어, 에리트로신(FD&C No.3) 및 일부 요오드화된 에리트로신(D&C No. 11 및 12)은 식품, 약물, 및 화장품 염료로서 사용된다. 특정의 테트라아이오도 잔텐, 로즈벵갈(rose bengal)은 안구 질병의 시각화를 위해, 및 방사성표지된 형태에서, 간 기능에 대한 의학적 진단으로서 사용되었으며, 이는 1965년에 미국 약전에 게재되어 있다..
안과 의사에 의한 생물학적 염색으로서 그리고 간 기능 연구에서 로즈벵갈(RB)의 사용은 20세기에 일반적이다[Norn, Acta Ophthalmol 48:546-559 (1970); Delprat Arch. Int . Med . 32:401-410 (1923)]. RB는 광역학적 감광제로서 또는 전이성 흑색종 및 난소암을 위한 레이저 활성화 없이도 미생물 및 암 세포 둘 모두를 사멸시킬 수 있다[Banks et al., J Appl Bact 58:391-400 (1985); Koevary, Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol 4:99-107 (2012); Thompson et al., Melanoma Res 18:405-411 (2008); Wachter et al., Proc. SPIE 4620:143-147 (2002)].
RB는 세포막을 관통하여 종양 세포의 리소좀에 축적되고 종양 세포를 30 내지 60분 내에 자가용해될 수 있지만, 이는 정상 세포로부터 제외된다[Wachter et al., Proc . SPIE 4620:143-147 (2002)]. 특히, PV-10(PBS 중 10% 로즈벵갈; Provectus Biopharmaceuticals, Inc., 테네시 녹스빌(Knoxville, TN) 소재)의 IL 치료법은 비-주사 방관자 병소 퇴행에서 나타나는 인간 연구에서 종양-특이적 면역력을 유도하는 나타났다[Thompson et al., Melanoma Res 18:405-411 (2008); 및 Thompson et al., Ann Surg Oncology 22:2135-2142 (2015)]. 추가 연구에서는, IL PV-10 치료가 MT901 유방암에서 및 B16 흑색종 마우스 모델에서 T-세포 매개 종양-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내었다[Toomey et al., PloS one 8:e68561 (2013)]. 그러나, 기초 메커니즘은 아직 알려져 있지 않다.
이에 따라, 로즈벵갈은 종양 파괴를 위해 특허를 받은 절제제(ablative agent)로서 개시되어 있다(미국 특허 제8,557,298호). 포스트 로즈벵갈 절제의 새로운 작용은 치료된 포유동물에서 종양 조직을 인시튜로 인식할 수 있는 면역계 성분들의 능력이다. 이러한 면역계 성분들은 절제-치료된 포유동물에서 전신 면역계 반응을 유도하는 것으로 확인되었다.
암에서 치료 전략으로서 면역 반응을 유도하기 위한 다수의 전략이 제안되었다. 이러한 방법들은 일반적으로, 숙주로부터 질병이 있는 조직을 제거하고 숙주에 면역 성분들의 재투여 전에 유용한 면역계 성분들을 표적화하거나, 치료하거나 크기 또는 수를 확장시키기 위해 그러한 조직을 조작하는 것으로 이루어진다.
예를 들어, 종양 항원 및 자연 살해 세포의 확장으로 생체외에서 펄스화된 수지상 세포로 이루어진 백신은 조사 중에 있다(미국 특허 제8,597,946호). 항원 및 비-항원-기반 항체는 종양 조직을 표적화하기 위해 생체외에서 제조되고 조작된다(미국 특허 제8,153,120호, US 2004/0161413 A1호). 특히, 비-골수절제 화학요법과 확장된 T-세포의 입양 전달(adoptive transfer)의 조합은 후기-단계 암 환자에서 지속적인 임상 반응을 야기시키는 것으로 보고되었다[Pilon-Thomas, J. Immunother 35(8): 615-620 (2012)]. 이러한 전략은 내인성 면역 조직과는 독립적이고, 환자에게 투여하기 위한 추출된 종양 조직 또는 말초 혈액으로부터 생체외에서 제조된다. 추가적으로, 비-골수절제 화학요법의 사용은 치료를 위한 추가 비용 및 비용을 부가하고, 증가된 치료-기반 이환율의 가능성을 향상시킬 수 있다.
죽어가는 암 세포(dying cancer cell)는 손상-관련 분자 패턴 분자(damage-associated molecular pattern molecule, DAMP)로서 알려진 가용성 분자를 방출시킬 수 있으며, 이는 주로 패턴 인지 수용체(pattern recognition receptor, PRR)로서 인식된다[Zitvogel et al., Cell 140:798-804 (2010)]. 특히 DAMP는 암 치료법을 위한 강력한 면역학적 애주번트로서 역할을 할 수 있다[Kroemer et al., Ann Rev Immunol 31:51-72 (2013); Krysko et al., Nature Rev Cancer 12:860-875 (2012)]. 이러한 DAMP는 열 충격 단백질(heat shock protein, HSP) 패밀리의 여러 구성원, S100 단백질, ATP, IL-1a 및 암포테린으로도 알려진, 고이동성 집단 박스 1(high mobility group box 1: HMGB1)을 포함한다[문헌[Panzarini et al., PloS one 9:e105778 (2013)]에서 검토됨].
HMGB1은 거의 모든 진핵 세포에서 DNA에 결합된 풍부한 단백질이다. 이의 추정 수용체는 발전된 당화 최종-산물을 위한 수용체(RAGE), 톨-유사 수용체-2(TLR2), TLR4 및 T 세포 면역글로불린-3(TIM-3)을 포함한다[Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000); Park et al., J Biol Chem 279:7370-7377 (2004); Chiba et al., Nature Immunol 13:832-842 (2012)]. HMGB1은 막-결합 형태를 가지고 또한 사이토카인-유사 인자로서 세포외 공간내로 분비될 수 있다. 이는 이의 아세틸화 후 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 활성화된 면역 세포로부터 분비되거나, 괴사성, 아폽토시스성 및 자가소화성 암 세포에 의해 DAMP로서 방출될 수 있다[Scaffidi et al., Nature 418:191-195 (2002); Bonaldi et al., EMBO J 22:5551-5560 (2003); Kazama et al., Immunity 29:21-32 (2008); Thorburn et al., Cell Death Differ 16:175-183. (2009)].
HMGB1은 내피 세포의 활성화, 혈관신생의 증진, 면역 세포 이동, 및 염증의 개시에서 중요한 역할을 한다[Lotze et al., Nature Rev Immunol 5:331-342 (2005)]. HMGB1이 종양 전이 및 신생 혈관형성에 기여하는 것으로 나타났지만, 죽어가는 종양 세포에 의한 이의 방출은 종양 진행을 방지하기 위해 DC의 활성화를 야기시킬 수 있다[Apetoh et al., Nature Med 13:1050-1059 (2007); Curtin et al., PLoS Med 6:e10 (2009)].
면역계 항-종양 활성을 자극하기 위해 설계된 조직을 갖는 암 환자를 단리, 저장, 확장, 표적, 및 퇴치시키는 것으로 알려진 여러 방식이 존재한다. 몇몇 전략, 예를 들어, PROVENGE®(SIPULEUCEL-T) 및 입양 전달은 환자 말초 혈액, 림프구 또는 종양 조직과 함께 출발한다. 그러나, 이러한 전략은 환자로부터의 이의 제거 이전에 내인성 면역 성분들의 질을 인시튜로 향상시키기 위해 종양 조직의 병소내 절제를 사용하지 않는다. 후 제거 치료 전략은 맞춤 치료법에 대해 환자-특이적일 수 있다.
면역글로불린(항체) 및 때때로 일반적인 질병에 대한 백신은 보다 넓은 환자 집단에서 종양 치료를 위한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되었다. 이러한 항체 및 백신은 이러한 것이 반드시 단리될 필요가 없는 환자에게 더욱 일반화될 수 있다. 예를 들어, 내인성 리간드를 사용한 항체 설계는 일반적으로, 매우 다양한 환자에게 적용 가능하며, 이러한 리간드는 종종 더욱 일반화 가능한 항체를 밝히기 위해 자극으로 시스템을 프로빙한 후에 발견되었다.
유사하게, 항체는 암에 대한 내인성 면역 반응에서 자연 발생 이벤트를 모방하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4(세포독성 T 림프구-관련 항원 4) 단클론성 항체 이필리무맙 및 트레멜리무맙은 CTLA-4 항체를 차단함으로써 면역계의 하향-조절에 대응하고 이에 따라 암에 대한 T-세포 반응을 증가시키도록 설계된다. 유사하게, 단클론성 항체, 예를 들어, 피딜리주맙, 니볼루맙, 람브롤리주맙 및 펨브롤리주맙은 면역계의 하향-조절에 대응하고 암성 종양에 대한 T-세포 반응을 증가시키기 위해 PD-1(프로그램화된 죽음 1) 수용체에 결합한다. PD-1 리간드, PD-L1 및 PD-L2에 대한 항체, 예를 들어, PD-L1에 대한 BMS-936559, MEDI4736 및 아테졸리주맙(MPDL328 OA)의 초기 연구는 또한, 면역계의 하향-조절의 억제, 및 암에 대한 증가된 T-세포 반응을 명시한다.
대안적인 방법은 비-특이적 사이토카인(예를 들어, 인터류킨-1, -2, 또는 -12; "IL-1", IL-2", 또는 "IL-12"; 인터페론-알파 또는 감마, "IFN-α" 및 "IFN-γ"; 과립구 대식세포 결장 자극 인자, "GM-CSF")을 포함하는, 면역계의 특정 성분들의 자극하고(즉, 상향-조절 또는 하향-조절) 종양-특이적 면역 반응을 일으키려고 시도하는 물질을 사용한다.
하기에 개시되는 바와 같이, PV-10에서 로즈벵갈과 같은 할로겐화된 잔텐으로 치료된 숙주 또는 종양 세포로부터 면역 세포를 함유한 조직의 제거가 일반적인 항체 또는 맞춤 치료법을 만들기 위해 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 성분들은 절제 화합물에 대한 노출 후 단리될 수 있다.
할로겐화된 잔텐으로 종양 조직(예를 들어, PV10의 것)의 병소내 투여는 절제 후 말초 혈액, 국소 림프 조직 또는 종양 조직에서 발견되지만, 플라시보-치료된 대상체의 이러한 조직에서 상당한 수준으로는 아닌 종양-특이적 면역 세포를 자극시키는 종양 항원을 방출시킨다. 이에 의해 국소 항원-표출 세포는 종양 잔해로 사전-로딩되고, 자체의 장점으로 인해 질병의 치료에서 가치가 있을 수 있다.
하기의 개시내용은 IL PV-10 주사가 흑색종을 갖는 예시적인 환자에서 그리고 흑색종을 지닌 마우스에서 종양-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 기초 메커니즘은 흑색종 종양에 PV-10의 IL 주사가 종양-특이적 면역의 유도를 위해 HMGB1의 방출 및 면역 세포의 활성화를 유도하는 것이라는 것이 추가로 발견된다. 유도된 종양 반응은 종양 및 면역계 조직에서 생체내 및 시험관내에서 계산식으로 일어나며, 이의 활성화된 세포는 암의 추가 에피소드를 치료 또는 억제하기 위해 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 뱅킹되고, 재도입되거나, 확장되고 이후에 재도입될 수 있다.
추가적으로, 이러한 국소적으로 사용되는 절제제는 포유류 또는 시험관내 연구에서 절제된 세포에 대해 특이적인 항체를 동정하는 툴로서 또는 암의 치료를 위한 유용한 생물학적 물질의 클로닝 이전에 동정을 위한 툴로서 사용될 수 있다. 이러한 항체는 단독으로, 또는 당해 분야에 공지된 기술에 따른 클로닝 및 제조 후에 암의 보다 일반적인 치료로서 유용할 수 있다. 말초 혈액, 비장, 종양, 또는 림프절로부터 생성되고 단리된 면역 성분들은 마우스 및 사람 둘 모두에서 종양에 대해 반응할 수 있고, 병소내 주사 후 약 1일 이상 내에 검출될 수 있다.
본 발명은 그러한 숙주 동물의 고형 암성 종양내에 로즈벵갈 다이소듐과 같은 할로겐화된 잔텐 종양-절제 화합물의 병소내(IL) 투여에 의해 동물 숙주에서 유도된 후 단리된 하나 이상의 타입의 면역 세포, 면역글로불린, 단백질, 항원, 사이토카인 및 다른 면역 성분과 같은 "유도된 면역 항암 성분"으로부터 유도된 "농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물"을 사용하여 면역치료의 방법을 고려한다. 할로겐화된 잔텐 종양 절제에 의해 생성된 유도된 면역 항암 성분의 샘플은 종양을 지닌 숙주로부터 제거(수집)되고, 요망되는 경우, 뱅킹되거나, 배양되고 바람직하게 확장되어 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성한다. 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물은 또한, 요망되는 경우에 뱅킹되거나 조정되어 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성하고, 선행 유도된 면역 항암 성분이 취해진 숙주 내에(자가조직 이동), 또는 필요로 하는 다른 면역학적으로 적합한 숙주에(동족이계 이동) 재도입될 수 있다.
그러한 유도된 면역 항암 성분은 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프(림프구-함유) 조직, 예를 들어, 배수 림프절, 가슴샘 세포 및 비장 세포 중 하나 이상의 샘플을 제거함으로써 수집된다. 유도된 면역 항암제는 IL 절제 후 또는 반복된 절제 후 바람직하게는 약 1 내지 약 365일, 바람직하게는 약 4 내지 약 90일, 및 가장 바람직하게는 약 7 내지 약 14일에 수집된다. 유도된 면역 항암 성분은 널리 공지된 혈액 저장 기술, 예를 들어, 비제한적으로, 취하는 추가 행위 이전에 냉동, 약 1.0 내지 약 8.0C까지의 냉각, 또는 동결건조에 의해 저장될 수 있다.
말초 혈액, 종양 조직 및/또는 림프 조직의 샘플에 존재하는 유도된 면역 항암 성분은 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성하기 위해 세포 배양의 공지된 방법에 의해 시험관내에서 배양된다. 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물 자체는 상기에 논의된 바와 같이 냉동되거나, 동결건조되거나, 그밖에 후속 사용을 위한 저장(뱅킹)될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 종양-특이적 면역 항암제 조성물은 제조물이 또한 비경구 주사-적절한 염 함량, 삼투압 및 pH 값을 갖는, 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 용해되거나 분산된 면역학적 유효 농도의 농축된 종양-특이적 면역 항암제를 함유한 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물을 형성하기 위해 조정된다. 그러한 제조물은 유도된 면역 항암 성분이 본래 취해진 숙주 동물에 비경구적으로 재도입되거나(자가조직 투여), 다른 면역학적으로 적절한 동물에 투여되거나(동종이계 투여), 추가 면역 항암제를 제공하기 위해 추가로 배양된다.
추가 구현예에서, 유도된 면역 항암 성분은 수득되고 전술된 절제된 종양의 위치와는 다른 위치에서 종양에 투여된다. 이러한 투여는 병소내에서 또는 정맥내, 피하 또는 복강내 투여에 의한 것과 같은 비경구 투여의 다른 널리 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다.
이러한 투여는 유도된 면역 항암 성분의 종양-특이적 면역 항암제 조성물로의 확장 없이 수행된다. 유도된 면역 항암 성분들은 숙주 동물에 이의 재도입 전에 뱅킹될 수 있다.
다른 구현예에서, 이러한 방법은 내인성 종양 조직에 표적화된 인터페론-양성 T-세포를 유도하기 위해 종양 조직 내로 예시적인 로우즈 뱅골과 같은 할로겐화된 잔텐의 병소내 주사를 이용한다. 추가 구현예에서, 이러한 방법은 수지상 세포를 유도하고 종양 항원을 노출하고 항체 및 환자-특이적 또는 환자-독립적 세포 치료제 및 사이토카인을 유도하기 위해 로즈벵갈에 대한 종양 조직의 동일한 절제 노출을 이용한다.
본 발명은 여러 이점 및 장점을 갖는다.
본 발명의 하나의 이점은 후속 사용을 위한 이러한 제제의 소스로서 사용될 수 있는 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물의 제공이다.
본 발명의 장점은 다양한 고형 암성 종양에 대한 투여를 위한 증가된 면역학적-기반 치료 방법을 제공한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 이점 및 장점은 하기 개시내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 개시내용의 일부를 형성하는, 도면에서,
도 1a는 임상적 연구 설계를 예시하는 개략도이다. 도 1b는 왼쪽 상에 IL PV-10으로 치료 전 및 치료 후 7 내지 14일에 인간 환자 종양으로부터의 생검 샘플, 및 방관자 종양으로부터의 생검 샘플(주사하지 않음)의 현미경 사진을 동시에 도시한 것이다. 세포를 흑색종 세포의 존재를 결정하기 위해 면역조직학(IHC)에 의해 melA에 대해 항체로 염색하였다. 유의미하게 감소된 종양 세포는 치료된 및 방관자 병소에서 관찰되었으며, 이는 또한, 병리학자 시험에 의해 확인되었다. 도 1c는 주사된 종양(inj) 및 방관자, 주사되지 않은 종양(uni)에서의 종양 퇴행의 그래프를 도시한 것이다. 도 1d, 도 1e 및 도 1f는 치료 후 인간 환자(n=14)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 증가된 CD8+ T(도 1d), CD4+ T(도 1e), 및 NKT(도 1f) 세포를 예시한 것이다. 각 도면에서 숫자는 중심 막대를 따라 p 값을 지시하였다. p 값은 Wilcoxon 부호 순위 시험에 의해 결정되었다. *, p<0.05 통계학적 유의성 대 사전-처리; **, p<0.01; p<0.001; n.s., 유의성 없음. 도 1g, 도 1h 및 도 1i는 PBMC로부터 정제되고 자가조직 흑색종 세포, 526 또는 624 또는 둘 모두(도 1g), HLA-매칭된 624 흑색종 세포(도 1h), 및 HLA-매칭된 흑색종 세포(도 1i)로 재-자극된 상이한 환자의 CD8+ T 세포로부터의 증가된 IFN-감마(IFN-g) 생산을 예시한다. 투여 전(pre), 투여 후 7 내지 14일(D7-14) 및 21 내지 28일(D21-28)의 값에 대한 데이터가 도시된다. P 값은 페어링되지 않은 스튜던트 t-시험에 의해 결정되었다. n.s. = 유의성 없음.
도 2a는 0일째에 C57BL/6 마우스의 한쪽 측면 내에 3×105 OVA-발현 흑색종 B16(M05) 세포의 주사 후 종양 성장을 예시한 것이다. 그 후에, 50㎕의 PV-10 또는 PBS를 7일 및 17일에 IL 주사하였다(n=4). 도 2b는 유세포 분석에 의해 측정하는 경우 주사 후 8일째에 배수 LN로부터 CD8+ 및 OVA 사량체-양성양성백분율을 예시한 것이다. 도 2c는 7일째에 반대쪽 측면 상에 s.c. 주사된 3×105 M05 세포로 재-접종된 마우스로부터 IFN-γ(IFN-g) 분비를 나타낸 그래프이다. 23일째에, 비장 세포를 7일 동안 20 ng/㎖ IL-15, IL-21 및 1 ㎍/㎖ OVA 257-264 펩타이드로 확장시키고, M05 세포로 접종하였다. IFN-γ(또한 IFN-g) 생산을 48시간 동안 측정하였다. 데이터는 3회 독립적인 연구로부터의 평균 ± SEM로서 제시된다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군; **, p<0.01. P 값은 페어링되지 않은 스튜던트 t-시험에 의해 결정되었다.
도 3a는 0일째에 C57BL/6 마우스의 한 옆구리에 3×105 OVA-발현 흑색종 B16(M05) 세포가 주사되고, 13일째에, 50㎕ PV-10이 반대편 옆구리에 IL 또는 PBS 주사되고, 2×105 Celltracker® 바이올렛-표지된 CD45.1 OT-1 T-세포가 4시간 후에 i.v. 주사된 후에 IL PV-10이 종양-특이적 억제 면역 반응을 유도함을 예시한다. p< 0.05, 23일째에 PV-10 + OT-1 그룹 통계학적 유의성 대 PV-10 그룹, 페어링되지 않은 스튜던트 t-테스트. 도 3b는 모니터링된 마우스의 생존을 예시한 것이다. *, p< 0.05, **, p<0.01. P 값은 log-순위 시험에 의해 결정되었다. 4일 후에, 비장으로부터의 세포(도 3c, 및 도 3d), 종양(도 3e), 및 원위 LN(도 3f)를 CD45.1 및 CD45.2 항체로 염색하였다. 바이올렛 염료 희석의 대표적인 히스토그램은 CD45.1+ T-세포의 자손(딸세포)를 도시한 것으로서, 이는 죽은 세포의 구분 후에 적어도 1회 분열된 것이다(도 3c). 데이터는 3회 독립적 실험(n=5 마우스/그룹)으로부터 평균 ± SEM으로서 제시된다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군;**, p<0.01.
도 4a는 IL 주사 후 18시간에 유세포 분석에 의해 측정하여, 3×105 M05 세포를 주사하고 이후에 7일째에 50㎕ PV-10 또는 PBS의 IL 주사된 C57BL/6 마우스로부터 종양 배수 LN(DLN) 또는 비-배수 LN(NDLN)으로부터의 수지상 세포(DC; CD11c+ MHC II+)의 수를 도시한 그래프이다. 도 4b는 18시간 후에 유세포 분석에 의해 측정하여, PV-10 치료 후 FITC-OVA을 i.t. 4시간 주사한 후에 DLN 또는 NDLN으로부터의 FITC+ DC에 대한 결과를 도시한 그래프이다. 이러한 데이터는 3회의 독립적인 연구(n=4 마우스/그룹)로부터의 평균 ± SEM로서 제시된다. 도 4c는 완전 배지(CM), 또는 IL PV-10 또는 PBS로 치료된 B16 흑색종을 지닌 마우스로부터의 종양 상청액(TS)와 함께 2일 동안 항온처리되고(incubated) 이후에 OVA 단백질로 펄싱되고, 3일 동안 상이한 비율로 OT-1 T-세포와 공동-배양된 혈액 단핵 세포-유도(BM-유도) DC의 최종 16시간 항온처리 동안 [3-H]-티미딘 도입에 의해 측정된 OT-1 T-세포 증식을 도시한 그래프이다. 도 4d는 100μM PV-10 또는 PBS와 함께 사전-항온처리된 B16 세포로부터의 종양 용해물과 함께 항온처리되고 OVA 단백질로 펄싱되고 3일 동한 기술된 비율로 OT-1 T-세포와 함께 공동-배양된 BM-유도 DC의 수를 비교한 그래프이다. 세포 증식은 최종 16시간 배양에서 [3H]-티미딘 섭취에 의해 3회 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 2회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군; **, p<0.01; p<0.001.
도 5a는 마우스 흑색종 B16 세포에서 PV-10 농도에 대한 세포 사멸(48시간 후에 60μM의 IC50을 가짐) 및 또한, 3T3 섬유아세포에서 PV-10 농도에 대한 세포 사멸(48시간 후에 110μM의 IC50을 가짐)을 도시한 그래프이다. 도 5b는 48시간 동안 50μM PV-10으로 치료된, B16 세포, 3T3 섬유아세포, 인간 원발성 흑색종 세포(P) 및 인간 배아 신장 293T 세포의 유세포 분석을 도시한 그래프이다. 도 5c는 조기 아폽토시스(Annexin V+ DAPI-)보다 오히려 괴사(DAPI+)에서 유의미한 증가가 PBS와 비교하여 PV-10으로 치료된 흑색종 세포에서 관찰된 유세포 분석을 도시한 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 48시간 동안 주지된 용량의 PV-10으로 B16, 3T3 세포(도 6a) 및 인간 888 흑색종 세포(도 6b)의 치료 후 웨스턴 블롯에 의해 검출하는 경우, 세포 상청액(S) 중 방출된 HMGB1의 농도계 밀도(densitometric density)의 그래프이다. 증가된 HMGB1 발현을 세포 용해물(L)에서 확인하였다. 도 6c는 CM과 함께 항온처리된 BM-유도 DC, 또는 2일 동안 HMGB1 중화 항체 또는 아이소타입 대조군의 존재 하에 100μM PV-10 또는 PBS와 함께 사전-항온처리된 B16 세포의 종양 상청액(TS)의 그래프이다. 세포를 CD40 및 CD11c에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. DC의 CD40의 상대적 평균 형광 세기(mean fluorescence intensity: MFI)가 도시되어 있다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 3회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, **, p < 0.01. 도 6d는 2일 동안 IL PV-10으로 치료된 M05 흑색종을 지닌 마우스로부터의 종양 상청액과 함께 항온처리되고, OVA 단백질과 함께 펄싱되고, 3일 동안 기술된 비율로 OT-1 T-세포와 함께 동시-배양된 BM-유도 DC에 대한 세포-대-세포 배양물에 대한 계수치의 비율의 그래프이다. OT-1 T-세포 증식을 최종 16시간 배양물에 [3-H]-티미딘 도입에 의해 시험하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 2회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, **, p< 0.01.
도 7은 치료 전에 존재하는 혈청 양과 비교하여 병소내 PV-10(10% 수성 로즈벵갈; Provectus Biopharmaceuticals, Inc., 테네시주 녹스빌 소재) 치료 요법 후 7 내지 14일 및 21 내지 28일에 흑색종 환자의 혈청에 존재하는 HMGB1 수준을 도시한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=14)으로서 나타낸다. *, p<0.05; n.s., 유의성 없음. P 값은 Wilcoxon 부호 순위 시험에 의해 결정되었다.
도 1a는 임상적 연구 설계를 예시하는 개략도이다. 도 1b는 왼쪽 상에 IL PV-10으로 치료 전 및 치료 후 7 내지 14일에 인간 환자 종양으로부터의 생검 샘플, 및 방관자 종양으로부터의 생검 샘플(주사하지 않음)의 현미경 사진을 동시에 도시한 것이다. 세포를 흑색종 세포의 존재를 결정하기 위해 면역조직학(IHC)에 의해 melA에 대해 항체로 염색하였다. 유의미하게 감소된 종양 세포는 치료된 및 방관자 병소에서 관찰되었으며, 이는 또한, 병리학자 시험에 의해 확인되었다. 도 1c는 주사된 종양(inj) 및 방관자, 주사되지 않은 종양(uni)에서의 종양 퇴행의 그래프를 도시한 것이다. 도 1d, 도 1e 및 도 1f는 치료 후 인간 환자(n=14)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 증가된 CD8+ T(도 1d), CD4+ T(도 1e), 및 NKT(도 1f) 세포를 예시한 것이다. 각 도면에서 숫자는 중심 막대를 따라 p 값을 지시하였다. p 값은 Wilcoxon 부호 순위 시험에 의해 결정되었다. *, p<0.05 통계학적 유의성 대 사전-처리; **, p<0.01; p<0.001; n.s., 유의성 없음. 도 1g, 도 1h 및 도 1i는 PBMC로부터 정제되고 자가조직 흑색종 세포, 526 또는 624 또는 둘 모두(도 1g), HLA-매칭된 624 흑색종 세포(도 1h), 및 HLA-매칭된 흑색종 세포(도 1i)로 재-자극된 상이한 환자의 CD8+ T 세포로부터의 증가된 IFN-감마(IFN-g) 생산을 예시한다. 투여 전(pre), 투여 후 7 내지 14일(D7-14) 및 21 내지 28일(D21-28)의 값에 대한 데이터가 도시된다. P 값은 페어링되지 않은 스튜던트 t-시험에 의해 결정되었다. n.s. = 유의성 없음.
도 2a는 0일째에 C57BL/6 마우스의 한쪽 측면 내에 3×105 OVA-발현 흑색종 B16(M05) 세포의 주사 후 종양 성장을 예시한 것이다. 그 후에, 50㎕의 PV-10 또는 PBS를 7일 및 17일에 IL 주사하였다(n=4). 도 2b는 유세포 분석에 의해 측정하는 경우 주사 후 8일째에 배수 LN로부터 CD8+ 및 OVA 사량체-양성양성백분율을 예시한 것이다. 도 2c는 7일째에 반대쪽 측면 상에 s.c. 주사된 3×105 M05 세포로 재-접종된 마우스로부터 IFN-γ(IFN-g) 분비를 나타낸 그래프이다. 23일째에, 비장 세포를 7일 동안 20 ng/㎖ IL-15, IL-21 및 1 ㎍/㎖ OVA 257-264 펩타이드로 확장시키고, M05 세포로 접종하였다. IFN-γ(또한 IFN-g) 생산을 48시간 동안 측정하였다. 데이터는 3회 독립적인 연구로부터의 평균 ± SEM로서 제시된다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군; **, p<0.01. P 값은 페어링되지 않은 스튜던트 t-시험에 의해 결정되었다.
도 3a는 0일째에 C57BL/6 마우스의 한 옆구리에 3×105 OVA-발현 흑색종 B16(M05) 세포가 주사되고, 13일째에, 50㎕ PV-10이 반대편 옆구리에 IL 또는 PBS 주사되고, 2×105 Celltracker® 바이올렛-표지된 CD45.1 OT-1 T-세포가 4시간 후에 i.v. 주사된 후에 IL PV-10이 종양-특이적 억제 면역 반응을 유도함을 예시한다. p< 0.05, 23일째에 PV-10 + OT-1 그룹 통계학적 유의성 대 PV-10 그룹, 페어링되지 않은 스튜던트 t-테스트. 도 3b는 모니터링된 마우스의 생존을 예시한 것이다. *, p< 0.05, **, p<0.01. P 값은 log-순위 시험에 의해 결정되었다. 4일 후에, 비장으로부터의 세포(도 3c, 및 도 3d), 종양(도 3e), 및 원위 LN(도 3f)를 CD45.1 및 CD45.2 항체로 염색하였다. 바이올렛 염료 희석의 대표적인 히스토그램은 CD45.1+ T-세포의 자손(딸세포)를 도시한 것으로서, 이는 죽은 세포의 구분 후에 적어도 1회 분열된 것이다(도 3c). 데이터는 3회 독립적 실험(n=5 마우스/그룹)으로부터 평균 ± SEM으로서 제시된다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군;**, p<0.01.
도 4a는 IL 주사 후 18시간에 유세포 분석에 의해 측정하여, 3×105 M05 세포를 주사하고 이후에 7일째에 50㎕ PV-10 또는 PBS의 IL 주사된 C57BL/6 마우스로부터 종양 배수 LN(DLN) 또는 비-배수 LN(NDLN)으로부터의 수지상 세포(DC; CD11c+ MHC II+)의 수를 도시한 그래프이다. 도 4b는 18시간 후에 유세포 분석에 의해 측정하여, PV-10 치료 후 FITC-OVA을 i.t. 4시간 주사한 후에 DLN 또는 NDLN으로부터의 FITC+ DC에 대한 결과를 도시한 그래프이다. 이러한 데이터는 3회의 독립적인 연구(n=4 마우스/그룹)로부터의 평균 ± SEM로서 제시된다. 도 4c는 완전 배지(CM), 또는 IL PV-10 또는 PBS로 치료된 B16 흑색종을 지닌 마우스로부터의 종양 상청액(TS)와 함께 2일 동안 항온처리되고(incubated) 이후에 OVA 단백질로 펄싱되고, 3일 동안 상이한 비율로 OT-1 T-세포와 공동-배양된 혈액 단핵 세포-유도(BM-유도) DC의 최종 16시간 항온처리 동안 [3-H]-티미딘 도입에 의해 측정된 OT-1 T-세포 증식을 도시한 그래프이다. 도 4d는 100μM PV-10 또는 PBS와 함께 사전-항온처리된 B16 세포로부터의 종양 용해물과 함께 항온처리되고 OVA 단백질로 펄싱되고 3일 동한 기술된 비율로 OT-1 T-세포와 함께 공동-배양된 BM-유도 DC의 수를 비교한 그래프이다. 세포 증식은 최종 16시간 배양에서 [3H]-티미딘 섭취에 의해 3회 측정되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 2회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, 통계학적 유의성 대 대조군; **, p<0.01; p<0.001.
도 5a는 마우스 흑색종 B16 세포에서 PV-10 농도에 대한 세포 사멸(48시간 후에 60μM의 IC50을 가짐) 및 또한, 3T3 섬유아세포에서 PV-10 농도에 대한 세포 사멸(48시간 후에 110μM의 IC50을 가짐)을 도시한 그래프이다. 도 5b는 48시간 동안 50μM PV-10으로 치료된, B16 세포, 3T3 섬유아세포, 인간 원발성 흑색종 세포(P) 및 인간 배아 신장 293T 세포의 유세포 분석을 도시한 그래프이다. 도 5c는 조기 아폽토시스(Annexin V+ DAPI-)보다 오히려 괴사(DAPI+)에서 유의미한 증가가 PBS와 비교하여 PV-10으로 치료된 흑색종 세포에서 관찰된 유세포 분석을 도시한 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 48시간 동안 주지된 용량의 PV-10으로 B16, 3T3 세포(도 6a) 및 인간 888 흑색종 세포(도 6b)의 치료 후 웨스턴 블롯에 의해 검출하는 경우, 세포 상청액(S) 중 방출된 HMGB1의 농도계 밀도(densitometric density)의 그래프이다. 증가된 HMGB1 발현을 세포 용해물(L)에서 확인하였다. 도 6c는 CM과 함께 항온처리된 BM-유도 DC, 또는 2일 동안 HMGB1 중화 항체 또는 아이소타입 대조군의 존재 하에 100μM PV-10 또는 PBS와 함께 사전-항온처리된 B16 세포의 종양 상청액(TS)의 그래프이다. 세포를 CD40 및 CD11c에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. DC의 CD40의 상대적 평균 형광 세기(mean fluorescence intensity: MFI)가 도시되어 있다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 3회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, **, p < 0.01. 도 6d는 2일 동안 IL PV-10으로 치료된 M05 흑색종을 지닌 마우스로부터의 종양 상청액과 함께 항온처리되고, OVA 단백질과 함께 펄싱되고, 3일 동안 기술된 비율로 OT-1 T-세포와 함께 동시-배양된 BM-유도 DC에 대한 세포-대-세포 배양물에 대한 계수치의 비율의 그래프이다. OT-1 T-세포 증식을 최종 16시간 배양물에 [3-H]-티미딘 도입에 의해 시험하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 나타나 있고, 2회의 독립적 연구를 대표한다. *, p< 0.05, **, p< 0.01.
도 7은 치료 전에 존재하는 혈청 양과 비교하여 병소내 PV-10(10% 수성 로즈벵갈; Provectus Biopharmaceuticals, Inc., 테네시주 녹스빌 소재) 치료 요법 후 7 내지 14일 및 21 내지 28일에 흑색종 환자의 혈청에 존재하는 HMGB1 수준을 도시한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=14)으로서 나타낸다. *, p<0.05; n.s., 유의성 없음. P 값은 Wilcoxon 부호 순위 시험에 의해 결정되었다.
본 발명은 후에 면역치료학적으로 사용될 수 있는 농축된 종양-특이적 면역 항암 성분의 제조물을 형성하고 사용하는 방법을 고려한다. 본 방법은 (A) 숙주 동물에서의 종양 조직을 바람직하게 약제학적 조성물에 용해되거나 분산된 종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐 화합물을 포함하는 화학절제 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 화학절제 약제학적 조성물의 특성은 하기에서 별도로 논의된다. (B) 숙주 동물은 이의 면역계가 그러한 종양에 대한 종양-특이적 면역 항암제를 형성하는 데, 즉 종양-특이적 면역 항암제의 유도하는 데 충분한 시간(약 1 내지 약 30일) 동안 유지된다. (C) 종양-특이적 면역 항암 성분을 함유한 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프 조직 중 하나 이상을 포함하는 샘플은 동물 숙주로부터 수집(제거)된다. (D) 말초 혈액, 종양 조직 및/또는 림프 조직의 그러한 샘플에 존재하는 종양-특이적 면역 항암 성분은 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성하기 위해 시험관내에서 배양되고 우선적으로 확장된다.
종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐을 함유한 약제학적 조성물이 암 세포와 접촉시키기 위해 숙주 동물의 고형 종양에 투여된 직후에, 숙주 동물은 상기 종양에 대한 종양-특이적 면역 항암제를 생성하기 위해 숙주 동물의 면역계를 유도하는 데 충분한 최소한의 시간 동안 유지된다. 통상적인 유지 시간은 약제학적 조성물의 절제 투여 후 약 1 내지 약 30일이다.
이러한 환경에서 유지는 일반적이고 이러한 치료 후 요구되는 바와 같이 의학적/수의학적 관찰 및/또는 개재와 함께 동물이 이의 정상적인 삶을 살도록 단순하게 허용한다. 예를 들어, 종양에 조사된 병소내 주사를 위해 제형화된 10% 로즈벵갈의 수성 조성물(PV-10; Provectus Biopharmaceuticals, Inc., 테네시주 녹스빌 소재)을 사용한 IIB-IV기의 흑색종에 걸린 80명의 환자의 2상 인간 임상 시험은 주로 주사 부위로 한정되는 악영향을 지니고 PV-10의 사용과 관련된 등급 4 또는 등급 5 부작용을 지니지 않으면서, 치료를 잘 견딜 수 있음을 발견하였다.
유지 기간이 경과한 직후에, (1) 말초 혈액의 분취액, (2) 종양 조직 및 (3) 종양-특이적 면역 항암 성분을 함유한 림프 조직 중 하나 이상을 포함하는 신체 샘플은 동물 숙주로부터 수집(제거)된다. 그러한 샘플은 배양되고 우선적으로 확장되기 전에 하기에서 논의되는 바와 같이 뱅킹(저장)될 수 있다. 대안적으로, 종양-특이적 면역 항암 성분은 고체 성분을 적절하게 크기 조절하고 비경구 투여를 위한 적절한 비히클에서 그러한 성분을 분산시킨 후에, 동일한 숙주 동물의 다른 종양내에 도입될 수 있다. 상기에서 주지된 바와 같이, 이러한 비경구 투여는 병소내, 정맥내, 피하 또는 복강내 또는 유사한 투여에 의해 수행될 수 있다. 이러한 분산액을 위한 적절한 비히클은 하기에서 논의된다.
바람직한 종양-특이적 면역 항암 성분은 2가지 일반적인 타입이다.
제1 타입의 종양-특이적 면역 항암 성분은 면역 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, 항원-표출 세포(APC), 예를 들어, 수지상 세포, NK 세포, 또는 단핵구(대식세포)이다. 이러한 세포는 종양 세포 항원 또는 절제된 종양 세포 잔해를 인식하고, 종양 세포 항원에 결합하거나, 사이토카인을 증식시키거나, 분비하거나, 달리 할로겐화된 잔텐-절제된 암 세포로부터 손상되지 않은 암 세포 또는 잔해 상에 존재하는 항원/면역원의 존재 하에서 활성화됨으로써 그러한 인식에 반응한다.
제2 타입의 종양-특이적 면역 항암 성분은 전체 종양 세포 또는 화학절제된 세포 잔해 상에 나타난 항원에 결합하는 항체, 또는 할로겐화된 잔텐 종양 절제 및 유지 시간 후 숙주의 혈장 또는 림프에서의 펩타이드 또는 당과 같은 림프-가용성 사이토카인 또는 다른 단백질이다.
유지 시간 후에, 종양-특이적 면역 항암 성분은 치료된 숙주에, 숙주 동물의 종양에 대한 병소내 할로겐화된 잔텐 화학절제 약제학적 조성물의 투여 전보다 상당히 더 많은 양으로 존재한다. 할로겐화된 잔텐 종양 절제 및 유지 후 상기에서 논의된 면역 세포 타입 또는 다른 종양-특이적 면역 항암 성분의 림프-가용성 사이토카인, 예를 들어, IL-2, TNF-α, LT, GM-CSF, IFN-γ 및 HMGB1의 상당히 향상된 농도는 문헌에서 보고된 표준 기술에 의해 혈액 또는 림프 또는 림프 조직에서 용이하게 검정되고 할로겐화된 잔텐 종양 절제 전에, 혈액 또는 림프 또는 림프 조직 각각에 존재하는 양과 비교될 수 있다. 림프-가용성 사이토카인 또는 면역 세포 타입의 농도의 유의미한 향상은 적어도 90% 신뢰도 수준(p < 0.1), 및 바람직하게는 95% 신뢰도 수준(p < 0.05)으로 통계학적으로 유의미한 증가에 의해 결정된다.
말초 전혈은 통상적으로 배양 및 선택적 농축을 위해 백혈구를 제공하는데 사용된다. 이에 따라, 말초 전혈은 통상적으로 Ficoll® 구배 원심분리에 의해 분획들로 분리된다. 3개의 층은 통상적으로 혈장(사이토카인 및 항체)의 상부층, 이후 백혈구의 버피 코트층(buffy coat layer), 및 다형핵 세포(예를 들어, 호중구 및 산호성백혈구(eosinophils)) 및 적혈구(erythrocytes)(red blood cell: RBC)의 하부 분획으로 형성된다.
백혈구들 중에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 원형 핵(round nucleus)(잎모양 핵(lobed nucleus)과는 상반되는 것임)을 갖거나 혈소판과 같이 핵을 갖지 않는 혈액 세포는 본 명세서에서 특별히 고려된다. 예시된 PBMC는 림프구 및 단핵구(대식세포)를 포함한다. 림프구 집단은 림프구 집단은 T 세포(예를 들어, CD4+ 및 CD8+ 세포, 약 75%), B 세포 및 NK 세포(합하여 약 25%)로 이루어진다. 5% DMSO 및 6% 펜타전분(약 50% 히드록시에틸화된 전분)에 냉동보존된 백혈구는 문헌[Stroncek et al., Transfusion 51 (12): 2647-2655 (2011)]에 따라 적어도 7년 동안 저장될 수 있다.
전혈 분리 후에, PBMC는 수집, 배양, 및 증대될 수 있으며, 혈장은 선택된 바이오마커의 절제 전 농도에 비해 항체 및/또는 사이토카인 바이오마커 농도의 검정을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 림프 조직은 바람직하게 화학절제된 종양 부위의 근위에 있는 하나 이상의 림프절로부터, 비장 조직으로부터 또는 가슴샘으로부터 또는 절제되거나 치료되지 않은 종양 병소로부터의 세포이다.
림프 조직 샘플과 같은 샘플에 존재하는 유도된 면역 항암 성분을 시험관내 배양하고 우선적으로 확장시키는 것은 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 제공한다. 그러한 농축된 종양-특이적 면역 항암제는 주로 향상된 수의 PBMC, 예를 들어, PBMC, 예를 들어, T 세포(예를 들어, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포), 단핵구(대식세포) 및 절제된 종양 조직에 대한 숙주 동물의 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 NK 세포를 포함할 수 있다. 유용한 세포 증식 기술은 종종 폐기되는, 사이토카인 및 항체를 포함하는 성장 배지-가용성 부분으로부터 세포 부분을 분리한다.
B 세포, T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 다른 항원-표출 세포(APC)의 배양 및 우선적 확장은 항체뿐만 아니라 사이토카인의 향상된 생산을 야기시킬 수 있다. 증식하는 세포에 의해 형성되는 면역 반응을 증가시킬 수 있는 향상된 양의 사이토카인, 예를 들어, IL-2, TNFα, LT, GM-CSF, 및 IFN-γ 및 다른 단백질, 예를 들어, HMGB1은 요망되는 경우에 공지된 분리 기술, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피 및/또는 친화력 크로마토그래피에 의해 성장 배지로부터 얻어질 수 있다.
유사한 공정은 종양 조직 샘플에 존재하는 종양-특이적 면역 항암 성분의 균등한 그룹을 시험관내 배양 및 우선적으로 확장하는 데 적용 가능하다.
어구 "우선적으로 확장시키는(preferentially expanding)" 및 이의 문법적으로 적절한 유사한 어구는 본 명세서에서 숫자가 증가하지 않는 다른 세포 타입과 비교하여 하나 이상의 특정 세포 타입의 수의 증가를 기술하기 위해 사용된다. 그러한 우선적 확장(농축)은 또한, 항암 단백질성 화합물, 예를 들어, 사이토카인 또는 종양-특이적 면역 항암 세포에 의해 분비된 항-종양 항체의 상대적 농도의 증가와 관련하여 사용된다. 세포 수 및 사이토카인 농도 중 하나 또는 둘 모두에서의 이러한 확장(농축)은 동물 숙주의 신체(생체내)에서보다 오히려 시험관내 또는 생체외에서 수행된다.
면역 세포의 수 및/또는 사이토카인 또는 항체와 같은 항암 단백질성 화합물 농도의 이러한 증가는 본 명세서에 예시된 바와 같이 널리 공지된 검정에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 시험관내(생체외) 우선적 확장 후 면역 세포 수 및/또는 사이토카인 농도에서의 향상은 제거된 신체 샘플에서의 농도와 비교하여 통계학적으로 유의미하다. 우선적 확장으로부터 형성된 조성물은 본 명세서에서 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물로서 지칭된다.
농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물의 제조는 대개 본래 숙주 동물에 재도입 또는 적절치 않은 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 농도, 염 함량, 삼투압, pH 값, 또는 다른 인자, 예를 들어, 이종 조직 미토겐(heterologous mitogen)의 존재로 인해 다른 동물에 도입을 위해 "그 자체로(as is)"는 유용하지 않다. 결론적으로, 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물은 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물을 형성하기 위해 조정된다.
고려된 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물은 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 용해되거나 분산된 적절한 면역학적 유효 농도의 농축된 종양-특이적 면역 항암제를 갖는다. 그러한 조성물은 또한 비경구 주사-적절한 염 함량, 삼투압 및 pH 값을 함유하고, 여기에는 원치 않는 구성성분, 예를 들어, 이종 조직 미토겐이 존재하지 않는다. 이러한 주사 가능한 조성물의 특성은 문헌[예를 들어, Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania; 1975 및 Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]에서 확인될 수 있고, 종양-절제 유효량의 고려된 할로겐화된 잔텐 화합물을 함유한 화학절제 약제학적 조성물에 대해 하기에 기술된 것을 포함할 수 있다.
면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물은 병소내 치료에 면역학적 상승(immunological boost)을 제공하기 위해 신체 샘플이 본래 얻어진(재도입된) 동물에 역으로 투여될 수 있다. 이러한 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물은 또한 대개 골수절제 화학요법을 수용한 후, 다른(제2) 면역학적으로 적절한 공통 유전자 동물 숙주에 투여될 수 있다.
이러한 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물 또는 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물은 혈액 은행 및 세포 보존 기술 분야에서 널리 알려진 바와 같이, 냉동 또는 냉장에 의해 후에 사용하기 위해 저장(뱅킹)될 수 있다. 그러한 조성물 또는 제조물에 존재하는 종양-특이적 면역 항암제는 또한, 요망되는 사이토카인, 예를 들어, 림포카인, 또는 항체 또는 세포 제조물내에 생성된 다른 면역 항암제를 생성시키기 위해 추가로 배양될 수 있다.
미국에서, 특정 표준은 각 혈액 산물의 수집 및 가공을 위해 설정된다. "전혈"(WB)은 하나의 규정된 생성물, 상세하게, 첨가된 승인된 보존제를 갖는 분리되지 않은 정맥혈에 대한 적절한 명칭이다. 수혈을 위한 대부분의 혈액은 전혈로서 수집된다. 자가조직 기부는 때때로 추가 개질 없이 수혈된다. 그러나, 전혈은 통상적으로 (원심분리를 통해) 이의 성분들로 분리되며, 용액 중에 현탁된 적혈구(RBC)는 가장 일반적으로 사용된 생성물이다.
WB 및 RBC의 유닛은 둘 모두 33.8 내지 42.8℉(1.0 내지 6.0℃)에서 냉장 상태로 유지되며, 이는 최대로 각각 35일 및 42일의 저장 기간(유통 기한)을 허용한다. RBC 유닛은 또한, 글리세롤로 완충화될 때 냉동될 수 있지만, 거의 수행되지 않는다. 냉동된 적혈구는 최대 10년의 유효 기간을 제공하고, -85℉(-65℃)에서 저장된다.
덜-치밀한 혈장은 다양한 냉동된 성분들로 제조되고, 냉동될 때 및 생성물의 의도된 용도가 무엇인지를 기초로 하여 상이하게 표지된다. 혈장은 항체 및 사이토카인뿐만 아니라 다른 분산된 단백질, 펩타이드, 당 및 염을 함유한다.
혈장이 즉식 냉동되고 수혈을 위해 의도되는 경우에, 이는 통상적으로 새로이 냉동된 혈장으로서 표지된다. 이러한 것이 다른 생성물 내에 제조되도록 의도되는 경우에, 이는 통상적으로, 회수된 혈장 또는 분별을 위한 혈장으로서 표지된다.
미국 특허 제8,153,120호(Sheikh et al., 및 이의 부서), 미국 특허 제8,540,982호에 기술된 바와 같이, 항원 표출 세포(APC) 및 수지상 세포(DC)는 당해 분야에 용이하게 입수 가능한 일반적인 방법에 의해 단리될 수 있다. DC의 단리를 위한 예시적인 적합한 방법은 미국 특허 제5,976,546호, 제6,080,409호, 및 제6,210,662호에 개시되어 있다.
간단하게, 버피 코트 세포는 말초 혈액으로부터 제조될 수 있다. 세포는 원심분리 튜브 또는 디바이스에서 pH 7.4, 280 mOsm/kg H2O), 밀도 1.0770 g/㎖에서 (미국 특허 제4,927,749호(Dom)에 기술된 바와 같이 제조된) 유기실란화된 콜로이드성 실리카(OCS) 분리 매질의 컬럼 상에 층형성된, leukopacs로부터 수확될 수 있다. OCS 매질은 바람직하게는 콜로이드성 실리카의 실란올기(대략 10 내지 20㎚ 직경 입자)를 알킬 트라이-메톡시 실란 시약과 반응시키고 이에 따라 차단시킴으로써 제조된다.
유사하게, 미국 특허 제8,597,946호(Mule 등)에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제공하기 위한 분리반출법 시스템으로부터의 DC의 제조 이후 Ficoll-Hypaque® 구배에 대한 원심분리가 교시되어 있다. 그러한 세포는 이후에 70% 인간 AB 혈청, 20% X-VIVO™ 15 조혈 배지(Lonza America Inc., 뉴저지주 앨런데일 소재) 및 10% DMS에서 저온보존되었다. 새로운 또는 저온보존된 PBMC는 이후에 GM-CSF, 이후에, 종양 용해물(조사된 종양 세포로부터 제조됨) 및 항-MARCO 항체의 존재 하에서 시험관내에서 배양되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 고려된 방법은 내인성 종양 조직에 표적화된 인터페론-양성 T-세포를 유도하기 위해 종양 조직 내에 할로겐화된 잔텐의 병소내(IL) 주사를 이용한다. 유도된 T-세포는 바람직하게는 순환하는 CD4+ T-세포 및/또는 CD8+ T-세포이다. 다른 구현예에서, 항암 세포는 NK 세포이다. 다른 구현예에서, 이러한 방법은 수지상 세포를 유도하고 종양 항원을 노출시키고 항체 및 환자-특이적 또는 환자-독립적 치료제, 예를 들어, 사이토카인을 유도하기 위해 로즈벵갈에 대한 종양 조직의 동일한 노출을 이용한다.
말초 혈액 분취액, 종양 조직 및/또는 림프 조직은, 종양-절제 생성물 및 종양 세포 항원(면역원)이 근접(근위), 배수 림프절(DLN)로 이동하도록 종양 절제 치료 후 제거(수집)된다. 이에 따라, 혈액, 종양 조직 및/또는 림프 조직의 제거는 이동 및 절제에 대한 면역 반응을 허용하기 위하여, 바람직하게는 절제 용량 투여 후 약 1 내지 약 30일 수행되고, 더욱 바람직하게는 종양 절제 후 약 4 내지 약 90일, 및 가장 바람직하게는 절제 용량 투여 후 약 7 내지 약 14일 수행된다.
다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 면역계 하향-조절의 전신 억제제가 숙주 동물에 투여된다. 바람직하게는 면역계 하향-조절의 전신 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2 중 하나 이상과 면역반응하는 단클론성 항체이다. 이러한 단클론성은 CTLA-4에 결합하는 이필리무맙 및 트레멜리무맙; PD-1에 결합하는 피딜리주맙, 니볼루맙, 람브롤리주맙 및 펨브롤리주맙; 및 PD-L1에 결합하는 BMS-936559, MEDI4736 및 아테졸리주맙(MPDL328OA)으로 명명된 것에 의해 예시된다.
면역계 하향-조절의 전신 억제제는 종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐의 투여 전, 후, 또는 이와 함께, 숙주 동물에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 억제제 투여는 종양 절제 후 및 숙주 동물로부터 유도된 면역 항암 성분을 함유한 샘플을 수집하기 전에 수행된다.
복수의 면역계 하향-조절 억제제 투여는 샘플의 수집 전에 제공될 수 있다. 2회 내지 4회의 이러한 투여는 초기 연구에서 성공적으로 사용되었다. 그러한 투여는 통상적으로, 약 1 내지 약 7일 간격으로 분리된다.
매회 투여되는 단클론성 항체 억제제의 용량은 최대 용량으로서 각 특정 제품에 대해 제조업체에 의해 제시된 것이며, 최대 용량의 약 25 내지 약 75%의 용량이 더욱 일반적으로 투여된다. 별도로 투여될 때, 종양-절제 잔텐 화합물의 부재 하에서, 단클론성 항체 억제제는 예시적으로 하기와 같이 투여된다: 이필리무맙(항-CTLA-4)은 문헌[Physicians' Desk Reference, 69 ed, PDR Network, ontvale, NJ (2014) [PDR]]에서 총 4회 용량에 대해 3주 마다 3 mg/kg으로 투여되는 것으로 제시되며, 펨브롤리주맙(항-PD-1)은 3주 마다 2 mg/kg으로 투여되는 것으로 제시되며[PDR]; 니볼루맙(항-PD-1)을 사용한 I/II상 용량-상승 연구는 96주 동안 2주 마다 0.1 내지 10 mg/kg으로 투여된다[Topalian et al., J Clin Oncol 32:1020 (2014)]. 각 투여는 하기에 논의되는 것과 유사한 수성 조성물에서 정맥내로 수행되었다.
약제학적 조성물
약제학적으로 허용 가능한 희석제에 용해되거나 분산된 종양-절제 유효량의 고려된 할로겐화된 잔텐 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유한 약제학적 조성물은 고려된 방법에서 사용된다. 종종 본 명세서에서 화학절제 조성물로서 지칭되는 이러한 조성물은 유도된 면역 항암 성분을 생산하기 위해 동물 숙주의 면역계를 유도하도록 포유류 숙주 동물에서의 종양내로(병소내로) 생체내 투여된다.
그러한 약제학적 조성물은 바람직하게는 약 1% 이상의 할로겐화된 잔텐, 예를 들어, 로즈벵갈(즉, PV-10)을 포함하는 병소내 주사를 위해 적합한 수성 조성물 또는 다른 할로겐화된 잔텐 또는 이들의 혼합물의 유사한 용액이다. 다이소듐 또는 다이포타슘 염과 같은 할로겐화된 잔텐의 약제학적으로 허용 가능한 염이 이러한 조성물에서 사용될 수 있다.
약 1%(w/v) 내지 약 3%(w/v)보다 큰 할로겐화된 잔텐의 양이 화학절제 사용을 위해 특히 유용한데, 왜냐하면, 더 낮은 농도가 일반적으로 표적 조직의 파괴(절제)를 직접적으로 유도하는데 불충분하기 때문이다. 결과적으로, 바람직한 구현예에서, 할로겐화된 잔텐의 농도는 약 3%(w/v) 내지 약 20%(w/v), 및 더욱 바람직하게는 약 3%(w/v) 내지 약 10%(w/v)이다. 다른 구현예에서, 할로겐화된 잔텐의 농도는 약 10%(w/v) 내지 약 20%(w/v)이다. 또 다른 구현예에서, 할로겐화된 잔텐의 농도는 약 10%(w/v)이다.
IL 또는 다른 비경구 투여에 의해 투여된 화학절제 약제학적 조성물의 전형적인 투여량은 약 0.1 mL/cc 병소 부피 내지 약 2 mL/cc 병소 부피, 더욱 바람직하게는 약 0.25 mL/cc 내지 약 0.75 mL/cc 병소 부피, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 mL/cc 병소 부피이다. 이러한 용량은 통상적으로 약 10 mg 내지 약 1500 mg의 할로겐화된 잔텐의 환자 용량에 해당한다(이는 진단 간 검정을 위해 사용되는 그러한 용량보다 더 유의미하게 높다).
고려된 약제학적 조성물은 또한 고도로 안정적이고, 제조 및 사용 둘 모두에서 용이하게 취급될 수 있다. 이러한 바람직한 농도는 부피에 대한 중량(w/v)으로 표현된다. 그러나, 중량에 대한 중량(w/w)의 농도는 실질적으로 균등하다.
본 명세서에서 유용한 바람직한 할로겐화된 잔텐은 하기 화학식 1의 화합물(여기서, R1은 독립적으로 F, Cl, Br, I, H 또는 C1-C4 알킬이며; R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 Cl, H 또는 I이며, 여기서, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나의 치환체는 I이며, 적어도 하나는 Cl 또는 H이며; R6은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이며; R11은 H 또는 C1-C4 알킬이며; R12는 H 또는 C1-C7 아실임); 모든 (a) 토토머 형태; (b) 아트로프 이성질체, (c) 하기 화학식 2에 도시된 바와 같은 닫혀진 락톤 형태, (d) 하기 화학식 2에 도시된 락톤 형태의 거울상 이성질체, 및 (e) 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
사용되는 바람직한 화학절제 할로겐화된 잔텐은 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 용해되거나 분산된 로즈벵갈(4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5',7'-테트라아이오도-플루오레세인), 에리스로신 B, 플록신 B, 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5',7'-테트라아이오도플루오레세인, 2',4,5,6,7-펜타클로로-4',5',7'-트라이아이오도플루오레세인, 4,4',5,6,7-펜타클로로-2',5',7'-트라이아이오도플루오레세인, 2',4,5,6,7,7'-헥사클로로-4',5'-다이아이오도플루오레세인, 4,4',5,5',6,7-헥사클로로-2',7'-다이아이오도플루오레세인, 2',4,5,5',6,7-헥사클로로-4',7'-다이아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',5'-트라이아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라클로로-2',4',7'-트라이아이오도플루오레세인, 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',5'-트라이아이오도플루오레세인, 및 4,5,6,7-테트라브로모-2',4',7'-트라이아이오도플루오레세인 중 하나 이상이다. 로즈벵갈은 특히 바람직한 할로겐화된 잔텐이다.
고려되는 화학절제 약제학적 조성물이 통상적으로 종양내로 주사에 의한 것과 같은 비경구 투여[병소내(IL) 투여]를 위해 의도되기 때문에, 이러한 조성물은 전해질을 함유하고, 바람직하게는 대략 생리학적 삼투압 및 pH 값을 가져야 한다. 화학절제 약제학적 조성물에서 단일로 하전된 전해질 이온의 바람직한 농도는 약 0.5 내지 약 1.5%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.8 내지 약 1.2%(w/v)이고, 가장 바람직하게는 약 0.9%(w/v)의 농도이다. 약 0.9%(w/v) 농도는 대략 등장액에 해당하기 때문에 특히 바람직하다. 추가의 바람직한 구현예에서, 화학절제 약제학적 조성물에서 전해질은 염화나트륨이다.
이러한 수준에서의 전해질은 IL 화학절제 약제학적 조성물의 삼투압을 증가시킨다. 이에 따라, 소정 범위의 전해질 농도를 특정하는 것에 대한 대안으로서, 삼투압은 부분적으로, 조성물의 전해질 수준을 특징화하기 위해 사용될 수 있다. 조성물의 삼투압이 100 mOsm/kg보다 더 높고, 더욱 바람직하게는 조성물의 삼투압이 약 250 mOsm/kg보다 더 높고, 가장 바람직하게는 이는 약 300 내지 약 500 mOsm/kg인 것이 바람직하다.
수성 비히클 중 할로겐화된 잔텐의 최대 용해도를 수득하고 생물학적 조직과 양립성을 보장하기 위해 화학절제 약제학적 조성물의 pH 값이 약 4 내지 약 9인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 pH 값은 약 5 내지 약 8 및 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 7.5이다. 이러한 pH 값에서, 할로겐화된 잔텐은 통상적으로, 낮은 pH 값에서 형성하는 수용성 락톤보다는 오히려 2염기성 형태로 존재한다.
화학절제 약제학적 조성물의 pH 값은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 조절되거나 조정될 수 있다. 조성물은 산 또는 염기, 등의 첨가에 의해 완충되거나 pH 값 조정될 수 있다. 할로겐화된 잔텐, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이 할로겐화된 잔텐 농도 및/또는 전해질 농도에 따라 약산이기 때문에, 조성물의 pH 값은 완충제 및/또는 pH 조절제의 사용을 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나, 조성물이 임의의 완충제를 함유하지 않고 투여된 직후에 생물학적 환경에 순응할 수 있게 하는 것이 특히 바람직하다.
개시내용이 본 명세서에 참고로 포함되는, 미국 특허 제9,107,887호에 개시된 바와 같이, 화학절제 약제학적 조성물은 바람직하게는 흑색종, 전립선, 유방, 방광, 신장, 췌장, 결장, 대장, 담낭, 원발성 또는 전이성 간암(간세포 암종), 및 소세포 및 비-소세포 폐암과 같은 적어도 하나의 암성 고형 종양내에 병소내(IL)로 투여된다. 본 발명의 바람직한 구현예는 본 명세서에서 특별히 흑색종과 관련하여 예시적으로 기술된다.
고려된 약제학적 조성물이 체내법(intracorporeal)(비경구) 경로인, IL 투여를 위해 의도되기 때문에, 미국 약전(USP) <71>에 적합성을 위해 요구되는 바와 같이 멸균이고, 또한 USP <85>(리뮐루스 변형세포 용해물 검정) 또는 USP <151>(토끼 발열원 시험), 또는 발열원 또는 1㎖당 10 이하(NMT)의 내독소 단위(EU)에 균등한 내독소 수준에서 실질적으로 균등한 요건을 준수하도록, 무시할 정도의 수준의 발열성 물질을 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 약제학적 조성물은 USP <788>에서 정의된 바와 같은 미립자(즉, 용기 당 크기가 10 마이크론 초과인 NMT 3000 미립자, 및 크기가 25 마이크론 초과인 NMT 300 미립자)의 함량을 제한하는 요건, 또는 실질적으로 균등한 요건을 준수해야 한다. USP로부터의 이러한 참고문헌 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
고려되는 할로겐화된 잔텐 화합물을 함유한 약제학적 조성물이 투여되고 유도된 면역 항암 성분을 함유한 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프 조직 중 하나 이상을 포함한 샘플이 제거된, (치료를 필요로 하는) 암성 종양을 갖는 동물 숙주는 실질적으로 임의의 포유동물일 수 있다. 예시적인 포유류 동물 숙주는 영장류, 예를 들어, 인간, 유인원, 예를 들어, 침팬지 또는 고릴라, 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이 또는 마카크(macaque), 실험실 동물, 예를 들어, 래트, 마우스 또는 토끼, 반려 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 또는 식용 동물, 예를 들어, 암소 또는 거세소(steer), 양, 어린양, 돼지, 염소, 라마, 등을 포함한다.
시험관내 포유류 세포 접촉이 배양 및 우선적 확장에서와 같이 고려되는 경우에, 예시적 포유동물로부터의 암성 세포의 조직 배양은 종종, 하기에 예시되는 바와 같이 사용된다.
요망되는 경우에, 추가 면역 반응을 유도하기 위해 이후에 숙주 동물에서 종양에 투여되는 유도된 면역 항암 성분들을 형성하기 위해 숙주 동물로부터의 잘려진 종양에 시험관내에서 약제학적 조성물에 용해되거나 분산된 및 이후에 상기에서 논의된 바와 같이 시험관내에서 배양(유지)된 화학절제 약제학적 조성물 종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐 화합물이 투여될 수 있다.
고려된 조성물은 종종 단지 1회 제공된 종양에 투여될 필요가 있지만, 수 일 또는 주, 또는 달의 기간에 걸쳐 그러한 종양에 여러 차례 투여될 수 있다. 동물 숙주에서 별개의 종양은 각각 이의 자체의 하나 이상의 투여를 수용할 수 있다.
고려된 할로겐화된 잔텐 화합물의 약제학적 조성물은 바람직하게는 치료될 암성 종양내로 직접적으로 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 비경구는 혈관내 및 병소내 주사, 또는 주입 기술뿐만 아니라, 피하, 복강내 또는 유사한 투여 모드를 포함한다. 약물의 제형은 예를 들어, 문헌[Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania; 1975 및 Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]에서 논의된다.
주사 가능한 제조물에 대하여, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 현탁액은 적합한 분산 또는 습윤 화합물 및 현탁 물질을 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제조물은 또한 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄다이올 중 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매들 중에는 물, 링거액, 및 염화나트륨 등장액, 포스페이트-완충 염수가 있다. 액체 약제학적 조성물은 예를 들어, 비경구 투여를 위해 적합한 용액을 포함한다. 활성 성분의 멸균 수용액 또는 물, 에탄올, DMSO 또는 프로필렌 글리콜을 포함하는 용매 중 활성 성분의 멸균 용액은 비경구 투여를 위해 적합한 액체 조성물의 예이다.
멸균 용액은 요망되는 용매 시스템에 활성 성분을 용해시키고 이후에 이를 멸균시키기 위해 막 필터로 얻어진 용액을 통과시킴으로써, 또는 대안적으로, 멸균 조건 하에서 이전에 멸균화된 용매에 멸균 화합물을 용해시킴으로써 제조될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 단위 투약 형태를 갖는다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 할로겐화된 잔텐 종양-절제 화합물을 함유한 단위 용량으로 분할된다. 단위 투약 형태는 패키징된 제조물일 수 있으며, 패키지는 예를 들어, 바이알 또는 앰플에서, 별개의 양의 제조물을 함유한다.
논의
IL 치료법은 예시적인 흑색종 환자에 대한 외과적 개입에 대한 대안이다. 그러나, 일부 병소내 화합물은 방관자, 치료받지 않은 병소의 전신 반응 및 퇴행을 유도하였다. IL 치료법에 도입된 일부 기존 화합물은 이상적이지 않다.
예를 들어, BCG는 아나필락시성 반응, 혈청전환 및 전신 감염을 포함하는 많은 수의 합병증과 관련이 있다[Abbott et al., Surg Clin North Am 94:1003-1015, viii(2014)]. BCG는 또한, 흑색종 치료에서 가장 큰 연구들 중 하나에서 효과를 입증하는 데 실패하였다[Agarwala et al., Cancer 100:1692-1698 (2004)]. 병소내 IL-2는 전신 종양-특이적 반응을 유도하지 못할 수 있지만, 치료된 흑색종 환자 중 62.5%에서 완전한 반응을 야기시켰다[Radny et al., Br J Cancer 89:1620-1626 (2003)] .
IL 치료법에 대한 신규한 후보물질로서, PV-10은 심각한 부작용 없이 종양 세포를 세포 용해시키는 능력을 나타낸다. 전이성 흑색종의 치료를 위한 PV-10의 최근 2상 임상 시험은 중간 정도의 부작용이 있는 최대 10개의 표적화된 병소에서 50%의 전체 반응률 및 26%의 완전한 반응률을 나타내었다[Thompson et al., Ann Surg Oncol. (2014)]. 치료된 환자에서, 8%는 52주 후에 질병의 증거를 지니지 않았다.
1상 연구에서, 91.7% 전체 병소 반응이 존재하였다(11개의 주사된 병소로부터 10개는 14일의 치료 내에 퇴행됨). 이러한 두 시험 모두에서는 치료되지 않은 병소가 또한, 퇴행한다는 것을 나타내었다(각각 23% 및 83%). 이러한 데이터는 IL PV-10에 의해 촉발된 방관자 종양의 종양-특이적 전신 반응이 존재함을 시사하는 것이다.
PV-10-유도된 종양-특이적 면역력의 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. B16 및 MT-901-지닌 마우스에서의 이전 연구는 PV-10의 IL 주사 후에 종양-특이적 T 세포의 활성화를 나타내었다[Toomey et al., PloS one 8:e68561 (2013)]. 다른 연구에서, IL PV-10으로 치료된 환자의 흑색종 병소내에 림프구의 침윤이 검사되었다. 그러나, 림프구는 IL PV-10 후에 병소가 감소된 일부 환자의 절제된 병소에서 검출되지 않을 수 있다[Sarnaik et al., ASCO Annual Meeting, Abstract 9028, presented June 2, 2014]. 이는 PV-10의 세포독성 또는 치료 후 종양 크기의 감소로 기인한 것일 수 있다. 예상치 못하게, 순환하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 수 증가 및 자가조직 종양 또는 HLA-매칭된 종양에 대한 IFN-γ 반응 증가는 이러한 동일한 환자의 말초 혈액에서 측정되었다.
OVA-발현 M05 흑색종을 지닌 마우스를 이용하여, 하기에서는, IL PV-10 치료 후 증가된 종양-특이적 T 세포(OT-1 T 세포) 및 기억 특징을 갖는 보다 많은 T 세포가 존재함을 나타낸다. PV-10-치료된 M05-지닌 마우스에서 OT-1 T 세포의 입양 전달은, OT-1 T 세포가 종양 항원에 대한 반응에서 더욱 빠르게 증식함을 나타내었다. 그러한 효과는 배수 림프절(DLN)내로의 종양으로부터의 수지상 세포(DC)의 침윤 증가에 의해 및 DC 활성화에 의해 일부 설명될 수 있다(도 4).
HMGB1 단백질은 종양 발달 및 암 치료법 동안 종양-증진 및 종양-억제 둘 모두의 역할을 한다. 한편으로, HMGB1 기능장애는 암의 특징 각각과 관련이 있으며, 이는 항-종양 면역력을 감소시킬 수 있다[Kusume et al., Pathobiology 76:155-162 (2009); Liu et al., Leukemia 25:23-31 (2011)]. 증가된 수준의 분리된 HMGB1 및 막-결합된 HMGB1의 발현은 종양 미세-환경에서 검출된다[Tang et al., Biochim Biophys Acta 1799:131-140 (2010)].
다른 한편으로, HMGB1은 종양 억제제-망막아세포종 단백질[Jiao et al., Acta Pharmacol Sin 28:1957-1967 (2007)] 또는 게놈의 안정화[Giavara et al., Curr Biol 15, 68-72 (2005)]와의 관련성으로 인하여 항-종양 역할을 한다. 교아세포종 다형성-지닌 마우스에서, FMS-유사 티로신 키나아제 3 리간드(Flt3L) 및 티미딘 키나아제의 국소 전달은 종양-침윤 DC를 활성화시키기 위해 죽어가는 종양 세포로부터 HMGB1의 배출을 통해 종양 퇴행에 이르게 한다[Curtin et al., PLoS Med 6, e10 (2009)]. HMGB1/TLR4 경로의 차단은 항원 가공의 간섭 및 DC의 교차-표출 능력을 통해 화학요법 및 방사선요법에서 종양-특이적 면역 반응을 폐지한다[Apetoh et al., Nature Med 13:1050-1059 (2007)]. 또한, TIM-3은 DC에서 HMGB1-매개 핵산 센서 시스템을 억제하고, 이에 따라, DNA 백신 및 화학요법의 효능을 감소시킬 수 있다[Chiba et al., Nature Immunol 13:832-842 (2012)].
하기에 논의된 연구에서, PV-10와 함께 항온처리 후 흑색종 세포의 상청액에서 HMGB1의 배출 증가가 측정되었다. 이러한 데이터는 HMGB1이 광역학 조사후 1시간 동안 로즈벵갈 아세테이트로 치료된 Hela 세포로부터 수동적으로 방출되었다는 관찰과 일치한다[Panzarini et al., PloS One 9:e105778 (2014)].
Panazarini 등의 연구에서, 로즈벵갈 아세테이트로의 치료는 감광화된 Hela 세포가 아폽토시스성 및 자가소화성이 되고 HSP70, HSP90 및 HMGB1를 분비하는 것을 가능하게 한다. 상반되게, 본 결과는 HSP 90의 수준이 변하지 않았으며, PV-10 항온처리 후 분비된 HSP 70이 적다는 것을 나타내었다. 이러한 불일치는 세포를 치료하는 상이한 방법 및 사용되는 로즈벵갈의 상이한 유사체로 인한 것일 수 있다.
또한, 환자 혈청에서의 HMGB1 수준은 IL PV-10 후에 증가되었다. 이러한 결과는 화학방사선 요법 후 암 환자의 혈청에서 HMGB1 수준의 증가를 나타내었다는 다른 연구와 일치한다[Suzuki et al., Cancer Res 72:3967-3976 (2012)]. 이에 따라, Suzuki 및 동료 연구원은, 항원-특이적 T-세포 반응을 갖는 환자에서 HMGB1의 수준이 항원-특이적 T-세포 반응 없는 환자에서의 수준보다 유의미하게 더 높다는 것을 발견하였다. 이러한 연구에서, HMGB1의 면역조직화학 분석은 절제된 종양 샘플에서 HMGB1의 더 높은 발현이 환자의 더 나은 생존과 상관 관계가 있음을 나타내었다.
하기 연구는 PV-10으로 치료된 종양 세포의 상청액이 BM-유도 DC에 대한 CD40 발현의 상향-조절 및 DC에 의한 증가된 항원 표출의 원인이 됨을 나타내었다. 이는 HMGB1이 인간 골수성 DC 및 플라즈마사이토이드 DC의 활성화를 위해 중요하다는 관찰과 일치한다[Dumitriu et al., J Immunol 174:7506-7515 (2005); Messmer et al., J Immunol 173:307-313 (2004)].
CD40 신호전달로의 DC의 성장은 종양 항원을 제시하고 종양 조직으로의 이동 후 세포독성 활성에 대한 CD8 T 세포를 프라이밍하는 데 중요하다[Watanabe et al., J Immunol 171:5828-5836 (2003)]. Watanabe는, DC에서 단기간 CD40 신호전달이 종양-DLN으로의 DC 이동을 증가시켰고 성공적으로 방어 면역력을 유도하였음을 발견하였다. 또한, HMGB1은 케모카인 리간드 9(CCL9) 및 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 12(CXCL12)에 대한 DC 반응을 유도하며[Dumitriu et al., J. Leuk Biol 81:84-91 (2007)] HMGB1/RAGE 상호작용이 24시간 후에 DLN으로의 피하 주사된 DC의 이동을 유도할 수 있는 것으로 나타났다[Manfredi et al., J Immunol 180:, 2270-2275 (2008)]. 이는 IL PV-10이 종양 부위에서 DLN으로 이동하는 증가된 수의 DC를 유도한다는 본 발명의 데이터와 일치한다. HMGB1 및 RAGE 수용체의 상호작용은 또한 이러한 공정에서 관여될 수 있다.
암에서 HMGB1의 이중 기능은 표적 세포, 종양 세포 또는 세포가 작용하는 면역 세포, 사이토카인과 상호작용하고 이와 상승효과를 갖는 수용체에 따른다. 이는 부분적으로 HMGB1의 레독스 상태에 의해 설명될 수 있으며, 아폽토시스성 세포로부터의 산화성 HMGB1은 내성을 유도한다[Kazama et al., Immunity 29:21-32 (2008)]. PV-10뿐만 아니라 다른 DAMP로 치료된 종양에 의해 분비된 HMGB1의 레독스 상태, 예를 들어, 요산 및 칼레티쿨린이 조사될 것이며, 이는 본 발명의 기초가 되는 연구에 관여하지 않는다.
이러한 연구는, IL PV-10 치료법이 흑색종 환자에서 향상된 종양-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내었다. 흑색종을 지닌 마우스에서, IL PV-10은 HMGB1을 방출시키기 위해 종양 세포의 괴사를 유도하며, 이는 DC 활성화 및 DLN으로의 DC 침윤을 위해 중요하고, 이에 따라, 종양-특이적 T 세포를 활성시키기 위해 중요하다. 항-종양 면역력의 유도에서 IL PV-10의 역할은 또한, 면역 체크포인트 분자, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 차단과 조합한 향상된 종양-특이적 면역 반응의 가능성을 시사한다.
결과
IL
PV
-10은 흑색종 환자에서 전신 면역 반응을 유도함
전이성 흑색종의 치료에서 PV-10의 IL 주사의 잠재적인 메커니즘을 조사하기 위해, 피부 및/또는 피하 전이성 흑색종을 갖는 14명의 인간 환자를 포함한 파일롯 임상 시험을 수행하였다(하기 표 1). 연구 방식은 도 1a에 도시되어 있다. 각 환자에서 2개의 연구 병소를 생검 사전처리에 의해 샘플링하였다.
7일 후[시험 0일(D0)], 2개의 병소들 중 하나에 IL PV-10을 주사하였다. PV-10 주사 후 7일 내지 14일째에, 두 부위 모두를 완전히 절개하였다. 생검 시편을 고정시키고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 병리학자에 의해 평가하였다. IL PV-10 주사 전 및 후에, 치료된 시편 및 치료되지 않은 시편에서 병리학적 완전 반응(pCR)의 비교를 수행하였으며, 결과를 흑색종 항원 Melan-A/MART-1(melA)에 대한 면역조직화학적 염색으로 확인하였다.
도 1b 및 도 1c에 도시된 바와 같이, 종양은 PV-10-치료된 병소 및 방관자 병소 둘 모두에서 완전히 퇴행하였다. 그러한 퇴행은 12명의 환자 중 4명에서 나타났다. 추가적으로, 12명의 환자 중 11명은 주사된 병소의 적어도 부분 퇴행을 나타내었으며, melA+ 세포의 빈도에서 4배 감소하였다(평균 값: 26.8 ± 3.6 vs 6.4 ± 2.8). 또한, 12명의 환자 중 10명은 melA+ 세포의 비율의 3배 감소(평균 값: 37.5 ± 6.7 vs 12.2 ± 4.1)와 함께 방관자 병소의 부분 퇴행을 나타내었다.
이러한 결과는, IL PV-10이 IL PV-10 주사에 의한 직접 절제에 대한 2차적인 전신 반응을 유도할 수 있음을 지시한다. 면역 세포의 역할을 시험하기 위하여, PV-10 치료된 및 방관자 병소에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T-세포의 백분율을 IL PV-10로의 치료 전 및 후에 비교하였다. 그러나, 종양이 완전히 퇴행되었을 때 병소에서 침윤이 거의 검출되지 않았으며, 유의미한 변화가 측정되지 않았다.
이어서, 면역 세포를 IL PV-10으로의 치료 전 및 후에 말초 혈액에서 시험하였다. PV-10 치료 후 순환하는 CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 및 NK T-세포의 유의미한 증가가 존재하였다(도 1d 내지 도 1f).
CD8+ T-세포가 흑색종 종양을 인식할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 순환하는 CD8+ T-세포를 정제하고, 자가조직 종양 세포와 시험관 내에서 동시-배양하였다. IL PV-10으로의 치료 후 인터페론-감마(IFN-γ) 생성이 유의미하게 증가하였는데(도 1g), PV-10 치료가 종양-특이적 면역 반응을 지시하는 것이다.
자가조직 종양이 모든 환자에 대해 이용 가능하지 않기 때문에, HLA-매칭된 종양 세포주를 또한 사용하였다. 순환하는 CD8+ T-세포에서 IFN-γ 수준을 시험된 6명의 환자 중 4명에서 IL PV-10 주사 후 증가하였다. CD8+ T-세포가 HLA-미스매칭된 세포주와 함께 동시-배양되었을 때, 변화가 측정되지 않았다. 이와 함께, 이러한 연구들은 IL PV-10 주사가 흑색종 환자에서 종양-특이적 면역 반응을 향상시킴을 나타낸다.
M05를 지닌 마우스에서 IL
PV
-10은 종양-특이적 면역 반응을 유도함
PV-10에 의해 유도된 종양-특이적 면역 반응의 기초 메커니즘을 조사하기 위하여, M05 종양 세포를 지닌 C57BL/6 마우스를 사용하였다. M05 종양 세포는 난백알부민(OVA) 단백질을 발현시키는 B16 흑색종 세포이다. B16 모델에서의 발견과 유사하게[Toomey et al., PloS one 8:e68561 (2013)], PV-10의 IL 주사는 종양 성장을 직접적으로 억제하였다(도 2a). IL PV-10 치료법은 PBS-치료 군와 비교하여, PV-10-치료된 마우스의 배수 림프절(DLN)에서 OVA-특이적 CD8+ T-세포를 증가하였다(도 2b).
PV-10의 IL 주사가 기억 특징을 갖는 T 세포를 유도하였는지의 여부를 결정하기 위해, IL PV-10으로 2회 치료된 마우스로부터의 비장 세포를 CD8+ 기억 T-세포를 유지시키기 위해 요구되는, 사이토카인 IL-15 및 IL-21이 보충된 매질 및 OVA 펩타이드의 존재 하에서 시험관내에서 배양하였다[Nguyen et al., J Leukocyte Biol 87:43-49 (2010)]. PV-10-치료된 마우스로부터의 T-세포는 PBS-치료된 마우스로부터 단리된 T-세포와 비교하여 M05 세포에 대한 반응으로 IFN-γ의 분비의 약 2배 증가를 나타내었다. 이는, IL PV-10이 M05 흑색종을 지닌 마우스에서 기억 특징을 갖는 종양-특이적 T-세포를 유도할 수 있음을 지시한다.
IL PV-10 후 CD8+ T-세포 반응을 모니터링하기 위하여, PV-10 또는 PBS를 13일에 M05 흑색종을 지닌 마우스에 주사하였고, Celltracker® 바이올렛 염료로 표지된 입양 전달된 OT-1 T-세포에 조사하였다. OT-1 T-세포는 OVA 단백질로부터 유래된 OVA 257-264 펩타이드를 특이적으로 인식하는 CD8+ T-세포이다[Roetzschke et al., Eur J Immunol 21 (11): 2891-2894 (1991); Lipford et al., J Immunol . 150(4): 1212-1222 (1993)]. PV-10의 IL 주사 및 OT-1 세포의 입양 전달의 조합은 종양 진행을 유의미하게 막고 생존율을 증가시켰다(도 3a 및 도 3b).
OT-1 세포의 입양 전달 단독 또는 IL PV-10로의 치료 단독은 52 ㎟의 평균 종양 크기를 갖는 경우에 치료가 13일에 시작하였을 때 종양 진행을 방지하는데 충분하지 못하였다. 종양, 림프절(LN) 및 비장에서 OT-1 T 세포의 증식을 주사된 CD45.1+ OT-1 T-세포의 염료 희석 측정에 의해 IL PV-10 주사 후 시험하였다(도 3c). OT-1 세포는 전달 후 4일째에 PV-10- 또는 PBS-치료된 마우스에서 종양 부위 및 근위 림프절 둘 모두에서 강하게 증식하였으며, 세포의 70% 초과는 적어도 하나의 추가적인 분열을 갖는다(전달 전 세포와 비교하여, 하기에서 "분열된" T 세포로 지칭됨)(도 3d).
증가된 수의 분열된 T 세포를 PBS로 치료된 마우스와 비교하여, IL PV-10으로 치료된 마우스에서 비장, 종양, 및 원위 LN에서 증가된 수의 분열된 T 세포를 측정하였다(도 3c 내지 도 3f). 근위 LN에서 변화가 발견되지 않았으며(데이터는 미도시됨), 배수 LN에서 OT-1 T-세포 반응이 치료된 마우스와 치료되지 않은 마우스 간의 차이를 측정하기에 너무 강력할 수 있다는 것을 지시하는 것이다. 함께, 이러한 데이터는 PV-10의 IL 주사가 종양-특이적 CD8+ T-세포 반응을 상승시켜, M05-지닌 마우스에서 종양 진행의 방지를 유도함을 지시한다.
IL
PV
-10은 수지상 세포(DC) 활성화를 유도함
DC가 T 세포를 프라이밍할 수 있는 전문적인 항원-표출 세포이기 때문에, 비장 및 LN에서의 DC의 존재를 IL PV-10 치료 후 시험하였다. PV-10 주사 후 7일째에 비장 DC의 절대 수 및 백분율이 변화되지 않았다. 이전 발견과 일치하여, CD8+ T 세포 및 골수성-유래 억제제 세포(MDSC)를 포함하는 다른 면역 서브세트는 또한 변하지 않았다(데이터는 도시되지 않음)[Toomey et al., PloS one 8:e68561 (2013)].
그러나, 비-배수 LN(NDLN)이 아닌 배수 LN(DLN)에서 침윤 DC의 수는 PV-10 치료의 24시간(즉, 약 1일) 후에 증가하였다(도 4a). DLN에서 세포의 전체 총 수는 치료 후 유의미하게 변하지 않았다. 72시간 후에, PV-10-치료된 마우스의 DLN에서 침윤 DC의 수는 PBS-치료된 마우스에서와 같이 기저 수준까지 감소하였는데, 이는 DC의 침윤이 일시적임을 시사한다.
DC가 종양의 부위로부터 침윤되는지의 여부를 시험하기 위하여, FITC로 표지된 OVA 단백질(FITC-OVA)을 PV-10 또는 PBS의 IL 주사 후 4시간 동안 IL 주사하였다. 증가된 FITC+ DC를 PV-10-치료된 마우스에서 NDLN에서가 아닌 DLN에서 측정하였는데(도 4b), 이는 IL PV-10이 항원을 섭취하고 종양 부위로부터 DLN에 침윤시키기 위해 DC를 유도할 수 있음을 시사한다.
IL PV-10 치료 후 DLN에서 향상된 OT-1 T-세포 증식 및 증가된 DC 침윤이 측정되었기 때문에, PV-10의 IL 주사가 종양-특이적 반응을 위해 요구되는 DC 활성화를 유도한다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, BM-유래 DC를 사전에 IL PV-10 또는 PBS로 주사된 B16 종양으로부터의 상청액과 함께 동시-배양하였다.
OVA 단백질로 펄싱된 후, DC를 OT-1 T-세포와 함게 동시-배양하였다. PV-10 치료된 마우스로부터 B16 종양에서 유래된 상청액과 함께 배양된 DC는 PBS-치료된 마우스로부터의 B16 종양에서 유래된 상청과 함께 배양된 DC와 비교하여, OT-I T-세포의 증가된 증식을 유도하였다(도 4c). 또한, PV-10-치료된 세포의 세포 용해물로 펄싱된 DC는 PBS-치료된 세포의 세포 용해물로 펄싱된 DC보다 OT-1 T-세포에 의한 IFN-γ의 분비를 더 양호하게 자극할 수 있었다(도 4d). 함께, 이러한 결과는 DC의 활성화 및 종양 부위에서 DLN으로의 DC의 증가된 침윤에서 IL PV-10의 역할을 지지한다.
PV
-10 치료는 HMGB1을 통해 DC 활성화를 증가시킴
IL PV-10에 의해 유발된 종양 사멸이 DC의 활성화에 어떻게 관련이 될 수 있는지를 시험하기 위하여, DC 활성화에 기여할 수 있는 종양 세포에 의해 방출되는 잠재적인 인자인, PV-10-매개 세포사가 조사되었다.
첫째로, PV-10에 의해 매개된 뮤린 흑색종 B16 세포의 세포독성을 시험관내에서 조사하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, PV-10은 B16 세포에서 용량-의존적 세포독성을 나타내었으며, 48시간의 치료 후에 IC50 값은 60μM이었다. 마우스 배아 NIH3T3 섬유아세포에서 세포독성이 낮았으며, PV-10로의 48시간 치료후 IC50 값은 110μM이었다(도 5a). B16 및 3T3 세포에 대한 PV-10의 IC50 값은 6, 12 및 24시간에 유사하였다.
50μM의 PV-10으로의 48시간 치료 후 B16 세포 및 인간 원발성 흑색종(P) 세포의 괴사(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 다이락테이트 염색; DAPI+)가 유의미하게 증가하였으며, 3T3 또는 인간 배아 신장 293T 세포에 대한 효과가 거의 없었다(도 5b). 그러나, 비교적 적은 비율의 세포는 조기 아폽토시스를 나타내었으며, 이는 Annexin V+DAPI-에 의해 입증된 것이다(BioVision, Inc., 캘리포니아주 밀피타스 소재; 도 5c). 이러한 것은 또한 치료 후 6, 12 및 24시간에 일어났다. 이러한 결과는 50μM의 PV-10로의 치료가 아폽토시스보다 오히려 괴사를 통해 세포사를 유도함을 지시한다. 동일한 용량의 PV-10의 존재 하에서 매우 적은 3T3 섬유아세포 및 인간 배아 신장 293 T 세포는 괴사되거나 아폽토시스성이었다(도 5b 및 도 5c). 이러한 연구는 PV-10이 비-종양 세포에 대해 독성이 없는 특정 용량에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 예시한다.
종래에, 괴사가 세포막의 완전성의 파괴 및 세포외 공간으로의 세포질 성분의 조절되지 않은 방출과 관련될 수 있다는 것이 밝혀졌다. PV-10으로 치료된 종양 세포가 임의의 손상-관련 분자 패턴 분자(DAMP)를 방출하였는지의 여부가 다음으로 시험되었다.
DAMP, 예를 들어, HMGB1, IL-1a, 및 HSP 단백질은 괴사 및 DC 활성화의 자극에 의한 공지된 부산물이다. B16, 888 흑색종 세포 및 3T3 섬유아세포를 48시간 동안 0, 100 또는 200μM PV-10으로 치료하였다. 동일한 양의 상청액을 HMGB1, HSP70, HSP90 또는 IL-1a에 대해 면역블롯팅하였다. PV-10으로의 치료는 3T3 세포가 아닌, B16 세포 및 인간 흑색종 888 세포에서 용량 의존적으로 상청액에 HMGB1의 방출을 유도하였다(도 6a 및 도 6b). HSP 70 및 IL-1a는 검출되지 않았고, HSP90은 PV-10로의 처리 후 변하지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
분비된 HMGB1이 DC 활성화에 기여하는 경우를 결정하기 위하여, 골수-(BM-)유래 DC를 HMGB1 중화 항체 또는 아아이소타입 대조 항체의 존재 하에 2일 동안 PV-10으로 치료된 B16 세포로부터의 10% 상청액(TS)과 함께 항온처리하였다. HMGB1 중화 항체는 RAW264.7 대식세포로부터의 TNF-α 분비의 차단에 의해 입증되었다.
PV-10-치료된 세포로부터의 종양 상청액은 표면 CD40의 상향-조절과 함께, DC 성숙을 야기시켰다. HMGB1의 중화는 CD40 발현을 유의미하게 감소시켰다(도 6c). PV-10으로의 DC의 치료는 CD40 발현을 직접적으로 변화시키지 않았는데, 이는 PV-10 자체가 DC 성숙에 영향을 미치지 않음을 시사한다. CD86 및 CD80을 포함하는, DC 상의 다른 공동-자극 마커는 상향-조절되지 않는다.
DC의 항원 표출 용량을 비교하기 위하여, BM-유래 DC를 HMGB1 중화 항체 아아이소타입 대조 항체의 존재 하에서 2일 동안 IL PV-10으로 치료된 M05 종양으로부터의 상청액과 함께 항온처리하였다. 전처리된 DC를 OVA 단백질로 펄싱하고 이후에, OT-1 세포와 동시-배양하여 OT-1 T-세포 증식을 시험하였다. HMGB1의 차단은, [3-H]-티미딘 도입에 의해 결정된 바와 같이, OT-1 T-세포 증식을 자극시키는 DC의 능력을 감소시켰다(도 6d). 이러한 결과는, PV-10으로 흑색종 세포와 같은 종양 세포의 치료가 HMGB1의 방출을 유도하고, 이는 DC 활성화를 위해 필수적인 것임을 지시한다.
HMGB1 방출이 IL PV-10으로 치료된 환자와 관련이 있는지를 결정하기 위하여, IL PV-10으로의 치료전 및 치료후 환자의 혈청에서의 HMGB1의 수준을 환자 혈청에서 IFN-γ의 측정에 의해 비교하였다. 환자의 혈청에서 HMGB1의 농도는 IL PV-10로의 치료 후 7 내지 14일에 수집된 샘플에서 유의미하게 증가되었다(도 7). 이에 따라, HMGB1 분비는 PV-10으로 IL 치료된 전이성 흑색종과 같은 종양을 갖는 환자에서 방관자 효과에 기여하는 것으로 보인다.
실시예
하기 실시예는 예시적이고 비제한적인 것으로 의도되고, 본 발명의 특정 구현예를 나타낸다.
일반적인 방법
인간 피검체
피부 및/또는 피하 전이성 흑색종을 가진 14명의 환자를 1상 임상 시험에 등록하였다(NCT01760499). 14명의 환자 중 6명은 이전 이필리무맙, 항-PD-1 및또는 베무라페닙 치료법에 불응하는 전이성 질병을 갖는다(표 1). 각 환자에서 2개의 종양 병소를 치료전 생검에 의해 샘플링하였다. 2개의 병소 중 하나에 OL PV-10을 주사하고, 두 나머지 부위 모두를 7 내지 14일 후에 완전히 절개하였다. 생검 시편을 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 임베딩하였다. 시편을 5 내지 8㎛로 절편화하고, 병리학적 완전 반응의 결정을 위하여 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 염색하였다.
면역조직화학을 CD8, CD4, CD56 및 melA를 사용하여 수행하였다. 말초 혈액 및 혈청을 분석을 위해 IL PV-10 주사 전에, IL PV-10 주사 후 7 내지 14일째에, 및 IL PV-10 주사 후 21 내지 28일째에 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque® Plus(GE Healthcare, 펜실베니아주 피츠버그 소재)에 의해 단리하였다. 실온에서 1시간 동안 혈액의 항온처리 및 1,000×g에서 원심분리 후 상청액을 수집함으로써 혈청을 준비하였다.
동물
암컷 C57BL/6 마우스(6주 내지 8주령)를 Harlan Laboratories(인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구매하였다. 마우스를 H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute의 동물 연구 설비에서 수용하였다. 마우스를 미국 수의 협회 지침에 따라 CO2 흡입에 의해 인위적으로 안락사시켰다. 매우스를 매일 관찰하였고, 단독 피하 종양이 200 ㎟ 면적을 초과하거나 마우스가 전이성 암과 관련될 수 있는 징후를 나타낸 경우에 인위적으로 안락사시켰다. 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았고, 미국 공중보건 서비스 정책 및 국가 연구 위원회(U.S. Public Health Service policy and National Research Council) 지침에 따라 수행되었다.
세포주 및 세포 배양
NIH3T3, 293T 세포 및 흑색종 B16 세포를 ATCC(버지니아주 머내서스 소재)로부터 획득하였다. 인간 흑색종 세포 526, 624 및 888을 NIH(메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 획득하였다. 세포를 10% 열-비활성화된 FBS, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 소듐 피루베이트, 2mM 새로운 L-글루타민, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린, 50 mg/㎖ 겐타마이신, 0.5 mg/㎖ 푼지존(fungizone)(모두는 Life Technologies(메릴랜드주 록빌 소재)로부터 획득됨), 및 0.05mM 2-ME(Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스 소재)이 보충된 RPMI 배지(cRPMI)에서 배양하였다. OVA 단백질을 발현시키는 M05 세포[Falo et al., Nature Med 1:649-653 (1995)]를 0.8 mg/㎖ G418이 보충된 cRPMI에서 유지시켰다. 세포주를 마이코플라즈마 오염에 대해 음성인 것으로 시험되었다. 모든 세포주를 냉동된 모액으로부터 최초 회복 후 10배 미만으로 계대배양하였다.
시험관내 연구를 위하여, 종양 세포를 명시된 시간 동안 상이한 용량의 PV-10과 함께 항온처리하였다. 세포 상청액을 기능성 검정 또는 웨스턴 블롯을 위해 수집하였다. PV-10을 Provectus Biopharmaceuticals, Inc.(테네시 녹스빌 소재)로부터 획득하였다.
생체내 연구를 위하여, 3×105 종양 세포를 마우스의 한 옆구리로 피하(s.c.) 주사하고, 7일 또는 13일째에 PV-10 또는 PBS를 병소내(IL) 주사하였다. 종양을 18시간 동안 마우스로부터 단리하고, 종양 분해 키트(Miltenyi Biotec(캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 GentleMACS™(Miltenyi Biotec)로 소화시켰다. 살아있는 세포를 cRPMI에 5×105 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 세포 상청액을 2일 후에 기능성 검정을 위해 수집하였다.
FACS
및 사량체 염색
70㎛ 세포 여과기로 세포를 통과시킴으로써 명시된 조직으로부터의 단일-세포 현탁액을 제조하였다. ACK 완충제로의 RBC 용해 후에, 세포를 유세포 분석을 위해 하기 항체를 갖는 FACS 완충제에서 염색하였다: 항-인간 CD3, CD4, CD8, 및 CD56; 항-마우스 CD11c, I-Ab, CD45.1, CD45.2, CD86, CD80 및 CD40(모두 BD Biosciences(캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 획득함). 사량체 염색을 위하여, 세포를 실온에서 20분 동안 H-2 Kb/SIINFEKL 사량체(BL international(매사추세츠주 워번 소재)로 염색하고, 이후에, 제조업체 설명서에 따라 얼음 상에서 추가적인 항체와 함께 추가 20분 동안 항온처리하였다. 살아있는/죽은 고정 가능한 근-IR 또는 aqua 형광 반응 염료(Invitrogen™)를 사용하여 분석 전에 죽은 세포를 배제시켰다. 세포를 4개의 레이저가 장착된 LSR II(BD Biosciences)에 의해 획득하고, 데이터를 FlowJo® 소프트웨어(Tree Star(오리건주 애슐랜드 소재)로 분석하였다.
ELISA에 의한
IFN
-γ 및
HMGB1의
평가
인간 샘플로부터 IFN-γ의 검출을 위하여, CD8+ T-세포를 인간 CD8+ T-세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)로 PBMC로부터 단리하였다. 1×1O5 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트에서 1:1의 비율로 3회 종양 세포와 함께 동시-배양하였다. 48시간 후에, 세포 상청액에서 IFN-γ 수준을 제조업체 설명서에 따라 IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems(미네소타주 미니애폴리스 소재)로 측정하였다.
환자 혈청에서 HMGB1의 검출을 위하여, IBL international(캐나다 토론토(Toronto, Canada) 소재)로부터의 HMGB1 ELISA 키트를 제조업체 설명서에 따라 사용하였다.
마우스 샘플에서 IFN-γ의 검출을 위하여, 마우스는 3×105 M05 세포를 수용하였다. 초기 종양 세포 주사 후 7일 째에, 마우스를 반대편 옆구리 상에 3×105 M05 세포 s.c.의 제2 주사를 수용하였다. PV-10 또는 PBS(50㎕)를 7일 및 17일 째에 초기 M05 종양 병소에 IL 주사하였다. 23일 째에, 비장 세포를 수집하고, 7일 동안 1 ㎍/㎖ SIINFEKL 펩타이드, 20 ng/㎖ IL-15 및 20 ng/㎖ IL-21이 보충된 cRPMI(R&D Systems)에서 배양하였다(Cheng et al., J Exp Med 205:2235-2249 (2008)). 확장된 세포를 조사된 M05 세포아 10:1의 비율로 혼합하고, 상청액에서 IFN-γ 생성을 제조업체 프로토콜에 따라 IFN-γ ELISA 키트(BD Biosciences)로 48시간 후에 측정하였다.
T 세포의 입양 전달
CD45.1 OT-1 T-세포를 T-세포 농축 컬럼(R&D Systems)으로 정제하고, 37℃에서 20분 동안 CellTracker™ Violet(Life Technologies, 현재 Thermo Fisher Scientific, Inc.(매사추세츠주 월섬 소재)과 함께 항온처리하였다. PBS 중에서 2회 세척 후에, 3×105 표지된 세포를 100㎕의 PBS 중에 재현탁시키고, M05 종양-지닌 마우스에 i.v. 주사하였다. 4일 후에, 비장, 림프절(LN) 및 종양을 수확하고, CD45.1에 및 CD45.2에 대한 항체로 염색하였다. 적어도 하나의 분할을 갖는 CD45.1+CD45.2- 세포는 "분할된 세포"로 여겨졌다.
DC 기능성 검정
C57BL/6 마우스로부터 얻어진 골수를 RBC 용해 후 재조합 뮤린 20 ng/㎖ GM-CSF 및 10 ng/㎖ IL-4(R&D Systems, 미네소타 미니애폴리스 소재)와 함께 배양하였다[Liu et al., J Immunol 191:1916-1926 (2013)]. 5일째에, DC를 제조업체 프로토콜에 따라 Opti-prep™ 구배(Axis-Shield, 노르웨이 오슬로 소재)로 정제하고, GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 5×105 세포/㎖의 세포 밀도로 배양하였다[Vohra et al., Cancer Immunol Immun CII 59:729-736 2010)].
DC를 HMGB1에 대한 길항성 항체(IBL international, 캐나다 토론토 소재) 또는 관련된 아이소타입의 존재 하에서 2일 동안 100μM PV-10과 함께 항온처리된 B16 세포로부터의 10% 상청액과 함께 배양하였다. 이어서, DC를 10 ㎍/㎖의 OVA 단백질(Sigma-Aldrich, 미주리 세인트루이스 소재)로 2시간 동안 펄싱하였다. 다수의 세척 후에, DC를 3일 동안 상이한 자극제-대-반응제 비율에서 U-바닥 96-웰 플레이트에서, 3회 1e5 반응제 OT-1 T-세포와 함께 배양하였다. 3H-티미딘(1 μCi)을 세포 수확 전 18시간에 각 웰에 첨가하였다. T-세포 증식을 액체 섬광 계수기 Microbeta® Trilux(PerkinElmer, 매사추세츠 월섬 소재)에서 3H-티미니딘 도입에 의해 측정하였다.
IC
50
의 결정
세포를 12-웰 플레이트에서 6, 12, 24 및 48시간 동안 12.5, 25, 50, 100, 또는 200μM PV-10 또는 PBS와 함께 항온처리하였다. 모든 웰을 수집하고, 카운팅 비드와 혼합하고, LSR II에 의해 획득하였다. DAPI를 사용하여 분석 전 죽은 세포를 배제하였다. 세포 이벤트에 대한 비드 이벤트의 비율을 비교함으로써 살아있는 세포의 절대 수를 계산하였다. 세포 성장에 대한 PV-10의 절반 최대 억제를 GraphPad Prism® 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라호이아 소재)를 이용하여 IC50으로서 결정하였다.
웨스턴 블롯
세포 잔해의 제거를 위하여, 세포 상청액을 14,000×g에서 원심분리하였다. 각 샘플의 단백질 농도를 결정하였다. 동일한 양의 단백질을 NuPAGE® Novex® 4 내지 12% Bis-Tris Gels(Life Technologies) 상에서 분리하고, 이후에, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(Millipore) 상으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 PBS 중 5% BSA(w/v)로 차단하고, 4℃에서 밤새 HMGB1(카탈로그 번호 3935), HSP70(D69), 또는 HSP90(C45G5) 항체로 프로빙하였다(모든 세포는 Cell Signaling Technology(매사추세츠주 댄버스 소재)로부터 얻어진 것임). 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 2차 항체와 함께 항온처리 및 향상된 화학발광 시약으로의 처리에 의해 면역반응성을 시각화하였다.
통계학적 분석
데이터를 GraphPad Prism® 소프트웨어 또는 Wilcoxon 부호 순위 시험으로 분석하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계학적으로 유의미한 것으로 여겨졌다.
본 명세서에서 인용된 특허, 특허 출원 및 문헌 각각은 참고 문헌으로 포함된다. 상기 설명 및 실시예는 예시적인 것으로 의도되고, 제한적인 것으로서 여겨지지 않는다. 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 또 다른 변형이 가능하고, 당업자에게 용이하게 나타날 것이다.
Claims (25)
- 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법으로서,
(A) 동물 숙주에서의 암성 종양 조직을 종양-절제 양(tumor-ablating amount)의 할로겐화된 잔텐과 접촉시키는 단계;
(B) 상기 동물 숙주를 동물의 면역계를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지시켜 상기 종양에 대한 유도된 면역 항암 성분을 생성시키는 단계;
(C) 상기 동물 숙주로부터 상기 유도된 면역 항암 성분을 함유하는 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프 조직 중 하나 이상을 포함하는 샘플을 수집하는 단계; 및
(D) 상기 샘플에 존재하는 상기 유도된 면역 항암 성분을 시험관내에서 배양하고 우선적으로 확장(preferentially expanding)시켜 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 유도된 면역 항암 성분이 숙주 동물로부터 얻어진 면역 세포를 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 면역 세포가 NK 세포인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 면역 세포가 수지상 세포인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 면역 세포가 B 세포인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유도된 면역 항암 성분이 항종양 항체 및 사이토카인을 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 사이토카인이 HMGB1을 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ를 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물이 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 용해되거나 분산된 면역학적 유효 농도의 농축된 종양-특이적 면역 항암제를 함유한 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물을 형성하기 위해 조정되며,
상기 조성물이 또한 비경구 주사-적절한 염 함량, 삼투압, 및 pH 값을 함유하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법. - 제1항에 있어서, T 세포가 상기 샘플로부터 분리되고 우선적으로 확장되는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (D) 전에 상기 샘플을 뱅킹하는(banking) 추가의 단계를 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (D) 후에 상기 샘플을 뱅킹하는 추가의 단계를 포함하는, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 할로겐화된 잔텐이 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법:
상기 식 중, R1은 독립적으로 F, Cl, Br, I, H 또는 C1-C4 알킬이고; R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 Cl, H 또는 I이되, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나의 치환체는 I이고, 적어도 하나는 Cl 또는 H이며; R6은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이고; R11은 H 또는 C1-C4 알킬이며; R12는 H 또는 C1-C7 아실이다. - 제1항에 있어서, 접촉된 암성 종양 조직이 흑색종, 전립선, 유방, 방광, 신장, 췌장, 결장, 대장, 담낭, 원발성 또는 전이성 간암, 및 소세포 및 비-소세포 폐암으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서, 접촉된 암성 종양 조직이 흑색종인, 숙주 동물로부터 농축된 종양-특이적 면역 항암제의 조성물을 형성하는 방법.
- 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법으로서, 상기 동물 숙주에 유효량의 제10항의 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물을 투여하는 단계를 포함하는, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물이 NK 세포, T 세포, B 세포 및 수지상 세포 중 하나 이상을 포함하는, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물이 HMGB1 및 IFN-γ 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 면역학적으로-효과적인 농축된 종양-특이적 면역 항암제 제조물의 농축된 종양-특이적 면역 항암제가 상기 숙주 동물에 대해 자가조직인, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 숙주 동물에 하나 이상의 면역계 하향-조절의 전신 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 면역계 하향-조절의 전신 억제제가 CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2 중 하나 이상과 면역반응하는 단클론성 항체인, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 면역계 하향-조절의 전신 억제제가 상기 종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐의 투여 후 및 상기 숙주 동물로부터 상기 유도된 면역 항암 성분을 함유한 상기 샘플을 수집하기 전에 상기 숙주 동물에 투여되는, 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
- 복수의 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법으로서,
(A) 상기 동물 숙주에서의 제1 암성 종양의 조직을 종양-절제 양의 할로겐화된 잔텐과 접촉시키는 단계;
(B) 상기 동물 숙주를 동물의 면역계를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지시켜 상기 종양에 대한 유도된 면역 항암 성분을 생성시키는 단계;
(C) 상기 동물 숙주로부터 상기 유도된 면역 항암 성분을 함유하는 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프 조직 중 하나 이상을 포함하는 샘플을 수집하는 단계;
(D) 상기 동물 숙주에서의 제2 암성 종양의 조직을 상기 동물 숙주로부터의 상기 유도된 면역 항암 성분과 접촉시키는 단계; 및
(E) 상기 동물 숙주를 동물의 면역계를 유도하기에 충분한 제2 시간 동안 유지시켜 상기 종양에 대한 제2 유도된 면역 항암 성분을 생성시키는 단계를 포함하는, 복수의 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법. - 제24항에 있어서,
(F) 상기 동물 숙주로부터 상기 제2 유도된 면역 항암 성분을 함유하는 말초 혈액의 분취액, 종양 조직 또는 림프 조직 중 하나 이상을 포함하는 제2 샘플을 수집하는 단계; 및
(D) 상기 샘플에 존재하는 상기 유도된 면역 항암 성분을 시험관내에서 배양하고 우선적으로 확장시켜 농축된 종양-특이적 면역 항암제 조성물을 형성하는 단계의 추가적인 단계를 포함하는, 복수의 암성 종양을 갖는 동물 숙주를 치료하는 방법.
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