CN111057690A - 肿瘤相关基因braf突变相关抗原短肽及其应用 - Google Patents

肿瘤相关基因braf突变相关抗原短肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了BRAF突变相关抗原短肽及其应用。所述BRAF突变相关抗原短肽的序列如SEQ ID NO:1‑20任一所示。该短肽具有与DC细胞上MHC I分子高度的亲和力，并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，可用于BRAF基因突变细胞的免疫清除，进而预防BRAF基因突变相关疾病的发生，尤其是BRAF基因突变相关肿瘤疾病的预防；因此本发明的BRAF抗原短肽具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，具有良好的临床转化及疾病预防潜力。而且，本发明的BRAF抗原短肽长度较短，化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，同时效果明确，具有很好的应用前景。

Description

肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽及其应用。
背景技术
鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B(v-raf murine sarcoma viral oncogenehomolog B，BRAF)是一个重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，由它参与的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路调控细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF基因位于7号染色体，BRAF对MAPK激酶MEK有很强的亲和性，磷酸化MEK的能力很强。所以，BRAF基因是下游MAPK信号传导通路最强的激活剂。一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，从而使其介导的信号通路失调并最终导致细胞转化甚至恶变。BRAF基因突变发生在许多恶性肿瘤中，与这些肿瘤的发生及发展密切相关。因此，维持BRAF的正常对维持细胞的正常功能非常重要。
利用肿瘤相关抗原短肽诱导建立肿瘤抗原肽特异性CTL，从而获得具有特异性杀伤肿瘤细胞的CTL克隆，被激活的CTL可以杀死相应的靶细胞，发挥免疫监视作用。而该技术的关键前提是获得免疫原性、特异性好、能够诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞的相关抗原短肽。
发明内容
本发明旨在针对肿瘤相关基因BRAF开发BRAF基因突变相关抗原短肽，所述BRAF基因突变相关抗原短肽具有与DC细胞上MHC I分子高度的亲和力，并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，可用于BRAF基因突变细胞的免疫清除，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力。
本发明的目的是提供肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽。
本发明另一目的是提供该短肽在制备用于BRAF突变的DC疫苗中的应用。
本发明再一目的是提供一种用于BRAF突变的DC疫苗。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明人通过T细胞表位预测综合平台NetCTL数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)在线分析，通过生物信息学预测，发现COSM451、COSM460、COSM459、COSM476、COSM478的突变多肽能够与MHC-I类分子结合(BRAF的这几个突变位点在肺癌、恶性黑色素瘤、肠癌等实体瘤中检出)。说明该位点是免疫清除BRAF基因突变细胞的重要靶点。而免疫学研究证实，CD8阳性T淋巴细胞CTL发挥细胞免疫的原理为：CTL细胞通过识别与MHC-I分子结合的抗原肽被激活，被激活的CTL可以杀死相应的靶细胞，发挥免疫监视作用。因此，本发明通过生物信息学技术预测BRAF突变序列与T淋巴细胞受体(TCR)及MHC I类分子的结合能力，同时分析其表达定位于细胞膜外，设计优化了针对肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽，本发明筛选得到的BRAF抗原短肽，其多肽序列优选为SEQ ID NO:1-20任一所示，所得BRAF抗原短肽具有与DC细胞上MHC I分子高度的亲和力并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，抑制肿瘤细胞生长，说明其具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，具有良好的临床转化及疾病预防前景。
因此，以下产品及应用均应在本发明的保护范围之内：
肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽，序列如SEQ ID NO:1-20任一所示。以所述短肽为活性抗原成分与辅剂可制成BRAF突变短肽产品。
所述短肽在制备可诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞的产品中的应用。具体地，特异性细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法为：使用SEQ ID NO:1-20的BRAF突变短肽中的至少一条经抗原提呈细胞与CD8+T细胞共培养，可诱导得到BRAF突变特异性细胞毒性T细胞。
所述短肽在制备人体免疫活性调节剂中的应用，具体是作为活性抗原成分调节人体免疫活性。短肽抗原在细胞内经过一系列加工处理，形成特定片段即抗原肽与MHC 1类分子完全匹配后提呈到细胞表面被相应T细胞受体(TCR)识别，组成抗原肽-MHC-TCR复合物，从而激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
所述短肽在制备预防BRAF基因突变及相关疾病的产品中的应用，尤其是BRAF基因突变相关肿瘤。所述产品包括疫苗，如DC疫苗或单核细胞疫苗等。
抗原肽-MHC-TCR复合物，激活细胞毒性T淋巴细胞，激活的特异性T淋巴细胞能够杀伤携带BRAF突变的异常细胞。特异性细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法：使用SEQ ID NO:1-20所示BRAF突变短肽中的至少一条经抗原提呈细胞与CD8+T细胞共培养，诱导得到BRAF突变特异性细胞毒性T细胞。
基于此，本发明还提供一种用于预防BRAF基因突变及相关疾病的DC疫苗或单核细胞疫苗，由本发明SEQ ID NO:1-20任一所示短肽与树突状细胞或单核细胞加载制成。
将SEQ ID NO:1-20任一条所示BRAF短肽与树突状细胞(dendritic cell，DC)加载回输，可以作为DC疫苗用于疾病预防，刺激机体产生多肽特异性抗细胞毒性T细胞，进而实现BRAF基因突变相关疾病的预防，尤其是BRAF基因突变相关肿瘤的预防。
具体地，疫苗为静脉回输型疫苗。
在所述预防BRAF基因突变及相关疾病的DC疫苗的制备方法中，选用vitrogen因子作为佐剂增加DC细胞活性，特异性的抗原肽体外致敏树突状细胞，获得自体树突状细胞制剂，作为静脉回输型肺炎衣原体相关慢病防治疫苗。具体制备方法为：以成熟促进因子，同时以Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；然后向诱导成熟的DC细胞培养体系中加入本发明的短肽，收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤后，用生理盐水重悬即得到DC疫苗。
更具体地，作为一种可选择的方案，所述DC疫苗的制备步骤如下：
S1.DC细胞的提取与诱导：
S11.获取未成熟DC细胞
采集健康捐献者的外周血，通过淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基中，37℃、5％CO2条件下常规培养3小时后，贴壁细胞为未成熟DC细胞；
S12.未成熟DC细胞的扩增培养
37℃、5％CO2条件下培养5天，期间隔天换液，完成未成熟DC细胞(imDC细胞)的扩增培养；
S13.DC细胞的诱导
加入成熟促进因子，同时以Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；
S2.多肽的负载：
诱导DC细胞成熟5天后，向培养体系中加入本发明的短肽；
S3.制备DC疫苗：
离心收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤细胞3次，最后将负载有短肽片段的DC细胞用生理盐水重悬，即得到DC疫苗。
本发明选用特异性的表位多肽，体外致敏自体DC细胞，制备DC细胞制剂，可以对患者进行静脉回输，重建机体全身免疫平衡，启动免疫系统，对基因突变肿瘤细胞特异性治疗。采用的DC技术，用多种特异性抗原肽联合激活树突细胞，这些抗原肽具有极强的特异性，诱导具有更高活性的树突状细胞携带多种抗原信息，回输进入人体后可刺激机体免疫，可以达到诱导人体产生特异性抗体及特异性CTL细胞，从而可以有效预防BRAF基因突变及相关疾病的发生发展。
本发明具有以下有益效果：
本发明的BRAF抗原短肽具有与DC细胞上MHC I分子高度的亲和力，并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)；而产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞可用于BRAF基因突变细胞的免疫清除，进而预防BRAF基因突变相关疾病的发生，尤其是肿瘤疾病的预防。
本发明的BRAF抗原短肽可用于制备多肽疫苗及DC疫苗，具有良好的临床转化及疾病预防前景。
而且，本发明的BRAF抗原短肽长度较短，有其不可比拟的应用优势，且化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，同时效果明确，具有很好的应用潜力。
附图说明
图1是BRAF突变相关抗原短肽特异性CTL IFN-γ释放实验结果。
图2是BRAF突变相关抗原短肽对靶细胞的杀伤活性的对比。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 BRAF基因突变肽的T细胞表位预测及BRAF短肽设计
1、通过T细胞表位预测数据综合平台(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)和生物信息学技术，分析预测与T细胞表位受体(TCR)及MHC I类分子高亲和力的多肽序列。研究获得，获得一系列BRAF突变相关抗原短肽。
2、从上述多肽中筛选出50条预测评分高且预测毒性较小的多肽片段，进行进一步研究。具体实验如下：
BRAF突变短肽特异性CTL克隆建立的方法如下：
通过流式分选健康捐献者的105个CD8+T细胞，加入负载BRAF突变短肽的Mo-DCs104个，间隔1周刺激2次，再使用丝裂霉素C处理过的负载BRAF短肽的自体外周血单个核细胞(PBMC)105个刺激1次，从而获得CTL细胞。
采用以上体外诱导建立BRAF基因突变短肽特异性CTL细胞的方法，吸取细胞培养上清液，通过检测上清液中IFN-γ含量。
结果显示，如表1所示的20条多肽具有特异性免疫应答效应，可以激活T淋巴细胞，诱导分泌IFN-γ(如图1所示)。同时结果也显示，20条多肽与上述预测出的50条多肽的预测评分高低的对应关系不显著相关，预测结果参考性较差。
表1
Figure BDA0002331510480000051
Figure BDA0002331510480000061
实施例2抑制肿瘤生长试验
实施例1得到20条具有特异性免疫应答效应、可以激活T淋巴细胞的BRAF突变短肽。从中随机挑选3条短肽，继续进一步验证实验。
分别将3条短肽所诱导的细胞培养上清液对结直肠癌细胞CaCo-2进行培养。对照组分为不加载短肽和加载无义短肽两组。
结果显示，与对照组相比，3条短肽所诱导的上清液均可明显抑制肿瘤生长、明显降低肿瘤存活率(如图2所示)。
实验结果表明，本发明建立的CTL表位是极其有效的。通过将SEQ ID NO:1-20任一所示BRAF突变短肽经树突状细胞提呈与细胞毒性淋巴T细胞共培养，可诱导筛选得到BRAF突变特异性细胞毒性T淋巴细胞。这种BRAF突变抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞可用于BRAF基因突变细胞的免疫清除，进而预防BRAF基因突变相关疾病的发生，尤其是肿瘤疾病的预防。因此，将SEQ ID NO:1-20任一条所示BRAF短肽与树突状细胞(dendritic cell，DC)加载回输，可以作为DC疫苗用于疾病预防，刺激机体产生多肽特异性抗细胞毒性T细胞，进而实现BRAF基因突变相关疾病的预防，尤其是肿瘤的预防。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 维塔恩（广州）医药有限公司
<120> 肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽及其应用
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<160> 20
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Claims (10)

1.肿瘤相关基因BRAF突变相关抗原短肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1-20任一所示。
2.权利要求1所述短肽在制备可诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞的产品中的应用。
3.权利要求1所述短肽在制备人体免疫活性调节剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述短肽是作为活性抗原成分调节人体免疫活性。
5.权利要求1所述短肽在制备预防BRAF基因突变的产品中的应用。
6.权利要求1所述短肽在制备可预防BRAF基因突变相关疾病的产品中的应用。
7.权利要求1所述短肽在制备预防BRAF基因突变的DC疫苗或单核细胞疫苗方面的应用。
8.权利要求1所述短肽在制备预防BRAF基因突变相关疾病的DC疫苗或单核细胞疫苗方面的应用。
9.根据权利要求6或8所述应用，其特征在于，所述BRAF基因突变相关疾病是BRAF基因突变相关肿瘤。
10.一种用于预防BRAF基因突变的疫苗，其特征在于，由权利要求1所述短肽与树突状细胞或单核细胞加载制成。
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