CN101139392B - Kdr肽和包括该肽的疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供选自包括如SEQ ID NOS：2、3、5、8、11和12所示氨基酸序列肽的九肽；提供选自包括如SEQ ID NOS：29、30、33、34、40和46所示氨基酸序列的九肽或十肽；具有通过取代或添加一个至几个氨基酸而来源于上述任何氨基酸序列并且能够诱导细胞毒性T细胞的肽；以及包含这种肽而用于治疗或预防肿瘤的药物。这些肽可用作疫苗。

Description

KDR肽和包括该肽的疫苗
此案是申请日为2003年9月12日、中国申请号为03825081.0、发明名称为“KDR肽和包括该肽的疫苗”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于治疗和预防肿瘤、作为癌症疫苗极为有用的新的肽以及包括这些肽的药物。
技术背景
肿瘤-排斥抗原基因主要是针对恶性黑色素瘤被鉴定出来的，因此，开发利用这些基因的癌症免疫治疗。具体地说，认识到在抗-肿瘤免疫应答中CD8-阳性T细胞的重要性，已经注意到体内诱导肿瘤-特异的CD8-阳性T细胞的癌症疫苗治疗，并将其用于多种临床应用。此外，也阐明了组成大约10个氨基酸残基的肽通过I类途径，经多种共刺激分子的帮助而活化T细胞以诱导肿瘤-特异的细胞毒性T细胞(CTLs)的机制。另外，积极地鉴定了限于个别HLA分子的肽。
然而，目前完全控制肿瘤是不可能的。这可能是由于肿瘤细胞的异质性、肿瘤细胞中MHC-I类表达的减少或消失、以及肿瘤细胞中靶分子的缺乏。此外，目前鉴定出来的肿瘤抗原肽只存在于一些肿瘤类型中，但不存在于所有的肿瘤类型中。因此为了解决这些问题，本发明不使用肿瘤细胞作为靶细胞，而是关注于肿瘤血管的内皮细胞。更具体地说，内皮细胞几乎没有涉及MHC-I类表达的减少或消失或异质性的任何问题。因此，如果可诱导靶向肿瘤血管的CTLs，就可以克服传统癌症疫苗治疗中的问题，例如I类的消失和靶分子的缺乏，而不必考虑肿瘤的类型，并且可以预见优良的治疗效果。对肿瘤血管生成的研究起始于70年代由Folkman等人提出的先驱性的假说，并且已经从多个角度进行了研究。已经在血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子(VEGF)受体(VEGFRs)上进行了许多研究来评估它们在肿瘤血管生成中的有效性。已经积极地开发了血管生成的抑制剂作为靶定向的药物，特别是在癌症治疗中，并且正在进行临床测试。然而，还未使用基于这个理念用于癌症疫苗治疗的疗法。一个原因可能是对在正常细胞中表达的VEGFR的免疫耐受性。然而，在90年代，Plate，Millauer，和Risau等人证实在肿瘤组织的内皮细胞中强烈表达VEGFRs。此外，对也在正常细胞中表达的自发抗原，例如CEA和HER/neu的免疫应答却不一定会有免疫耐受性。因此，本发明人推论VEGFRs可用作癌症疫苗治疗的靶。
近来，有报道说针对VEGFRs的活化免疫能够抑制肿瘤中的血管生成和转移(The Journal of Experimental Medicine，2002，195：12，1575-1584)。然而这篇文献只使用溶解的VEGFR蛋白质，并且对于有效肽的氨基酸序列没有进行研究。
发明公开
本发明人关注于靶向VEGFR2(KDR/flk-1；以下称为KDR)的可能的癌症疫苗治疗，其中VEGFR2在肿瘤组织的内皮细胞中强烈表达，并且认为其涉及对VEGF信号的内皮细胞增殖。此外，本发明人筛选了能够有效用作疫苗的肽，检验了它们的特异性，并且完成了本发明。
更具体地说，本发明提供了下列[1]至[22]。
[1]选自包括SEQ ID NO：2、3、5、8、11或12的氨基酸序列的肽之九肽。
[2]具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID NO：2、3、5、8、11或12的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。
[3][2]的肽，其中N末端的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。
[4][2]或[3]的肽，其中C-末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
[5]选自包括SEQ ID NO：29、30、33、34、40或46的肽之九肽或十肽。
[6]具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID NO：29、30、33、34、40或46的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。
[7][6]的肽，其中N末端的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
[8][6]或[7]的肽，其中C-末端的氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
[9]用于治疗和/或预防肿瘤的药物，其中该药物包括[1]至[8]中任何一项的一个或多个肽。
[10]用于治疗糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的药物，其中该药物包括权利要求[1]至[8]中任何一项的一个或多个肽。
[11]在其表面呈递包括[1]至[8]中任何一项的肽和HLA抗原复合物的外来体。
[12][11]的外来体，其中HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02。
[13][12]的外来体，其中HLA抗原是HLA-A2402或HLA-A0201。
[14]一种利用权利要求[1]至[8]中任何一项的肽诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法。
[15]一种利用权利要求[1]至[8]中任何一项的肽诱导细胞毒性T细胞的方法。
[16]一种诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码[1]至[8]中任何一项的肽的多核苷酸的基因导入抗原-呈递细胞的步骤。
[17]利用[1]至[8]中任何一项的肽诱导的分离的细胞毒性T细胞。
[18]呈递HLA抗原和[1]至[8]中任何一项的肽的复合物的抗原-呈递细胞。
[19][18]的抗原-呈递细胞，其是通过[14]或[15]的方法诱导的。
[20]用于在疾病部位抑制血管生成的疫苗，其中该疫苗包括权利要求[1]至[8]中任何一项的肽作为活性成分。
[21][20]的疫苗，将其施用于HLA抗原为HLA-A24或HLA-A02的受试体。
[22][20]或[21]的疫苗，将其用于抑制恶性肿瘤的生长和/或转移。
本说明书包括在日本专利申请Nos.2002-267285、2003-062003、和2003-167042的说明书和附图中所描述的内容，本发明以其为优先权的基础。
附图简述
图1显示针对靶细胞的CTLs克隆的细胞毒性。
图2显示已建立的CTL克隆的HLA-四聚体分析的结果：
(a)由本发明的肽诱导的CTL克隆，和培养细胞；以及
(b)饲养细胞(对照)。
图3显示利用本发明的肽进行疫苗接种对接种Colon26的BALB/c小鼠存活率的影响。
图4显示利用本发明的肽进行疫苗接种对Colon26来源的肿瘤生长的影响。
图5显示利用本发明的肽进行疫苗接种对接种B16的小鼠存活率的影响。
图6显示利用本发明的肽进行疫苗接种对B16黑色素瘤来源的肿瘤生长的影响。在皮下注射B16肿瘤细胞前，用A2/Kb TGM疫苗接种两次，间隔时间为1周，用KDR773脉冲的Dc(黑圆)、单独的DC(白三角)、或HBSS(白方块)。该图显示平均的肿瘤生长(P＜0.01)。
图7显示CTL克隆C29-169对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图8显示CTL克隆C29-169对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图9显示CTL克隆KDR C85-775(KWC85-775)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图10显示CTL克隆KDR C85-775(KWC85-775)对呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图11显示CTL克隆KDR C51-1328(KWC51)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图12显示CTL克隆KDR C51-1328(KWC51)对呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图13显示CTL克隆KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图14显示CTL克隆KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图15显示CTL克隆KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)对呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图16显示每种类型的抗体对CTL克隆的细胞毒性效果的抑制作用。
图17显示本发明的肽对A2/KbTGM中B16细胞诱导血管生成应答的抑制活性。用HBSS、未脉冲的DC、或用本发明的表位肽脉冲的DC(KDR190、KDR772、KDR773、KDR773-2L、KDR775、或KDR1084)疫苗接种小鼠两次。箭头标明了新形成的血管，其以锯齿形的特征性模式行进。
图18显示本发明的肽对转基因小鼠中人肿瘤体积增加的抑制作用。
图19显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC65-190对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图20显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC72-772对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图21显示CTL克隆KWC72-772对呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。HePG2-VEGFR2：黑框；HePG2-EGFP：白框。
图22显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C7-1318对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图23显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC46对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图24显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C18-189对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图25显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C65-826对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
图26显示CTL克隆C7-1318对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2：黑框；HT29-EGFP：白框。
图27显示CTL克隆KWC46对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2：黑框；HT29-EGFP：白框。
图28显示CTL克隆C18-189对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2：黑框；HT29-EGFP：白框。
图29显示CTL克隆C65-826对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2：黑框；HT29-EGFP：白框。
图30显示本发明的肽对BALB/c小鼠中Colon26细胞诱导血管生成应答的抑制活性。用HBSS、未脉冲的DC、或用本发明的表位肽脉冲的DC(KDR189或KDR826)疫苗接种小鼠两次。箭头标明了新形成的血管，其以锯齿形的特征性模式行进。
图31显示本发明的肽对BALB/c中Colon26细胞诱导血管生成应答的抑制。柱状表示平均值，而垂直误差的柱状表示标准误差。
图32显示在存在肽(黑菱形)或缺乏肽(白方块)时，来源于用本发明肽刺激的患者的CTL对HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。
(A)通过用SEQ ID NO：8(其中氨基酸的起始位置是KDR169)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用；
(B)通过用SEQ ID NO：5(其中氨基酸的起始位置是KDR189)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用；
(C)通过用SEQ ID NO：3(其中氨基酸的起始位置是KDR220)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用。
实施本发明的方式
本发明人首先考虑到在被降解为9-基体(9-mer)的肽后(九肽)，抗原呈递细胞上体内呈递了多种蛋白质，因此检验了KDR蛋白质的9-基体或10-基体部分肽与HLA抗原的结合亲合力，HLA抗原是人的主要组织相容性抗原(MHC抗原)。表1右侧所示的肽序列中小写字母标明了第5个氨基酸。
人KDR蛋白质的氨基酸序列是已知的，例如，如美国专利号5,861,301所公开的，并且可由本领域的技术人员容易地获得。可根据所获得的KDR蛋白质的全长氨基酸序列，通过从任何位置开始合成肽来获得9-基体或10-基体的肽。可根据肽化学中使用的常规方法来合成肽。普遍用于合成的方法在例如Peptide Synthesis，Interscience，New York，1996；The Proteins，vol.2，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide Synthesis(Peputido Gousei)，Maruzen Co.，Ltd.，1975；Foundations and Experiments in Peptide Synthesis(Peputido Gousei no Kiso to Jikken)，Maruzen Co.，Ltd.，1985；and Developmentof Pharmaceuticals，New Series(Iyakuhin no Kaihatsu，Zoku)，Volume 14，Peptide Synthesis(Peputido Gousei)，Hirokawa Shoten，1991，的文献以及例如国际公开No.WO99/67288的出版物中有描述。可通过分离在其细胞表面上包括HLA抗原的细胞，例如树突状细胞，并且利用测量肽与细胞的结合的常规方法来测量与HLA抗原的结合。
备选地，可使用目前可在互联网上获得的软件程序，例如在Parker K.C.，J.Immunol.152，1994中所描述的软件程序在硅芯片上计算机模拟(in silico)各种肽和HLA抗原之间的结合亲合力。可如例如在Parker，K.C.，J.Immunol.，152，1994；和Nukaya，I.，Int.J.Cancer，80，1999中所描述的测量与HLA抗原的结合亲合力。
为了得到足够的结果，优选使用据说在日本人中高表达的A-24型和A-02型抗原作为HLA抗原。更优选的，使用例如A-2402和A-0201的亚型。然而临床地，通过预先确定需要接受治疗的患者的HLA抗原类型，可适当地选择与该抗原具有高水平的结合亲合力，或对抗原呈递具有高水平的细胞毒性T细胞(CTL)可诱导性的肽。此外，为了获得具有高水平的结合亲合力和CTL可诱导性的肽，可根据天然存在的KDR部分肽的氨基酸序列进行一个、两个或几个氨基酸的取代或添加。在此，术语“几个”是指5个或以下，或优选为3个或以下。除了天然的肽，显示与HLA抗原结合的肽的序列规律是已知的(J.Immunol.，152，3913，1994；Immunogenetics.41：178，1995；J.Immunol.155：4307，1994)。因此，也可在所获得的肽上根据这个规律进行改进。例如，N末端的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，以及C-末端的氨基酸被取代为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽也可优选用作具有高HLA-24结合亲合力的肽。另一方面，N末端的第二个氨基酸被取代为亮氨酸或甲硫氨酸，以及C-末端的氨基酸被取代为缬氨酸或亮氨酸也可优选用作具有高HLA-0201结合亲合力的肽。此外，也可向肽的N和/或C末端加入一个或两个氨基酸。
然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的部分氨基酸序列相同，其可能产生副作用，例如，自身免疫疾病或针对特异物质的过敏症状。因此，优选使用可获得的数据库来进行同源性搜索，以避免该序列与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。此外，如果同源性搜索发现不存在即使包括一个或两个氨基酸不同的肽，就没有为了增加与HLA抗原的高亲合力和/或CTL可诱导性而改进上述氨基酸序列所导致的这种问题的风险。
如上所述，预期具有与HLA抗原的高亲合力的肽作为癌症疫苗是高度有效的。然而，需要确定利用高结合亲合力作为指标选择出来的候选肽实际上是否具有CTL可诱导性。通过诱导包括人MHC抗原的抗原-呈递细胞(例如，B-淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞)，更具体地来源于人外周血单核白细胞的树突状细胞；用肽刺激细胞；将细胞与CD-8阳性细胞混合；然后测量针对靶细胞的细胞毒性，从而证实CTL的可诱导性。至于反应系统，可使用为表达人HLA抗原而产生的转基因动物(例如，在Hum.Immunol.2000 Aug.；61(8)：764-79 Related Articles，Books，Linkout Induction of CTLresponse by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response.，BenMohamed L.，Krishnam R.，Longmate J.，Auge C.，Low L.，Primus J.，and Diamond DJ.中所描述的)。例如，通过用51Cr等放射标记靶细胞，可从靶细胞释放的放射活性计算细胞毒性。备选地，通过在存在具有固定肽的抗原-呈递细胞时测量由CTL产生和释放的IFN-γ，并且利用抗-IFN-γ单克隆抗体肉眼观察介质上的抑制带来检验活性。
如上所述检验肽的CTL可诱导性的结果表明具有对HLA抗原的高结合亲合力的肽不是必定具有高的可诱导性的。此外，选自VYSSEEAEL(SEQID NO：2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO：3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO：5)、RFVPDGNRI(SEQ ID NO：8)、KWEFPRDRL(SEQ ID NO：11)、或DFLTLEHLI(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列的九肽，和选自AMFFWLLLV(SEQ ID NO：29)、VIAMFFWLL(SEQ ID NO：30)、AVIAMFFWL(SEQ ID NO：33)、KLIEIGVQT(SEQ ID NO：34)、YMISYAGMV(SEQ ID NO：40)、或IQSDVWSFGV(SEQ ID NO：46)的氨基酸序列的九肽和十肽显示特别高的CTL可诱导性。
本发明进一步提供具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ IDNO：2、3、5、8、11或12的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加。可以对由9个氨基酸组成的SEQ ID NOs：2、3、5、8、11和12的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加，只要它们具有CTL可诱导性并且不与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配。特别的，例如，N末端的第二个氨基酸优选被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，或C-末端的氨基酸优选被取代为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸；或向N末端和/或C末端添加一个或两个氨基酸。
本发明也提供具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ IDNOs：29、30、33、34、40或46的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加。可以对由9个或10个氨基酸组成的SEQ ID NOs：29、30、33、34、40和46的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加，只要它们具有CTL可诱导性并且不与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配。特别的，例如，N末端的第二个氨基酸优选被取代为亮氨酸或甲硫氨酸，或C-末端的氨基酸优选被取代为缬氨酸或亮氨酸；或向N末端和/或C末端添加一个或两个氨基酸。这种修饰的肽的实例是SEQ ID NO：30的肽，其中N末端的第二个氨基酸被取代为亮氨酸(SEQ ID NO：54)，但这个实例不是限制性的。用这些修饰的肽刺激所得到的CTL克隆能够识别最初的肽，并导致破坏。
本发明的肽可单独使用或两种以上组合使用作为能够体内诱导CTL的癌症疫苗。通过施用本发明的肽，该肽在抗原-呈递细胞的HLA抗原上以高密度呈递。诱导特异地与在所陈列的肽和HLA抗原之间形成的复合物起反应的CTLs，增加被靶向的肿瘤细胞中对血管内皮细胞的侵占。备选地，可通过从受试个体衍生树突状细胞，并用本发明的肽进行刺激来获得其细胞表面固定有本发明肽的抗原呈递细胞。将所得到的抗原-呈递细胞再施用于受试个体以在受试合体中诱导CTL。结果是，可增加指向靶细胞的侵占。
更具体地，本发明提供治疗肿瘤或预防肿瘤的增殖、转移等的药物，其中该药物包括一个或多个本发明的肽。病理部位的血管生成不仅与肿瘤紧密相关，而且与例如糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的疾病，以及实体瘤的转移紧密相关(Folkman，J.，NatureMed.1：27-31(1995)；Bicknell，R.，Harris，A.L.，Curr.Opin.Oncol.8：60-65(1996))。因此，本发明的肽可用于治疗肿瘤、例如糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的疾病，以及实体瘤的转移。
证实本发明的肽抑制曲折血管的形成，这种血管在形态上有别于正常的血管，并且在恶性肿瘤的组织中形成。分析接种疫苗的小鼠中伤口的愈合和繁殖力的结果也证实该肽对正常的生理学上的血管形成无不良效果。此外，利用识别本发明肽的CTL克隆，体外测试对非增殖性或增殖性的内皮细胞的细胞毒性。这些克隆显示针对增殖性的内皮细胞比对非增殖性的内皮细胞有更强的活性。更具体地，它们对于涉及增殖性内皮细胞的病症，以及特别为癌症可十分特异地发挥作用。
可通过将细胞暴露于高浓度的肽，轻易地用本发明的肽体内或体外刺激树突状细胞，这导致这些肽替换最初固定在细胞上的肽。因此，本发明所使用的肽必须至少具有一定水平的结合HLA抗原的亲合力。
本发明的药物可直接以本发明肽本身的形式给药，或以通过常规配制方法配制的药物组合物的形式给药。在这种情况下，本发明的药物除了本发明的肽以外，可适当的包括载体、赋形剂、以及一般用于药物的制剂，而没有特别的限制。本发明的药物可用于治疗和预防各种肿瘤，例如胃癌、十二指肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤。本发明的肽不是靶向肿瘤细胞本身，而是靶向在肿瘤组织中新形成的血管的内皮细胞。因此，很多种类的肿瘤可以是治疗的标靶，并且不特别地限制本发明药物的用途。
包括本发明的肽作为活性成分、用于治疗和/或预防肿瘤的药物可以伴随佐剂给药以有效诱导细胞的免疫性；可伴随例如抗肿瘤剂的其他活性成分给药；可以颗粒剂的形式给药。在文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中描述的佐剂等是可应用的。此外，本发明的药物可以下列形式给药：如脂质体制剂、结合直径为几微米的珠子的颗粒制剂、以及结合脂类的制剂。给药的方法可以是例如，口服、皮内地、或皮下地、或经过静脉内的注射等。全身性给药或对靶肿瘤附近的局部给药都是可应用的。可根据待治疗的疾病、患者的年龄和重量、给药方法等适当地调节本发明肽的剂量。一般地，优选地几天一次或几个月一次地施用0.001mg至1,000mg，优选0.01mg至1,00mg，更优选0.1mg至10mg的本发明的肽。本领域的技术人员能够适当地选择合适的剂量。
备选地，本发明提供呈递在本发明的肽和其表面的HLA抗原之间形成的复合物的胞内囊泡。可根据例如在国际公开号Hei 11-510507和2000-512161的公开的日文翻译文本中具体描述的方法制备外来体。优选利用从待治疗或预防的目标受试个体获得的抗原呈递细胞制备外来体。本发明的外来体可如同本发明的肽，作为癌症疫苗进行接种。
将使用的HLA抗原的类型必须与需要接受治疗和/或预防的受试个体的HLA抗原类型相匹配。例如，对于日本人，HLA-A24或HLA-A02，特别是HLA-A2402或HLA-A0201经常是合适的。
本发明也提供利用本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。通过诱导来自外周血单核细胞的树突状细胞；然后将它们与本发明的肽体外或体内接触(刺激)来诱导抗原呈递细胞。将本发明的肽施用于受试个体诱导受试个体体内的抗原呈递细胞，其上固定有本发明的肽。备选地，本发明的肽可固定至将被作为疫苗施用到受试个体的抗原呈递细胞上。
本发明也提供用于诱导具有高水平的细胞毒性T细胞可诱导性的抗原呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码本发明肽的多核苷酸的基因体外导入抗原呈递细胞。待导入的基因可以是DNA或RNA的形式。导入的方法可以是本领域普遍使用的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法，而没有特别的限制。更具体地，这些方法可如在例如，CancerRes.，56：5672，1996；J.Immunol.，161：5607，1998；J.Exp.Med.，184：465，1996；或国际公开号2000-509281的公开的日文翻译文本中所描述的进行。通过将基因导入抗原呈递细胞，该基因在细胞中经历转录、翻译等。然后所得到的蛋白质经受I或II类MHC过程和递呈通路以呈递部分的肽。
此外，本发明提供利用本发明的肽诱导CTLs的方法。通过将本发明的肽施用于受试个体，在受试个体体内诱导CTLs，增强了针对肿瘤组织中血管形成内皮细胞的免疫性。备选地，该方法可用自体内的治疗方法，其中将来源于受试个体的抗原呈递细胞、CD8-阳性细胞、或外周血单核白细胞体外接触本发明的肽(刺激)以诱导CTLs，然后将该细胞返回该受试个体。
此外，本发明提供利用本发明的肽诱导并分离的细胞毒性T细胞。已经通过用呈递本发明肽的抗原-呈递细胞刺激而诱导的细胞毒性T细胞优选是来源于待治疗和/或预防的目标受试个体。细胞毒性的T细胞可以单独施用，为了抗肿瘤效果的目的，与其他药物组合施用，包括本发明的肽、外来体等。所得到的细胞毒性T细胞特异地针对呈递本发明肽的靶细胞发挥作用，或优选地针对呈递用于诱导的相同肽的靶细胞发挥作用。靶细胞可以是内源表达KDR的细胞，或被迫表达KDR的细胞。此外，也可以靶向由于经这些肽的刺激而在其细胞表面呈递本发明肽的细胞。
本发明也提供呈递在HLA抗原和本发明的肽之间形成的复合物的抗原呈递细胞。通过与本发明的肽、或与编码本发明肽的核苷酸接触而获得的抗原呈递细胞优选来源于待治疗和/或预防的受试个体。抗原呈递细胞可作为单独的疫苗而施用，或与其他的药物，例如本发明的肽、外来体和细胞毒性T细胞组合使用。
实施本发明的最佳方式
下文中，本发明将利用实施例进行具体描述，但并不认为仅限于此。
[实施例1]VEGFR-2(KDR)-来源的肽-1(HLA-A*2402)的预测
根据KDR蛋白质的完整氨基酸序列，利用BioInformatics&MolecularAnalysis Section(BIMAS)HLA肽结合预测软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)，以与HLA-A*2402的最高结合亲合力的顺序预测12种9-基体肽(SEQ ID Nos：1至12)，和12种10-基体肽(SEQ ID Nos：13至24)(表1)。表1显示按照最高值，以及KDR蛋白质氨基酸序列中N末端的位置的顺序排列的每个9-基体和10-基体的结合亲合力。在表中，CE652(SEQ ID NO：25)是指已由Nukaya，I.(Int.J.Cancer 80，1999)报道过的肿瘤抗原CEA(癌胚抗原)的一个表位。使用HIV肽(ILKEPVHGV(SEQ ID NO：55)和RYLRDQQLL(SEQ IDNO：56))作为阴性对照肽。
根据标准的固相合成方法，利用Cleaved PepSet(Mimotope，San Diego，CA)合成肽，并通过反相HPLC纯化。利用HPLC和质谱仪分别确定肽的纯度(＞95％)和类型。
表1 HLA-A*2402与KDR-来源的肽的结合
Figure BYZ000002115110800131
＊1 Parker.KC：1994.J.Immunol 152
＊2 Nukaya I：1999 Int.J.Cancer 80
[实施例2]利用预测的肽建立CTL系
固定Epstein-Barr病毒(EBV)的B细胞系、TISI(HLA-A24/24)和EHM(HLA-A3/3)是由Takara ShHzo生物技术研究实验室提供的。
利用收集自健康个体的7mL外周血进行HLA血清分型。利用FicollPaque(Pharmacia)特异的重力离心从HLA-A24-阳性外周血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs)。
将所获得的PBMCs在培养瓶(Corning，43072)中静置10小时。除去悬浮的细胞后，在补充有2％自体血清、添加1,000U/mL人GM-CSF(由Kirin Brewery提供)和1,000U/mL人IL-4(Genzyme)的AIM-V培养基(Invitrogen)中培养贴附于培养瓶的细胞。5天后，在10μg/mL的OK-432(由Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd提供)中另外培养细胞48小时，并用作诱导CTL的抗原-呈递细胞。通过与FITC-标记的抗-II类、CD80、和CD86抗体，以及PE-标记的抗-I类、CD11c、和CD40(所有来自Beckton-Dickinson)和CD83(Immunotech)抗体反应来证实树突状细胞(DCs)是DCs，然后利用Cell Quest软件的FACS-Calibur(Beckton-Dickinson)分析表面抗原。
在存在3μg/mL的β2-微球蛋白时，于20℃，将在实施例1中预测具有高结合亲合力的12种9-基体肽(SEQ ID NOs：1至12)(20μg/mL)脉冲刺激预诱导的DCs4小时。将所得到的DCs与经磁珠(Dynabeads M-450和Detachabeads)从PMBC选择出来的CD8-阳性细胞以1∶20或1∶2的比例混合，然后在存在10ng/mL的人IL-7(Genzyme)时，在48-孔板(Corning)中培养。3天后，向培养物加入终浓度为10U/mL的IL-2(Sigma)。7天和14天后，刺激相同的DCs以诱导CTLs，20天后，利用肽脉冲的TISI细胞作为靶来测量每个孔的细胞毒性。通过异常的-PBMC、固定-EBV的B细胞系(EHM)和30ng/mL的抗-CD3抗体的刺激方法只培养阳性的孔。14天后功能性地分析CTLs。
通过4小时的51Cr释放分析评估细胞毒活性。将浓度为20μg/mL的靶细胞用肽脉冲刺激过夜。在37℃，用100μCi的Na2 51CrO4标记靶细胞1小时，然后用RPMI1640洗涤3次。将总体积为200μL的靶细胞(1×104/100μL)和100μL各种浓度的效应细胞接种到U-形的96-孔微滴定平板(Corning)中，并在37℃，CO2恒温箱培养4小时。培养后，从每个孔收集100μL的上清液，并利用γ计数器测量。自然的衰变是靶细胞和培养基的放射活性，而最大的衰变是靶细胞和1M HCl的放射活性。通过下列公式计算细胞毒活性(特异裂解的百分数)：
细胞毒活性(％细胞毒性)＝
(试验衰变-自然衰变)/(最大衰变-自然衰变)×100
结果建立了6种CTL系，如表2所示。特别地，如SEQ ID NO：2(氨基酸起始位置KDR1318)、SEQ ID NO：3(KDR220)、SEQ ID NO：5(KDR189)、SEQ ID NO：8(KDR169)、SEQ ID NO：11(KDR826)、和SEQ ID NO：12(KDR998)所示的九肽表明是有效的表位肽。
表2
＊1 Parker.KC：1994.J.Immunol 152
＊2 Nukaya I：1999 Int.J.Cancer 80
[实施例3]建立来源于预测肽的CTL克隆
将实施例2中建立的6种CTL系在U-形96-孔板中稀释到0.3、1或3个细胞/孔。向每个孔加入7×104个细胞/孔的异常PBMC、1×104个细胞/孔的EHM、30ng/mL的抗-CD3抗体、和125U/mL的IL-2，再加入补充有5％自体血清的AIM-V，总的浓度为150μL/孔。10天后，加入调节的补充有50μL/孔IL-2的培养基至IL-2的终浓度为125U/mL。在第14天功能性地分析CTLs，并以更大的规模培养有活性的CTLs。
结果是，从如SEQ ID NO：8(氨基酸起始位置KDR169)、SEQ ID NO：5(KDR189)、SEQ ID NO：3(KDR220)、SEQ ID NO：2(KDR1318)、和SEQ IDNO：11(KDR826)所示的5类九肽的每一种，分别建立了8种(C13-169、C19-169、C29-169、C53-169、C72-169、C61-169 K5-169、和K25-169)、2种(C12-189和C18-189)、11种(KWC3、23、25、26、36、42、46、58、61、70和77)、1种(C7-1318)、和1种(C65-826)CTL克隆(表3)。
表3
Figure BYZ000002115110800161
[实施例4]测量建立的CTL克隆的细胞毒性
通过改变其与靶细胞的比率(E∶T比率)检验实施例3中建立的10种CTL克隆的细胞毒性的程度。
结果是，来源于SEQ ID NO：8(氨基酸起始位置KDR169)的九肽的C53-169显示最强的细胞毒性。
[实施例5]已建立的CTL克隆的HLA-四聚体分析
从HLA-A*2402和SEQ ID NO：8(氨基酸起始位置KDR169)的肽合成HLA-四聚体。更具体地说，分别产生表达H链(大约35kDa)和L链(大约11kDa)的质粒载体，并利用大肠杆菌表达其重组的蛋白质。H-链质粒载体只由胞外结构域组成，其中羧基末端被生物素酰化酶的识别序列取代。H链和L链通过与抗原性肽再折叠而形成HLA肽复合物。通过生物素酰化酶生物素酰化HLA肽复合物，通过凝胶过滤色谱和离子交换色谱除去过量的生物素，并且分离和纯化生物素酰化的HLA肽复合物。通过将得到的生物素酰化的HLA肽复合物与链霉抗生物素(SA)以4∶1的摩尔比反应形成四聚体来合成HLA-四聚体。在分析样品时，藻红蛋白(PE)标记的SA(SA-PE)被用于形成四聚体。已知CD8分子除了HLA-A、B、和C的部分外，结合α3结构域的第245个氨基酸，其为丙氨酸。因此本发明人使HLA-四聚体中的丙氨酸突变为缬氨酸，以产生能够选择性地检测具有对HLA肽复合物的高亲合力的CTLs的突变HLA-四聚体，而不依赖于CD8分子和α3结构域之间的结合。
通过合成的HLA-A24 KDR169-四聚物突变体检测已建立的CTL克隆。结果是，如图2所示，发现已建立的CTL克隆被四聚体阳性和CD8-阳性的部分强烈地染色，并且特异地识别在本发明肽和HLA抗原之间形成的复合物。四聚体阴性和CD8-阴性部分中的信号归结于培养的细胞。
[实施例6]VEGFR-2(KDR)-来源的肽-2(HLA-A*0201)的预测
以与实施例1相似的方式，根据KDR蛋白质的完整氨基酸序列，利用HLA肽结合预测软件
(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)，以与HLA-A*0201的最高结合亲合力的顺序预测15种9-基体肽(SEQ ID Nos：26至40)，和12种10-基体肽(SEQ ID Nos：41至52)(表4)。表4显示按照最高值，以及KDR蛋白质氨基酸序列中N末端的位置的顺序排列的每个9-基体和10-基体的结合亲合力。在表中，CEA588(SEQ ID NO：53)是指已由Tanaka，H.等人(poster presentation，AACR#3669，vol.42，p681-682，March2001)报道过的肿瘤抗原CEA(癌胚抗原)的一个表位。
表4HLA-A*0201与KDR-来源的肽的结合
＊1 Tanaka H et al.：Poster presented at AACR 2001
[实施例7]HLA-A*0201固定表位肽的确定
利用在实施例6中预测的16种9-基体和10-基体肽(SEQ ID NO：26至41)在表达人HLA(A0201)的转基因小鼠上通过疫苗接种方法诱导CTLs(Hum.Immunol.2000 Aug.；61(8)：764-79 Related Articles，Books，LinkoutInduction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response.，BenMohamed L.，Krishnan R.，Longmate J.，Auge C.，Low L.，Primus J.，andDiamond DJ.)。
从CLEA Japan获得6-至8-周大的BALB/C(H-2d)小鼠。由Vanderbilt-Ingram癌症中心的F.Jim Primus博士提供A2/Kb转基因的小鼠(TGM)。由Mie University′s Third Department of Internal Medicine的H.Shiku教授提供T2细胞(缺乏TAP和HLA-A*0201-阳性细胞)。
从小鼠股骨和胫骨收集骨髓，并且利用抗-CD4、CD8、Gr-1抗体(Beckton-Dickinson)、抗-B220抗体(Bioscience)和兔补体(PeL-Freez)移出淋巴细胞和粒性白细胞。在6-孔板中培养获得的细胞。随后几天收集悬浮的细胞，培养在补充有10％FBS的RPMI1640(Invitrogen)培养基的另一个6-孔板中，向其中加入1,000U/mL的小鼠GM-CSF(由KirinBrewery提供)和1,000U/mL的小鼠IL-4(PEPRO TECH)。3天后，改变上述一半的培养基，并且另2天后，在10μg/mL的OK-432中培养20小时。使用所得到的悬浮细胞作为DCs。将DCs与FITC-标记的抗-II类和CD40抗体、以及PE-标记的抗-I类、CD11c、CD80、和CD86抗体(全部来自Beckton-Dickinson)起反应，通过使用Cell Quest软件的FACS-Calibur(Beckton-Dickinson)分析表面抗原来证实是DCs。
然后将100μg的每种肽、140μg的HbcAg120-140辅助肽、和100μL的IFA混合(总计为200μL)。在第0天将混合物皮下施用到右侧腹部，而在第11天施用到左侧腹部。在第21天收集接种小鼠的脾，利用红色裂解缓冲液(Sigma)溶血除去红细胞，并且使用一部分细胞作为IFN-γELISPOT分析的应答细胞。将剩余的细胞以比率为3∶1的饲养细胞、6×106个细胞/孔置入24-孔板(Corning)，并且再次进行刺激。5天后测量它们的细胞毒性。将来源于同基因小鼠的无红细胞的脾细胞在存在25μg/mL的脂多糖(LPS)时培养3天，以用作饲养细胞。
在这个实施例中，根据由产生IFN-γ的细胞产生的斑点，使用IFN-γELISPOT方法评估CTL的可诱导性。用抗-小鼠IFN-γ的单克隆抗体(Pharmingen)于4℃将平底的96-孔多筛平板MAHA S45(Millipore)处理过夜。第二天，用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤平板，然后与封闭缓冲液在室温下反应2小时。然后，向每个孔加入105个细胞/100μL的肽脉冲的T2细胞和未脉冲的T2细胞。进一步的，向每个孔加入最大量的4×106个细胞/100μL(总计为200μL)的接种小鼠的脾细胞，并且在37℃培养过夜。第二天，洗涤每个孔，并且与生物素酰化的大鼠抗-小鼠IFN-抗体(Pharmingen)反应2小时。彻底地洗涤平板后，向每个孔加入外抗生物素蛋白(extravidin)，并且于室温反应2小时。洗涤后，向孔中加入碱性磷酸酶结合底物(BIO-RAD)，然后在室温下放置5分钟。利用KS ELISPOT紧密释放(Carl Zeiss)检测由IFN-γ的产生所导致的蓝斑。
如下确定特异的蓝斑：
特异的蓝斑＝(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)
认为满足下列条件的蓝斑是有效的：
TISI(+)SPOT/TISI(-)SPOT≥2
结果是，通过IFN-γELISPOT分析，获得5种表位肽：SEQ ID NO：29(氨基酸起始位置KDR775)、SEQ ID NO：30(KDR773)、SEQ ID NO：33(KDR772)、SEQ ID NO：34(KDR1328)、和SEQ ID NO：40(KDR190)(表5)。
表5 ELISPOT分析
＊1 Tanaka H et al.：Poster presented at AACR 2001
[实施例8]体内抗肿瘤效果的证实--1
从6-至8-周大的具有与人HLA-A2402相同的锚定基序的雄性BALB/c小鼠(CLEA Japan，Inc.)收集骨髓。如实施例7，向骨髓加入GM-CSF(KirinBrewery)(1,000U/mL)和IL-4(Genzyme)(1,000U/mL)并且培养以制备树突状细胞。用SEQ ID NO：5的肽(氨基酸起始位置KDR189)脉冲刺激树突状细胞，然后对9只BALB/c小鼠在右下腹给药2次(1×106个细胞/小鼠)，其间间隔7天。7天后，将结肠癌细胞系(5×105个细胞)，Colon 26(TaihoPharmaceutical)接种到小鼠的右侧腹部，并且检验小鼠的存活和肿瘤的生长。
首先如图3所指明的，通过RT-PCR分析KDR表达，以证实KDR不是单独只在Colon 26中表达的，而是在接种Colon 26的小鼠的肿瘤组织中表达的。更具体地说，证实肿瘤血管出现在肿瘤组织中并且形成肿瘤。
图3显示接种-Colon 26的小鼠的存活曲线。肿瘤接种后35天，单独施用HBSS(Hank’s平衡盐溶液)(100μL)作为对照的9只小鼠中存活了2只；接种未用肽脉冲的树突状细胞的9只小鼠中存活了5只；而接种用SEQ IDNO：5的肽脉冲的树突状细胞的9只小鼠全部存活。
图4显示对小鼠中Colon 26-来源的肿瘤生长的影响。与对照相比，当接种树突状细胞时，观察到对肿瘤生长的抑制作用；当接种用SEQ ID NO：5的肽脉冲的树突状细胞时，观察到对肿瘤生长的显著的抑制作用。
[实施例9]对于本发明肽的同源性搜索
利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)对本发明的肽(SEQ ID NO：2(氨基酸起始位置KDR1318)、SEQ ID NO：3(KDR220)、SEQ ID NO：5(KDR189)、SEQ ID NO：8(KDR169)、SEQ ID NO：11(KDR826)，SEQ ID NO：30(KDR773)、和SEQ ID NO：40(KDR190))进行同源性搜索。没有发现与这些肽的任何一个具有完全相同的序列的肽(表6)。在实施例4中能够诱导强CTL活性的SEQ ID NO：8的9-基体肽(KDR169)只有1个包含2个错配的序列(77.8％的同源性)，以及2个包含3个错配的序列(66.7％的同源性)。在实施例8中观察到显著的体内抗-肿瘤效果的SEQ ID NO：5的肽(KDR189)只有1个包含3个错配的序列(66.7％的同源性)。
表6利用BLAST程序的同源性分析
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)
Figure BYZ000002115110800211
[实施例10]体内抗-肿瘤效果的证实--2
从6-至8-周大的表达人HLA-A0201的雄性A2/Kb转基因小鼠(TGM)收集骨髓。如实施例8，向骨髓加入GM-CSF(Kirin Brewery)(1,000U/mL)和IL-4(Genzyme)(1,000U/mL)并且培养以制备树突状细胞。用SEQ ID NO：30的肽(氨基酸起始位置KDR773)脉冲刺激树突状细胞，然后对12只A2/Kb转基因小鼠在左下腹给药2次(1×106个细胞/小鼠)，其间间隔7天。7天后，将B16黑色素瘤细胞系(ATCC)(1×106个细胞)接种到小鼠的右侧腹部，并且检验小鼠的存活和肿瘤的生长。
图5显示接种-B16的小鼠的存活比率。肿瘤接种后35天，单独施用HBSS(100μL)作为对照的12只小鼠中存活了8只；接种未用肽脉冲的树突状细胞的12只小鼠中存活了11只；而接种用SEQ ID NO：30的肽脉冲的树突状细胞的12只小鼠全部存活。
图6显示对小鼠中B16小鼠-来源的肿瘤生长的影响。与对照相比，当接种树突状细胞时，观察到对肿瘤生长的抑制作用；当接种用SEQ ID NO：30的肽脉冲的树突状细胞时，观察到对肿瘤生长的显著的抑制作用。
[实施例11]对强制表达KDR的细胞的细胞毒活性
根据由Miyake，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，1320-1324(1996)所描述的方法，利用腺病毒在HLA-A24-阳性的人结肠癌HT29细胞株(ATCC)中强制表达KDR(参见，J.Biol.Chem.1994 Oct 28；269(43)：26988-95)。更具体地说，根据通过人293细胞的噬菌斑分析确定的滴度，以特定的重复性感染细胞。以105个细胞的密度将HT29细胞接种在60-mm的碟中，并且培养24小时。次日，除去培养基并且变换为用新鲜培养基连续稀释的200μL病毒。使细胞在37℃培养1小时，然后向细胞加入生长培养基，培养48小时以用作靶细胞使用通过腺病毒强制表达EGFP(参见，Leukemia 1999 Apr；13(4)：605-13)的HLA-A24-阳性的HT29细胞株作为对照。分别强制表达KDR和EGFP的HT29细胞株可分别潜在地在其细胞表面呈递每个蛋白质的部分肽。
利用如实施例3所描述的，从SEQ ID NO：8的肽(氨基酸起始位置KDR169)诱导的、结合HLA-A24的CTL克隆C29-169，通过铬释放分析测量对强制表达KDR的HLA-A24-阳性的HT29细胞的细胞毒作用。结果显示在图7中。
通过4小时的51Cr释放分析测量细胞毒活性。在6-孔板中，以1×106个细胞/孔的浓度培养靶细胞24小时，以MOI 50感染插入KDR或EGFP(Ad-KDR或Ad-EGFP)的腺病毒并进行48小时。用100μCi的Na2 51CrO4在37℃标记靶细胞1小时，并用RPMI 1640洗涤3次。向U-形96-孔微滴定平板(Corning)加入靶细胞(1×104个细胞/100μL)和100μL不同浓度的效应细胞(总计为200μL)，并且于37℃在CO2培养箱中培养4小时。培养后，从每个孔收集100μL的悬浮液，并以与实施例2中相同的方式，利用γ计数器测量以计算细胞毒性。
结果是，如图7所示，与对强制表达EGFP的细胞相比，CTL克隆C29-169显示对强制表达KDR的HLA-A24-阳性的HT29有非常高的细胞毒作用。
[实施例12]对内源性表达KDR的细胞的细胞毒活性
利用KDR-阳性和HLA-A24-阴性的HUVEC细胞株P8作为对照检验实施例3中所述的CTL克隆C29-169对来源于HLA-A24-阳性的人的、内源性表达KDR的脐带血管的内皮细胞HUVEC KT5细胞株的细胞毒作用。这些细胞在其细胞表面呈递KDR的部分肽。
通过4小时的51Cr释放分析测量细胞毒活性。用100μCi的Na2 51CrO4在37℃标记靶细胞1小时，然后用RPMI 1640洗涤3次。向U-形96-孔微滴定平板(Corning)加入靶细胞(1×104个细胞/100μL)和100μL不同浓度的效应细胞(总计为200μL)，并且于37℃在CO2培养箱中培养4小时。培养后，从每个孔收集100μL的悬浮液，并以与实施例2中相同的方式，利用γ计数器测量以计算细胞毒性。
从图8的结果明显看出，CTL克隆C29-169显示对内源性表达KDR的HLA-A24-阳性HUVEC的细胞毒作用，并且显示对HLA-A24-阴性HUVEC的弱细胞毒作用。
[实施例13]利用HLA-A0201-结合肽建立CTL克隆
利用结合HLA-A0201并根据实施例7中的ELISPOT分析确定为有效的SEQ ID NO：40的肽(氨基酸起始位置KDR190)、KDR773-2L肽(SEQ IDNO：54)，其中SEQ ID NO：30的肽中(KDR773)N末端的第2个氨基酸已经转变为亮氨酸、SEQ ID NO：29的肽(KDR775)、SEQ ID NO：34的肽(KDR1328)、以及SEQ ID NO：33的肽(KDR772)，如实施例3分别获得2种(KWC14-190和KWC65-190)、4种(KWC44-773-2L、KWC76-773-2L、KWC129-773-2L、和KWC134-773-2L)、2种(KWC81-775和KWC85-775)、12种(KWC16、KWC21、KWC22、KWC47、KWC51、KWC108、KWC117、KWC132、KWC151、KWC153、KWC156、和KWC159)、以及1种(KWC72-772)CTL克隆。各自的细胞毒性如表7所示。
表7
Figure BYZ000002115110800241
从表7的结果明显看出，SEQ ID NOs：29、33、34、和40的肽、以及SEQ ID NO：54的肽，其中N末端的第2个氨基酸是亮氨酸的SEQ ID NO：30的肽，都可以诱导具有显著的细胞毒性的CTLs，因此表明作为表位肽是有效的。
[实施例14]
向HLA-A0201-阳性T2细胞株加入SEQ ID NO：29的肽(氨基酸起始位置KDR775)以产生靶细胞。利用该细胞，通过铬释放分析检验从实施例13中的SEQ ID NO：29的肽获得的CTL克隆(KDR C85-775(KWC85-775))的细胞毒效果。
如图9所示的结果，CTL克隆C85-775(KWC85-775)清楚地显示对呈递SEQ ID NO：29的肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒效果。相反地，对不呈递SEQ ID NO：29的肽的对照细胞完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例151
通过铬释放分析检验CTL克隆(KDR C85-775(KWC85-775))对由腺病毒强制表达KDR的肝细胞癌细胞系HLA-A0201-阳性的HePG2的细胞毒效果。使用强制表达EGFP的HLA-A0201-阳性HePG2作为对照。
如图10所示的结果，与对呈递EGFP肽的细胞的活性相比，CTL克隆KDR C85-775(KWC85-775)显示对在其表面上呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞显著高的细胞毒效果。
[实施例16]
向HLA-A0201-阳性T2细胞株加入SEQ ID NO：34的肽(氨基酸起始位置KDR1328)以产生靶细胞。利用这些细胞，通过铬释放分析检验从实施例13中的SEQ ID NO：34的肽获得的CTL克隆(KDR C51-1328(KWC51))的细胞毒效果。
如图11所示的结果，CTL克隆KDR C51-1328(KWC51)清楚地显示对呈递SEQ ID NO：34的肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒效果。相反地，对不呈递SEQ ID NO：34的肽的对照细胞完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例17]
通过铬释放分析检验CTL克隆(KDR C51-1328(KWC51))对由腺病毒强制表达KDR的肝细胞癌细胞系HLA-A0201-阳性的HePG2的细胞毒效果。使用强制表达EGFP的HLA-A0201-阳性HePG2作为对照。
如图12所示的结果，与对呈递EGFP肽的细胞的活性相比，CTL克隆KDR C51-1328(KWC51)显示对在其表面上呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞显著高的细胞毒效果。
[实施例18]
向HLA-A0201-阳性T2细胞株加入SEQ ID NO：54的肽(KDR773-2L)以产生靶细胞，该肽中SEQ ID NO：30的第2个肽被转变为亮氨酸。利用这些细胞，通过铬释放分析检验从实施例13中的SEQ ID NO：54的肽获得的CTL克隆(KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L))的细胞毒效果。图13显示了这些结果。
如图13所示的结果，CTL克隆KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)清楚地显示对呈递KDR773-2L的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒效果。相反地，对不呈递KDR773-2L的对照细胞完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例19]
利用以未改变的SEQ ID NO：30的肽(氨基酸起始位置KDR773)脉冲刺激HLA-A0201-阳性的T2细胞株作为靶细胞，通过铬释放分析检验从SEQ ID NO：54的肽(KDR773-2L)获得的CTL克隆(KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L))的细胞毒效果，该肽中SEQ ID NO：30的第2个肽已经被转变为亮氨酸。
如图14所示的结果，通过用已修饰的肽刺激而获得的CTL克隆能够识别并破坏修饰后的肽。
[实施例20]
通过铬释放分析检验CTL克隆(KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L))对由腺病毒强制表达KDR的肝细胞癌细胞系HLA-A0201-阳性的HePG2的细胞毒效果。使用强制表达EGFP的HLA-A0201-阳性的HePG2作为对照。
如图15所示的结果，与对呈递EGFP肽的细胞的活性相比，CTL克隆KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)显示对在其表面上呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞显著高的细胞毒效果。
[实施例21]
本发明人确定了各种抗体是否能够阻断从SEQ ID NO：34的肽获得的CTL克隆(KDR C51-1328(KWC51))，对由腺病毒强制表达KDR的肝细胞癌细胞系HLA-A0201-阳性的HePG2的细胞毒效果。
如图16所示的结果，通过抗-HLA I类的抗体抑制对由靶细胞显示的HLA抗原的细胞毒作用，并且使用针对CD8的抗-CD8抗体细胞毒T细胞的标记。
[实施例22]通过背侧气囊(DAS)分析检验抑制血管生成的活性
利用DAS分析在小鼠中评估肽表位的实际的抑制血管生成的活性(参见，Clinical Cancer Research，Vol.5，2185-2191，August 1999；Cancer Research62，6116-6123，November 1，2002)。
具体地，将滤膜固定在环槽的两侧，并且用环氧乙烷气体灭菌。制备5×105个细胞/0.15mL的B16黑色素瘤细胞并且注射到槽中。将小鼠(A2/kb转基因小鼠(来源于B16))脸朝下固定，并且通过在鼠背侧的下皮层中利用注射器注射5至10mL的空气产生气囊。切割大约1-cm至气囊的下半部分。将充满悬浮细胞溶液的环槽嵌入背侧的下皮层，并且利用皮肤钉封闭皮肤。植入6天后，将鼠皮与环槽一起剥离，以延展的形式固定，并且用黑橡胶圈标记以利用显微镜观察新形成的血管。由从恶性肿瘤细胞释放的血管生成因子新形成的血管特征性地以锯齿形的方式进行，而在形态上不同于天然存在的背景血管。因此，可以确定橡胶圈内3-mm或更长的、以及以锯齿形的方式进行的血管是新形成的血管，并且利用血管生成指数(AI)加以评估。根据弯曲血管的数目评估AIs为从0到5的6个水平。确定所有具有5个以上弯曲血管的是5。
在植入环槽前14天进行疫苗接种，并且一周后分别通过尾静脉注射5×104个细胞的HBSS、单独的DC、或肽-脉冲的DC进行重复(总计为2次)。结果显示在图17和表8中，如下所示。
表8  DAS分析的效果
Figure BYZ000002115110800271
图17和表8显示与单独施用DC的组相比，在分别用SEQ ID NO：40(氨基酸起始位置KDR190)、SEQ ID NO：33(KDR772)、SEQ ID NO：30(KDR773)、SEQ ID NO：54(KDR773-2L)、SEQ ID NO：29(KDR775)、和SEQID NO：46(KDR1084)的肽脉冲刺激的DCs接种的组中明显抑制了弯曲血管的形成。这在统计学上表明了显著的血管生成抑制效果。
为了观察利用这些肽表位的疫苗接种对正常的生理学上血管生成的副作用，分析接种小鼠中的伤口愈合和繁殖力。然而，在接种的小鼠中没有发现明显的副作用。此外，利用识别KDR肽的CTL克隆，体内测试对非-增殖性或增殖性的内皮细胞的细胞毒性以检验在人类中的副作用。结果是，这些克隆对增殖性的内皮细胞比对非-增殖性的内皮细胞显示更强的活性。
[实施例23]
利用表达人HLA-A0201的A2/Kb转基因小鼠，将SEQ ID NO：30(氨基酸起始位置KDR773)和SEQ ID NO：34(KDR1084)的肽各自与不完全的Freund’s佐剂混合，然后在第3天和13天施用于植入结肠癌细胞株MC38的发生肿瘤的小鼠以表明肿瘤体积的变化。
利用实施例22中的相同接种方法，根据肿瘤的面积评估固定表位肽(KDR773)的HLA-A*0201的治疗模型中的体内抗-肿瘤效果。从图18可明显看出结果是，证实接种SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34的肽对肿瘤生长的显著的抑制效果。
[实施例24]
将SEQ ID NO：40的肽(氨基酸起始位置KDR190)加入HLA-A0201-阳性的T2细胞株以产生靶细胞。利用这些细胞，通过铬释放分析检验从实施例13中SEQ ID NO：40的肽获得的CTL克隆(KWC65-190)的细胞毒效果。
如图19所示的结果，CTL克隆KWC65-190明显地显示对呈递SEQ IDNO：40的肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒效果。相反的，对不呈递SEQID NO：40的肽的对照细胞完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例25]
将SEQ ID NO：33的肽(氨基酸起始位置KDR772)加入HLA-A0201-阳性的T2细胞株以产生靶细胞。利用这些细胞，通过铬释放分析检验从实施例13中SEQ ID NO：33的肽获得的CTL克隆(KWC72-772)的细胞毒效果。
如图20所示的结果，CTL克隆KWC72-772明显地显示对呈递SEQ IDNO：33的肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒效果。相反的，对不呈递SEQID NO：33的肽的对照细胞完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例26]
通过铬释放分析检验CTL克隆(KWC72-772)对由腺病毒强制表达KDR的肝细胞癌细胞系HLA-A0201-阳性的HePG2的细胞毒效果。使用强制表达EGFP的HLA-A0201-阳性的HePG2作为对照。
如图21所示的结果，与针对呈递EGFP肽的细胞的活性相比，CTL克隆KWC72-772对在其表面呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞显示显著高的细胞毒效果。
[实施例27]
将SEQ ID NO：2(氨基酸起始位置KDR1318)、SEQ ID NO：3(KDR220)、SEQ ID NO：5(KDR189)、和SEQ ID NO：11(KDR826)的肽加入HLA-A24-阳性的人B-淋巴细胞株A24-LCL(HLA-A24/24，TakaraShuzo)以产生靶细胞。利用这些细胞，通过铬释放分析检验实施例3中所描述的CTL克隆C7-1318、KWC46、C18-189、和C65-826的细胞毒效果。
如图22至25所示的结果，每个CTL克隆C7-1318、KWC46、C18-189、和C65-826，明显地显示分别对各自呈递SEQ ID NOs：2、3、5、和11的肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒效果。相反的，对不呈递肽的每种对照细胞几乎或完全没有观察到细胞毒效果。
[实施例28]
如同对于实施例11，通过铬释放分析检验实施例3中所描述的CTL克隆C7-1318、KWC46、C18-189、和C65-826对由腺病毒强制表达KDR的人结肠癌HT29细胞株(ATCC)的细胞毒效果。使用强制表达EGFP的HLA-A24-阳性的HT29细胞株作为对照。
如图26至29所示的结果，与对强制表达EGFP的细胞的活性相比，所有的CTL克隆C7-1318、KWC46、C18-189、和C65-826，对强制表达KDR的HLA-A24-阳性的HT29显示明显高的细胞毒效果
[实施例29]
如同对于实施例22，，通过DAS分析评估BALB/c小鼠中肽表位对由Colon 26细胞诱导的血管生成反应的抑制血管生成的活性。
从图30和31的结果可明显看出，在接种分别用SEQ ID NO：5(氨基酸起始位置KDR189)和SEQ ID NO：11(KDR826)的肽脉冲刺激的DCs的组中，与单独施用DC的组相比，明显抑制了弯曲血管的形成。这在统计学上表明了显著的血管生成抑制效果。
[实施例30]
利用以每种肽刺激后的癌症患者的PBMC研究对下列每种表位肽的CTL应答：
具有高的HLA-24结合亲合力的SEQ ID NO：8(氨基酸起始位置KDR169)、SEQ ID NO：5(KDR189)、SEQ ID NO：3(KDR220)、SEQ ID NO：11(KDR826)、以及SEQ ID NO：17(KDR1318)的肽；和具有高的HLA-A0201结合亲合力的SEQ ID NO：40(KDR190)、SEQ ID NO：33(KDR772)、SEQ ID NO：30(KDR773)、SEQ ID NO：29(KDR775)、和SEQ IDNO：34(KDR1328)的肽。
利用由Maeda，Y.等人.在Br.J.Cancer 87，796-804(2002)中报道的方法，在PBMC中检测特异于肽的CTLs。首先，在包括200μL培养基的U-形底96-孔板中，将从患者收集的PBMC(1×105个细胞)与10μM的每种肽一起培养。培养基由45％RPMI1640培养基、45％AIM-V培养基、10％FBS、100U/mL白细胞介素-2(IL-2)、和0.1μM MEM非必需的氨基酸溶液组成。每隔3天，除去一半的培养基，并且换为含有相应肽(20μM)的新鲜培养基。培养12天后，收集细胞以测试应答每种肽的IFN-γ产生能力。当由应答相应肽的肽-刺激的PBMC产生的IFN-γ的量是应答对照的HIV肽中产生的量的2倍或以上时，该测试的肽被认为是阳性的。
这些结果显示，如同在健康的供体中，在HLA-A2-和HLA-A24-型的癌症患者中产生CTL前体(表9)。在表中，患者A、B、和C是HLA-A24-型患者；而患者D是HLA-A02-型的患者。患者A和D是结肠癌患者；而患者B和C是黑色素瘤患者。CMVs是指用作阳性对照的巨细胞病毒-来源的肽。在Kuzushima，K.等人，Blood 2001，98(6)：第1872-1881页等中描述了具有高的A-24结合亲合力的肽；以及在Solache，A.等人，J.of Immunol.1999，163(10)；第5512-5518页等中描述了具有高的A-2结合亲合力的肽。
表9  来自癌症患者的CTL前体
Figure BYZ000002115110800301
如同对于实施例14等，使51Cr释放分析进行4小时以从CTL前体(图32)建立CTL系。
工业实用性
本发明提供新的肽，其通过靶向各种肿瘤组织中形成的内皮细胞而诱导细胞毒T细胞，并且其作为癌症疫苗是极为有效的。本发明也提供用于治疗和预防肿瘤的、包括这些肽的药物。
将在此引用的所有出版物、专利和专利申请引入本说明书作为参考。
Figure IWB00000012071900321
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Claims (14)

1.包括SEQ ID NO：46氨基酸序列的十肽。
2.用于治疗和/或预防肿瘤的药物，其中该药物包括权利要求1的肽。
3.用于治疗糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的药物，其中该药物包括权利要求1的肽。
4.在其表面呈递包括权利要求1的肽和HLA抗原的复合物的外来体。
5.权利要求4的外来体，其中HLA抗原是HLA-A0201。
6.一种在体外利用权利要求1的肽诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法。
7.一种在体外利用权利要求1的肽诱导细胞毒性T细胞的方法。
8.一种在体外诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码权利要求1的肽的多核苷酸的基因导入抗原-呈递细胞的步骤。
9.利用权利要求1的肽诱导的分离的细胞毒性T细胞。
10.呈递HLA抗原和权利要求1的肽的复合物的抗原-呈递细胞。
11.权利要求10的抗原-呈递细胞，其是通过权利要求6或8的方法诱导的。
12.用于在疾病部位抑制血管生成的疫苗，其中该疫苗包括权利要求1的肽作为活性成分。
13.权利要求12的疫苗，将其施用于HLA抗原为HLA-A0201的受试体。
14.权利要求12或13的疫苗，将其用于抑制恶性肿瘤的生长和/或转移。
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