ES2375299T3 - Péptidos kdr y vacunas que los contienen. - Google Patents

Péptidos kdr y vacunas que los contienen. Download PDF

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Abstract

Un nonapéptido o decapéptido seleccionado de los péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº : 30, 29, 33, 34, 40, 46 o 54 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores.

Description

Péptidos KDR y vacunas que los contienen
Campo técnico
La presente invención está relacionada con péptidos para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores que son extremadamente útiles como vacunas para el cáncer, y fármacos que contienen estos péptidos, para el tratamiento y prevención de tumores.
Antecedentes
Los genes de antígenos de rechazo tumoral se han identificado principalmente para melanomas malignos, y de acuerdo con esto, se han desarrollado inmunoterapias contra el cáncer que utilizan estos genes. Específicamente, con reconocimiento de la importancia de los linfocitos T CD8-positivos en las respuestas inmunes antitumorales, ha llamado la atención la terapia con vacunas contra el cáncer que induce linfocitos T CD8-positivos específicos de tumor in vivo, y se está aplicando en varias aplicaciones clínicas. Además, también se ha descrito el mecanismo por el que los péptidos que constan de aproximadamente diez residuos de aminoácidos activan a los linfocitos T a través de la ruta de Clase I, mediante la asistencia de varias moléculas coestimuladoras para inducir linfocitos T citotóxicos específicos de tumor (LTC).. Además, se han identificado activamente los péptidos restringidos a moléculas de HLA individuales.
No obstante, el control completo de los tumores es actualmente imposible. Esto puede ser debido a la heterogeneidad de las células tumorales, a la reducción o desaparición de la expresión de MHC de Clase I en las células tumorales y a la ausencia de moléculas diana en las células tumorales. Además, los péptidos de antígeno tumoral identificados actualmente existen en algunos tipos de tumor, pero no en todos los tipos de tumor. Así, para resolver estos problemas, los presentes inventores no utilizan células tumorales como células diana, sino que se centran en las células endoteliales de los vasos tumorales. Más específicamente, las células endoteliales difícilmente presentan problemas relacionados con un descenso o desaparición de la expresión de MHC de Clase I, o heterogeneidad. Así, si se inducen los LTC dirigidos contra los vasos tumorales, pueden superarse los problemas de la terapia con vacunas convencionales contra el cáncer, como la desaparición de la Clase I y la ausencia de una molécula diana, independientemente del tipo de tumor, y pueden anticiparse excelentes efectos terapéuticos. Se han iniciado estudios en la angiogénesis tumoral a partir de hipótesis pioneras propuestas por Folkman et al. en los años 70 y han sido desarrolladas desde varias perspectivas. Se han llevado a cabo muchos estudios sobre los receptores (VEGFR) VEGF-VEGF para evaluar su significancia en la angiogénesis tumoral. Se han desarrollado exhaustivamente inhibidores de la angiogénesis como fármacos orientados a dianas, particularmente en la terapia contra el cáncer, y se han probado ya clínicamente. No obstante, las terapias que utilizan este concepto para los tatamientos de vacunas contra el cáncer no están todavía en uso. Una de las razones puede ser inmunotolerancia al VEGFR, que se expresa en células normales. No obstante, en la década de 1990, Plate, Millauer, y Risau et al confirmaron que el VEGFR se expresan fuertemente en las células endoteliales de los tejidos tumorales. Además, la respuesta inmune a los autoantígenos como CEA y HER/neu, que también se expresan en células normales, no es necesariamente de inmunotolerancia. Por lo tanto, los presentes inventores concluyeron que los VEGFR pueden utilizarse como dianas para la terapia con una vacuna para el cáncer.
Recientemente, se describió que la inmunización activa frente a los VEGFR puede inhibir la angiogénesis en tumores y la metástasis (The Journal of Experimental Medicine, 2002, 195: 12, 1575-1584). No obstante, esta bibliografía simplemente utilizó proteínas VEGFR solubles, y no realizó ninguna investigación sobre las secuencias de aminoácido de los péptidos efectivos.
Descripción de la Invención
Los presentes inventores se han centrado en las posibles terapias con vacunas para el cáncer que la diana VEGFR2 (KDR/flk-1; denominada de ahora en adelante KDR), en las que VEGFR2 se expresa fuertemente en células endoteliales de tejido tumoral, y se cree que está involucrado en la proliferación de células endoteliales a la señal de VEGF. Además, los presentes inventores realizaron un cribado en busca de los péptidos que puede utilizarse de forma efectiva como vacunas, examinando su especificidad y completando esta invención.
La presente invención proporciona lo siguiente (de [1] a [6]):
[1] Un nonapéptido o decapéptido seleccionado de péptidos que constan de la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 30, 29, 33, 34 40, 46 o 54 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores.
[3] Una composición farmacéutica para utilizar en el tratamiento y/o prevención de tumores, en el que la composición farmacéutica comprende uno o más péptidos definidos en la reivindicación 1 o 2.
[4] Una vacuna para su uso en el tratamiento o prevención de tumores, en el que la vacuna comprende un péptido definido en la reivindicación 1 o 2 como compuesto activo.
[5] La vacuna de la reivindicación 4 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores, que se utiliza para su administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A02 o HLA-A24.
[6] La vacuna de la reivindicación 4 o 5 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores, que se utiliza para suprimir el crecimiento y/o metástasis de tumores malignos.
Breve descripción de las Figuras
La Fig. 1 muestra la citotoxicidad de los clones de LTC frente a las células diana.
La Fig. 2 muestra los resultados de los análisis de tetrámero de HLA en los clones de LTC establecidos: (a) clones de LTC inducidos por los péptidos de esta invención, y células de soporte; y (b) células de soporte (control).
La Fig. 3 muestra el efecto de la vacunación utilizando los péptidos de esta invención sobre la supervivencia de ratones BALB/c inoculados con Colon 26.
La Fig. 4 muestra el efecto de la vacunación utilizando los péptidos de esta invención sobre el crecimiento de tumores derivados de Colon 26.
La Fig. 5 muestra el efecto de la vacunación utilizando los péptidos de esta invención sobre la tasa de supervivencia de ratones inoculados con B16.
La Fig. 6 muestra el efecto de la vacunación utilizando los péptidos de esta invención sobre el crecimiento de tumores derivados de melanoma B16. Antes de la exposición mediante inyección subcutánea de células tumorales B16, los RTG A2/Kb se vacunaron dos veces, con un intervalo de una semana, con CD pulsadas con KDR773 (círculos negros), CD sólo (triángulos blancos), o HBSS (cuadrados blancos). La figura muestra el crecimiento tumoral medio (P < 0,01).
La Fig. 7 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C29-169 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 8 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C29-169 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 9 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C85-775 (KWC85-775) en células positivas para HLAA0201 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 10 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C85-775 (KWC85-775) en células positivas para HLAA0201 que presentan péptidos KDR.
La Fig. 11 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C51-1328 (KWC51) en células positivas para HLAA0201 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 12 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C51-1328 (KWC51) en células positivas para HLAA0201 que presentan péptidos KDR.
La Fig. 13 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 14 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos de esta descripción.
La Fig. 15 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos KDR.
La Fig. 16 muestra el efecto inhibidor de cada tipo de anticuerpo en el efecto citotóxico de LTC.
La Fig. 17 muestra la actividad inhibitoria de los péptidos de esta descripción en la respuesta angiogénica inducida por las células B16 en RTG A2/Kb. Los ratones se vacunaron dos veces con HBSS, CD no pulsadas o CD pulsadas con los péptidos epítopo de esta descripción (KDR190, KDR772, KDR773, KDR773-2L, KDR775 o KDR1084). Las flechas indican vasos sanguíneos formados de nuevo, que se extienden con un patrón característico en zig-zag.
La Fig. 18 muestra el efecto supresor de los péptidos de esta descripción en el aumento de volumen de los tumores humanos en ratones transgénicos.
La Fig. 19 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KWC65-190 en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 20 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KWC72-772 en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 21 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KWC72-772 en células positivas para HLA-A0201 que presentan péptidos KDR. HePG2-VEGFR2: cajas negras; HePG2-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 22 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C7-1318 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 23 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KWC46 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 24 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C18-189 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 25 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C65-826 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 26 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C7-1318 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción. HT29-VEGFR2: cajas negras; HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 27 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC KWC46 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción. HT29-VEGFR2: cajas negras; HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 28 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C18-189 en células positivas para HLA-A24 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción. HT29-VEGFR2: cajas negras; HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 29 muestra el efecto citotóxico del clon de LTC C65-826 en células positivas para HLA-A24 en células positivas para HLA-A24 que presentan péptidos de esta descripción. HT29-VEGFR2: cajas negras; HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 30 muestra la actividad inhibitoria de los péptidos de esta descripción sobre la respuesta angiogénica inducida por células Colon 26 en ratones BALB/c. Los ratones se vacunaron dos veces con HBSS, CD no pulsadas
o CD pulsadas con un péptido epítopo de esta descripción (KDR189 o KDR826). Las flechas indican vasos sanguíneos formado de nuevo que presentan un patrón característico en zig-zag.
La Fig. 31 muestra la inhibición de la respuesta angiogénica inducida por células Colon 26 en BALB/c mediante péptidos de esta descripción. Las barras indican la media y las barras de error verticales indican el error estándar.
La Fig. 32 muestra el efecto citotóxico de los LTC, derivados de pacientes estimulados con péptidos de esta descripción, sobre células positivas para HLA-A24, en presencia (rombos negros) o ausencia (cuadrados blancos) de los péptidos.
(A)
el efecto citotóxico de LTC derivados de un paciente de cáncer de colon obtenido mediante estimulación con el Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR169);
(B)
el efecto citotóxico de LTC derivados de un paciente de cáncer de colon obtenidos mediante estimulación con el Id. de Sec. Nº: 5 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR189); y
(C)
el efecto citotóxico de LTC derivados de un paciente de cáncer de colon obtenidos mediante estimulación con el Id. de Sec. Nº: 3 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR220).
Modo de llevar a cabo la invención
Los presentes inventores consideraron en primer lugar que varias proteínas se presentan in vivo en las células presentadoras de antígeno tras ser degradadas a péptidos 9-meros (nonapéptidos), y se examinó la afinidad de unión de péptidos parciales 9-meros o 10-meros de las proteínas KDR a los antígenos HLA, que son los antígenos mayores de histocompatibilidad humanos (antígenos MHC). Las letras en minúscula en las secuencias de los péptidos que se muestran a la derecha en la Tabla 1 indican el quinto aminoácido.
La secuencia de aminoácidos de la proteína KDR humana es bien conocida, se describe en la patente estadounidense Nº 5.861.301 por ejemplo, y un experto en la materia puede obtenerla fácilmente. Los péptidos 9meros y 10-meros pueden obtenerse sintetizando péptidos iniciados a partir de cualquier posición, en base a la secuencia completa de aminoácidos de la proteína KDR obtenida. Los péptidos pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos convencionales utilizados en la química de péptidos. Los métodos de síntesis comúnmente utilizados se describen, por ejemplo, en bibliografía como Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis (Peputido Gousei), Maruzen Co., Ltd., 1975; Foundations and Experiments in Peptide Synthesis (Peputido Gousei no Kiso to Jikken), Maruzen Co., Ltd., 1985; y Development of Pharmaceuticals, New Series (Iyakuhin no Kaihatsu, Zoku), Volumen 14, Peptide Synthesis (Peputido Gousei), Hirokawa Shoten, 1991, y en publicaciones como la Publicación Internacional Nº WO 99/67288. La unión a los antígenos HLA puede analizarse mediante el aislamiento de células que comprenden antígenos HLA en su superficie celular, como las células dendríticas, y utilizando métodos convencionales para medir la unión de los péptidos a las células.
Alternativamente, pueden utilizarse los programas disponibles actualmente en Internet, como los descritos en Parker
K. C., J. Immunol. 152, 1994, para calcular las afinidades de unión entre varios péptidos y los antígenos HLA in silico. La afinidad de unión a los antígenos HLA puede determinarse como se describe, por ejemplo, en Parker, K. C., J. Immunol., 152, 1994; y Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 1999.
Para obtener suficientes resultados, preferiblemente se utilizan como antígenos HLA los antígenos tipo A-24 y tipo A-02, que se cree que son de elevada expresión entre los japoneses. Más preferiblemente, se utilizan los subtipos A-2402 y A-0201. No obstante, a nivel clínico, puede seleccionarse de forma apropiada un péptido con un mayor nivel de afinidad de unión a antígeno o mayor nivel de inducibilidad de células T citotóxicas (LTC) tras la presentación del antígeno, al predeterminar el tipo de antígeno HLA de un paciente en necesidad de un tratamiento. Además, para obtener péptidos con niveles elevados de afinidad de unión y de inducibilidad de LTC, puede realizarse una sustitución o adición de uno, dos o varios aminoácidos en base a la secuencia de aminoácidos del péptido parcial de KDR que aparece en la naturaleza. Aquí, el término "varios" significa cinco o menos, o preferiblemente tres o menos. Además de los péptidos en la naturaleza, también se conoce la regularidad de la secuencia de los péptidos presentados mediante la unión a antígenos HLA (J. Immunol., 152, 3913, 1994; Inmunogenetics. 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Así, las modificaciones basadas en esta regularidad también pueden realizarse en los péptidos obtenidos. Por ejemplo, los péptidos en los que el segundo aminoácido del extremo N-terminal se sustituye por fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano, y en el que el aminoácido en C-terminal se sustituye por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina también pueden utilizarse preferiblemente como péptidos con elevada afinidad de unión a HLA-24. Por otro lado, los péptidos en los que el segundo aminoácido del extremo N-terminal se sustituye por leucina o metionina, y en el que el aminoácido en C-terminal se sustituye por valina o leucina pueden utilizarse preferiblemente como péptidos con elevada afinidad de unión a HLA-0201. Además, también pueden añadirse de uno a dos aminoácidos al extremo N y/o C-terminal de los péptidos.
No obstante, cuando la secuencia de un péptido es idéntica a la porción de una secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena con una función diferente, esto puede causar efectos colaterales como enfermedades autoinmunes o síntomas alérgicos frente a sustancias específicas. Por lo tanto, es preferible utilizar las bases de datos disponibles para realizar búsquedas de homología, y evitar situaciones en las que una secuencia se corresponde con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Además, si las búsquedas de homología revelan que no existen péptidos, incluso que comprendan una diferencia de uno o dos aminoácidos, no existe riesgo de tales problemas causados por las modificaciones de las anteriormente mencionadas secuencias de aminoácido para aumentar la afinidad de unión a los antígenos HLA y/o la inducibilidad de LTC.
Como se ha descrito anteriormente, se espera que los péptidos con elevada afinidad de unión a los antígenos HLA tengan una gran efectividad como vacunas del cáncer. No obstante, es necesario determinar si los péptidos candidatos, que se seleccionan utilizando como indicador la elevada afinidad de unión, realmente presentan inducibilidad de LTC o no. La confirmación de la inducibilidad de LTC se realiza induciendo las células presentadoras de antígeno que comprenden antígenos MHC humanos (como los linfocitos B, macrófagos y células dendríticas), más específicamente células dendríticas derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana; estimulando las células con los péptidos; mezclando las células con células positivas para CD8; y luego midiendo la citotoxicidad frente a las células diana. Como sistema de reacción, pueden utilizarse animales transgénicos generados para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los descritos en Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61 (8): 764-79 Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., y Diamond DJ.). Por ejemplo, mediante radiomarcaje de las células diana con 51Cr o similar, puede calcularse la citotoxicidad a partir de la radiactividad liberada de las células diana. Alternativamente, la actividad puede analizarse midiendo el IFN-Ȗ producido y liberado por los LTC en presencia de las células presentadoras de antígeno que tienen péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en el medio utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-Ȗ.
Los resultados del análisis de la inducibilidad de LTC de los péptidos descritos anteriormente revelaron que los de elevada afinidad de unión a los antígenos HLA no necesariamente muestran una elevada inducibilidad. Además, los nonapéptidos seleccionados a partir de los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácido VYSSEEAEL (Id. de Sec. Nº: 2), GYRIYDVVL (Id. de Sec. Nº: 3), SYMISYAGM (Id. de Sec. Nº: 5), RFVPDGNRI (Id. de Sec. Nº: 8), KWEFPRDRL (Id. de Sec. Nº: 11) o DFLTLEHLI (Id. de Sec. Nº: 12), y los nonapéptidos y decapéptidos seleccionados a partir de los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácido AMFFWLLLV (Id. de Sec. Nº: 29), VIAMFFWLL (Id. de Sec. Nº: 30), AVIAMFFWL (Id. de Sec. Nº: 33), KLIEIGVQT (Id. de Sec. Nº: 34), YMISYAGMV (Id. de Sec. Nº: 40) o IQSDVWSFGV (Id. de Sec. Nº: 46), mostraron una inducibilidad de LTC particularmente elevada.
La presente invención describe además péptidos con inducibilidad de células T citotóxicas, en los que uno, dos o varios aminoácidos se sustituyen o se añaden a la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 2, 3, 5, 8, 11 o 12. Las secuencias de aminoácidos, que constan de nueve aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 2, 3, 5, 8, 11 y 12, en las que uno, dos o varios aminoácidos se sustituyen o se añaden pueden presentar inducibilidad de LTC siempre que no se correspondan con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. En particular, por ejemplo, el segundo aminoácido del extremo N-terminal preferiblemente se sustituye por fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano, o el aminoácido en C-terminal preferiblemente se sustituye por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina; o se añaden uno o dos aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal.
La presente invención también describe péptidos con inducibilidad de células T citotóxicas, en los que uno, dos o varios aminoácidos se sustituyen o se añaden a la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 29, 30, 33, 34, 40 o
46. Las secuencias de aminoácidos, que constan de nueve o diez aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 29, 30, 33, 34, 40
o 46, en las que uno, dos o varios aminoácidos se sustituyen o se añaden pueden presentar inducibilidad de LTC siempre que las secuencias no se correspondan con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. En particular, por ejemplo, el segundo aminoácido del extremo N-terminal preferiblemente se sustituye por leucina o metionina, o el aminoácido en C-terminal preferiblemente se sustituye por valina o leucina; o se añaden uno o dos aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal. Un ejemplo de tal péptido modificado es el péptido de Id. de Sec. Nº: 30, en el que el segundo aminoácido del extremo N-terminal se sustituye por leucina (Id. de Sec. Nº: 54), pero este ejemplo no es limitante. Los clones de LTC obtenidos en la estimulación con estos péptidos modificados pueden reconocer los péptidos originales y causar daños.
Los péptidos de esta descripción pueden utilizarse solos o en combinaciones de dos o más, como vacunas contra el cáncer capaces de inducir los LTC in vivo. Mediante la administración de los péptidos de esta invención, los péptidos se presentan con una elevada densidad a los antígenos HLA de las células presentadoras de antígeno. Los LTC que reaccionan específicamente con los complejos formados entre los péptidos presentados y los antígenos HLA se inducen, aumentando la agresión frente a las células endoteliales vasculares en las células tumorales diana. Alternativamente, las células presentadoras de antígeno en cuya superficie celular se inmovilizan péptidos de esta invención pueden obtenerse mediante la derivación de células dendríticas de un sujeto, y su estimulación con los péptidos de esta invención. Las células presentadoras de antígeno obtenidas se readministran a los sujetos para inducir los LTC en los sujetos. Como resultado, puede aumentarse la agresión hacia las células diana.
Más específicamente, la presente invención proporciona productos farmacéuticos para su uso en el tratamiento de tumores o prevención de la proliferación, metástasis y similares de los tumores, en los que los productos farmacéuticos comprenden uno o más péptidos de esta descripción. La angiogénesis en los lugares patológicos está fuertemente asociada no sólo con los tumores, sino también con enfermedades como la retinopatía diabética, artritis reumatoide crónica, psoriasis y aterosclerosis, y con la metástasis de los tumores sólidos (Folkman, J., Nature Med.
1: 27-31 (1995); Bicknell, R., Harris, A.L., Curr. Opin. Oncol. 8: 60-65 (1996)). Por lo tanto, los péptidos de esta descripción pueden utilizarse para tratar tumores, enfermedades como la retinopatía diabética, artritis reumatoide crónica, psoriasis, aterosclerosis y metástasis de los tumores sólidos.
Se confirmó que los péptidos de esta descripción inhibían la formación de vasos sanguíneos tortuosos, que son morfológicamente diferentes de los vasos sanguíneos normales, y que se forman en los tejidos tumorales malignos. Los resultados de analizar la cicatrización y la fertilidad en ratones vacunados también confirmó que los péptidos no provocan efectos adversos sobre la angiogénesis fisiológica normal. Además, se analizó in vitro la citotoxicidad frente a las células endoteliales no proliferativas o proliferativas utilizando los clones de LTC que reconocen los péptidos de esa invención. Estos clones mostraron una mayor actividad frente a las células endoteliales proliferativas que frente a las células endoteliales no proliferativas. Más específicamente, estos pueden funcionar muy específicamente en los trastornos que involucran células endoteliales proliferativas, y particularmente el cáncer.
La estimulación in vivo e in vitro de células dendríticas mediante los péptidos de esta descripción puede realizarse fácilmente mediante la exposición de células a una elevada concentración de péptidos, lo que causa que estos péptidos reemplacen a los péptidos originalmente inmovilizados sobre las células. Por los tanto, los péptidos utilizados en esta invención deben tener al menos cierto nivel de afinidad de unión a los antígenos HLA.
Los productos farmacéuticos de esta invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de tumores pueden administrarse directamente como los péptidos de esta invención en sí mismos, o pueden administrarse como composiciones farmacéuticas que se han formulado mediante los métodos de formulación convencionales. En tales casos, los productos farmacéuticos de esta invención pueden incluir de forma apropiada, además de los péptidos de esta invención, transportadores, excipientes y similares que normalmente se usan en los productos farmacéuticos, sin limitaciones particulares. Los productos farmacéuticos de esta invención se utilizan para el tratamiento y prevención de varios tumores, como el cáncer gástrico, cáncer duodenal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata y tumores cerebrales. Los péptidos de esta invención no atacan las células tumorales en sí mismas, sino que atacan las células endoteliales de los vasos sanguíneos que se forman de nuevo en los tejidos tumorales. Por lo tanto, una gran variedad de tumores pueden ser objeto de tratamiento, y los productos farmacéuticos de esta invención no tienen limitaciones particulares es su utilización.
Los productos farmacéuticos para tratar y/o prevenir tumores, que comprenden un péptido de esta invención como compuesto activo, pueden administrarse con adyuvantes de forma que la inmunidad celular se induzca de forma efectiva; pueden administrarse con otros compuesto activos como los agentes antitumorales; y pueden administrarse en formas granulares. Son aplicables estos adyuvantes descritos en la bibliografía (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) o similares. Además, los productos farmacéuticos de esta invención pueden administrarse como formulaciones de liposomas, como formulaciones granulares unidas a cuentas de pocos micrómetros de diámetro, y como formulaciones a los que se unen lípidos. Los métodos de administración pueden realizarse, por ejemplo, por vía oral, por vía intradérmica o por vía subcutánea, o a través de inyección intravenosa, o similar. Puede utilizarse una administración sistémica o una administración local en los alrededores del tumor diana. Las dosis de los péptidos de esta invención pueden ajustarse de forma apropiada, dependiendo de la enfermedad a tratar, edad y peso de los pacientes, métodos de administración y similares. Normalmente se administran preferiblemente de 0,001 mg a 1000 mg, preferiblemente de 0,01 mg a 100 mg, más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg, de los péptidos de esta invención una vez durante algunos días y hasta varios meses. El experto en la materia podrá seleccionar de forma adecuada las dosis apropiadas.
Alternativamente, la presente descripción proporciona vesículas intracelulares que presentan complejos formados entre los péptidos de esta invención y los antígenos HLA en su superficie. Estas vesículas intracelulares se denominan exosomas. Los exosomas pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos específicamente descritos en la traducción japonesa publicada de las publicaciones internacionales Nº Hei 11510507 y 2000-512161. Los exosomas pueden obtenerse preferiblemente utilizando células presentadoras de antígeno obtenidas de sujetos que van a someterse a terapia o profilaxis. Los exosomas de esta descripción pueden inocularse como vacunas del cáncer, como los péptidos de esta invención.
El tipo de antígenos HLA a utilizar debe corresponderse con el del sujeto en necesidad de terapia y/o profilaxis. Por ejemplo, para los japoneses, el HLA-A24 o HLA-A02, en particular HLA-A2402 o HLA-0201, a menudo es apropiado.
La presente invención también describe los métodos para inducir las células presentadoras de antígeno utilizando los péptidos de esta invención. Las células presentadoras de antígeno pueden inducirse mediante la inducción de células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica; y luego poniéndolas en contacto (estimulándolas) con los péptidos de esta invención, in vitro o in vivo. La administración de los péptidos de esta descripción a los sujetos induce en el cuerpo del sujeto las células presentadoras de antígeno en las que los péptidos de esta descripción se inmovilizan. Alternativamente, los péptidos de esta invención pueden inmovilizarse en las células presentadoras de antígeno a administrar al sujeto como vacuna.
La presente descripción también proporciona métodos para inducir células presentadoras de antígeno con un elevado nivel de inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dichos métodos comprenden la introducción in vitro en una células presentadoras de antígeno de un gen que comprende un polinucleótido que codifica un péptido de esta descripción. Los genes a introducir pueden estar en forma de DNA o RNA. Los métodos de introducción pueden ser diferentes métodos comúnmente utilizados en la materia, como los métodos de lipofección, electroporación y fosfato cálcico, sin limitaciones particulares. Más específicamente, los métodos pueden realizarse como se describen en, por ejemplo, Cancer Res., 56: 5672, 1996; J. Immunol., 161: 5607, 1998; J. Exp. Med., 184: 465, 1996; o la traducción japonesa publicada de las publicaciones internacionales Nº 2000-509281. Mediante la introducción de genes en las células presentadoras de antígeno, los genes se someten a transcripción, traducción y similares en las células. Las proteínas obtenidas 7 se someten entonces a un procesado de MHC de clase I o II y a la vía de presentación para presentar los péptidos parciales.
Además, la presente descripción proporciona los métodos para inducir los LTC utilizando los péptidos de esta descripción. Mediante la administración de los péptidos de esta descripción a un sujeto, se inducen los LTC en el cuerpo del sujeto, potenciando la inmunidad frente a las células endoteliales angiogénicas en los tejidos tumorales. Alternativamente, los métodos pueden utilizarse en métodos terapéuticos ex vivo, en los que las células presentadoras de antígeno derivadas del sujeto, células positivas para CD8, o leucocitos mononucleares de sangre periférica se ponen en contacto (se estimulan) in vitro con los péptidos de esta descripción para inducir LTC, y luego las células se devuelven al sujeto.
Además, la presente descripción proporciona células T citotóxicas, que se inducen utilizando los péptidos de esta descripción y luego se aíslan. Las células T citotóxicas, que se han inducido mediante estimulación con las células presentadoras de antígeno que presentan los péptidos de esta invención, se derivan preferiblemente de los sujetos que se van a someter a terapia y/o profilaxis. Los linfocitos T citotóxicos pueden administrarse solos o, con propósito de obtener un efecto antitumoral, en combinación con otros fármacos, los que incluye los péptidos, exosomas y demás de esta descripción. Los linfocitos T citotóxicos obtenidos actúan específicamente frente a las células diana que presentan los péptidos de esta descripción, o preferiblemente, frente a las células diana que presentan los mismos péptidos utilizados para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan de forma endógena el KDR, o células en las que se ha forzado la expresión de KDR. Además, también pueden convertirse en diana las células que presentan los péptidos de esta descripción sobre su superficie celular debido a la estimulación mediante estos péptidos.
La presente descripción también proporciona unas células presentadoras de antígeno que presentan complejos formados entre los antígenos HLA y los péptidos de esta descripción. Las células presentadoras de antígeno que se obtienen mediante el contacto con los péptidos de esta descripción, o con nucleótidos que codifican los péptidos de esta descripción, derivan preferiblemente de sujetos a los que se desea someter a terapia y/o profilaxis. Las células presentadoras de antígeno pueden administrarse como vacunas en sí mismas, o en combinación con otros fármacos como los péptidos de esta descripción, exosomas y células T citotóxicas.
Mejor forma de llevar a cabo la invención
A continuación, se describe la presente invención de forma específica utilizando Ejemplos, pero no debe tomarse como una limitación de la misma.
[Ejemplo 1] Predicción de péptidos derivados de VEGFR-2 (KDR)-- 1 (HLA-A*2402)
Basados en la secuencia completa de aminoácidos de la proteína KDR, se predijeron doce tipos de péptidos 9meros (Id. de Sec. Nº: 1 a 12), y doce tipos de péptidos 10-meros (Id. de Sec. Nº: 13 a 24) ordenados desde la afinidad de unión más alta a HLA-A*2402, utilizando el programa de Predicción de Unión de Péptidos a HLA de la Sección de Análisis Molecular y Bioinformática (BIMAS) (http:// bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (Tabla 1). La Tabla 1 muestra la afinidad de unión de cada uno de los 9-meros y 10-meros ordenados desde el valor de afinidad más alto, junto con la posición de su N terminal en la secuencia de aminoácidos de la proteína KDR. En la tabla, CE652 (Id. de Sec. Nº: 25) se refiere a uno de los epítopos del antígeno tumoral CEA (antígeno carcinoembrionario) descrito por Nukaya, I. (Int. J. Cancer 80, 1999). Los péptidos de VIH (ILKEPVHGV (Id. de Sec. Nº: 55) y RYLRDQQLL (Id. de Sec. Nº: 56)) se utilizaron como péptidos de control negativo.
Los péptidos se sintetizaron de acuerdo con los métodos de síntesis estándar en fase sólida utilizando Cleaved PepSet (Mimotope, San Diego, CA), y se purificaron mediante HPLC de fase reversa. La pureza (>95%) y el tipo de péptido se determinaron individualmente utilizando HPLC y espectrometría de masas. . Tabla 1 Unión de HLA-A*2402 a los péptidos derivados de KDR
Id. de POSICIÓN SECUENCIA AA AFINIDAD Id. de POSICIÓN SECUENCIA AA AFINIDAD Sec. Nº INICIO (9meros) DE UNIÓN*1 Sec Nº INICIO (10meros) DE UNIÓN*1
1
KDR583 WYKLCPQPL*3 240 13 KDR950 DYVGaIPVDL*3 420
2
KDR1318 VYSSEEAEL 220 14 KDR434 SYQYgTTQTL*3 360
3
KDR220 GYRIYDVVL 200 15 KDR1058 DYVRkGDARL*3 300
4
KDR920 KFGNLSTYL*3 48 16 KDR304 LYTCaASSGL*3 200
5
KDR189 SYMISYAGM 38 17 KDR1318 VYSSeEAELL*3 200
6
KDR828 EFPRDRLKL*3 33 18 KDR734 LYTCqACSVL*3 200
7
KDR1152 TFSELVEHL*3 29 19 KDR926 TYLRsKRNEF*3 198
8
KDR169 RFVPDGNRI*3 22 20 KDR353 KYLCyPPPEI*3 16
9
KDR331 AFGSGMESL*3 20 21 KDR116 VYVQdYRSPF*3 150
10
KDR604 KNLDTLWKL*3 16 22 KDR395 NYTViLTNPI*3 72
11
KDR826 KWEFPRDRL 12 23 KDR777 FFWLILVIIL*3 24
12
KDR998 DFLTLEHLI 9 24 KDR193 SYAGmVFCEA*3 9,2
25
CE652*2 TYACFVSNL*3 200
*1 Parker KC: 1994. J. Immunol 152 *2 Nukava I: 1999 Int. J. Cancer 80 *3 los péptidos se listan sólo a modo informativo.
[Ejemplo 2] Establecimiento de líneas LTC utilizando los péptidos predichos
Las líneas celulares de linfocitos B inmortalizados de virus Epstein-Barr (EBV), TISI (HLA-A24/24) y EHM (HLAA3/3), fueron proporcionados por Takara Shuzo Biotechnology Research Laboratory.
El serotipaje de HLA se realizó utilizando 7 mL de sangre periférica recogida de un sujeto sano. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBMC) de sangre periférica HLA-A24-positiva utilizando centrifugación por gravedad específica con Ficoll Paque (Pharmacia).
Los PBMC obtenidos se dejaron reposar diez horas en un frasco de cultivo (Corning, 43072). Tras eliminar las células en suspensión, se cultivaron en medio AIM-V las células adheridas al frasco (Invitrogen) suplementado con autosuero al 2% añadiendo 1000 U/mL de GM-CSF humana (proporcionado por Kirin Brewery), y 1000 U/mL de IL-4 humana (Genzyme). Cinco días después, las células se cultivaron durante otras 48 horas en 10 ȝg/mL de OK-432 (proporcionado por Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), y se utilizaron como células presentadoras de antígeno para la inducción de LTC. Las células dendríticas (CD) se confirmaron que eran CD mediante reacción con anticuerpos marcados con FITC anti-Clase II, CD80, y CD86, y con anticuerpos marcados con PE anti-Clase I, CD11c, CD40 (todos de Beckton-Dickinson), y anticuerpos CD83 (Inmunotech); seguido de análisis de los antígenos de superficie mediante FACS-Calibur (Beckton- Dickinson) utilizando el programa Cell Quest.
Las CD preinducidas se sometieron a un pulso durante cuatro horas a 20°C con doce clases de péptidos 9-meros (Id. de Sec. Nº: 1 a 12) (20 ȝg/mL), que se predijeron en el Ejemplo 1 que tenían alta afinidad de unión, en presencia de 3 ȝg/mL de ȝ2-microglobulina. Las CD resultantes se mezclaron con células CD8-positivas seleccionadas con cuentas magnéticas (Dynabeads M-450 y Detachabeads) de los PBMC, en una proporción de 1:20 o 1:2, y después se cultivaron en una placa de 48 pocillos (Corning), en presencia de 10 ng/mL de IL-7 humana (Genzyme). Tres días después, se añadió IL-2 (Sigma) a una concentración final de 10 U/mL al cultivo. Siete y 14 días después, las mismas CD se estimularon para inducir LTC, y 20 días después, se midió la citotoxicidad de cada pocillo utilizando células TISI pulsadas con péptido como dianas. Sólo los pocillos positivos se cultivaron mediante un método de estimulación con líneas celulares de alo-PBMC, linfocitos B EBV-inmortalizadas (EHM), y 30 ng/mL de anticuerpo anti-CD3. Se analizaron funcionalmente los LTC 14 días después.
Se evaluó la actividad citotóxica en un ensayo de liberación de 51Cr de cuatro horas. Las células diana se sometieron a un pulso con péptidos a una concentración de 20 ȝg/mL durante la noche. Las células diana se marcaron con 100 PCi de Na251CrO4 a 37°C durante una hora, y se lavaron tres veces con RPMI1640. Se colocaron las células diana (1x 104 células/ 100 ȝL) y 100 ȝL de células efectoras a varias concentraciones con un volumen total de 200 ȝL en una placa microtitulada de 96 pocillos en forma de U (Corning), y se cultivaron en un incubador de CO2 a 37°C durante cuatro horas. Tras el cultivo, se recogió 100 ȝL de sobrenadante de cada pocillo y se midió utilizando un contador /D GHVLQWHJUDFLµQQDWXUDO GHODUDGLRDFWLYLGDGXHHQODV F«OXODV GLDQD\HO PHGLR \OD P£[LPR desintegración de la radioactividad fue en las células diana y HCl 1M. La actividad citotóxica (porcentaje de lisis específica) se calculó mediante la siguiente fórmula:
Actividad citotóxica (% de citotoxicidad) = (desintegración experimental - desintegración natural) / (máxima desintegración - desintegración natural) x 100
Como resultado, se establecieron seis tipos de líneas de LTC, como se muestra en la Tabla 2. En particular, los nonapéptidos mostrados por Id. de Sec. Nº: 2 (posición del aminoácido de iniciación en KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 8 (KDR169), Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), e Id. de Sec. Nº: 12 (KDR998) se determinaron que eran efectivos como péptidos epítopo.
Tabla 2
ACTIVIDAD CITOTÓXICA
Id. de Sec. Nº:
POSICIÓN INICIO SECUENCIA AA AFINIDAD DE UNIÓN*1 X20 X2___ pep(+) pep(-) pep(+) pep(-)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
KDR583 KDR1318 KDR220 KDR920 KDR189 KDR828 KDR1152*3 KDR169 KDR331 KDR604 KDR826 KDR998 WYKLGPQPL*3 VYSSEEAEL GYRIYDVVL KFGNLSTYL*3 SYMISYAGM EFPRDRLKL*3 TFSELVEHL RFVPDGNRI*3 AFGSGMESL*3 KNLDTLWKL*3 KWEFPRDRL DFLTLEHLI 240 220 200 48 38 33 29 22 20 16 12 9 6% 39% 57% 3% 41% 3% 0% 98% 6% 3% 23% 13% 4% 21% 2% 4% 3% 2% 0% 2% 6% 2% 0% 4% 0% 8% 20% 0% 20% 1% 0% 53% 0% 1% 11% 8% 0% 3% 0% 2% 0% 0% 0% 0% 0% 1% 0% 0%
25
CE652*2 TYACFVSNL*3 200 29% 16% 7% 1%
*1 Parker KCC: 1994.J.Immunol 152 *2 Nukaya I: 1999 Int.J.Cancer 80 *3 los péptidos se listan sólo a modo informativo
[Ejemplo 3] Establecimiento de clones de LTC derivados de los péptidos predichos
Los seis tipos de líneas de LTC establecidas en el Ejemplo 2 se diluyeron a 0,3, 1, o 3 células/ pocillo en una placa de 96 pocillos en forma de U. Se añadieron a cada pocillo 7x 104 células/ pocillo de alo-PBMC, 1x 104 células/ pocillo de EHM, 30 ng/mL de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/mL de IL-2, y se le añadió AIM-V suplementado con autosuero al 5%, por lo que la concentración total fue de 150 ȝL/ pocillo. Diez días después, se añadieron 50 ȝL/ pocillo de medio suplementado con IL-2 ajustado a una concentración final de IL-2 de 125 U/mL. Se analizaron funcionalmente los LTC el día 14, y los LTC con actividad se cultivaron a gran escala.
Como resultado, de cada uno de los cinco tipos de nonapéptidos mostrados por Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR169), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 2 (KDR1318), e Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), ocho tipos (C13-169, C19-169, C29-169, C53-169, C72-169, C61-169, K5-169, y K25-169), dos tipos (C12-189 y C18-189), once tipos (KWC3, 23, 25, 26, 36, 42, 46, 58, 61, 70, y 77), un tipo (C7-1318), y un tipo (C65-826) de clon de LTC se establecieron, respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3
ACTIVIDAD CITOTÓXICA KWC42 67% 0% KWC46 94% 1% 51% 0% KWC58 76% 0% KWC61 70% 2% 19% 1% KWC70 92% 3% 64% 2% KWC77 99% 3% 70% 2% C65-826 38% 6% 8% 3% C7-1318 84% 1% 62% 1%
X 20
X 2
NOMBRE DEL CLON
Pep(+) Pep(-) Pep(+) Pep(-)
C13-169
98% 2% 66% 2%
C19-169
94% 2% 50% 0%
C29-169
100% 1% 70% 0%
C53-169
100% 2% 91% 2%
C72-169
87% 1% 39% 0%
C61-169
88% 0% 38% 0%
K5-169
36% 0% 6% 0%
K25-169
27% 0% 5% 0%
C12-189
27% 18% 7% 3%
C18-189
67% 18% 28% 7%
KWC3
54% 2% 11% 1%
KWC23
95% 1% 49% 1%
KWC25
93% 1% 70% 1%
KWC26
87% 1% 34% 0%
KWC36
62% 2% 11% 2%
[Ejemplo 4] Medición de la citotoxicidad de los clones de LTC establecidos
Se analizó el grado de citotoxicidad de los diez tipos de clones de LTC establecidos en el Ejemplo 3 variando la proporción con las células diana (proporción E:T).
Como resultado, C53-169 derivado del nonapéptido de Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR169) mostró la mayor citotoxicidad.
[Ejemplo 5] Análisis de tetrámeros de HLA de los clones de LTC establecidos
Se sintetizó un tetrámero de HLA a partir de HLA-A*2402 y el péptido de Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR169). Más específicamente, los vectores plasmídicos que expresan la cadena H (aproximadamente 35 kDa) y la cadena L (aproximadamente 11 kDa) se produjeron individualmente, y su proteína recombinante se expresó utilizando E. coli. El vector plasmídico de la cadena H contiene sólo el dominio extracelular, en el que el carboxilo terminal se sustituyó con una secuencia de reconocimiento de enzima de biotinilización. La cadena H y la cadena L forman un complejo de péptidos de HLA mediante el replegamiento con un péptido antigénico. Los complejos de péptidos de HLA se biotinilaron mediante un enzima de biotinilización, el exceso de biotina se eliminó mediante cromatografía de filtración en gel y cromatografía de intercambio de iones, y los complejos de péptidos de HLA biotinilados se aislaron y purificaron. El tetrámero de HLA se sintetizó haciendo reaccionar el complejo de péptidos de HLA biotinilado obtenido con estreptavidina (SA) en una proporción molar de
4:1 para formar un tetrámero. Cuando se analizaron las muestras, se utilizó SA marcada fluorescentemente con ficoeritrina (PE) (SA-PE) para formar el tetrámero. La molécula de CD8 se conoce porque se une al 245º aminoácido en el dominio a3, que es una alanina, con la excepción de las porciones de HLA-A, B, y C. Por lo tanto, los presentes inventores mutaron la alanina en los tetrámeros de HLA en una valina, para producir un tetrámero de HLA mutante capaz de detectar de forma selectiva los LTC con alta avidez hacia los complejos de péptidos de HLA, independientemente de la unión entre la molécula de CD8 y el dominio Į3.
Los clones LCT establecidos se detectaron mediante el mutante sintetizado tetrámero KDR169 HLA-A24. Como resultado, como se muestra en la Fig. 2, se vio que los clones LCT establecidos se tiñeron fuertemente mediante las fracciones tetrámero-positivo y CD8-positivo, y que reconocen específicamente los complejos formados entre los péptidos de esta invención y los antígenos HLA. Las señales en las fracciones tetrámero-negativo y CD8-negativo se debe a las células de soporte.
[Ejemplo 6] Predicción de péptidos derivados de VEGFR-2 (KDR) --2(HLA- A*0201)
De forma similar al Ejemplo 1, se predijeron 15 tipos de péptidos 9-meros (Id. de Sec. Nº: 26 a 40), y 12 tipos de péptidos 10-meros (Id. de Sec. Nº: 41 a 52) de la secuencia completa de aminoácidos de la proteína KDR, ordenados desde la afinidad de unión más alta con HLA-A*0201, utilizando el programa de Predicción de Unión de Péptidos a HLA (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (Tabla 4). La tabla 4 muestra la afinidad de unión de cada uno de los 9 meros y 10 meros ordenados desde el valor de afinidad más alto, junto con la posición de su N terminal en la secuencia de aminoácidos de la proteína KDR. En la tabla, CEA588 (Id. de Sec. Nº: 53) se refiere a uno de los epítopos del antígeno tumoral CEA (antígeno carcinoembrionario) descrito por Tanaka, H. et al. (presentación de póster, AACR Nº3669, vol. 42, p681-682, Marzo 2001).
Tabla 4 Unión de HLA- A*0201 a los péptidos derivados de KDR* Id. de Sec. Nº: INICIO POSICIÓN SECUENCIA AA AFINIDAD Id. de Sec. Nº: INICIO POSICIÓN SECUENCIA AA AFINIDAD
(9meros) DE UNIÓN (10meros) DE UNIÓN 26 KDR 1093 VLLWEIFSL*2 1792 41 KDR 1094 LLWEIFSLGA*2 1092 27 KDR 633 SLQDQGDYV*2 769 42 KDR 5 VLLAvALWLC*2 539 28 KDR 5 VLLAVALWL*2 739 43 KDR 313 LMTKkNSTFV*2 470 29 KDR 775 AMFFWLLLV 427 44 KDR 779 WLLLvIILRT*2 292 30 KDR 773 VIAMFFWLL 270 45 KDR 505 ALIEgKNKTV*2 285 31 KDR 1034 ILLSEKNVV*2 179 46 KDR10 84 IQSDvWSFGV 285 32 KDR 604 KNLDTLWKL*2 128 47 KDR 733 GLYTcQACSV*2 223 33 KDR 772 AVIAMFFWL 113 48 KDR 780 LLLViILRTV*2 201 34 KDR 1328 KLIEIGVQT 107 49 KDR 6 LLAVaLWLCV*2 201 35 KDR 698 IMWFKDNET*2 76 50 KDR 137 YITEnKNKTV*2 180 36 KDR 608 TLWKLNATM*2 41 51 KDR10 35 LLSEkNVVKI*2 167 37 KDR 491 FQGGNKIEV*2 32 52 KDR 4 KVLLaVALWL*2 133 38 KDR 435 YQYGTTQTL*2 32 39 KDR 505 ALIEGKNKT*2 31 ___________________________________ _ 40 KDR 190 YMISYAGMV 30 53 CEA 588*1 DVLYGPDTPI*2 0,25 *1 Tanaka H et al.: Póster presentado en AACR 2001 *2 los péptidos se listan sólo a modo informativo.
[Ejemplo 7] Determinación de péptidos epítopo inmovilizados de HLA-A*0201
Los LCT se indujeron mediante un método de vacunación, utilizando los 16 tipos de péptidos 9-meros y 10-meros (Id. de Sec. Nº: 26 a 41) predichos en el Ejemplo 6 en ratones transgénicos que expresan HLA humano (A0201) (Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61 (8): 764-79 Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLAA*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., y Diamond DJ.).
Se obtuvieron ratones BALB/C (H-2d) de seis a ocho semanas de edad de CLEA Japan. Los ratones transgénicos A2/Kb (RTG) fueron proporcionados por F. Jim Primus, Ph. D. del Centro de Cáncer Vanderbilt-Ingram. Los linfocitos T2 (deficientes para TAP y HLA-A*0201-positivos) fueron proporcionados por el Prof. H. Shiku de la Universidad de Mie, Tercer Departamento de Medicina Interna.
La médula ósea se recogió del fémur y tibia del ratón, y se retiraron los linfocitos y granulocitos utilizando anticuerpos anti-CD4, CD8, Gr-1 (Beckton-Dickinson), anticuerpo anti-B220 (Bioscience) y complemento de conejo (PeL- Freez). Las células obtenidas se cultivaron en una placa de 6 pocillos. Las células en suspensión se recogieron al día siguiente en medio RPMI1640 (Invitrogen) suplementado con FBS al 10% en otra placa de 6 pocillos, a la que se le añadió 1000 U/mL de GM-CSF de ratón (proporcinado por Kirin Brewery) y 1000 U/mL de IL-4 de ratón (PEPRO TECH). Tres días después, se cambió la mitad del medio anterior, y dos días después, las células se cultivaron durante 20 horas en 10 ȝg/mL de OK- 432. Las células en suspensión resultantes se utilizaron como CD. Las CD se hicieron reaccionar con anticuerpos marcados con FITC anti-Clase II y CD40, y anticuerpos marcados con PE anti-Clase I, CD11c, CD80, y CD86 (todos de Beckton-Dickinson), y se confirmó que eran CD mediante análisis de los antígenos de superficie mediante FACS-Calibur (Beckton- Dickinson) utilizando el programa Cell Quest.
Después, 100 ȝg de cada péptido, 140 ȝg de péptido ayudante HbcAg120-140, y 100 ȝL de IFA se mezclaron (200 ȝL en total). La mezcla se administró por vía subcutánea en el abdomen derecho el día 0, y en el abdomen izquierdo el día 11. Se recogieron los bazos de los ratones vacunados el día 21, los eritrocitos se eliminaron hemolíticamente utilizando el tampón de lisis rojo (Sigma), y se utilizó una porción de las células como células respondedoras para el ensayo IFN-Ȗ ELISPOT. El resto de células se colocaron en una placa de 24 pocillos (Corning) a 6x106 células/ pocillo con células de soporte en una proporción de 3:1, y se estimularon de nuevo. Se midió la citotoxicidad cinco días después. Los esplenocitos libres de eritrocitos, que derivaban de los ratones singénicos, se cultivaron durante tres días en presencia de 25 ȝg/mL de lipopolisacárido (LPS) para utilizar como células de soporte.
En este Ejemplo, el método IFN-Ȗ ELISPOT se utilizó para evaluar la inducibilidad de los LCT de acuerdo con los puntos (SPOT) producidos por las células productoras de IFN-Ȗ. Se trató una placa de 96 pocillos de fondo plano MAHA S45 (Millipore) a 4°C durante la noche con anticuerpo monoclonal anti-IFN-Ȗ de ratón (Pharmingen). Al día siguiente, se lavó la placa con PBS que contenía 0,05% de Tween 20, y después se hizo reaccionar con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, se añadieron las células T2 pulsadas y no pulsadas con péptido a cada pocillo a 105 células/ 100 ȝL. Los esplenocitos de los ratones vacunados se añadieron a cada pocillo a un máximo de 4x 106 células/ 100 ȝL (200 ȝL en total), y se cultivaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, cada pocillo se lavó, y se hizo reaccionar durante dos horas con anticuerpos biotinilados de rata antiIFN-Ȗ-de ratón (Pharmingen). Tras lavar la placa extensivamente, se añadió Extravidina a cada pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante dos horas. Tras lavar, se añadió sustrato conjugado de fosfatasa alcalina (BIO-RAD) a los pocillos, que se dejó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Los puntos azules resultantes de la producción de IFN-Ȗ se midieron utilizando liberación compacta KS ELISPOT (Carl Zeiss).
Los puntos azules específicos se determinaron como:
Puntos azules específicos =(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)
Aquellos que cumplen la siguiente condición se consideraron efectivos:
TISI(+)SPOT/ TISI(-)SPOT
Como resultado, se obtuvieron cinco tipos de péptidos epítopo, Id. de Sec. Nº: 29 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR775), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), y Id. de Sec. Nº: 40 (KDR190) mediante el ensayo ELISPOT de IFN7DEOD
Tabla 5* Análisis ELISPOT
AN�?LISIS ELISPOT X 40 (SFC)
Id. de
INICIO POSICIÓN SECUENCIA AFINIDAD RATÓN1 RATÓN2___
Sec. Nº:
AA DE UNIÓN pep(+) pep(-) pep(+) pep(-)
26
KDR 1093 VLLWEIFSL*2 1792 5 8 7 1
41
KDR 1094 LLWEIFSLGA*2 1092 0 0 0 0
27
KDR 633 SLQDQGDYV*2 769 0 0 0 0
28
KDR 5 VLLAVALWL*2 739 6 0 7 3
29
KDR 775 AMFFWLLLV 427 95 32 322 17
30
KDR 773 VIAMFFWLL 270 171 6 193 1
31
KDR 1034 ILLSEKNVV*2 179 0 0 0 0
32
KDR 604 KNLDTLWKL*2 128 0 7 0 0
33
KDR 772 AVIAMFFWL 113 88 19 143 31
34
KDR 1328 ELIEIGVQT 107 0 0 81 5
35
KDR 698 IMWFKDNET*2 76 0 0 0 0
36
KDR 608 TLWKLNATM*2 41 0 0 0 0
37
KDR 491 FQGGNKIEV*2 32 0 0 0 0
38
KDR 435 YQYGTTQTL*2 32 0 0 0 0
39
KDR 505 ALIEGKNKT*2 31 0 0 0 0
40
KDR 190 YMISYAGMV 30 122 6 33 11
53 CEA5 588*1 DVLYGPDTPI 0,25 229 2 230 6
*1 Tanaka H et al.: Póster presentado en AACR 2001
*2 los péptidos se listan sólo a modo informativo.
[Ejemplo 8] Confirmación del efecto antitumoral in vivo -- 1
Se recogió la médula ósea de ratones macho BALB/c de seis a ocho semanas de edad (CLEA Japan, Inc.) con el mismo motivo de anclaje que el HLA-A2402 humano. Como en el Ejemplo 7, se añadieron GM-CSF (Kirin Brewery) (1000 U/mL) e IL-4 (Genzyme) (1000 U/mL) a la médula ósea y se cultivaron para preparar células dendríticas. Las células dendríticas se sometieron a un pulso con el péptido de Id. de Sec. Nº: 5 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR189) y después se administró (1x 106 células/ ratón) dos veces a nueve ratones BALB/c en el cuadrante inferior derecho, con un intervalo de siete días. Siete días después, se inoculó la línea celular de cáncer de colon (5x 105 células), Colon 26 (Taiho Pharmaceutical), en los abdómenes derechos de los ratones, y se analizaron las supervivencias de los ratones y el crecimiento tumoral.
Primero, se analizó la expresión de KDR mediante RT-PCR, como se indica en la Fig. 3, para confirmar que la KDR no se expresa sólo en las células Colon 26, sino que se expresa en los tejidos tumorales de los ratones inoculados con Colon 26. Más específicamente, se confirmó la aparición de los vasos tumorales en los tejidos tumorales, y para formar el tumor.
La Fig. 3 muestra la curva de supervivencia de los ratones inoculados con Colon 26. 35 días después de la inoculación del tumor, dos de nueve ratones sobrevivieron cuando se administró como control HBSS sola (100 ȝL) (Solución salina equilibrada de Hank); cinco de nueve ratones sobrevivieron cuando se inocularon con células dendríticas que no fueron pulsadas con péptidos; y los nueve ratones sobrevivieron cuando se inocularon con células dendríticas pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 5.
La Fig. 4 muestra el efecto en el crecimiento de los tumores derivados de Colon 26 en ratones. En comparación con el control, se observaron efectos supresores en el crecimiento tumoral cuando se inocularon células dendríticas, y se observaron efectos de supresión remarcables cuando se inocularon células dendríticas pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 5.
[Ejemplo 9] Búsquedas de homología para los péptidos de esta invención
Se llevaron a cabo búsquedas de homología para los péptidos de esta invención (Id. de Sec. Nº: 2 (en el que la posición del aminoácido de iniciación es KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 8 (KDR169), Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), y Id. de Sec. Nº: 40 (KDR190)) utilizando el programa BLAST (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). No se pudieron encontrar péptidos con una secuencia completamente idéntica a ninguno de estos péptidos (Tabla 6). Los péptidos 9-meros (KDR169) de Id. de Sec. Nº: 8 capaces de inducir una fuerte actividad LCT en el Ejemplo 4 poseen sólo una secuencia que contenía dos faltas de coincidencia (homología del 77,8%), y dos secuencias que contenían tres faltas de coincidencia (homología del 66,7%). El péptido de Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), cuyo remarcable efecto antitumoral in vivo se observó en el Ejemplo 8, posee sólo una secuencia que contenía tres faltas de coincidencia (homología del 66,7%).
Tabla 6 Análisis de homología utilizando el programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)
KDR169 KDR189 KDR826 KDR220 KDR1318 KDR773 KDR190
IDENTIDAD (9/9) 0 0 0 0 0 0 0 IDENTIDAD (8/9) 0 0 3 0 0 0 0 IDENTIDAD (7/9) 1 0 2 0 2 2 0 IDENTIDAD (6/9) 2 1 -0 -2 0 [Ejemplo 10] Confirmación de efecto antitumoral in vivo -- 2
Se recogió la médula ósea de ratones macho A2/Kb transgénicos (RTG) de seis a ocho semanas de edad que expresan el HLA-A0201 humano. Como en el Ejemplo 8, se añadieron GM-CSF (Kirin Brewery) (1000 U/mL) e IL-4 (Genzyme) (1000 U/mL) a la médula ósea y después se cultivaron para preparar células dendríticas. Las células dendríticas se sometieron a un pulso con el péptido de Id. de Sec. Nº: 30 (posición del aminoácido de iniciación en KDR773), y se administraron (1x 106 células/ ratón) dos veces en el cuadrante inferior izquierdo de doce ratones transgénicos A2/Kb, con un intervalo de siete días. Siete días después, se inocularon células de melanoma B16 (ATCC) (1x 106 células) en el abdomen derecho del ratón, y se analizaron las supervivencias y el crecimiento tumoral de los ratones.
La Fig. 5 muestra la tasa de supervivencia de los ratones inoculados con B16. 35 días después de la inoculación tumoral, ocho de doce ratones sobrevivieron cuando se administró HBSS sólo (100 ȝL) como control; once de doce ratones sobrevivieron cuando se inocularon con células dendríticas que no fueron pulsadas con péptidos; y los doce ratones sobrevivieron cuando se inocularon con células dendríticas pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 30.
La Fig. 6 muestra el efecto en el crecimiento de los tumores derivados de B16 en ratones. En comparación con el control, se observaron efectos supresores en el crecimiento tumoral cuando se inocularon células dendríticas, y se observaron efectos de supresión remarcables cuando se inocularon células dendríticas pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 30.
[Ejemplo 11] Actividad citotóxica frente a las células forzadas a expresar KDR
Utilizando adenovirus, se forzó la expresión de KDR (véase, J. Biol. Chem. 1994 Oct 28; 269 (43): 26988-95) en una cepa HT29 de cáncer de colon humano HLA-A24-positivo (ATCC), de acuerdo con el método descrito por Miyake, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1320-1324 (1996). Más específicamente, basado en la titulación determinada por el ensayo de placas de las células 293 humanas, las células se infectaron en una multiplicidad específica. Las células HT29 se plaquearon a una densidad celular de 105 células en un disco de 60 mm, y se incubaron durante 24 horas. Al día siguiente, se retiró el medio y se cambió con 200 ȝL de virus diluidos continuamente con medio fresco. Las células se incubaron a 37°C durante una hora, y después se añadió medio de crecimiento a las células, que se cultivaron durante 48 horas para usarse como células diana. Se utilizó como control la cepa HT29 HLA-A24-positiva, forzada por los adenovirus a expresar EGFP (véase, Leukemia 1999 Apr; 13 (4): 605-13). Las cepas HT29 forzadas a expresar KDR y EGFP, respectivamente, pueden presentar potencialmente péptidos parciales de cada proteína en sus correspondientes superficies celulares.
Utilizando el clon de LCT C29-169, inducido a partir del péptido de Id. de Sec. Nº: 8 (posición del aminoácido de iniciación en KDR169), como se describe en el Ejemplo 3, que se une a HLA-A24, el efecto citotóxico sobre las células HT29 HLA-A24-positivas forzadas a expresar KDR se midió mediante el ensayo de liberación de cromo. Los resultados se muestran en la Fig. 7.
La actividad citotóxica se midió mediante el ensayo de liberación de 51Cr durante cuatro horas. Las células diana se cultivaron en una placa de 6 pocillos a una concentración de 1x 106 células/ pocillo durante 24 horas, infectadas con adenovirus en los que se había insertado KDR o EGFP (Ad-KDR o Ad-EGFP) a una MDI de 50, y se utilizaron tras 48 horas. Las células diana se marcaron con 100 PCi de Na251CrO4 a 37°C durante una hora, y se lavaron tres veces con RPMI1640. Se añadieron las células diana (1x 104 células/ 100 ȝL) y 100 ȝL de células efectoras a varias concentraciones (200 ȝL en total) a una placa microtitulada de 96 pocillos en forma de U (Corning), y se cultivaron en un incubador de CO2 a 37°C durante cuatro horas. Tras el cultivo, se recogió 100 ȝL de sobrenadante de cada pocillo y se midió utilizando un contador Ȗ para calcular la citotoxicidad de la misma forma que en el Ejemplo 2.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 7, el clon LCT C29-169 mostró un efecto citotóxico muy remarcable hacia HT29 HLA-A24-positivas que expresan de forma forzada KDR, en comparación con las células que expresan de forma forzada EGFP.
[Ejemplo 12] Actividad citotóxica frente a células que expresan endógenamente KDR
El efecto citotóxico del clon LCT C29-169 descrito en el Ejemplo 3, frente a la cepa KT5 HUVEC, derivada de células endoteliales vasculares del cordón umbilical humano HLA-A24-positivas que expresan endógenamente KDR, se analizaron utilizando cepas HUVEC KDR-positivas y HLA-A24-negativas, y P8 como control. Estas células presentan péptidos parciales de KDR en su superficie celular.
La actividad citotóxica se midió mediante un ensayo de liberación de 51Cr de cuatro horas. Las células diana se marcaron con 100 PCi de Na251CrO4 a 37°C durante una hora, y se lavaron tres veces con RPMI1640. Se añadieron las células diana (1x 104 células/ 100 ȝL) y 100 ȝL de células efectoras a varias concentraciones (200 ȝL en total) a una placa microtitulada de 96 pocillos en forma de U (Corning), y se cultivaron en un incubador de CO2 a 37°C durante cuatro horas. Tras el cultivo, se recogió 100 ȝL de sobrenadante de cada pocillo y se midió utilizando un contador Ȗ para calcular la citotoxicidad, de la misma forma que en el Ejemplo 2.
Como aparece en los resultados de la Fig. 8, el clon LCT C29-169 mostró un efecto citotóxico frente a HUVEC HLAA24-positiva que expresan endógenamente KDR, y mostró un débil efecto citotóxico frente a HUVEC HLA-A24negativa.
[Ejemplo 13] Establecimiento de clones LCT utilizando péptidos de unión a HLA-A0201
Utilizando el péptido de Id. de Sec. Nº: 40 (posición del aminoácido de iniciación en KDR190), el péptido KDR773-2L (Id. de Sec. Nº: 54) en el que el segundo aminoácido del N terminal en el péptido de Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773) se ha convertido a leucina, el péptido de Id. de Sec. Nº: 29 (KDR775), el péptido de Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), y el péptido de Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), que se une a HLA-A0201 y que se determinaron que eran efectivos según el análisis ELISPOT del Ejemplo 7, se obtuvieron dos tipos (KWC14-190 y KWC65-190), cuatro tipos (KWC44-7732L, KWC76-773-2L, KWC129-773-2L, y KWC134-773-2L), dos tipos (KWC81-775 y KWC85-775), doce tipos (KWC16, KWC21, KWC22, KWC47, KWC51, KWC108, KWC117, KWC132, KWC151, KWC153, KWC156, y KWC159), y un tipo (KWC72-772) de clones LCT, respectivamente, como en el Ejemplo 3. Las correspondientes citotoxicidades se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
ACTIVIDAD CITOTÓXICA
X 20 X 2
NOMBRE DEL CLON
Pep(+) Pep(-) Pep(+) Pep(-)
KWC14-190
43% 0% 9% 0%
KWC65-190
83% 0% 27% 0%
KWC44-773-2L
87% 0% 64% 0%
KWC76-773 -2L
83% 2% 68% 1%
KWC129-773-2L
89% 0% 82% 1%
KWC134-773-2L
89% 2% 54% 2%
KWC81-775
86% 0% 64% 0%
KWC85-775
90% 0% 63% 0%
KWC16
95% 0% 85% 0%
KWC21
100% 0% 91% 0%
KWC22
93% 0% 77% 0%
KWC47
109% 2% 87% 1%
KWC51
101% 0% 93% 1%
KWC108
71% 2% 23% 2%
KWC117
83% 0% 42% 0%
KWC132
102% 0% 55% 0%
KWC151
102% 0% 101% 0%
KWC153
47% 0% 18% 0%
KWC156
64% 0% 23% 0%
KWC159
93% 0% 86% 0%
KWC72-772
101% 0% 67% 0%
Como aparece en los resultados de la Tabla 7, los péptidos de Id. de Sec. Nº: 29, 33, 34, y 40, así como el péptido de Id. de Sec. Nº: 54, en el que el segundo aminoácido del N terminal en el péptido de Id. de Sec. Nº: 30 es leucina, pueden todos inducir a los LCT con una citotoxicidad remarcable, y mostraron así ser efectivos como péptidos epítopo.
[Ejemplo 14]
El péptido de Id. de Sec. Nº: 29 (posición del aminoácido de iniciación en KDR775) se añadió a una cepa T2 HLAA0201-positiva para producir una célula diana. Utilizando la célula, el efecto citotóxico del clon LCT (KDR C85-775 (KWC85-775)) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 29 en el Ejemplo 13 se analizó mediante ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 9, el clon LCT C85-775 (KWC85-775) mostró claramente un efecto citotóxico frente a células HLA-A0201-positivas que presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 29. Por contra, no se observó en absoluto efecto citotóxico frente a células control que no presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 29.
[Ejemplo 15]
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR C85-775 (KWC85-775)) frente a la línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positivo, forzado a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. HePG2 HLAA0201-positivo forzado a expresar EGFP se utilizó como control.
En los resultados, mostrados en la Fig. 10, el clon LCT KDR C85-775 (KWC85-775) mostró un alto efecto citotóxico remarcable frente a células HLA-A0201-positivas que presentan péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad frente a células que presentan el péptido EGFP.
[Ejemplo 16]
El péptido de Id. de Sec. Nº: 34 (posición del aminoácido de iniciación en KDR1328) se añadió a la cepa T2 HLAA0201-positiva para producir células diana. Utilizando estas células, el efecto citotóxico del clon LCT (KDR C51-1328 (KWC51)) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 34 en el Ejemplo 13 se examinó mediante ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 11, el clon LCT KDR C51-1328 (KWC51) mostró claramente un efecto citotóxico frente a células HLA-A0201-positivas que presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 34. Por el contrario, no se observó ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 34.
[Ejemplo 17]
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR C51-1328 (KWC51)) frente a la línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positiva, forzada a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. Se utilizó como control HePG2 HLAA0201-positivas forzadas a expresar EGFP.
En los resultados, mostrados en la Fig. 12, el clon LCT KDR C51-1328 (KWC51) mostró un alto efecto citotóxico remarcable frente a células HLA-A0201-positivas que presentan péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad frente a células que presentan el péptido EGFP.
[Ejemplo 18]
El péptido de Id. de Sec. Nº: 54 (KDR773-2L), en el que el segundo péptido de Id. de Sec. Nº: 30 se convierte en una leucina, se añadió a una cepa T2 HLA-A0201-positiva para producir células diana. Utilizando estas células, el efecto citotóxico del clon LCT (KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 54 en el Ejemplo 13 se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. La Fig. 13 muestra los resultados.
En los resultados, mostrados en la Fig. 13, el clon LCT KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) mostró claramente un efecto citotóxico frente a células HLA-A0201-positivas que presentan KDR773-2L. Por el contrario, no se observó ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan KDR773-2L.
[Ejemplo 19]
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 54 (KDR773-2L), en el que el segundo péptido de Id. de Sec. Nº: 30 se ha convertido en una leucina, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo utilizando la cepa T2 HLA-A0201-positiva pulsada con el péptido no modificado de Id. de Sec. Nº: 30 (posición del aminoácido de iniciación en KDR773) como célula diana.
En los resultados, mostrados en la Fig. 14, los clones LCT obtenidos mediante estimulación con el péptido modificado pudieron reconocer y dañar el péptido post-modificación.
[Ejemplo 20]
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)) frente la línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positiva, forzada a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. Se utilizó como control HePG2 HLA-A0201-positivo forzado a expresar EGFP.
En los resultados, mostrados en la Fig. 15, el clon LCT KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) mostró un alto efecto 5 citotóxico remarcable frente a células HLA-A0201-positivas que presentan péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad frente a células que presentan el péptido EGFP.
[Ejemplo 21]
10 Los presentes inventores determinaron si diferentes anticuerpos pueden bloquear el efecto citotóxico del clon LCT (KDR C51-1328 (KWC51)), obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 34, frente a la línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positiva, forzada a expresar KDR por los adenovirus.
En los resultados, mostrados en la Fig. 16, la función citotóxica se inhibió mediante un anticuerpo anti-HLA de Clase
15 I frente a antígenos de HLA mostrados por las células diana, y anticuerpo anti-CD8 frente a CD8 utilizado como marcador de linfocitos T citotóxicos.
[Ejemplo 22] Examinación de la actividad inhibidora de la angiogénesis mediante el ensayo del saco aéreo dorsal (DAS)
20 La presente actividad inhibidora de la angiogénesis de péptidos epítopo se evaluó en ratones utilizando un ensayo DAS (véase, Clinical Cancer Research, Vol. 5, 2185-2191, Agosto 1999; Cancer Research 62, 6116-6123, Noviembre 1, 2002).
25 Específicamente, un filtro de membrana se fijó a ambos lados de una cámara en anillo, y se esterilizó con óxido de etileno gas. Se prepararon las células de melanoma B16 a 5x 105 células/ 0,15 mL, y se inyectaron en la cámara. Los ratones (ratones transgénicos A2/kb (derivados de B16)) se inmovilizaron cara abajo, y se produjo un saco de aire al inyectar de 5 a 10 mL de aire en la hipodermis dorsal murina utilizando una jeringa. Se realizó una incisión de aproximadamente 1 cm en la parte inferior del saco. La cámara en anillo, se rellenó con una solución de células en
30 suspensión, se implantó en la hipodermis dorsal, y se cerró la piel utilizando una grapa de piel. Seis días después del implante, la piel del ratón se retiró junto con la cámara, se fijó de forma extendida, y se marcó con un anillo de goma negra para observar los vasos sanguíneos formados de nuevo utilizando un microscopio. Los vasos sanguíneos nuevamente formados mediante los factores angiogénicos liberados por las células tumorales malignas, característicamente discurren en forma de zigzag, y son morfológicamente diferentes de los vasos sanguíneos que
35 aparecen de forma natural. Por lo tanto, los vasos sanguíneos de 3 mm o más den-tro del anillo de goma y que discurren en forma de zigzag se determinaron como vasos sanguíneos de nueva formación, y se analizaron utilizando un índice de angiogénesis (IA). El IA se analiza en seis niveles, de 0 a 5 de acuerdo con el número de vasos sanguíneos tortuosos. Todos aquellos con cinco o más vasos sanguíneos tortuosos se calificaron como 5.
40 La vacunación se realizó 14 días antes de la implantación de la cámara, y se repitió al cabo de una semana (un total de dos veces) inyectando respectivamente 5x 104 células de HBSS, CD solas, o CD pulsadas con péptido, en la vena de la cola. Los resultados se muestran en la Fig. 17 y en la Tabla 8, a continuación.
Tabla 8. Efecto del ensayo DAS
INOCULACIÓN
PÉPTIDO DE ESTIMULACIÓN �?NDICE ANGIOGÉNESIS (IA) P
VEH�?CULO
- (0,7 ± 0,2)
HBSS
- (4,5 ± 0,2)
CD
NINGUNO (4,2 ± 0,4)
CD
KDR190 (Id. de Sec. Nº: 40) (3,6 ± 0,5) 0,3453
CD
KDR772 (Id. de Sec. Nº: 33) (2,8 ± 0,5) 0,0346
CD
KDR773 (Id. de Sec. Nº: 30) (2,2 ± 0,7) 0,0034
CD
KDR773-2L (Id. de Sec. Nº: 54) (1,3 ± 0,8) 0,0001
CD
KDR775(Id. de Sec. Nº: 29) (2,2 ± 0,5) 0,0007
CD KDR1084
(Id. de Sec. Nº: 46) (1,7 ± 0,3) <0.0001
La Fig. 17 y la Tabla 8 muestran que la formación de vasos sanguíneos tortuosos se suprimió claramente en los grupos vacunados con CD pulsadas con los péptidos de Id. de Sec. Nº: 40 (posición del aminoácido de iniciación en KDR190), Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), Id. de Sec. Nº: 54 (KDR773-2L), Id. de Sec. Nº: 29 (KDR775), e Id. de Sec. Nº: 46 (KDR1084), respectivamente, en comparación con el grupo al que se administró CD solas. Esto indicó un efecto inhibidor de la angiogénesis estadísticamente significativo.
Se analizó la curación de heridas y la fertilidad en ratones vacunados para observar los efectos adversos de la vacunación utilizando estos péptidos epítopo en la angiogénesis fisiológica normal. No obstante, no se encontraron efectos adversos significativos en los ratones vacunados. Además, utilizando los clones de LCT que reconocen los péptidos KDR, se analizó la citotoxicidad frente a células endoteliales no proliferativas o proliferativas in vitro para examinar los efectos adversos en humanos. Como resultado, estos clones mostraron una actividad más fuerte frente a células endoteliales proliferativas que frente a células endoteliales no proliferativas.
[Ejemplo 23]
Utilizando los ratones transgénicos A2/Kb que expresan el HLA-A0201 humano, los péptidos de Id. de Sec. Nº: 30 (posición del aminoácido de iniciación en KDR773) y de Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1084) se mezclaron cada uno con adyuvante incompleto de Freund, después se administraron al día 3 y 13 a los ratones portadores de tumores de la cepa MC38 de cáncer de colon para indicar cambios en el volumen del tumor.
El efecto antitumoral in vivo en un modelo terapéutico de péptido de epítopo inmovilizado de HLA-A*0201 (KDR773) se analizó utilizando el área del tumor, utilizando el mismo método de vacunación como en el Ejemplo 22. El resultado, como aparece en la Fig. 18, confirma un efecto supresor significativo en el crecimiento tumoral por la vacunación con los péptidos de Id. de Sec. Nº: 30 e Id. de Sec. Nº: 34.
[Ejemplo 24]
El péptido de Id. de Sec. Nº: 40 (posición del aminoácido de iniciación en KDR190) se añadió a la cepa T2 HLAA0201-positiva para producir células diana. Utilizando estas células, se examinó el efecto citotóxico del clon LCT (KWC65-190) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 40 en el Ejemplo 13 utilizando un ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 19, el clon LCT KWC65-190 mostró claramente un efecto citotóxico frente a células HLA-A0201-positivas que presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 40. Por el contrario, no se observó ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 40.
[Ejemplo 25]
El péptido de Id. de Sec. Nº: 33 (posición del aminoácido de iniciación en KDR772) se añadió a la cepa T2 HLAA0201-positiva para producir células diana. Utilizando estas células, se examinó el efecto citotóxico del clon LCT (KWC72-772) obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 33 en el Ejemplo 13 utilizando un ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 20, el clon LCT KWC72-772 mostró claramente un efecto citotóxico frente a células HLA-A0201-positivas que presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 33. Por el contrario, no se observó ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan el péptido de Id. de Sec. Nº: 33.
[Ejemplo 26]
El efecto citotóxico del clon LCT (KWC72-772) frente a la línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2HLAA0201-positiva, forzada a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. Se utilizó HePG2 HLA-A0201-positiva forzada a expresar EGFP como control.
En los resultados, como se muestra en la Fig. 21, el clon LCT KWC72-772 mostró un alto efecto citotóxico remarcable frente a células HLA-A0201-positivas que presentan péptidos KDR en su superficie, en comparación con la actividad frente a células que presentan el péptido EGFP.
[Ejemplo 27]
Los péptidos de Id. de Sec. Nº: 2 (posición del aminoácido de iniciación en KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), e Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826) se añadieron a la cepa de linfocitos B humanos A24-LCL HLA-A24-positiva (HLA-A24/24, Takara Shuzo) para producir células diana. Utilizando estas células, los efectos citotóxicos de los clones LCT, C7-1318, KWC46, C18-189, y C65-826, descritos en el Ejemplo 3, se examinaron mediante ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 22 a 25, cada uno de los clones LCT, C7-1318, KWC46, C18-189, y C65826, mostró claramente un efecto citotóxico frente a cada una de las células HLA-A24-positivas que presentan los péptidos de Id. de Sec. Nº: 2, 3, 5, y 11, respectivamente. Por el contrario, no se observó ningún efecto citotóxico en absoluto o casi ninguno frente a cada una de las células control, que no presentaban los péptidos.
[Ejemplo 28]
Como para el Ejemplo 11, los efectos citotóxicos de los clones LCT, C7-1318, KWC46, C18-189, y C65-826, descritos en el Ejemplo 3, frente a la cepa HT29 de cáncer de colon humano (ATCC), forzada a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo. La cepa HT29 HLA-A24-positiva forzada a expresar EGFP, se utilizó como control.
En los resultados, mostrados en las Fig. 26 a 29, todos los clones LCT, C7-1318, KWC46, C18-189, y C65-826, mostraron un alto efecto citotóxico remarcable frente a HT29 HLA-A24-positiva forzada a expresar KDR, en comparación con la actividad frente a células forzadas a expresar EGFP.
[Ejemplo 29]
Como para el Ejemplo 22, la actividad inhibidora de la angiogénesis de los péptidos epítopos frente a la respuesta angiogénica inducida por las células Colon 26 en ratones BALB/c se analizó mediante un ensayo DAS.
Como aparece en los resultados de las Fig. 30 y 31, en los grupos vacunados con CD pulsadas con los péptidos de Id. de Sec. Nº: 5 (posición del aminoácido de iniciación en KDR189) y Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), respectivamente, la formación de vasos sanguíneos tortuosos se suprimió claramente en comparación con el grupo al que se le administró CD solas. Esto indico un efecto supresor de la angiogénesis estadísticamente significativo.
[Ejemplo 30]
La respuesta de los LCT frente a cada tipo de los siguientes péptidos epítopo se investigó utilizando PBMC de pacientes con cáncer tras la estimulación con cada péptido:
Péptidos de Id. de Sec. Nº: 8 (posición del aminoácido de iniciación en KDR169), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), e Id. de Sec. Nº: 17 (KDR1318), con alta afinidad de unión por HLA-24; y péptidos de Id. de Sec. Nº: 40 (KDR190), Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), Id. de Sec. Nº: 29 (KDR775), e Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), con alta afinidad de unión por HLA-A0201.
Utilizando el método escrito por Maeda, Y et al. en Br. J. Cancer 87, 796-804 (2002), se detectaron LCT específicos de péptido en PBMC. Primero, las PBMC recogidas de pacientes (1x 105 células) se incubaron con 10 ȝM de cada péptido en una placa de 96 pocillos con el fondo en forma de U, que comprende 200 ȝL de medio. El medio consiste de medio RPMI1640 al 45%, medio AIM-V al 45%,, FBS al 10%, 100 U/mL de interleuquina-2 (IL-2), y 0,1 ȝM de solución de aminoácidos no esenciales MEM. Cada tres días, la mitad del medio se retiró y se sustituyó con medio fresco que contenía el péptido correspondiente (20 ȝM). Tras la incubación durante doce días, se recogieron las células para analizar la capacidad de producir IFN-Ȗ en respuesta a cada péptido. Cuando la cantidad de IFN-Ȗ producida por las PBMC estimuladas por el péptido en respuesta al péptido correspondiente fue dos veces superior
o más a la cantidad producida en respuesta al péptido control VIH, el péptido analizado se consideró positivo.
Estos resultados mostraron que el precursor de LCT se produce en pacientes de cáncer de tipo HLA-A2 y HLA-A24, así como en donantes sanos (Tabla 9). En la tabla, los pacientes A, B, y C son pacientes de tipo HLA-A24; y el paciente D es un paciente de tipo HLA-A02. Los pacientes A y D son pacientes con cáncer de colon; y los pacientes B y C son pacientes con melanoma. CMV se refiere a los péptidos derivados de citomegalovirus utilizados como control positivo. Los péptidos con alta afinidad de unión por A-24 se describen en Kuzushima, K. et al., Blood 2001, 98 (6): p1872-1881, y similares; y los péptidos con alta afinidad de unión por A-2 se describen en Solache, A. et al.,
J. of Immunol. 1999, 163 (10); p5512-5518, y similares.
Tabla 9 precursor de LCT derivados de pacientes con cáncer PACIENTE A PACIENTE B PACIENTE C PACIENTE D
POZOS POZOS POZOS POZOS POZOS POZOS POZOS POZOS POSITIVOS TOTALES POSITIVOS TOTALES POSITIVOS TOTALES POSITIVOS TOTALES
CMV 1 32 1 24 0 16: CMV 5 20 KDR 169 12 32 4 32 1 24 KDR 190 3 24 KDR 189 3 32 1 32 0 24 KDR 772 3 24 KDR 220 0 32 3 32 0 24 KDR 773 1 24 KDR 826 11 32 3 32 0 24 KDR 775 2 24 KDR 1318 0 32 9 32 1 24 KDR 1328 0 24
Como para el Ejemplo 14 y similares, se realizó un ensayo estándar de liberación de 51Cr durante cuatro horas para establecer líneas de LCT de los precursores de LCT (Fig. 32).
Aplicabilidad Industrial
La presente invención proporciona péptidos para su utilización en el tratamiento o prevención de tumores, que inducen linfocitos T citotóxicos localizando las células endoteliales formadas en un amplio rango de tejidos tumorales, y que son extremadamente efectivos como vacunas contra el cáncer. La presente invención también proporciona fármacos para tratar y prevenir tumores, en los que los fármacos comprenden estos péptidos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Oncotherapy Science, Inc.
<120> PÉPTIDOS KDR Y VACUNAS QUE LOS CONTIENEN
<130> L1360 EP/2 S3
<150> EP 03795432.8
<151> 2003-09-12
<150>
JP 2002-267285<151> 2002-09-12
<150>
JP 2003-062003<151> 2003-03-07
<150>
JP 2003-167042<151> 2003-06-11
<160> 56
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10 <210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> fuente
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 13
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> fuente
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 14
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> fuente
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 15 <210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> fuente
<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético
<400> 16
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> fuente
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un nonapéptido o decapéptido seleccionado de los péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 30, 29, 33, 34, 40, 46 o 54 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores.
  2. 2.
    Un nonapéptido seleccionado de los péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 2, 3, 5, 11 o 12 para utilizar en el tratamiento o prevención de tumores.
  3. 3. Una composición farmacéutica para utilizar en el tratamiento y/o prevención de tumores, en el que la composición 10 farmacéutica comprende uno o más péptidos definidos en las reivindicaciones 1 o 2.
  4. 4. Una vacuna para su uso en el tratamiento o prevención de tumores, en el que la vacuna comprende un péptido definido en las reivindicaciones 1 a 2 como un ingrediente activo.
    15 5. La vacuna de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento o prevención de tumores, que se utiliza para su administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24.
  5. 6. La vacuna de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento o prevención de tumores, que se utiliza para suprimir el crecimiento y/o metástasis de tumores malignos.
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