WO2016129335A1 - 免疫細胞療法のためのペプチドスクリーニング方法 - Google Patents
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- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Definitions
- the present invention relates to a peptide screening method for immune cell therapy and the like.
- Immune cell therapy is a therapeutic method using self-immune cells that are attracting attention as the fourth cancer treatment following the three major treatments for cancer such as surgical treatment, chemotherapy and radiation treatment.
- Cytotoxic T Lymphocytes which are one type of immune cells, have cytotoxic activity when activated. More specifically, naive T cell receptors without cytotoxic activity recognize an antigenic peptide that is a foreign substance for cells bound to human leukocyte antigen (HLA), and at the same time from a costimulatory molecule Thus, naive T cells become CTLs having specific cytotoxic activity against cells expressing the antigen, and attack cells expressing the antigen.
- HLA human leukocyte antigen
- a peptide derived from a tumor associated antigen is singly administered and presented to dendritic cells in the body, or dendritic cells presenting a tumor associated antigen derived peptide are prepared in vitro.
- TAA tumor associated antigen
- the tumor-associated antigen-derived peptide is recognized as a foreign substance, and naive T cells become CTLs having specific cytotoxic activity against cancer cells expressing the tumor-associated antigen. Cancer can be treated by attacking cancer cells in which this CTL expresses a tumor-associated antigen.
- Non-patent Document 1 In order to induce and activate antigen-specific CTL using a tumor-associated antigen-derived peptide, usually, the HLA type of each cancer patient is examined, and a tumor-associated antigen derived capable of binding to that HLA type is derived It is believed that it is necessary to select a peptide (Patent Documents 1 and 2). Recently, an algorithm can be used to predict HLA class I binding peptide sequences, and HLA molecule binding peptides can be shown from search sites such as BIMAS and SYFPEITHI. However, the predicted epitope peptide is not always correct (Non-patent Document 1).
- Non-patent Document 2 Since HLA has been evolved by mutation of gene exchange between alleles, antigenic epitopes among HLA-A, B and C have many similarities, and a common amino acid sequence is concentrated around the position where peptide is received. It is known to exist (non-patent document 2). Therefore, peptides designed to conform to each HLA-A type do not necessarily have a one-to-one correspondence, and screening of tumor-related antigen-derived peptides still has many problems. On the other hand, cancer cells may develop resistance to molecular target drugs for cancer, which is considered to be due to changes in target antigens (Non-patent Documents 3 and 4).
- this invention makes it a subject to provide the screening method for selecting the tumor related antigen origin peptide suitable for a patient.
- the present inventors have invented a method of screening a tumor-associated antigen-derived peptide using unnecessary floating cells generated in the early stage of dendritic cell culture.
- the mature dendritic cells stimulated by the tumor-associated antigen-derived peptide selected by the screening method according to the present invention are referred to as "variable molecule-targeted dendritic cells”.
- a screening method for selecting n tumor associated antigen-derived peptides used for stimulation of dendritic cells for administration to patients in immunocell therapy (where n represents an integer of 1 or more), Separating mononuclear cells derived from the patient into adherent cells and floating cells; Selecting a tumor-associated antigen-derived peptide using floating cells; Screening methods including; [2] The step of selecting a tumor-associated antigen-derived peptide The screening method according to the above-mentioned [1], wherein each tumor-associated antigen-derived peptide candidate is brought into contact with floating cells and incubated, and the n tumor-associated antigen-derived peptides are selected from the one with the highest growth rate of floating cells; [3] The step of selecting n tumor-associated antigen-derived peptides from the one with the highest growth rate of floating cells is selected as described in the above [2], such that all n peptides are derived from different tumor-associated antigens Screening method; [
- a method for producing a composition comprising dendritic cells for administration to a patient in immunocell therapy which comprises: Differentiating adherent cells into immature dendritic cells; Contacting the immature dendritic cells with the tumor-associated antigen-derived peptide selected by the screening method described in [1] to [5] above to differentiate them into mature dendritic cells; Manufacturing method including; [7] The method for producing the composition according to [6] above, wherein the step of differentiating adherent cells into immature dendritic cells is performed by adding IL-4 and GM-CSF to a medium; [8] The composition according to [6] or [7] above, wherein the step of differentiating immature dendritic cells into mature dendritic cells is performed by adding a tumor associated antigen-derived peptide and OK-432 to a
- a tumor-associated antigen-derived peptide suitable for each patient by screening using unnecessary floating cells generated in dendritic cell culture Since they can be selected, by stimulating dendritic cells with such tumor-associated antigen-derived peptides, compositions for use in immune cell therapy can be efficiently obtained. In addition, when the patient-derived cancer cells develop resistance, appropriate peptides can be reselected by screening again. In addition, according to the screening method for selecting a tumor-associated antigen-derived peptide according to the present invention, it is possible to search for a tumor-associated antigen-derived peptide independent of HLA-A type. Among the options listed above, compositions comprising dendritic cells presenting tumor-associated antigen-derived peptides suitable for the patient can be obtained.
- FIG. 1 is a conceptual view showing an embodiment of the present invention before it is used for immunocell therapy.
- FIG. 2 is a graph showing the combined therapeutic results of dendritic cells (variable molecular target dendritic cells) to which a tumor-associated antigen-derived peptide selected according to the method of the present invention has been added and activated lymphocytes.
- FIG. 3 shows the combined therapeutic results (a) of dendritic cells (variable molecular target dendritic cells) added with a tumor-associated antigen-derived peptide selected according to the method of the present invention and activated lymphocytes (a), and dendritic cells It is an image which shows the monotherapy result (b).
- the screening method according to the present invention is a screening method for selecting n tumor associated antigen-derived peptides to be used to stimulate dendritic cells for administration to patients in immunocell therapy (n is one or more). 1), as shown in FIG. 1, separating the mononuclear cells derived from the patient into adherent cells and floating cells, selecting the tumor-related antigen-derived peptide using the floating cells, and ,including.
- a tumor-associated antigen refers to a protein specifically expressed in cancer cells or a protein having a significantly higher expression in cancer cells than normal cells, for example, CEA (Carcinoembryonic Antigen), PSA (Prostate Specific) Antigen), EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), Her2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2), hTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), MAGE (Melanoma Associated Antigen), MUC1 (Mucin 1), and WT1 (Wilms Tumor 1) Etc.
- CEA Carcinoembryonic Antigen
- PSA Prostate Specific Antigen
- EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
- Her2 Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2
- hTERT Human Telomerase Reverse Transcriptase
- MAGE Melanoma Associated Antigen
- MUC1 Monoma Associated Antigen
- WT1 Wimor 1 Etc.
- proteins associated with tumor angiogenesis such as VEGFR1 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1) and VEGFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) may also be included in the tumor-associated antigen.
- VEGFR1 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1
- VEGFR2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
- a tumor-associated antigen-derived peptide refers to a peptide having 8 to 12 amino acids, which is a part of a tumor-associated antigen, and an analog thereof.
- the number of amino acids may be 8, 9, 10, 11, or 12.
- the tumor-associated antigen-derived peptide candidate and the tumor-associated antigen-derived peptide may be commercially available ones, or based on an HLA type, an amino acid sequence of a tumor-associated antigen, etc., using a computer program such as BIMAS, SYFPEITHI, etc. It is also possible to use one that is designed and synthesized.
- a plurality of peptides having different amino acid sequences derived from one type of tumor-associated antigen may be used as the tumor-associated antigen-derived peptide. Multiple peptides derived from tumor associated antigens may be used.
- An analog of a peptide having 8 to 12 amino acids, which is a part of a tumor-associated antigen, means one or several one or more at one or both ends or inside of the peptide without substantially changing the functional properties of the peptide
- the term “several” refers to two or three.
- the tumor-associated antigen-derived peptide has at one or both ends one or more amino acids attached for the purpose related to production, purification, stabilization, binding, detection or the like of the peptide. May be As used herein, "amino acid” is used in its broadest sense and includes artificial amino acid variants and derivatives in addition to naturally occurring amino acids.
- amino acids may also be indicated in conventional one-letter or three-letter notation.
- amino acids or derivatives thereof include naturally occurring proteinaceous L-amino acids; non-naturally occurring amino acids; chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids, and the like.
- non-natural amino acids include ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids (such as ⁇ -methylalanine), N-alkyl- ⁇ -amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ - ⁇ , which are different in main chain structure from natural types.
- Non-limiting examples include amino acids (such as cysteic acid) in which the carboxylic acid functional group is substituted with a sulfonic acid group.
- dendritic cell refers to an antigen-presenting cell having a dendritic form in a mature state and having the ability to present an antigenic peptide to MHC class I and / or class II to activate T cells.
- Human MHC is human leukocyte antigen (HLA: Human Leukocyte Antigen).
- dendritic cells stimulated with a tumor-associated antigen-derived peptide refer to dendritic cells in which any reaction is caused in the cell by contacting the tumor-associated antigen-derived peptide, for example, the tumor-associated antigen Dendritic cells presenting a derived peptide and / or dendritic cells differentiated to a mature state.
- a patient is a mammal, including a human, in need of treatment or prevention of cancer.
- Treatment or prevention of cancer includes at least reduction in tumor size (delay or arrest), inhibition of tumor metastasis, inhibition of tumor growth (delay or arrest), and alleviation of one or more symptoms associated with cancer. It means to make one happen.
- the cancer targeted by the composition according to the present invention includes lung cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, cholangiocarcinoma, uterine cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, malignant
- lung cancer gastric cancer, colon cancer, liver cancer, cholangiocarcinoma, uterine cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, malignant
- lung cancer gastric cancer, colon cancer, liver cancer, cholangiocarcinoma, uterine cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, prostate cancer, bladder cancer, sarcoma, malignant
- lymphoma laryngeal cancer
- laryngeal cancer cancerous pleurisy and peritonitis
- bone metastases and metastatic cancer include, but are not limited to, lymphom
- n represents an integer of 1 or more, and may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6 or more.
- a mononuclear cell is a cell population containing monocytes and lymphocytes (T cells, NK cells, NKT cells, and B cells), and granulocytes, red blood cells, And platelets etc. mean a substantially eliminated cell population.
- Mononuclear cells can be obtained from a sample collected from a patient by a known method such as specific gravity centrifugation. Examples of samples collected from patients include peripheral blood, bone marrow fluid, cord blood and the like.
- the step of separating mononuclear cells into adherent cells and floating cells can be performed according to a conventional method such as a cell adhesion method.
- a cell adhesion method For example, mononuclear cells are resuspended in a culture medium, seeded on a culture dish and incubated, and then the supernatant of the dish is collected. At this time, cells adhering to the culture surface of the dish are treated as adherent cells, and are collected together with the supernatant of the dish, cells not adhering to the culture surface of the dish and weakly adherent from the culture surface when collected. Cells of the sex are suspended cells.
- the separated adherent cells can be used in the step of differentiating into immature dendritic cells described later.
- isolated floating cells can be used in the step of selecting a tumor-associated antigen-derived peptide.
- the medium for the cells in the present specification is not particularly limited.
- Eagle's minimal essential medium MEM medium
- Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM medium
- Iscove's modified Dulbecco's medium RPMI-1640 medium
- MEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
- IMDM medium Iscove's modified Dulbecco's medium
- RPMI-1640 medium ⁇ - Commercially available media used for cell culture such as MEM media, F-12 media, and AIM-V media
- serum such as bovine serum, fetal bovine serum, and human serum
- various additives may be added to the medium as necessary.
- the step of selecting a tumor-associated antigen-derived peptide using suspended cells in the present specification includes a step of contacting and incubating each tumor-associated antigen-derived peptide candidate with suspended cells derived from mononuclear cells.
- the step of contacting and incubating each tumor-associated antigen-derived peptide candidate with floating cells includes culturing in a medium containing the tumor-associated antigen-derived peptide candidate, and, for example, plates the tumor-associated antigen-derived peptide candidate And immobilizing cells on the carrier, and adding a floating cell thereto, or a method of adding a tumor associated antigen-derived peptide candidate to a plate containing the floating cell.
- concentration of the tumor-associated antigen-derived peptide candidate, the incubation time and temperature, and the conditions for culturing and recovering floating cells are appropriately selected by those skilled in the art.
- Selection of a tumor-associated antigen-derived peptide herein is carried out, for example, by measuring the proliferation rate or viability of floating cells after the above-mentioned incubation, and selecting a tumor-associated antigen-derived peptide having a higher proliferation rate or survival rate. be able to.
- the toxicity of the tumor-associated antigen-derived peptide candidate to floating cells may be measured, and peptides with lower toxicity may be selected.
- the affinity between floating cells and a tumor-associated antigen-derived peptide may be measured, and a peptide with higher affinity may be selected.
- the expression level of a specific gene in floating cells may be measured, and peptides in which the expression of the specific gene is enhanced and / or reduced may be selected.
- the proliferation rate of floating cells is measured to select a tumor-associated antigen-derived peptide
- the proliferation rate is determined by the number of living cells cultured in a medium not containing a tumor-associated antigen-derived peptide candidate and the tumor-associated antigen-derived peptide candidate And the number of living cells cultured in a medium containing
- the method of measuring the number of viable cells is not particularly limited, but methods such as colorimetric method, colony forming method, crystal violet method, [ 3 H] thymidine incorporation method, MTT method, and WST method may be used.
- the step of selecting a tumor-associated antigen-derived peptide candidate in the present specification includes selecting n tumor-associated antigen-derived peptides from the one with the highest growth rate of floating cells. A plurality of peptides derived from the same tumor associated antigen may be included in n.
- the step of selecting n tumor-associated antigen-derived peptides from the one with the highest growth rate of floating cells in the present specification includes selecting all n peptides to be derived from different tumor-associated antigens. For example, the case where two peptides are selected is shown below. First, the peptide with the highest proliferation rate is selected as the first peptide. Next, when the first peptide was a peptide derived from tumor associated antigen A, the second peptide had the highest growth rate among peptides derived from tumor associated antigens other than tumor associated antigen A Select the peptide. Next, the case of selecting 3 peptides is shown below. First, the peptide with the highest proliferation rate is selected as the first peptide.
- the second peptide is the peptide having the highest growth rate among peptides derived from tumor-associated antigens other than tumor-associated antigen A
- the third peptide is the peptide having the highest growth rate among the peptides derived from tumor-associated antigens other than tumor-associated antigens A and B.
- the patient has already been administered dendritic cells stimulated with the tumor-associated antigen-derived peptide, and
- the step of selecting a tumor-associated antigen-derived peptide from the one with a high growth rate includes at least one different from the previously administered tumor-associated antigen-derived peptide.
- the patient has already been administered dendritic cells stimulated with tumor-associated antigen-derived peptides X and Y to select to include at least one different from the previously administered tumor-associated antigen-derived peptide.
- the newly selected peptide includes selecting to include a tumor-associated antigen-derived peptide different from the previously administered tumor-associated antigen-derived peptides X and Y by at least one.
- the number of peptides to be selected is not particularly limited.
- the dendritic cells stimulated with a tumor-associated antigen-derived peptide have been used once or twice. Including cases where it has been administered three, four, five or more times.
- the first tumor and the second administration use dendritic cells stimulated with the same tumor-associated antigen peptide.
- dendritic cells which have been newly stimulated with a tumor-associated antigen-derived peptide may be used, using mononuclear cells newly obtained from the patient.
- the first and second doses may be given for a fixed period of time. This period can be selected as appropriate by those skilled in the art in consideration of the patient's condition, desire, therapeutic effect, etc
- the method for producing a composition containing dendritic cells for administering to a patient in the immune cell therapy according to the present invention differentiates adherent cells into immature dendritic cells. And D. contacting the immature dendritic cells with the tumor associated antigen derived peptide selected by the screening method for selecting a tumor associated antigen peptide, and differentiating them into mature dendritic cells. .
- the immature dendritic cells herein can be obtained by stimulating adherent cells separated from mononuclear cells with a cytokine or the like.
- Cytokines that induce immature dendritic cells include, but are not limited to, for example, GM-CSF, IL-4, SCF, IL-13, TNF- ⁇ , IL-1, IL-2, IL-3 Be Cytokines and the like may be added to the cell culture medium.
- Dendritic cells in the present specification can be obtained by stimulating immature dendritic cells with a cytokine or the like.
- cytokines that induce dendritic cells include, but are not limited to, for example, OK-432 (picibanil etc.), GM-CSF, IL-1, IL-4, IL-6, SCF, IL-13, PGE2, TNF- ⁇ , IL-2, IL-3 can be mentioned.
- Cytokines and the like may be added to the cell culture medium.
- Dendritic cells as used herein, unless otherwise indicated, refer to mature dendritic cells.
- mature dendritic cells refer to dendritic cells that are more differentiated than immature cells and have high T cell activation ability.
- contacting immature dendritic cells with a tumor-associated antigen-derived peptide includes incorporating a tumor-associated antigen-derived peptide that is an antigen into immature dendritic cells.
- the means for incorporation may be carried out by a known method, and examples thereof include co-culture method and electroporation method.
- the co-culture method is a method in which a tumor-associated antigen-derived peptide is taken up by the phagocytic function of immature dendritic cells.
- the tumor-associated antigen-derived peptide can be incorporated into the immature dendritic cells by suspending the tumor-associated antigen-derived peptide and the immature dendritic cells in the same container and culturing them for a certain period of time or longer.
- administration includes administration to a patient by methods known to those skilled in the art.
- it may be direct administration to the affected site, may be intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, as well as direct injection to lymph nodes.
- the dose varies depending on the disease, physical size, age, sex, condition of the patient, purpose of administration, administration method and the like, but can be appropriately determined by those skilled in the art.
- compositions herein include, for example, sterile water and saline, vegetable oils, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders, immunostimulants, and A pharmaceutically acceptable carrier or solvent such as an adjuvant can be included.
- the mononuclear cell fraction is collected from peripheral blood by specific gravity centrifugation using Ficoll solution, and the cells are seeded at a concentration of 1.0-1.3 ⁇ 10 6 cells / mL. did.
- the culture vessel was incubated for 30 minutes or more, adherent cells were confirmed, and then the supernatant containing floating cells was collected, and the medium for adherent cells was changed to a medium containing GM-CSF and IL-4 (10% autologous plasma).
- Tumor-Associated Antigen-Derived Peptide The supernatant containing floating cells of the above (2) was centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). The cell pellet was confirmed and the supernatant was discarded. To this, AIM-V containing IL-2 (175 IU / mL) is added, and in advance, tumor-related antigen-derived peptide candidates, 2 types of VEGFR1 (SEQ ID NO: 1 and 2), 4 types of VEGFR2 (SEQ ID NO: 3-6) , 4 types of Her2 (SEQ ID NO: 7-10), 3 types of EGFR (SEQ ID NO: 11-13), and 3 types of hTERT (SEQ ID NO: 14-16), each in a 96-well plate coated with 5 ⁇ g , 100 ⁇ L (1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells) / well was dispensed.
- VEGFR1 SEQ ID NO: 1 and 2
- 4 types of VEGFR2 SEQ ID NO: 3-6
- the number of cells of wells to which each peptide was dispensed was calculated by the method of 3., and three or four types of tumor-associated antigen-derived peptides were selected for each patient (Table 2, second round). Then, above 2.
- Dendritic cells stimulated with a tumor-associated antigen-derived peptide were administered to the patient by the method of After a certain period of time has passed since the second administration of dendritic cells, mononuclear cell fractions were collected again from the peripheral blood of the same patient. Above 1.
- the number of cells in wells to which each peptide was dispensed was calculated according to the method described above, and 3 or 4 types of tumor-associated antigen-derived peptides were selected for each patient (tables 2 and 3). Then, above 2.
- Dendritic cells stimulated with a tumor-associated antigen-derived peptide were administered to the patient by the method of As shown in Table 2, the reactivity between the patient-derived floating cells and each peptide was not the same every time, and the combination of peptides selected was different. Therefore, using this method, it is possible to avoid therapeutic resistance due to immune escape caused by long-term use of the same peptide.
- the effect of the peptide selected by the screening method on the number of recovered cells The suspended cells of a healthy subject are used as described in 1. above. The number of cells in the wells into which each peptide was dispensed was calculated by the method described above, and the tumor associated antigen-derived peptide (circle) with the largest numerical value and the peptide (triangle square) with the lowest numerical value were selected (Table 3) ). Then, above 2. The number of final recovered cells of dendritic cells stimulated with the tumor-associated antigen-derived peptide was compared by the method described in the following. Dendritic cells to which the circled peptide was added were more final than dendritic cells to which the triangular peptide was added.
- the number of cells successfully recovered was large (Table 3).
- the tumor-associated antigen-derived peptide selected by the screening method according to the present invention screening
- the tumor-associated antigen-derived peptide conforming to HLA-A type is not screened.
- the dendritic cells were stimulated without screening
- the number of dendritic cells finally recovered was compared, but there was no significant difference, but there was a tendency for a large number in the screening group (data not shown). display).
- the present invention can greatly contribute not only to treatment resistance but also to the increase in the number of administered cells, which is one of the important problems in autologous dendritic cell therapy.
- the therapeutic results are shown in FIG. 3 (b) when dendritic cells (variable molecule-targeted dendritic cells) to which a tumor-associated antigen-derived peptide selected according to the method of the present invention was added alone were administered without combination therapy.
- Activated lymphocytes include PBMCs derived from patients, AIM-V containing IL-2 (175 IU / mL) and KBM medium (Cordin Bio), which is a culture medium for expanding lymphocytes, and A Lys medium (Nipro) 2 They are cultured weekly, and those grown to 1.2 ⁇ 10 10 or more are dissolved in 100 mL of physiological saline and filled in a drip bag.
- the day of administration of dendritic cells is indicated by a triangle, and the day of administration of lymphocytes is indicated by a circle.
- VEGFR1 SEQ ID NO: 2
- VEGFR2 SEQ ID NO: 6
- Her2 SEQ ID NO: 10
- EGFR SEQ ID NO: 12
- a decrease in the tumor marker CA19-9 was observed 4 weeks after the initiation of treatment.
- peptides of VEGFR2 SEQ ID NO: 6
- Her2 SEQ ID NO: 7
- EGFR SEQ ID NO: 11
- hTERT SEQ ID NO: 14
- VEGFR1 SEQ ID NO: 1
- VEGFR2 SEQ ID NO: 6
- Her2 SEQ ID NO: 7
- EGFR SEQ ID NO: 11
- the first administration is VEGFR1 (SEQ ID NO: 1), VEGFR2 (SEQ ID NO: 4), Her2 (SEQ ID NO: 7), EGFR (SEQ ID NO: 13), and the second administration is VEGFR1 (SEQ ID NO: 1) , VEGFR2 (SEQ ID NO: 6), Her2 (SEQ ID NO: 10), hTERT (SEQ ID NO: 15), for the third administration, VEGFR1 (SEQ ID NO: 2), VEGFR2 (SEQ ID NO: 4), Her2 (SEQ ID NO: : 9) and hTERT (SEQ ID NO: 15) were selected.
- the CT image of the third day after administration of the third dose confirmed that the tumor had almost disappeared (FIG. 3, b).
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Abstract
本発明は、患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法を提供すること等を目的とする。本発明は、樹状細胞培養初期の過程で生じる不要な浮遊細胞を用いて腫瘍関連抗原由来ペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
Description
本発明は、免疫細胞療法のためのペプチドスクリーニング方法等に関する。
免疫細胞療法は、外科治療、化学治療、及び放射線治療といった癌の３大治療に続く第４の癌治療として注目を浴びている自己の免疫細胞を用いた治療法である。
免疫細胞の１種である細胞障害性Ｔリンパ球細胞（Cytotoxic T Lymphocyte；ＣＴＬ）は、活性化されると細胞障害活性を持つ。より具体的には、細胞傷害活性を持たないナイーブＴ細胞の受容体が、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；ＨＬＡ）に結合した細胞にとっての異物である抗原ペプチドを認識し、同時に共刺激分子からのシグナルが入ることで、ナイーブＴ細胞が当該抗原を発現する細胞に対する特異的な細胞傷害活性を持つＣＴＬとなり、当該抗原を発現する細胞を攻撃するようになる。
免疫細胞療法では、腫瘍関連抗原（Tumor Associated Antigen；ＴＡＡ）由来ペプチドを単体で投与して体内の樹状細胞に提示させるか、腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示した樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製して投与する。これにより、腫瘍関連抗原由来ペプチドは異物であると認識され、ナイーブＴ細胞が腫瘍関連抗原を発現する癌細胞に対する特異的な細胞傷害活性を持つＣＴＬとなる。このＣＴＬが腫瘍関連抗原を発現する癌細胞を攻撃することで、癌を治療することができる。
近年、腫瘍関連抗原は数多く報告されている。その一つ一つに抗原エピトープとなるペプチド候補が多数存在し、それぞれの患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することは非常に困難である。また、ナイーブＴ細胞を活性化するためには、腫瘍関連抗原由来ペプチドが樹状細胞のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及びＣ）と結合する必要がある。ＨＬＡ－Ａ～Ｃには、それぞれ数十種類の異なるアレルが存在し、ペプチド結合部位の分子構造が異なる。そのため、腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いて抗原特異的なＣＴＬを誘導し活性化するためには、通常、癌患者それぞれが有するＨＬＡ型を調べ、そのＨＬＡ型に結合することができる腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する必要があると考えられている（特許文献１、及び２）。最近では、アルゴリズムを用いて、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド配列を予想することができ、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ等の検索サイトよりＨＬＡ分子結合ペプチドを示すことができる。しかしながら、予想されたエピトープペプチドが必ずしも正しいわけではない（非特許文献１）。また、ＨＬＡはアリル間の遺伝子交換の変異で進化してきたため、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及びＣ間での抗原エピトープには類似点が多く、ペプチドを受容する位置周辺に集中して共通のアミノ酸配列が存在することが知られている（非特許文献２）。従って、各ＨＬＡ－Ａ型に適合するように設計したペプチドが１対１の対応をするとは限らず、腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニングには、依然として、多くの課題が残っている。一方、癌の分子標的薬に対しては、癌細胞が耐性を生じることがあり、これは標的抗原が変化するためと考えられている（非特許文献３、４）。免疫細胞療法においても同様であり、当初は効果が見られた腫瘍関連抗原由来ペプチドでも長期間使用し続けることにより、免疫原性が高いＴＡＡ程、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇが起こり、癌抗原の消失やＨＬＡの発現低下等、さらには免疫細胞自身も疲弊することによる免疫逃避を招く恐れがある（非特許文献５）。
Ｂａｃｈｉｎｓｋｙ ＭＭ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ.２００５ Ｍａｒ ２２；５：６
ＭＨＣ Ｖｏｌ．１８．Ｎｏ１ ３１－４６：公益財団法人ＨＬＡ研究所資料
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３３１（６０２４）：１５６５－１５７０
生化学，２０１３，８５（６）：４７５－４８３
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１８５：３７６８－３７７６
そこで本発明は、患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法を提供すること等を課題とする。
上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明者らは、樹状細胞培養初期の過程で生じる不要な浮遊細胞を用いて腫瘍関連抗原由来ペプチドをスクリーニングする方法を発明した。本発明に係るスクリーニング方法で選択した腫瘍関連抗原由来ペプチドによって刺激された成熟樹状細胞を「変動型分子標的樹状細胞」と呼ぶ。
すなわち、本発明は、
〔１〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、
患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法；
〔２〕腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択工程は、
各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、浮遊細胞とを接触させてインキュベートし、浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する、上記〔１〕に記載のスクリーニング方法；
〔３〕浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程は、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択する、上記〔２〕に記載のスクリーニング方法；
〔４〕患者が、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、
浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択する、上記〔２〕又は〔３〕に記載のスクリーニング方法；
〔５〕ｎは３又は４である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法；
〔６〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物の製造方法であって、
接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
未成熟樹状細胞を、上記〔１〕から〔５〕に記載のスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、
を含む製造方法；
〔７〕接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程は、ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを培地に添加することによって行う、上記〔６〕に記載の組成物の製造方法；
〔８〕未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化させる工程は、腫瘍関連抗原由来ペプチド及びＯＫ－４３２を培地に添加することによって行う、上記〔６〕又は〔７〕に記載の組成物の製造方法；
に、関する。
〔１〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、
患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法；
〔２〕腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択工程は、
各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、浮遊細胞とを接触させてインキュベートし、浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する、上記〔１〕に記載のスクリーニング方法；
〔３〕浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程は、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択する、上記〔２〕に記載のスクリーニング方法；
〔４〕患者が、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、
浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択する、上記〔２〕又は〔３〕に記載のスクリーニング方法；
〔５〕ｎは３又は４である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法；
〔６〕免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物の製造方法であって、
接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
未成熟樹状細胞を、上記〔１〕から〔５〕に記載のスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、
を含む製造方法；
〔７〕接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程は、ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを培地に添加することによって行う、上記〔６〕に記載の組成物の製造方法；
〔８〕未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化させる工程は、腫瘍関連抗原由来ペプチド及びＯＫ－４３２を培地に添加することによって行う、上記〔６〕又は〔７〕に記載の組成物の製造方法；
に、関する。
本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法によれば、樹状細胞培養中に生じる不要な浮遊細胞を用いてスクリーニングすることにより、それぞれの患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチド選択することができるので、かかる腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激することにより、免疫細胞療法に用いる組成物を効率的に得ることができる。また、患者由来癌細胞に耐性が生じた場合も、再度スクリーニングをすることで、適したペプチドを選択しなおすことができる。また、本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法によれば、ＨＬＡ-Ａ型に依存しない腫瘍関連抗原由来ペプチドの探索が可能となるので、より多くの腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択肢の中から患者に適した腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示する樹状細胞を含む組成物を得ることができる。
本発明に係るスクリーニング方法は、免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、図１に示すように、患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、を含む。
本明細書において腫瘍関連抗原とは、癌細胞に特異的に発現しているタンパク質、又は癌細胞において正常細胞より発現が有意に多いタンパク質をいい、例えば、ＣＥＡ（Carcinoembryonic Antigen）、ＰＳＡ（Prostate Specific Antigen）、ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）、Ｈｅｒ２（Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2）、ｈＴＥＲＴ（Human Telomerase Reverse Transcriptase）、ＭＡＧＥ（Melanoma Associated Antigen）、ＭＵＣ１（Mucin 1)、及びＷＴ１（Wilms Tumor 1）等が挙げられる。また、ＶＥＧＦＲ１（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1）、及びＶＥＧＦＲ２（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2）等の腫瘍血管新生に関与するタンパク質も腫瘍関連抗原に含んでもよい。
本明細書において腫瘍関連抗原由来ペプチドとは、腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８～１２のペプチド、及びその類似体をいう。アミノ酸数は、８個、９個、１０個、１１個、１２個のいずれであってもよい。
腫瘍関連抗原由来ペプチド候補及び腫瘍関連抗原由来ペプチドは、市販されているものを用いてもよいし、ＨＬＡ型や腫瘍関連抗原のアミノ酸配列等に基づき、例えば、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ等のコンピュータープログラムを用いて設計し、合成したものを用いることもできる。本発明に係る医薬組成物の製造方法においてｎ≧２の場合、腫瘍関連抗原由来ペプチドとして、１種類の腫瘍関連抗原に由来する、アミノ酸配列の異なる複数のペプチドを用いてもよく、それぞれ複数の腫瘍関連抗原に由来する複数のペプチドを用いてもよい。
腫瘍関連抗原の一部からなる、アミノ酸数８～１２のペプチドの類似体とは、そのペプチドの機能特性を実質的に変えることなく、ペプチドの一方若しくは両方の末端又は内部に、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたペプチドのエピトープをいう。数個とは、２個又は３個をいう。
腫瘍関連抗原由来ペプチドには、一方又は両方の末端に、そのペプチドの生成、精製、安定化、結合、又は検出等に関連する目的のために追加された１又は２以上のアミノ酸が結合していてもよい。
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書においてアミノ酸又はその誘導体としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。
腫瘍関連抗原由来ペプチドには、一方又は両方の末端に、そのペプチドの生成、精製、安定化、結合、又は検出等に関連する目的のために追加された１又は２以上のアミノ酸が結合していてもよい。
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書においてアミノ酸又はその誘導体としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において樹状細胞とは、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩに提示してＴ細胞を活性化する能力を持つ抗原提示細胞をいう。ヒトのＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ: Human Leukocyte Antigen）である。
本明細書において腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激された樹状細胞とは、腫瘍関連抗原由来ペプチドを接触させることによって細胞内において何らかの反応が引き起こされた樹状細胞をいい、例えば、当該腫瘍関連抗原由来ペプチドを提示した樹状細胞及び／又は成熟状態に分化した樹状細胞をいう。
本明細書において患者とは、癌の治療又は予防を必要とするヒトを含む哺乳類である。癌の治療又は予防とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及び癌と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせることをいう。
本発明に係る組成物が対象とする癌には、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆管癌、子宮癌、乳癌、すい臓癌、卵巣癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、悪性リンパ腫、咽頭癌、喉頭癌、癌性胸膜炎及び腹膜炎、並びに骨転移及び転移性癌が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書におけるｎ個は、１以上の整数を表し、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個以上であってもよい。
本明細書において単核球細胞(ＰＢＭＣ: Peripheral blood mononuclear cell)とは、単球やリンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＢ細胞）を含む細胞集団であり、顆粒球、赤血球、及び血小板などはほぼ除去された細胞集団を意味する。単核球細胞は、患者から採取した試料より比重遠心分離法等の公知の方法によって得ることができる。患者から採取した試料としては、末梢血、骨髄液、臍帯血等があげられる。
本明細書において単核球細胞を接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程は、細胞接着法等の常法に従って行うことができる。例えば、単核球細胞を培地に再懸濁し、培養用ディッシュに播種してインキュベートした後、ディッシュの上清を回収する。この際にディッシュの培養面に接着している細胞を接着細胞とし、ディッシュの上清と共に回収される、ディッシュの培養面に接着していない細胞及び回収の際に培養面からはがれてしまう弱接着性の細胞を浮遊細胞とする。
分離した接着細胞は、後述する未成熟樹状細胞に分化させる工程に用いることができる。また、分離した浮遊細胞は、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程に用いることができる。
本明細書における細胞の培地は、特に限定されず、例えば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、α－ＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、及びＡＩＭ－Ｖ培地等の細胞培養に使用されている市販の培地を用いることができる。培地には、必要に応じて、ウシ血清、ウシ胎児血清、及びヒト血清等の血清を添加することができる。また、培地には、必要に応じて、各種の添加剤を加えてもよい。
本明細書における浮遊細胞を用いて腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程には、各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、単核球由来の浮遊細胞とを接触させてインキュベートする工程を含む。各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、浮遊細胞とを接触させてインキュベートする工程には、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含む培地中で培養することを含み、例えば、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補をプレート等の担体に固相化して、これに浮遊細胞を添加する方法、または、浮遊細胞を含むプレートに腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を添加する方法等があげられる。腫瘍関連抗原由来ペプチド候補の濃度、インキュベーションの時間・温度、および浮遊細胞の培養および回収の条件などは、当業者により適宜選択される。
本明細書における腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択は、例えば、上記インキュベーションの後に浮遊細胞の増殖率又は生存率を測定し、増殖率又は生存率がより高い腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することによって行うことができる。あるいは、浮遊細胞に対する腫瘍関連抗原由来ペプチド候補の毒性を測定し、毒性がより低いペプチドを選択してもよい。浮遊細胞と腫瘍関連抗原由来ペプチドとの親和性を測定し、親和性がより高いペプチドを選択してもよい。浮遊細胞における特定の遺伝子の発現量を測定し、特定の遺伝子の発現が亢進及び／又は低下しているペプチドを選択してもよい。
浮遊細胞の増殖率を測定して腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択を行う場合、増殖率は、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含まない培地中で培養した生細胞の数と、腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を含む培地中で培養した生細胞の数とを比較して求めてもよい。
生細胞数の測定方法は特に限定されないが、比色法、コロニー形成法、クリスタルバイオレット法、［３Ｈ］チミジン取り込み法、ＭＴＴ法、及びＷＳＴ法等の方法を用いてもよい。
本明細書における腫瘍関連抗原由来ペプチド候補を選択する工程には、浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択することを含む。ｎ個の中には同じ腫瘍関連抗原由来のペプチドを複数個含めてもよい。
本明細書における浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程には、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択することを含む。例えば、２個のペプチドを選択する場合を以下に示す。まず、増殖率が最も高かったペプチドを１個目のペプチドとして選択する。次に、１個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ａ由来のペプチドであった場合、２個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチドの中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。次に、３個のペプチドを選択する場合を以下に示す。まず、増殖率が最も高かったペプチドを１個目のペプチドとして選択する。次に、１個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ａ由来のペプチドであった場合、２個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチド中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。２個目のペプチドが腫瘍関連抗原Ｂ由来のペプチドであった場合、３個目のペプチドは腫瘍関連抗原Ａ及びＢ以外の腫瘍関連抗原に由来するペプチドの中で、増殖率が最も高かったペプチドを選択する。
本発明に係る腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法の一態様では、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含む。
本明細書において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択するとは、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドＸ及びＹで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合である場合には、新たに選択するペプチドには、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドＸ及びＹと少なくとも１つ違う腫瘍関連抗原由来ペプチドを含むように選択することを含む。このとき選択するペプチドの数は特に限定されない。長期間同じペプチドを選択した樹状細胞を患者に投与し続けることにより、免疫細胞が疲弊し癌細胞の増殖を促進する場合があり、少なくとも１つ違うものを含めることで、これを抑制することができうる。
本明細書において、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合とは、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に１回、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上投与されたことがある場合を含む。
本明細書において、患者が腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を２回以上投与する場合、１回目の投与と２回目の投与では、同じ腫瘍関連抗原ペプチド刺激した樹状細胞を用いてもよいし、２回目の投与の際、患者から新たに得られた単核球細胞を用いて、改めて腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を用いてもよい。１回目と２回目の投与は、一定期間おいて行ってもよい。この期間は、患者の状態、希望、治療効果等を考慮し、当業者が適宜選択することができる
本発明に係る免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物（以下「本発明に係る組成物」という。）の製造方法は、接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、未成熟樹状細胞を、腫瘍関連抗原ペプチドを選択するためのスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、を含む製造方法を含む。
本明細書における未成熟樹状細胞は、単核球細胞から分離した接着細胞をサイトカイン等で刺激することにより得ることができる。未成熟樹状細胞を誘導するサイトカインとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＳＣＦ、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３が挙げられる。サイトカイン等は細胞の培地に添加すればよい。
本明細書における樹状細胞は、未成熟樹状細胞をサイトカイン等で刺激することにより得ることができる。樹状細胞を誘導するサイトカイン等としては、特に限定されないが、例えば、ＯＫ－４３２（ピシバニール等）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＩＬ－１３、ＰＧＥ２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－３が挙げられる。サイトカイン等は細胞の培地に添加すればよい。
本明細書における樹状細胞は、特に断りがない限り、成熟樹状細胞を意味する。ここで、成熟樹状細胞とは、未成熟細胞に比べて分化が進み、Ｔ細胞活性化能力が高い樹状細胞をいう。
本明細書において「未成熟樹状細胞を腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させる」とは、抗原である腫瘍関連抗原由来ペプチドを未成熟樹状細胞に取り込ませることを含む。取り込ませる手段は、公知の方法で行ってもよく、例えば、共培養法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
共培養法とは、未成熟樹状細胞が有する貪食機能により腫瘍関連抗原由来ペプチドを取り込ませる方法である。例えば、腫瘍関連抗原由来ペプチドと未成熟樹状細胞とを同一容器に懸濁して、一定時間以上培養することによって、未成熟樹状細胞に腫瘍関連抗原由来ペプチドを取り込ませることができる。
本明細書において「投与」とは、当業者に公知の方法で患者へ投与することを含む。例えば、罹患部位への直接投与であってもよく、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射、並びにリンパ節への直接注入であってもよい。投与量は、疾患、患者の体格、年齢、性別、症状、投与目的、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することができる。
本明細書における組成物には、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、免疫促進剤、及びアジュバント剤等の医薬上許容される担体又は溶媒などを含むことができる。
１．腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニング
（１）材料
培養用容器は、ディッシュ（培養面積５５ｃｍ２）またはフラスコ（培養面積２５ｃｍ２）を使用した。Ｆｉｃｏｌｌ溶液は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア）を使用した。サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－４をそれぞれ最終濃度５０ｎｇ/ｍＬで使用した。培地は、基礎培地ＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培地にピシバニール（ＯＫ－４３２）を５ＫＥ／２ｍＬの濃度で添加した。
（１）材料
培養用容器は、ディッシュ（培養面積５５ｃｍ２）またはフラスコ（培養面積２５ｃｍ２）を使用した。Ｆｉｃｏｌｌ溶液は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア）を使用した。サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－４をそれぞれ最終濃度５０ｎｇ/ｍＬで使用した。培地は、基礎培地ＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培地にピシバニール（ＯＫ－４３２）を５ＫＥ／２ｍＬの濃度で添加した。
（２）単核球細胞の分離
Ｆｉｃｏｌｌ溶液を用いた比重遠心法により、末梢血から単核球分画を採取し、１．０－１．３×１０６個/ｍＬの濃度で細胞を播種した。
培養容器を３０分以上インキュベートし、接着細胞を確認してから浮遊細胞を含む上清を回収し、接着細胞の培地はＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４含有培地（１０％自己血漿）へ交換した。
Ｆｉｃｏｌｌ溶液を用いた比重遠心法により、末梢血から単核球分画を採取し、１．０－１．３×１０６個/ｍＬの濃度で細胞を播種した。
培養容器を３０分以上インキュベートし、接着細胞を確認してから浮遊細胞を含む上清を回収し、接着細胞の培地はＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４含有培地（１０％自己血漿）へ交換した。
（３）腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択
上記（２）の浮遊細胞を含む上清を遠心（１２００ｒｐｍ、５分）した。細胞ペレットを確認し、上清を廃棄した。そこにＩＬ－２（１７５ＩＵ/ｍＬ）含有ＡＩＭ－Ｖを加え、予め腫瘍関連抗原由来ペプチド候補、ＶＥＧＦＲ１を２種類（配列番号：１及び２）、ＶＥＧＦＲ２を４種類（配列番号：３－６）、Ｈｅｒ２を４種類（配列番号：７－１０）、ＥＧＦＲを３種類（配列番号：１１－１３）、及びｈＴＥＲＴを３種類（配列番号：１４－１６）、それぞれ５μｇをコーティングした９６ウェルプレートに、１００μＬ（１×１０４～１×１０５ｃｅｌｌｓ）／ウェルずつ分注した。７２時間培養後にＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ２．０溶液（プロメガ）を５０μＬ／ウェル添加し、ルミノメーターで生細胞数を測定した。ペプチド非添加ウェルの細胞数を１としたときの、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算した。
様々なＨＬＡ-Ａ型をもつ癌患者１２名の結果を表１に示す。１以上の細胞数を示したウェルの腫瘍関連抗原由来ペプチドを、細胞増殖率が高いペプチドとして選択した。さらにその中より、数値が高く、腫瘍関連抗原の種類が重複しないように３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドを患者ごとに選択した（丸印）。
各ペプチドはＨＬＡ-Ａ型に適合するように設計されたが、ＨＬＡ-Ａ型が適合しなくても細胞増殖促進効果があることがわかった。
上記（２）の浮遊細胞を含む上清を遠心（１２００ｒｐｍ、５分）した。細胞ペレットを確認し、上清を廃棄した。そこにＩＬ－２（１７５ＩＵ/ｍＬ）含有ＡＩＭ－Ｖを加え、予め腫瘍関連抗原由来ペプチド候補、ＶＥＧＦＲ１を２種類（配列番号：１及び２）、ＶＥＧＦＲ２を４種類（配列番号：３－６）、Ｈｅｒ２を４種類（配列番号：７－１０）、ＥＧＦＲを３種類（配列番号：１１－１３）、及びｈＴＥＲＴを３種類（配列番号：１４－１６）、それぞれ５μｇをコーティングした９６ウェルプレートに、１００μＬ（１×１０４～１×１０５ｃｅｌｌｓ）／ウェルずつ分注した。７２時間培養後にＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ２．０溶液（プロメガ）を５０μＬ／ウェル添加し、ルミノメーターで生細胞数を測定した。ペプチド非添加ウェルの細胞数を１としたときの、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算した。
様々なＨＬＡ-Ａ型をもつ癌患者１２名の結果を表１に示す。１以上の細胞数を示したウェルの腫瘍関連抗原由来ペプチドを、細胞増殖率が高いペプチドとして選択した。さらにその中より、数値が高く、腫瘍関連抗原の種類が重複しないように３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドを患者ごとに選択した（丸印）。
各ペプチドはＨＬＡ-Ａ型に適合するように設計されたが、ＨＬＡ-Ａ型が適合しなくても細胞増殖促進効果があることがわかった。
[規則91に基づく訂正 08.06.2016]
２．樹状細胞への刺激
上記１．（２）の接着細胞は５日間－１０日間培養した後、ＯＫ－４３２を０．０５ＫＥ／ｍＬの濃度で添加し、さらに４８時間培養した。また、ＯＫ－４３２による成熟樹状細胞化刺激を行うのと同時に、上記１．（３）で選択した３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドをそれぞれの患者由来の接着細胞に１０～２０μｇ/ｍＬ添加した。
上記１．（２）の接着細胞は５日間－１０日間培養した後、ＯＫ－４３２を０．０５ＫＥ／ｍＬの濃度で添加し、さらに４８時間培養した。また、ＯＫ－４３２による成熟樹状細胞化刺激を行うのと同時に、上記１．（３）で選択した３又は４種類の腫瘍関連抗原由来ペプチドをそれぞれの患者由来の接着細胞に１０～２０μｇ/ｍＬ添加した。
３．腫瘍関連抗原由来ペプチドのスクリーニング及び樹状細胞の刺激
上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、１回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
樹状細胞を患者に投与してから一定の期間が経過した後、再度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、２回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
２回目の樹状細胞の投与から一定の期間が経過した後、再々度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、３回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
表２に示すように、患者由来の浮遊細胞と各ペプチドとの反応性は毎回同じ結果にはならず、選択するペプチドの組み合わせは異なるものとなった。従って、この方法を用いれば同じペプチドを長期間使用することによって生じる免疫逃避による治療抵抗性を回避することが可能となる。
上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、１回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
樹状細胞を患者に投与してから一定の期間が経過した後、再度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、２回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
２回目の樹状細胞の投与から一定の期間が経過した後、再々度同患者末梢血から単核球分画を採取した。上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、腫瘍関連抗原由来ペプチドを３又は４種類を患者ごとに選択した（表２、３回目）。その後、上記２．の方法により腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を患者に投与した。
表２に示すように、患者由来の浮遊細胞と各ペプチドとの反応性は毎回同じ結果にはならず、選択するペプチドの組み合わせは異なるものとなった。従って、この方法を用いれば同じペプチドを長期間使用することによって生じる免疫逃避による治療抵抗性を回避することが可能となる。
[規則91に基づく訂正 08.06.2016]
４．スクリーニング方法で選択したペプチドが及ぼす回収細胞数への効果
健常人被験者の浮遊細胞を用いて上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、数値が最大となった腫瘍関連抗原由来ペプチド（丸印）と最低となったペプチド（三角印）を選択した（表３）。その後、上記２．の方法により、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞の最終回収細胞数を比較したところ、丸印のペプチドを添加した樹状細胞の方が三角印のペプチドを添加した樹状細胞より最終的に回収できた細胞数が多かった（表３）。
また、本発明に係るスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングあり）と、スクリーニングを行わずにＨＬＡ－Ａ型に適合した腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングなし）とで、最終的に回収できた樹状細胞の細胞数を比較したところ、有意差はないものの、スクリーニングありの群で多い傾向が認められた（データ非表示）。
本発明は治療抵抗性のみならず、自己樹状細胞療法における重要な課題の一つである、投与細胞数の増加にも大いに貢献できるものである。
健常人被験者の浮遊細胞を用いて上記１．の方法により、それぞれのペプチドを分注したウェルの細胞数を計算し、数値が最大となった腫瘍関連抗原由来ペプチド（丸印）と最低となったペプチド（三角印）を選択した（表３）。その後、上記２．の方法により、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞の最終回収細胞数を比較したところ、丸印のペプチドを添加した樹状細胞の方が三角印のペプチドを添加した樹状細胞より最終的に回収できた細胞数が多かった（表３）。
また、本発明に係るスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングあり）と、スクリーニングを行わずにＨＬＡ－Ａ型に適合した腫瘍関連抗原由来ペプチドで樹状細胞を刺激した場合（スクリーニングなし）とで、最終的に回収できた樹状細胞の細胞数を比較したところ、有意差はないものの、スクリーニングありの群で多い傾向が認められた（データ非表示）。
本発明は治療抵抗性のみならず、自己樹状細胞療法における重要な課題の一つである、投与細胞数の増加にも大いに貢献できるものである。
[規則91に基づく訂正 08.06.2016]
[規則91に基づく訂正 08.06.2016]
５．本発明を用いた治療例
上記１－３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）と活性化リンパ球との併用治療成績を図２（ａ）、図２（ｂ）、および図３（ａ）に示す。また、上記１－３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）を併用療法を用いずに単独で投与した場合の治療成績を図３（ｂ）に示す。活性化リンパ球とは患者由来のＰＢＭＣをＩＬ－２（１７５ＩＵ/ｍＬ）含有のＡＩＭ－Ｖ及びリンパ球拡大培養用培地であるＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬyｓ培地（ニプロ）等を用いて２週間培養し、１．２×１０１０個以上まで増殖させたものを生理的食塩水１００ｍＬに溶解し、点滴バックに充填したものを指す。樹状細胞を投与した日を三角印、リンパ球を投与した日を丸印で示した。
症例１の肺がん患者では、２回の投与共に、ＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：９）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択した（図２、ａ）。治療開始から３週間後に腫瘍マーカーであるＳＣＣ（正常値２ｎｇ/ｍＬ以下）の低下と倦怠感および呼吸苦の改善がみられた。
症例２の膵臓がん患者では、前半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択し、後半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１２）のペプチドを選択した（図２、ｂ）。治療開始から４週間後に腫瘍マーカーであるＣＡ１９-９（正常値３７Ｕ/ｍＬ以下）の低下がみられた。
症例３の乳がん患者では、１回目の投与はＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１４）のペプチドを選択した。約１か月後の２回目投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）のペプチドを選択した。両治療日とも、活性化リンパ球を同時に投与した。２回目の治療日から１週間後のエコー画像により腫瘍径が約半分に縮小したことが確認された（図３、ａ）。
症例４の肺がん患者では、２週間ごとに、併用療法を用いずに、樹状細胞のみを３回投与した。１回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１３）を、２回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０)、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）、３回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：９)、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）のペプチドを選択した。３回目を投与した翌日のＣＴの画像により、腫瘍がほぼ消失したことが確認された（図３、ｂ）。
５．本発明を用いた治療例
上記１－３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）と活性化リンパ球との併用治療成績を図２（ａ）、図２（ｂ）、および図３（ａ）に示す。また、上記１－３．の方法に従い選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドを添加した樹状細胞（変動型分子標的樹状細胞）を併用療法を用いずに単独で投与した場合の治療成績を図３（ｂ）に示す。活性化リンパ球とは患者由来のＰＢＭＣをＩＬ－２（１７５ＩＵ/ｍＬ）含有のＡＩＭ－Ｖ及びリンパ球拡大培養用培地であるＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬyｓ培地（ニプロ）等を用いて２週間培養し、１．２×１０１０個以上まで増殖させたものを生理的食塩水１００ｍＬに溶解し、点滴バックに充填したものを指す。樹状細胞を投与した日を三角印、リンパ球を投与した日を丸印で示した。
症例１の肺がん患者では、２回の投与共に、ＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：９）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択した（図２、ａ）。治療開始から３週間後に腫瘍マーカーであるＳＣＣ（正常値２ｎｇ/ｍＬ以下）の低下と倦怠感および呼吸苦の改善がみられた。
症例２の膵臓がん患者では、前半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１３）のペプチドを選択し、後半２回の投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０）、及びＥＧＦＲ（配列番号：１２）のペプチドを選択した（図２、ｂ）。治療開始から４週間後に腫瘍マーカーであるＣＡ１９-９（正常値３７Ｕ/ｍＬ以下）の低下がみられた。
症例３の乳がん患者では、１回目の投与はＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１４）のペプチドを選択した。約１か月後の２回目投与ではＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１１）のペプチドを選択した。両治療日とも、活性化リンパ球を同時に投与した。２回目の治療日から１週間後のエコー画像により腫瘍径が約半分に縮小したことが確認された（図３、ａ）。
症例４の肺がん患者では、２週間ごとに、併用療法を用いずに、樹状細胞のみを３回投与した。１回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：７）、ＥＧＦＲ（配列番号：１３）を、２回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：１）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：６）、Ｈｅｒ２（配列番号：１０)、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）、３回目の投与はＶＥＧＦＲ１（配列番号：２）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号：４）、Ｈｅｒ２（配列番号：９)、ｈＴＥＲＴ（配列番号：１５）のペプチドを選択した。３回目を投与した翌日のＣＴの画像により、腫瘍がほぼ消失したことが確認された（図３、ｂ）。
Claims (8)
- 免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞の刺激に使用するｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択するためのスクリーニング方法であって（ｎは１以上の整数を表す）、
前記患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
前記浮遊細胞を用いて、腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。 - 前記腫瘍関連抗原由来ペプチドの選択工程は、
各腫瘍関連抗原由来ペプチド候補と、前記浮遊細胞とを接触させてインキュベートし、前記浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。 - 前記浮遊細胞の増殖率が高い方からｎ個の腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程は、ｎ個のペプチドがすべて異なる腫瘍関連抗原に由来するように選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
- 前記患者が、腫瘍関連抗原由来ペプチドで刺激した樹状細胞を既に投与されたことがある場合であって、
前記浮遊細胞の増殖率が高い方から腫瘍関連抗原由来ペプチドを選択する工程において、前回投与された腫瘍関連抗原由来ペプチドと、少なくとも１つ違うものを含むように選択する、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。 - 前記ｎは３又は４である、請求項１から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
- 免疫細胞療法において患者に投与するための樹状細胞を含む組成物の製造方法であって、
前記患者に由来する単核球細胞を、接着細胞と浮遊細胞とに分離する工程と、
前記接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
前記未成熟樹状細胞を、請求項１から５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法で選択された腫瘍関連抗原由来ペプチドと接触させ、成熟樹状細胞に分化させる工程と、
を含む製造方法。 - 前記接着細胞を未成熟樹状細胞に分化させる工程は、ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを培地に添加することによって行う、請求項６に記載の組成物の製造方法。
- 前記未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化させる工程は、前記腫瘍関連抗原由来ペプチド及びＯＫ－４３２を培地に添加することによって行う、請求項６又は７に記載の組成物の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP2016574701A JP6604975B2 (ja) | 2015-02-09 | 2016-01-19 | 免疫細胞療法のためのペプチドスクリーニング方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2015-023473 | 2015-02-09 | ||
| JP2015023473 | 2015-02-09 |
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|---|---|
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| PCT/JP2016/051452 WO2016129335A1 (ja) | 2015-02-09 | 2016-01-19 | 免疫細胞療法のためのペプチドスクリーニング方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020101037A1 (ja) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | 株式会社Ｔｎｐパートナーズ | オーダーメイド医療基幹システム |
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| WO2004024766A1 (ja) * | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Oncotherapy Science, Inc. | Kdrペプチド及びこれを含むワクチン |
| JP2007522447A (ja) * | 2004-01-23 | 2007-08-09 | サノフィ パストゥール インコーポレイテッド | 細胞傷害性アッセイ |
| JP2007246451A (ja) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Keio Gijuku | 癌ワクチン |
-
2016
- 2016-01-19 WO PCT/JP2016/051452 patent/WO2016129335A1/ja active Application Filing
- 2016-01-19 JP JP2016574701A patent/JP6604975B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Title |
|---|
| LEE,T.V. ET AL.: "Secretion of CXC chemokine IP- 10 by peripheral blood mononuclear cells from healthy donors and breast cancer patients stimulated with HER-2 peptides", J INTERFERON CYTOKINE RES., vol. 20, no. 4, April 2000 (2000-04-01), pages 391 - 401 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020101037A1 (ja) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | 株式会社Ｔｎｐパートナーズ | オーダーメイド医療基幹システム |
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| Publication number | Publication date |
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