CN112402596A - 多肽组合物及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含衍生于选自Survivin、Her2、和CEA的多肽组合物。本发明提供一种包含该多肽组合物的药物组合物、免疫调节剂、疫苗、负载该多肽组合物的细胞、该细胞的制备方法、一种激活的T细胞与前述中的任一种或多种在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。本发明提供的多肽组合物衍生的肿瘤疫苗、DC疫苗、药物组合物等能够显著激活免疫效应细胞并提高其激活相关的细胞因子分泌水平和对肿瘤细胞的杀伤水平，具有潜在的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫学领域，具体地涉及多肽组合物及疫苗。
背景技术
近年来，通过外科手术结合放化疗治疗癌症取得了一些进展，提高了患者生存率，尤其是乳腺、肺、前列腺和肾脏扩散性癌症病人的生存率得以提高。然而，大多数这类治疗都具有显著的毒副作用，易伤害到正常的细胞。
肿瘤在机体内能引发体液免疫应答和细胞免疫应答。肿瘤抗原在细胞内加工成肽段后与细胞表面的主要组织相容性复合体I类分子结合并呈递给CD8+细胞毒性淋巴细胞，或先从肿瘤细胞上脱落，再由抗原提呈细胞摄取、加工成肽段后与表面主要组织相容性复合体II类分子结合并呈递给CD4+辅助性淋巴细胞，进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答。对抗肿瘤免疫及恶性肿瘤进展过程中遗传改变的认识的加深，使得人类能够开发更有选择性的安全治疗方法，采用通过激活免疫系统的方法以攻击正在发生的肿瘤，即肿瘤疫苗。根据肿瘤疫苗的具体用途，可以分为预防性疫苗和治疗性疫苗两类。预防性疫苗的主要功能为控制肿瘤的发生；治疗性疫苗以肿瘤相关抗原为基础，主要用于化疗后的辅助治疗。肿瘤疫苗中的一种为基于树突状细胞(DC)的疫苗。由于DC大量表达共刺激分子，并且具有既可有效地致敏CD4+辅助T细胞(T helper，Th)又可致敏CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic TLymphocyte，CTL)的能力，故DC细胞与B淋巴细胞与巨噬细胞不同。DC通过负载肿瘤抗原并诱导为成熟的DC,产生特异性抗肿瘤免疫应答。基于此，已经用DC开发出多种抗肿瘤疫苗，包括肿瘤抗原肽负载DC、肿瘤全细胞抗原负载DC、肿瘤细胞RNA负载DC、肿瘤细胞DNA负载DC、外泌体(exosome)负载DC、细胞因子、趋化因子基因修饰DC。目前DC疫苗已经在恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌等癌种当中进行了尝试，并部分取得了成功。各种形式的DC疫苗已在肿瘤的免疫治疗中开始尝试并在初步临床试用中显示出了良好的疗效。其中由美国Dendreon公司生产的DC疫苗Provenge在2010年被美国国家食品药品监督管理局批准上市，用于晚期尤其是对激素疗法失效的前列腺癌病人，疗效显示与安慰剂相比，其能够延长患者的生存时间超过4个月(Nature Medicine,2010,16(6):615.)。
当前大多数临床试验中仍然采用自体全肿瘤裂解液来负载DC，具体操作是将病人自身的肿瘤组织通过多次循环冻融进行裂解，以裂解液对DC细胞进行刺激(CancerImmunol Immunother,2006,55:819；Medical oncology,2006,23:273.)。冻融循环会诱导产生肿瘤细胞坏死，但冻融诱导的肿瘤细胞坏死并不具有免疫源性，甚至会抑制Toll样受体(TLR)诱导的DC细胞成熟及正常功能(Hatfeld P,Merrick AE,West E,O’Donnell D,Selby P,Vile R,et al.Optimization of dendritic cell loading with tumor celllysates for cancer immunotherapy.J Immunother(2008)31(7):620–32)，并且病人的肿瘤组织并非总是容易获得。肿瘤细胞裂解液，纯化的肿瘤相关抗原和肿瘤衍生mRNA也被证明可以用作负载DC的抗原来源。肿瘤细胞裂解液能够提供多种抗原供DC加载，并能诱导CD4+和CD8+T细胞应答和赋予DC不同的损伤相关分子模式(Damage-Associated MolecularPatterns，DAMP)以确保DC的成熟，但也会向DC提供免疫调节型细胞因子，诱导DC细胞发生耐受转化(Guida M,Pisconte S,Colucci G.Metastatic melanoma:the new era oftargeted therapy.Expert Opin Ther Targets 2012；16Suppl 2:S61-70)。纯化的肿瘤相关抗原负载DC能够激活抗原特异性T细胞应答，并诱导CD4+和CD8+T细胞应答，但单次使用的不同的抗原种类数量有限。肿瘤衍生mRNA可以转入肿瘤相关抗原和共刺激分子，保证I型MHC的抗原呈递，并且不需要交叉呈递(Robbins PF,Morgan RA,Feldman SA,Yang JC,Sherry RM,Dudley ME,Wunderlich JR,Nahvi AV,Helman LJ,Mackall CL,et al.Tumorregression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanomausing genetically engineered lymphocytesreactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol2011；29:917-24)，但不能诱导DC细胞成熟，也不能诱导有效的CD4+免疫应答，同时单次使用的不同的抗原种类数量也有限。
在肿瘤免疫中，肿瘤相关抗原的抗原表位的多肽片段与抗原呈递细胞如DC表面的HLA结合，形成HLA-肿瘤抗原表位肽复合物被TCR识别，进而被呈递给T细胞，使能够识别相应肿瘤抗原表位的T细胞被特异性激活并扩增。当使用肿瘤相关抗原中的多肽片段作为负载DC的抗原时，可以有效地增加单次使用时能够涉及到的抗原种类的数量，提高CD4+和CD8+T细胞的免疫应答水平，但需要先测定受试者的HLA单倍型，并在选定的肿瘤相关抗原中选取适当的肽段验证其是否能够与该HLA单倍型结合，在操作上较为繁琐。
HLA等位基因在不同种族人群中具有高度的多态性。根据世界卫生组织统计，截至2018年4月，I型HLA等位基因的数量已超过13000个，其中HLA-A等位基因4200个，HLA-B等位基因5091个，HLA-C等位基因3854个(http://www.hla.alleles.org/nomenclature/stats.html)。其中，亚洲人群常见的HLA分型多为HLA-A2、A3和A24(Experimental andTherapeutic Medicine,2011,2:109-117.)。HLA-A2、A11和A24三种分型能够覆盖超过中国人口的90％(Immunol Today,1996；17:261.)。HLA-A2属于HLA-A2超型，在中国人群中频率最高为45.9％，HLA-A11属于HLA-A3超型，在白种人(Caucasian)中频率最低，为37.5％，在中国人中频率最高，达52.7％；HLA-A24属于HLA-A24超型，在白种人中频率最低，为23.9％，在中国人中频率为40.1％，在日本人中频率最高，为58.6％(Curr Opinion In Immunol,1998,10:478-482；Immunogenetics,1999,50(3-4):201-212.)。目前针对各HLA分型都缺少包含能够有效被抗原呈递细胞呈递的免疫源性多肽组合物及包含这类多肽组合物的肿瘤疫苗。
发明内容
本发明针对HLA分型提供用于负载DC细胞的多肽组合物，该多肽组合物中包括针对HLA-A2分型的肿瘤相关抗原表位。具体地，本发明提供一种多肽组合物，其包含衍生于选自Survivin、Her2、和CEA中的一种或多种的分离的多肽，以及包含所述多肽组合物的细胞和疫苗。本发明的多肽组合物、包含该多肽组合物的细胞和疫苗能够有效诱导DC成熟，并能激活T细胞产生较高的肿瘤细胞杀伤活性，具有较大的抗肿瘤潜力。
本发明一方面提供一种多肽组合物，其包含一种或多种的分离的多肽，所述多肽选自Survivin蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体、Her2蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体、和CEA蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体。
在一个或多个实施方案中，所述Survivin蛋白的片段包含Survivin的抗原表位。
在一个或多个实施方案中，所述Survivin蛋白的片段的序列长度在50个氨基酸残基以内。
在一个或多个实施方案中，所述Survivin蛋白的片段包含SEQ ID NO:1所示序列或由SEQ ID NO:1所示序列组成。
在一个或多个实施方案中，所述Her2蛋白的片段是Her2蛋白的抗原表位。
在一个或多个实施方案中，所述Her2蛋白的片段的序列长度在50个氨基酸残基以内。
在一个或多个实施方案中，所述Her2蛋白的片段包含SEQ ID NO:2所示序列，或由SEQ ID NO:2所示序列组成。
在一个或多个实施方案中，所述CEA蛋白的片段是CEA蛋白的抗原表位。
在一个或多个实施方案中，所述CEA蛋白的片段的序列长度在50个氨基酸残基以内。
在一个或多个实施方案中，所述CEA蛋白的片段包含SEQ ID NO:3所示序列，或由SEQ ID NO:3所示序列组成。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含Survivin蛋白的片段和Her2蛋白的片段。在一个或多个实施方案中，Survivin蛋白的片段和Her2蛋白的片段的质量比为1:20～20:1，优选为1:10～10:1，更优选1:1。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含Survivin蛋白的片段和Her2蛋白的片段。在一个或多个实施方案中，Survivin蛋白的片段和Her2蛋白的片段的质量比为1:20～20:1，优选为1:10～10:1，更优选1:1。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段。在一个或多个实施方案中，Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段的质量比为1:20～20:1，优选为1:10～10:1，更优选1:1。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含Survivin蛋白的片段、Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段。在一个或多个实施方案中，Survivin蛋白的片段、Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段的质量比为(1～20):(1～20):(1～20)，优选(1～10):(1～10):(1～10)，更优选1:1:1。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物还包括免疫增强剂。在一个或多个实施方案中，所述免疫增强剂选自polyIC︰IL、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、铝盐、氢氧化铝纳米颗粒、前列腺素E2、干扰素和HB100-108多肽中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述免疫增强剂为HMGB1的B box区的长5-50个氨基酸残基的片段。在一个或多个实施方案中，所述免疫增强剂是含有SEQ ID NO:4所示序列的B Box区的片段或与该片段具有至少70％序列相同性的突变体。在一个或多个实施方案中，所述免疫增强剂包含HB100-108的片段。所述HB100-108的片段包含SEQ ID NO:4所示序列，或包含与SEQ ID NO:4具有至少70％相同性的突变体。在一个或多个实施方案中，所述HB100-108的片段由SEQ ID NO:4所示序列组成或由与SEQ ID NO:4具有至少70％相同性的突变体组成。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物中免疫增强剂与其他任一种多肽的质量比为1:20～20:1，优选1:10～10:1，更优选15:7。
在一个或多个实施方案中，本发明所述多肽可以任意顺序、任意组合连接。在一个或多个实施方案中，Survivin的片段与Her2的片段、CEA的片段和HB100-108的片段中的任一种或多种连接。在一个或多个实施方案中，多肽通过接头连接。所述接头选自(GS4)3、Furin2A肽和双精氨酸(RR)中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:1-3的分离的多肽中的任一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ IDNO:1的多肽和SEQ ID NO:2的多肽。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:1的多肽和SEQ ID NO:3的多肽。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:2的多肽和SEQ ID NO:3的多肽。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:1的多肽、SEQ ID NO:2的多肽和SEQ ID NO:3的多肽。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子和/或HLA II型分子。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子中的HLA-A2亚型分子。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物还包含序列为SEQ ID NO:4的多肽。
本发明另一方面还提供免疫调节剂，其包含本文所述多肽。
本发明另一方面还提供一种包含本文所述多肽的细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞负载所述多肽。
在一个或多个实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞表达I型和/或II型HLA。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞表达的HLA分型为HLA-A2。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞选自巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞为DC。
在一个或多个实施方案中，所述DC来源于PBMC中的单核细胞。在其他实施方案中，所述DC为人工构建的能够在体外永生化扩增和培养的DC细胞系或DC前体细胞系。
本发明另一方面提供一种负载多肽的细胞的制备方法，包括(1)使本文所述多肽组合物与细胞接触，进行抗原负载，获得细胞-多肽混合物；(2)任选使(1)中所述细胞-多肽混合物与细胞促成熟因子接触，和(3)获得负载所述多肽的细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞表达I型和/或II型HLA。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞表达的HLA分型为HLA-A2。
在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞选自巨噬细胞、B细胞和树突状细胞中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述抗原呈递细胞为DC。
在一个或多个实施方案中，所述DC来源于PBMC中的单核细胞。在其他实施方案中，所述DC为人工构建的能够在体外永生化扩增和培养的DC细胞系或DC前体细胞系。
在一个或多个实施方案中，所述细胞促成熟因子选自TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP，优选IFN-γ、poly(I:C)和R848。
在一个或多个实施方案中，(1)中所述接触包括持续3小时-48小时的共孵育，优选在20-50℃、2-10％CO2下进行，更优选在37℃、5％CO2下进行。
在一个或多个实施方案中，(2)中所述接触包括持续12小时-72小时的共孵育，优选在20-50℃、2-10％CO2下进行，更优选在37℃、5％CO2下进行。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含本文所述多肽、免疫调节剂和/或细胞。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物还包含辅剂和/或药学上可接受的盐。
本发明另一方面提供一种疫苗，其包含本文所述多肽和/或细胞。
在一个或多个实施方案中，所述疫苗是肿瘤疫苗。
本发明另一方面提供一种激活T细胞的方法，包括将本文的多肽、多肽组合物、药物组合物、免疫调节剂、细胞或疫苗与初始T细胞接触。
本发明另一方面提供将本文的多肽、多肽组合物、药物组合物、免疫调节剂、细胞或疫苗与初始T细胞接触后获得的活化的T细胞。
本发明另一方面提供一种在受试个体的体内引发免疫应答的方法，包括对受试个体施用本文所述的多肽或其组合物、药物组合物、免疫调节剂、负载本文所述多肽或多肽组合物的细胞、疫苗、和活化的T细胞。
本发明另一方面提供本文所述多肽或其组合物、药物组合物、免疫调节剂、负载本文所述多肽或多肽组合物的细胞、疫苗、和活化的T细胞中的一种或多种在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
本发明提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向癌症患者施用本文所述多肽或其组合物、药物组合物、免疫调节剂、负载有本文所述多肽或多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种。
附图说明
图1：由PBMC细胞分离DC细胞的收获细胞中的DC细胞占比。
图2：多肽或多肽组合物与DC细胞孵育后的细胞聚集显微照片。
图3：用多肽负载后，DC细胞吸收水平的荧光显微镜检测。
图4：用多肽组合物负载后，DC细胞吸收水平的荧光显微镜检测。
图5：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞吸收水平的定量检测。
图6：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞的I型HLA的定量检测。
图7：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞的II型HLA的定量检测。
图8：用多肽或多肽组合物负载后，表达CD80的DC细胞的定量柱状图。
图9：用多肽或多肽组合物负载后，表达CD86的DC细胞的定量柱状图。
图10：用多肽或多肽组合物负载后，表达CD83的DC细胞的定量柱状图。
图11：用多肽或多肽组合物负载后，表达CD40的DC细胞的定量柱状图。
图12：用多肽或多肽组合物负载后，表达CCR7的DC细胞的定量柱状图。
图13：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞的IL-6分泌水平。
图14：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞的TNF-α分泌水平。
图15：用多肽或多肽组合物负载后，DC细胞的IL-12分泌水平。
图16：由负载有多肽或多肽组合物的DC细胞诱导的CTL的IL-4的分泌水平。
图17：由负载有多肽或多肽组合物的DC细胞诱导的CTL的IL-6的分泌水平。
图18：由负载有多肽或多肽组合物的DC细胞诱导的CTL的TNF-α的分泌水平。
图19：由负载有多肽或多肽组合物的DC细胞诱导的CTL的IFN-γ的分泌水平。
图20：供体受试者1的DC-CTL的细胞毒性。
图21：供体受试者2的DC-CTL的细胞毒性。
具体实施方式
本发明所取得的积极效果在于：本发明提供的多肽组合物通过负载DC后呈递并激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)而达到对肿瘤细胞的靶向毒性作用。本发明的多肽组合物及其衍生的肿瘤疫苗、DC疫苗、药物组合物的抗原负载效率高，DC成熟水平高，能够引起强烈的免疫应答效果，激活免疫效应细胞，特别是T细胞，明显提高免疫效应细胞激活相关的细胞因子的分泌水平和对肿瘤细胞的杀伤水平，具有潜在的临床价值。
本发明提供用于负载DC细胞的多肽组合物，该多肽组合物中包括肿瘤相关抗原表位。在一个或多个实施方案中，多肽组合物包含衍生于选自Survivin、Her2和CEA中的一种或多种的分离的多肽。在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物中的分离的多肽与抗原呈递细胞相结合，可以用于引发免疫应答反应。所述多肽组合物可以作为对发生中的癌症进行预防和治疗的试剂对受试者施用。
本发明包括编码本发明所述氨基酸序列或多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。
本发明还提供包含本文所述多肽组合物的肿瘤疫苗。所述肿瘤疫苗能够在体内引发免疫应答。在一个或多个实施方案中，所述免疫应答是体液免疫应答。在其他实施方案中，所述免疫应答是细胞介导的免疫应答。
本发明还提供包含上述多肽组合物的DC疫苗。所述DC疫苗包含负载有上述多肽组合物中一条或多条分离的多肽的成熟DC。本发明提供制备所述DC疫苗的方法，包括用本文所述多肽接触未成熟的DC，使DC负载所述多肽中的一条或多条。负载本文所述多肽能够显著地使未成熟DC转化为成熟DC，进而获得包含负载有肿瘤抗原多肽表位的成熟DC和DC疫苗。
本发明提供一种在受试个体内引发免疫应答反应的方法，包括获取受试个体的PBMC，培养后分离获得单核细胞，诱导成为未成熟DC后使其负载本文所述多肽中的一条或多条，使DC成熟后将负载有上述多肽的DC回输至受试个体体内。特别地，本发明提供一种负载有上述多肽的DC。
本发明还提供一种激活的T细胞，所述激活的T细胞通过使T细胞与本文所述DC细胞或DC疫苗接触而被激活。
本发明提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向癌症患者施用本文所述多肽或其组合物、负载有本文所述多肽的细胞和疫苗中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述癌症患者的癌细胞表面表达水平升高的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原包含本文所述的分离的多肽所代表的抗原表位中的一种或多种。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。非如下另行定义，否则本文中的术语按照本领域通常所用的方式使用。
在本发明中，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非标准的氨基酸来进行的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
本文所述“衍生于……的多肽”表示蛋白或多肽的全长、片段、修饰物或突变体。本文所述“片段”在涉及多肽时可为保留全长蛋白或多肽的抗原性的任意长度的多肽。在一个或多个实施方案中，所述片段是全长蛋白的抗原表位。在一个或多个实施方案中，所述片段包含50、40、30个以内的氨基酸。例如，所述片段的长度可以是5-30个氨基酸、8-25个氨基酸、8-15个氨基酸或9-12个氨基酸，或有上述端点任意组合形成的范围，如9-15个氨基酸。在一个或多个实施方案中，所述片段的长度可以是9个氨基酸。
术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代使氨基酸序列发生变化但保留至少一种生物活性的肽或多肽。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的SEQ ID NO:1、2、3或3或本文所述的各片段)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性(如作为抗原表位)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的氨基酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的氨基酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
术语“野生型”具有其在此项技术中所理解的含义，其是指具有如在自然界中发现的呈“正常”(如与突变体、患病者、改变者等形成对比)状态或情形的结构和/或活性的实体。所属领域的技术人员将了解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”，是指被肿瘤细胞特异性表达或被肿瘤细胞以与相同组织种类的非肿瘤细胞相比较高频率或密度表达的抗原。肿瘤相关抗原可以是正常不被宿主表达的抗原；它们可经突变、截短、错误折叠、或正常被宿主表达的分子的其他方式异常显现；它们可与正常表达的分子相同但以异常高水平表达；或它们可以在异常的情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白或蛋白片段、复杂碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的组合。
术语“疫苗”是指用于施用至哺乳动物的免疫原性组合物，其用于在哺乳动物中引发针对特定抗原的免疫反应。疫苗典型地包含相似于或衍生自该免疫反应的目标的试剂(已知为“抗原”或“免疫原”)，该目标诸如造成疾病的微生物或肿瘤细胞。意图用于肿瘤诸如癌症的治疗的疫苗，典型地包含衍生自目标肿瘤上所发现的肿瘤相关抗原且能够引发对目标肿瘤上的肿瘤相关抗原的免疫原性的抗原。根据肿瘤疫苗的具体用途，可以分为预防性疫苗和治疗性疫苗两类。预防性疫苗的主要功能为控制肿瘤的发生；治疗性疫苗以肿瘤相关抗原为基础，主要用于化疗后的辅助治疗。肿瘤疫苗中的一种为基于树突状细胞(DC)的疫苗。
术语“Survivin”表示一种蛋白，其是凋亡抑制蛋白家族的成员，可以是人Survivin蛋白或非人的哺乳动物Survivin蛋白。适用于本发明的Survivin蛋白本领域周知。
术语“Her2”表示一种蛋白，其是人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)基因的表达产物。适用于本发明的Her2蛋白本领域周知。
术语“CEA”表示癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)，可以是人CEA蛋白或非人的哺乳动物CEA蛋白。适用于本发明的CEA蛋白本领域周知。
术语“免疫增强剂”，如本文所使用，意指一种物质，当它与免疫原混合时能够比免疫原单独存在时诱发更强的免疫应答。例如，一种免疫增强剂能够提高免疫源性，并提供优异的免疫应答。又例如，一种免疫增强剂能够通过提高巨噬细胞和其他抗原呈递细胞上的共刺激因子的表达来起作用。示例性的免疫增强剂可选自polyIC︰IL、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、铝盐、氢氧化铝纳米颗粒、前列腺素E2、干扰素和HB100-108多肽中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，免疫增强剂包含衍生于HB100-108的多肽。本领域周知HB100-108是从HMGB1的B box区提取的短肽。本发明所述的衍生于HB100-108的多肽可以是HMGB1的Bbox区的长5-50个氨基酸残基的片段，优选是含有SEQ ID NO:4所示序列的B Box区的片段，也包括所述B box区的长5-50个氨基酸残基的片段的突变体，即与该片段具有至少70％序列相同性的序列。
术语“癌症”、“肿瘤”和“恶性”指或描述在哺乳动物中典型地是特征为不受控制的细胞生长的生理病症。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、血癌(包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM))、各种类型的头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)、以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾乳头状癌。在某些实施例中，该血癌选自：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、以及慢性骨髓性白血病。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，或含有两个R的接头。
术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
术语“细胞促成熟因子”是能够促进细胞成熟的物质。术语“DC促成熟因子”是指任何能够促进未成熟DC向成熟DC转化的蛋白质、核酸、多肽、复合物、提取物、分离物或以上的组合物，其可以通过与未成熟DC接触而使未成熟DC向成熟DC转化。DC促成熟因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP。成熟DC的验证方法可以是检测本领域所周知的成熟DC表面所表达的分子标志和/或成熟DC所分泌的细胞因子，包括但不限于CD80、CD83、CD86、CCR7、HLA-ABC、HLA-DR和IL-6。
术语“分离的”是指通过人工的方法将天然存在的生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、抗体，或其形成的复合物等从体内的天然状态中分离、提纯或在体外被从头合成后所形成的状态。
术语“工作浓度”是指某种试剂或某种有效成分在溶液体系中发挥功效时的实际的浓度。通常，某种试剂或某种有效成分会在使用前配置成为浓度较高的母液或储存液储存，在使用时再按一定比例加入到最终反应体系中被稀释，通常其稀释后获得的最终浓度即为工作浓度。
术语“负载”是指蛋白质、多肽或核酸分子直接与细胞表面上的受体相结合，形成细胞与蛋白质、多肽或核酸分子的复合体。所述结合作用可以是共价结合，也可以是非共价结合，包括受体与配体的相互结合。例如，负载抗原肽的DC即为抗原肽与DC表面表达的与所述抗原肽的HLA分型相匹配的HLA分子相结合而形成的DC-抗原肽复合体。
术语“DC-细胞毒性T淋巴细胞”或“DC-CTL”是指被负载抗原肽的成熟DC所激活的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)，其能够特异性结合表达含有所述成熟DC所负载的抗原肽的抗原，并对表达该抗原的细胞产生细胞杀伤作用，是通过DC介导的细胞免疫的主要执行者。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是指能够表达主要组织相容性复合物(MHC)I型或II型的一类细胞，能够通过MHC结合抗原肽形成MHC-抗原肽复合物并进一步结合T细胞表面的受体进而激活T细胞的一类细胞，包括但不限于树突状细胞(dendritic cell,DC)、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、Langerhans细胞。
术语“负载抗原的抗原呈递细胞”包括已暴露于抗原并被抗原活化的APC。例如，APC可以在体外(例如在有抗原存在的培养期间)负载抗原。APC也可以通过暴露于抗原而在体内被负载。“抗原负载的APC”通常以两种方式之一制备：(1)被称为抗原肽的小片段直接“脉冲”到APC的外部与MHC分子结合；(2)APC与多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒孵育，然后多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒由APC摄取。这些多肽大片段或蛋白质分子通过APC被消化成小的肽段，并且最终被运输并呈递在APC表面上。此外，还可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞中来产生负载抗原的APC。
多肽组合物
本发明提供了一种多肽组合物，所述多肽组合物包括选自Survivin的片段、Her2的片段、CEA的片段中的一种或多种的分离的多肽。在本发明中，Survivin、Her2和CEA代表其各自相应的抗原蛋白，具有本领域所周知的含义和序列，包括其各自分子的氨基酸野生型序列和各种已知的或可能存在的变体序列。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物中包含的分离的多肽是其各自对应的抗原蛋白的抗原表位。在一个或多个实施方案中，所述抗原表位各自单独地或在一起能够引起免疫应答。在一个或多个实施方案中，所述免疫应答可以是细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。在一个或多个实施方案中，所述分离的多肽具有免疫源性。在一个或多个实施方案中，所述分离的多肽可以是相应抗原蛋白的一部分，其长度短于全长抗原蛋白。在一个或多个实施方案中，所述抗原表位或所述多肽组合物中的一条或多条多肽能够提供预防和/或治疗癌症的效果。在一个或多个实施方案中，多肽组合物还包含免疫增强剂。
本发明提供用所述多肽或多肽组合物刺激受试者个体体内免疫应答反应的方法和预防和/或治疗受试个体癌症的方法。本发明提供包含所述多肽或多肽组合物的疫苗，具有治疗和/或预防癌症的用途。
在一个或多个实施方案中，所述分离的多肽的长度在50个氨基酸以内；优选地，在30个氨基酸以内。例如，所述分离的多肽的长度可以是5-30个氨基酸、8-25个氨基酸、8-15个氨基酸或9-12个氨基酸。例如，所述分离的多肽的长度可以是9个氨基酸。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物中的分离的多肽可以为包含所述分离的多肽的抗原表位的变体。所述变体为所述分离的多肽的功能等同物，具有改变的序列，其在对应于所述分离的多肽所包含的抗原表位序列中存在一个或多个氨基酸替换，或有一个或多个氨基酸被添加到所述抗原表位序列中，或有一个或多个氨基酸从所述抗原表位序列中被删除而不影响包含所述抗原表位的分离的多肽及包含所述分离的多肽的多肽组合物的功能。在一个或多个实施方案中，有1-5个氨基酸，优选地有1-3个氨基酸被添加到所述抗原表位序列的N端和/或C端。
在一个或多个实施方案中，所述衍生于Survivin蛋白的分离的多肽为Survivin蛋白的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:1所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述衍生于Her2蛋白的分离的多肽为Her2蛋白的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述衍生于CEA蛋白的分离的多肽为CEA蛋白的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述衍生于HB100-108的分离的多肽包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述氨基酸替换可以是非保守氨基酸替换或保守氨基酸替换。保守氨基酸替换指替换的氨基酸与野生型的所述分离的多肽中的对应的氨基酸具有类似的结构和化学性质。例如，保守氨基酸替换可以包含脂肪族或疏水氨基酸之间的相互替换，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸之间的相互替换；还可以是包含羟基氨基酸的替换，如丝氨酸和苏氨酸之间的相互替换；还可以是酸性氨基酸之间的相互替换，如天冬氨酸和谷氨酰胺；还可以是芳香族氨基酸的相互替换，如苯丙氨酸和酪氨酸之间的相互替换；还可以是碱性氨基酸的相互替换，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸之间的相互替换；还可以是小氨基酸的相互替换，如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸之间的相互替换。
多肽组合物可包含合适的载体或赋形剂。这类载体或赋形剂应不对DC的生存及生物学功能产生任何实质性影响。多肽组合物可以是本领域可接受的形式，如冻干粉末。或者，该多肽组合物可以是溶液的形式，如包含灭菌注射用水或有机溶剂，如DMSO。
对多肽组合物中各多肽的用量配比并无特殊限制，任意两种多肽的重量比可在1:3到3:1的范围内。通常，多肽组合物中各多肽的用量相同，即重量比为1。在一个或多个实施方案中，多肽组合物中衍生于抗原蛋白的多肽与免疫增强剂的重量比为7:15。
应理解，本发明所述多肽组合物可以通过本领域所周知的常规方法制备得到，包括但不限于通过固相合成的化学合成后经HPLC将合成产物与副产品分离，以及在活细胞内表达编码包含本发明多肽组合物中抗原片段的多肽的核酸或通过体外的无细胞翻译系统翻译上述编码核酸后通过纯化，获得本发明多肽组合物中的抗原肽片段。此外，本发明所述多肽组合物中所包含的不需要的小分子可通过充分透析被去除，所得产物冻干后可添加其他赋形剂以形成需要的制剂。还应当理解，本发明多肽组合物中可能附带的一些在疫苗组分中产生的氨基酸、突变体、化学修饰等基本不会干扰抗体或TCR识别抗原表位序列。
细胞
本发明提供一种负载本文所述多肽或多肽组合物的细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，具有与被负载的多肽相匹配的HLA分型。所述抗原呈递细胞可以为专职抗原呈递细胞(professional antigenpresenting cell)或非专职抗原呈递细胞(non-professional antigen presentingcell)。在一个或多个实施方案中，所述专职抗原呈递细胞为DC、巨噬细胞或B细胞，优选地为DC。所述非专职抗原呈递细胞为表达I型HLA的抗原呈递细胞。所述抗原呈递细胞通过暴露于所述多肽组合物，例如通过与所述多肽组合物共同孵育培养而被所述多肽组合物加载，获得负载多肽组合物的抗原呈递细胞。
本领域技术人员知晓并理解，APC以暴露于抗原的方式被“脉冲”(pulse)或加载包含所述抗原的抗原表位的片段，暴露的时间需要足够长，以使得包含所述抗原的表位的片段能够被呈递到所述APC的表面。在一个或多个实施方案中，所述APC可以被暴露于以多条短多肽片段的形式存在的抗原，即暴露于抗原肽下，所述抗原肽被直接加载到APC表面。除短多肽片段外，APC也可以与衍生于抗原蛋白的大片段、完整的抗原全蛋白或包含抗原蛋白的颗粒一起孵育。所述衍生于抗原蛋白的大片段、完整的抗原全蛋白或包含抗原蛋白的颗粒可以被APC通过胞吞等方式吞入包内，而后被溶酶体或蛋白酶体加工为短多肽片段并最终被运载并呈递到APC的表面，与APC表面的HLA结合形成抗原呈递复合物。
在一个或多个实施方案中，负载有所述多肽组合物的抗原呈递细胞可以通过在体外(in vitro)或体内(in vivo)使APC接触上述多肽组合物中的一条或多条分离的多肽制得。当所述APC在体外加载所述多肽组合物的抗原肽时，所述APC可以在培养皿或孔板上铺板生长，然后再暴露于足够量的包含抗原肽的多肽组合物，并与之接触足够长的时间使抗原肽与APC相结合。抗原肽结合APC所需要使用的量和结合时间可以通过本领域所周知的检测方法进行确定。本领域技术人员所知晓的其他方法，如免疫检测或结合检测，也可以被用于检测暴露于包含抗原肽的多肽组合物后的APC上是否负载有抗原肽。
在一个或多个实施方案中，所述APC为DC，所述DC的来源可以是自体来源或异体来源。在一个或多个实施方案中，所述DC可以分离自受试个体。在其他实施方案中，所述DC可以是人工构建的与天然DC具有相似生物学特性的DC细胞系，其在细胞的形态和/或基因表型上与天然DC类似，如在CN201810368646.3中所记载的转导有表达Tax基因的慢病毒载体的DC细胞，其CD3表达为阴性，CD70、CD80、CD83、CD86、CCR7和HLA-DR等DC标志分子均有表达；又如在US20050272151A1中所记载的GEN2.2细胞系，其为浆细胞样DC细胞系，具有CD4+,HLA-DR+,CD123+,CD45RA+,CD11c-,CD13-的表型。在其他实施方案中，所述DC可以分化自DC前体细胞系，如分化自MUTZ-3细胞系，其为表达单核细胞标志分子单核细胞特异性酯酶和CD14的细胞系(Santegoets SJ,van den Eertwegh AJ,van de Loosdrecht AA,ScheperRJ,de Gruijl TD.Human dendritic cell line models for DC differentiation andclinical DC vaccination studies.J Leukoc Biol.2008Dec；84(6):1364-73.)。
在一个或多个实施方案中，负载本发明多肽组合物的抗原呈递细胞为DC，优选地，所述DC可来自单核细胞。例如，DC的获得方式可以是从受试个体的血液中分离PBMC，再从中分离出单核细胞，然后向所述单核细胞中加入适当的细胞因子，如GM-CSF和IL-4，诱导所述单核细胞向DC分化。又例如，DC的获得方式可以是向永生化的单核细胞的细胞系中加入上述细胞因子，诱导其向DC分化。DC也可以直接获得自永生化的DC细胞系，如在CN201810368646.3中所记载的转导有表达Tax基因的慢病毒载体的DC细胞系。在一个或多个实施方案中，GM-CSF的工作浓度为30-500ng/mL，优选地为40-100ng/mL，更优选地为50ng/mL；IL-4的工作浓度为100-2000U/mL，优选地为500-1500U/mL，更优选地为1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，加入细胞因子后第5-7天，所述单核细胞被诱导分化为未成熟DC，此时加入本发明所述多肽组合物与未成熟DC接触，如共同孵育，使本发明多肽组合物负载未成熟DC。在一个或多个实施方案中，本发明多肽组合物中每条多肽的工作浓度为10-100μg/mL；优选地，为20-80μg/mL；更优选地，为35μg/mL。在一个或多个实施方案中，所述未成熟DC与所述多肽组合物可以接触3小时-48小时，优选地，接触6-12小时。未成熟DC与本发明多肽组合物接触后，本发明多肽组合物对DC的成熟具有促进作用。在一个或多个实施方案中，在所述未成熟DC与所述多肽组合物接触3小时-48小时后，DC仍未完全成熟。此时向包含未完全成熟的DC与本发明多肽组合物的混合物中加入DC促成熟因子，如加入选自TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP中的一种或多种，孵育8-48小时，优选地孵育18-24小时，使DC完全成熟，获得负载本发明多肽组合物的DC。在一个或多个实施方案中，所述DC促成熟因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2，优选地，TNF-α的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL，IL-1β的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL，IL-6的工作浓度为800-1500U/mL、如800-1200U/mL，PGE2的工作浓度为0.5-3μg/mL、如0.5-1.5μg/mL。在一个或多个实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848。在其他实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848。在一个或多个实施方案中，IFN-γ的工作浓度为10-1000IU/mL；优选地为100-300IU/mL；更优选地，为100IU/mL；poly(I:C)的工作浓度为1-200μg/mL，优选地，为20-40μg/mL；更优选地，为30μg/mL；R848的工作浓度为0.1-50μg/mL；优选地，为1-10μg/mL；更优选地，为5μg/mL。在一个或多个实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848，IFN-γ的工作浓度为100IU/mL，poly(I:C)的工作浓度为30μg/mL，R848的工作浓度为5μg/mL。
本发明因此提供一种负载有多肽组合物的细胞的制备方法，其包括(1)使本文所述多肽组合物与细胞接触，进行抗原负载，获得细胞-多肽混合物；(2)任选使(1)中所述细胞-多肽混合物与细胞促成熟因子接触，和(3)获得负载所述多肽组合物的细胞。
本发明因此提供一种制备成熟DC的方法，包括(1)使本文所述多肽组合物与未成熟DC接触，获得DC-多肽混合物，(2)任选使(1)中所述DC-多肽混合物与DC促成熟因子接触，和(3)获得成熟DC。
在一个或多个实施方案中，所述未成熟DC可以由DC前体细胞分化而来。在一个或多个实施方案中，所述未成熟DC可以由单核细胞分化而来。所述单核细胞可以根据本领域所周知的，与细胞因子GM-CSF与IL-4接触后能够在体外诱导分化未成熟DC。GM-CSF与IL-4的用量可以为本领域所知晓的已经报道过的用量。在一个或多个实施方案中，GM-CSF的工作浓度为30-500ng/mL，优选地为40-100ng/mL，更优选地为50ng/mL；IL-4的工作浓度为100-2000U/mL，优选地为500-1500U/mL，更优选地为1000U/mL。在一个或多个实施方案中，所述单核细胞可以通过分离个体的PBMC后进行培养而获得。所述PBMC的分离方法可以为本领域所周知的方法，例如抽取个体的血液，通过密度梯度离心法分离。所分离的PBMC经过培养后，贴壁细胞即基本为单核细胞。培养PBMC的时间优选地为2-8小时，更优选地为2-4小时。
在一个或多个实施方案中，细胞因子GM-CSF和IL-4与所述未成熟DC的前体细胞的接触为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长为本领域所周知的时间，以使未成熟DC前体细胞能够分化为未成熟DC为标准。在一个或多个实施方案中，所述共孵育的时长为3-6天；优选地，为3-5天；更优选地，为5天。细胞因子GM-CSF和IL-4与未成熟DC的前体细胞共孵育的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一个或多个实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一个或多个实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
与所述未成熟DC的前体细胞共孵育的细胞因子GM-CSF和IL-4的工作浓度可以为本领域所周知的浓度，以能够实现诱导未成熟DC的前体细胞，如单核细胞分化为未成熟DC为标准。例如可以为根据中国专利申请CN201610522851.1中所记载的GM-CSF和IL-4的工作浓度。在一个或多个实施方案中，GM-CSF的工作浓度可以为30-500ng/mL，优选地为40-100ng/mL，更优选地为50ng/mL。在一个或多个实施方案中，IL-4的工作浓度为100-2000U/mL，优选地为500-1500U/mL，更优选地为1000U/mL。
本发明多肽组合物与未成熟DC的接触可以为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长可以为本领域所周知的多肽负载DC的时长，以本发明所述多肽组合物中抗原肽能够结合到DC表面HLA形成HLA-抗原肽复合物为标准。在一个或多个实施方案中，所述共孵育的时长为3小时-48小时。在一个或多个实施方案中，孵育所用的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一个或多个实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一个或多个实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
在一个或多个实施方案中，所述DC-多肽混合物与DC促成熟因子接触为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长可以为本领域所周知的时长，以DC促成熟因子能够诱导未成熟DC至成熟为标准。在一个或多个实施方案中，所述共孵育的时长可以为12-72小时；优选地，为24-48小时；更优选地，为24小时。在一个或多个实施方案中，孵育所用的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一个或多个实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一个或多个实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
本发明相应地提供一种激活的免疫效应细胞，通过使未激活的免疫效应细胞与上述负载本发明多肽组合物的细胞接触获得。在本发明所提供的能够负载多肽组合物的细胞如DC，在其表面表达某一亚型的HLA如A2，与该某一特定亚型的HLA相匹配的抗原肽如肿瘤抗原肽与之结合后形成HLA-抗原肽复合物，进而被T细胞表面特异性识别该复合物的受体TCR所识别并结合，表达该TCR的T细胞因此受到刺激并开始增殖。
在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞为选自T细胞或NK细胞，优选地为T细胞。在一个或多个实施方案中，所述负载本发明多肽组合物的细胞为DC。在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞与负载本发明多肽组合物的细胞为来自相同个体或不同个体；优选地，为来自相同个体。在一个或多个实施方案中，所述负载多肽组合物的细胞为DC，所述免疫效应细胞为T细胞。所述负载多肽组合物的DC与所述T细胞的数量比可以为本领域所周知的任何比例，只要所述负载多肽组合物的DC能够有效激活识别其表面HLA-抗原肽复合物的T细胞即可，优选地，为1:2-1:30，更优选地为1:3-1:10，进一步更优选地，为1:5。在一个或多个实施方案中，所述负载多肽组合物的DC与T细胞的接触为共同孵育。优选地，所述共同孵育的时长为2-48小时；更优选地，为24-48小时；进一步更有选地，为24小时。在一个或多个实施方案中，所述共同孵育在培养基中进行，所述培养基为AIM-V、DMEM或RPMI1640；优选地，所述共同孵育在AIM-V培养基中进行；更优选地，所述AIM-V培养基包含2％(v/v)FBS。在一个或多个实施方案中，所述AIM-V培养基中还包含IL-2。优选地，所述IL-2的工作浓度为10-100U/mL，如100U/mL。
疫苗
本发明提供一种适于免疫治疗的疫苗。在一个或多个实施方案中，所述疫苗为肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含本文所述多肽组合物。在一个或多个实施方案中，所述肿瘤疫苗可以被注射到受试者体内，通过负载到受试者体内的抗原呈递细胞上如DC上与识别所述肿瘤疫苗中抗原肽的相应亚型的HLA相结合后形成HLA-抗原肽复合物，所述HLA-抗原肽复合物与相应的特异性TCR结合，激活表达该特异性TCR的T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述疫苗为DC疫苗，所述DC疫苗包含负载本文所述多肽的DC。在一个或多个实施方案中，所述DC可以是由来源于受试者自体血液中分离获得的DC前体细胞、如来源于脐带血的CD34+的造血前体细胞或来源于外周血CD14+的单核细胞分化而来的DC。本发明多肽与受试者体内分离、培养、扩增并分化后获得的自体DC共孵育后，获得包含本发明多肽与负载有所述多肽的成熟DC的细胞混合物制剂。DC前体细胞分化为DC的培养方法可以为本领域周知的方法或任何其他能够使DC前体细胞分化为DC的方法，如在培养基中加入细胞因子GM-CSF与IL-4进行分化培养。所述细胞混合物制剂作为DC疫苗回输到受试者体内，所述多肽由受试者的自体成熟DC呈递，激活特异性的T细胞从而引起体内针对包含所述多肽组合物中的抗原肽所包含的抗原表位的免疫应答。在其他实施方案中，所述DC可以是由永生化DC前体细胞系经过体外扩增培养后再进行分化培养而获得的细胞。所述永生化的DC前体细胞系可以是本领域所周知的或已公开报导过的细胞系，如MUTZ3细胞系，或通过CN201810368646.3中所记载的方法制备的永生化DC前体细胞系。所述永生化DC前体细胞系可以在体外进行大量扩增后通过分化培养而形成DC，所述分化培养的方法可以为前述方法。本发明多肽与由永生化DC前体细胞系扩增后进行分化培养而获得的DC共孵育后获得包含本发明多肽与负载有多肽的成熟DC的细胞混合制剂，该细胞混合制剂作为DC疫苗输入到受试者体内，通过DC呈递其负载的多肽进而激活特异性的T细胞应答。在一个或多个实施方案中，对受试者个体施用包含分化自所述永生化DC前体细胞系DC的疫苗时可以同时施用能够降低免疫排斥反应的试剂，如抑制内源TCR表达的抑制剂。
成熟DC的验证方法可以是检测本领域所周知的成熟DC表面所表达的分子标志和/或成熟DC所分泌的细胞因子，包括但不限于CD80、CD83、CD86、CCR7、HLA-ABC、HLA-DR和IL-6。所述验证方法所采用的检测手段可以是本领域任何能够检测上述分子标志和/或细胞因子的检测手段，包括但不限于ELISA、Western杂交和流式细胞仪检测。
在一个或多个实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。所述佐剂可以为本领域所周知的能够提升免疫应答效应的化合物小分子、生物大分子、组合物、复合物或提取物。在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、前列腺素E2、α干扰素、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送系统、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)]磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述疫苗用于预防或治疗癌症。在一个或多个实施方案中，根据本发明对病患施用所述疫苗可以在外科手术去除肿瘤之前或之后发生，或在放化疗治疗癌症之前或之后发生。在其他实施方案中，所述疫苗可以与其他组合物或药物产品一起或联合向患癌个体施用。应理解，本发明所述疫苗除了可以施用于已经罹患癌症的个体外，也可以施用于没有患癌但具有患癌风险的个体。
根据本发明制备的疫苗可以广泛施用于癌症的治疗或预防，其部分取决于所述疫苗的抗原形成部分的选择。根据本发明所记载的实施能够治疗或预防的癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、间皮瘤、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、肾细胞癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胆管癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、尿路上皮癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症和各类白血病与淋巴癌以及各类癌前病变
在一个或多个实施方案中，所述疫苗可以通过节内注射被施用于腹股沟节。可选地，取决于疫苗的靶标，所述疫苗可以经皮下或皮内施用于接受治疗的患癌症病人的手足。其他施用路径，例如肌肉内注射或血液注射也可以采用。
此外，所述疫苗也可以与佐剂和/或免疫调节剂一起施用，以增强其在病人体内免疫反应的活性。所述佐剂可选自上述佐剂中的任意一种或多种，可根据具体情况作出不同的选择和组合。所述免疫调节剂可以为本领域所周知的具有调节免疫活性的小分子、生物大分子、提取物、药物组合物和/或复合物，可以在本领域已经公开发表的论文、教科书、会议纪要等当中获得。
在一个或多个实施方案中，取决于所制备的疫苗的类型，所述疫苗的生产规模如果需要时可以通过在生物反应器或发酵罐或类似的适于细胞批量生长的容器和装置中培养细胞而进行扩大。在一个或多个实施方案中，根据本发明，包含生产的或回收的所述疫苗或抗原的装置或组合物适于持续或间断性释放的，可以被植入体内或在身体相应位置进行局部施用，以达到缓慢和定时地释放这些材料进入体内的效果。
疾病的治疗方法
本发明提供一种治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括对受试者施用有效剂量的前述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、间皮瘤、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、肾细胞癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胆管癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、尿路上皮癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症和各类白血病与淋巴癌以及各类癌前病变。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括治疗和预防两方面中至少一方面的效果。在一个或多个实施方案中，本发明所述方法为预防目的，本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种在癌症或癌前病变发生前对受试者个体施用。在某些情况下，所述疫苗在上述一种或多种癌症发病后对受试者个体施用，旨在预防出现更进一步的症状或已经发生的症状进一步恶化。本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的预防性施用旨在预防或减轻任何后续的症状。在一个或多个实施方案中，本发明所述方法为治疗目的，本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种在癌症发生时或癌症发生后对受试者个体施用，旨在减轻已经产生的癌症的症状。
在一个或多个实施方案中，所述方法中的针对任何特定治疗应用的所述有效剂量可以取决于不同的因素来确定，如癌症的种类、癌症发病的程度、受试者个体的状况如年龄、性别、体重、身体各项指标的水平等以及所施用的具体药剂的组分以及施用的具体方式。对于所施用的包含本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的药剂的有效剂量，本领域技术人员可以按找所述药剂中包含的具体组分来根据经验决定，而无需进行另外不必要的试验。
在一个或多个实施方案中，所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的施用的具体方式可以由本领域技术人员根据癌症的种类、癌症发病的程度、受试者个体的状况受试者个体的状况如年龄、性别、体重、身体各项指标的水平等以及所施用的具体药剂的组分来确定，例如，可以通过包括但不限于静脉内、肌肉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、创伤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻腔内、阴道内、直肠内、不经肠胃地、全身地、局部地、肿瘤内、经腹膜、脑室内、经皮下、经结膜下、经粘膜、透粘膜地、心包内、脐带内、眼眶内、经口、透皮地、经肺内、经吸入、经注射、经植入、经回输、经连续回输、经局部灌注、经导管、经灌洗、用乳剂和用脂质体组合物中的一种或多种手段对受试者个体施用。
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例中所述的“过夜”指超过8小时。
以下实施例针对中国人群中比例较高的HLA分型-A2型，提供了多种包含多条肿瘤抗原肽的多肽组合物，每种多肽组合物中包括了针对HLA-A2分型的肿瘤相关抗原表位多肽和任选的免疫增强剂。以下实施例所用到的多肽如下表1所示：
表1
| 来源 | 序列 | 序列编号 |
| Survivin | LTLGEFLKL | SEQ ID NO:1 |
| Her2 | RLLQETELV | SEQ ID NO:2 |
| CEA | YLSGANLNL | SEQ ID NO:3 |
| HB<sub>100-108</sub>肽 | SAFFLFCSE | SEQ ID NO:4 |
上述各多肽和HB100-108肽由上海淘普生物科技有限公司合成。各多肽的荧光染料FITC标记在多肽构建体合成完成以后通过本领域常规的方法进行。
以下实施例中将序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的多肽的组合物称为多肽组合物。若无特别说明，以下所有实施例中所加入的上述序列为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的多肽的终浓度均为35μg/mL，所加入的HB100-108肽的终浓度均为75μg/mL。
本发明实施例中DC均使用含有无血清AIM-V培养基培养。
本发明实施例中所用血液来源的供体受试者均为健康成年人。
本发明所用抗体及来源如下表2所示：
表2
实施例1-PBMC细胞和树突状细胞(DC)的分离
(1)PBMC细胞的分离按以下步骤进行：
1)从供体受试者的血液中抽取200～400μL用白细胞分析仪测定白细胞浓度。
2)20℃水浴预热Ficoll，时间在20分钟以上。
3)根据测定的白细胞浓度，用PBS将每个血样稀释至白细胞浓度为5～9×109/L，稀释倍数根据情况计算。
4)Ficoll分离
按体积比血样︰Ficoll＝4:3的比例计算Ficoll的用量，将稀释好的血样沿着离心管壁匀速缓慢加入Ficoll中，完成后轻持离心管，放入离心机中。将离心机转速调为800g，时间25min，升速调为1g/s，降速调为0，开始离心。
5)收获白细胞
上一步离心结束后，轻轻取出离心管，观察分层是否均匀，有无异常。将离心管转移至超净工作台中，首先吸取血浆层，弃掉，再用移液枪头轻轻吸取白膜层，收集至新离心管中，加入生理盐水洗涤，体积为白细胞量体积3倍，放入离心机中。将离心机转速调为400g，升降速为9g/s，离心10min。
6)洗涤白细胞
上一步离心结束后，观察上清液是否澄清，如较澄清，可倾倒弃去上清，再次加入生理盐水，混匀后再次离心，转速与时间同上。如上清液较浑浊，则吸取上清至一个新的离心管继续离心，转速与时间同细胞沉淀。
7)收获白细胞
弃去离心管中的上清液，将2份细胞沉淀合并，计数，加入AIM-V培养液，并按6×107/mL铺入培养瓶中贴壁4h，或过夜。
8)收集T细胞
PBMC贴壁后，收集仍然悬浮的存在于细胞悬液中的细胞至离心管中，1200rpm，离心5min，弃去上层培养基，再加入一定体积的生理盐水洗涤，取样计数并离心，获得的即为T细胞，可根据需要进行后续实验或冻存。
9)T细胞冻存(可选)
根据步骤8收获的T细胞总数，加入计算好的冻存液，按2×107/mL，1mL/支冻存。
(2)DC的分离按以下步骤进行：
1)D0：PBMC加入不含血清的AIM-V培养基，贴壁2h，将悬浮细胞与贴壁细胞分离；悬浮细胞计数，取106细胞送检HLA-A分型；贴壁细胞继续使用不含血清的AIM-V培养基培养，添加GM-CSF至终浓度50ng/mL和IL-4至终浓度1000U/mL。
2)D3&D5：贴壁细胞半量换液，补加GM-CSF和IL-4至终浓度50ng/mL和IL-4至终浓度1000U/mL。
3)D5-7：收集未贴壁的细胞，不使用EDTA或胰酶；使用CD11c流式抗体进行标记，FCM检测收获得到的DC纯度，结果如图1所示。D6和D7收获的细胞中DC占比均超过90％。考虑到D6收获的DC在细胞活力等因素上更优，以下实验中所使用DC均为D6收获。
4)收集的DC按以下实施例中的实验组与对照组的设置与不同的多肽构建体或多肽组合物进行孵育后进行相应的检测。
实施例2-DC聚集效应的检测
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液。
2)将铺有DC的孔分为4组，分别为对照DC、DC+多肽组合物、DC+多肽组合物+HB100-108肽、DC+HB100-108，每组3个平行复孔，向各实验组中分别加入各自相应的多肽和/或HB100-108肽，在不含血清的AIM-V培养基中于37℃5％CO2孵育6小时。
3)PBS洗涤细胞，各组均挑选3个复孔中的一个显微镜明场下观察，结果如图2所示。多肽组合物与DC孵育后，对DC细胞的聚集有一定程度的提高；与多肽组合物+HB100-108肽孵育后的DC与多肽组合物孵育的DC相比聚集成团的细胞进一步明显增多，现象非常明显，且聚集成的细胞团更大。
根据已有的文献报道，DC的聚集与其成熟相关。以上结果表明，本发明多肽组合物与DC孵育后，会诱导DC产生明显的聚集效应，并且包含HB100-108肽的多肽组合物诱导的DC聚集的效应更加明显，说明本发明多肽组合物能够显著促进DC成熟。
实施例3-多肽组合物的DC吸收水平
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，37℃5％CO2静置培养2小时。2)分别向不同的孔中加入各不同多肽、多肽组合物、各多肽+HB100-108肽、以及多肽组合物+HB100-108肽的混合物，孵育6小时，分别通过荧光显微镜和流式细胞仪检测DC对各多肽或多肽组合物的吸收水平。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。
结果如图3-图5所示，图中“+HB100-108”表示加入了HB100-108，“-HB100-108”表示不加入HB100-108，肽1,2&3表示多肽组合物。图3与图4显示DC对不同的多肽和多肽组合物在加入或不加入HB100-108肽的条件下的吸收水平的荧光显微镜检测结果。与单独的多肽或多肽组合物相比，DC对加入HB100-108肽的多肽或多肽组合物的吸收水平显著更高。图5显示了DC对不同的多肽和多肽组合物在加入或不加入HB100-108肽的条件下的吸收水平的流式细胞仪检测的定量结果。图5的结果表明，加入HB100-108肽后的各多肽或多肽组合物与不加入HB100-108肽的各多肽或多肽组合物相比，DC的吸收水平均有提升，并且DC对多肽组合物与加入HB100-108肽的多肽组合物的吸收具有最高的水平。
实施例4-多肽组合物对DC的I型及II型HLA表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％(v/v)FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，各组细胞分别与FITC-标记的HLA-ABC抗体或PE-标记的HLA-DR抗体避光孵育30分钟，同型对照抗体(鼠源IgG)孵育作为对照，孵育后再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测荧光细胞。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。结果如图6和图7所示。图6和图7表明，与多肽组合物孵育后，DC的I型与II型HLA均有显著提升，并且加入HB100-108肽能够更进一步提升DC的I型与II型HLA的表达。HLA-I型与II型分子表达水平的升高与DC的成熟相关，图6和图7的结果表明本发明的多肽组合物能够显著地促进DC的成熟。
实施例5-多肽组合物对DC成熟相关的共刺激分子的表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％(v/v)FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，各组细胞分别与荧光标记的CD80抗体、CD86抗体、CD83抗体与CD40抗体避光孵育30分钟，同型对照抗体(鼠源IgG)孵育作为对照，孵育后再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测荧光细胞。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。结果如图8-11所示。图8、9、10和11分别为表达CD80、CD86、CD83和CD40的DC的流式细胞检测结果的定量柱状图。图8-11的结果表明，本发明多肽组合物能够显著提高DC的CD80、CD86、CD83和CD40的表达，并且在加入HB100-108肽的条件下这种提升效果进一步更加明显。CD80、CD86、CD83和CD40均为与DC成熟与激活相关的共刺激分子，CD80、CD86、CD83和CD40的表达上升表明本发明多肽组合物能够明显提升DC的成熟。
实施例6-多肽组合物对DC的趋化因子受体CCR7表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％(v/v)FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，各组细胞分别与荧光标记的CCR7抗体避光孵育30分钟，同型对照抗体(鼠源IgG)孵育作为对照，孵育后再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测荧光细胞。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。
结果如图12所示。图12为表达CCR7的DC的流式细胞检测结果的定量柱状图。图12的结果表明，本发明多肽组合物能够显著提高DC的趋化因子CCR7的表达，并且在加入HB100-108肽的条件下这种提升效果进一步更加明显。当接受到感染或危险信号时，DC通常被认为会离开外周组织，在此过程中，DC开始成熟且CCR7的表达水平升高。因此CCR7表达水平的提升提示了DC的成熟。并且DC进入到淋巴结中的T细胞区域与DC的归巢(homing)过程分别依赖于CCR7与其配体CCL19和CCL21的结合，因此DC的CCR7表达水平的提升显示DC归巢的潜力有明显的增强。
实施例7-多肽组合物对DC细胞因子分泌水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％(v/v)FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，分为IL-6、TNF-α组与IL-12组。IL-6、TNF-α组37℃、5％CO2培养18h；IL-12组37℃、5％CO2培养48h后，取各组细胞的上清检测IL-6、TNF-α与IL-12浓度。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。
结果如图13-15所示。图13、图14与图15分别显示本发明多肽组合物处理后DC的IL-6、TNF-α与IL-12分泌水平的改变。根据图13、图14与图15的结果，本发明多肽组合物处理后DC的IL-6、TNF-α与IL-12的分泌水平明显提高，并且在HB100-108肽加入后此种提升更进一步加强。
实施例8-多肽组合物对T细胞的细胞因子分泌的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，再加入成熟鸡尾酒混合物(终浓度100IU/ml IFN-γ，30μg/ml Poly(I:C)和5μg/ml R848)培养24h，PBS洗涤后与T细胞按DC与T细胞1:5的数量比孵育18h，然后用CBA试剂盒(购自BD)检测上清液中IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。
结果如图16-19所示。图16-19显示来自供体受试者的T细胞在与各组经过不同处理的DC孵育后细胞因子IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌水平。与未经过任何处理的对照DC孵育后的T细胞相比，经过本发明多肽组合物处理的DC孵育后的T细胞上述四种细胞因子的分泌水平均有明显升高，并且在加入HB100-108肽时上述四种细胞因子分泌水平又有了进一步明显的提升。图16-19的结果表明，与本发明多肽组合物处理的DC共孵育后的T细胞的多种细胞因子分泌水平明显上升，T细胞被激活程度明显提高。
实施例9-多肽组合物对T细胞的细胞毒性的影响
根据实施例1所述方法，对2名不同的供体受试者的血液进行DC与T细胞的分离(分别记为供体受试者1和2)，取分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入多肽组合物、多肽组合物+HB100-108肽及HB100-108肽，37℃、5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，再加入成熟鸡尾酒混合物(终浓度100IU/ml IFN-γ，30μg/mlPoly(I:C)和5μg/ml R848)培养24h，PBS洗涤后与T细胞按DC与T细胞1：5的数量比孵育24h。T细胞孵育后获得的激活的T细胞与PANC-1细胞(购自ATCC)共孵育5h(T细胞与PANC-1细胞数量比5：1)，用LDH细胞毒性检测试剂盒(乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，货号：C0017,碧云天)检测T细胞的细胞毒性。T细胞的细胞毒性按靶细胞(PANC-1)的裂解百分率来计(具体计算方法见碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，货号：C0017说明书)。数据计为平均值±标准误。上述孵育和培养的培养基均为不含血清的AIM-V培养基。
结果如图20与21所示，图20与21分别为供体受试者1和2的细胞毒性结果。图20与21的结果表明，对于2名不同的供体受试者，与本发明多肽组合物孵育后的DC-CTL(Cytotoxic T Lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)对PANC-1细胞的裂解效果均明显高于对照组的DC-CTL，并且加入HB100-108的本发明多肽组合物的DC-CTL对PANC-1细胞的裂解在前者的水平上均又有了进一步明显的提升。图20与21的结果表明，本发明多肽组合物处理后的DC-CTL能够明显提升T细胞对靶细胞的毒性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
<120> 多肽组合物及疫苗
<130> 196798
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu
1 5
Claims (20)
1.一种多肽组合物，其包含一种或多种分离的多肽，所述多肽选自Survivin蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体、Her2蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体、和CEA蛋白的片段或与该片段具有至少70％相同性的突变体。
2.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述Survivin蛋白的片段具有选自以下的一个或多个特征：
所述片段包含Survivin的抗原表位，
所述片段的序列长度在50个氨基酸残基以内，和
所述片段包含SEQ ID NO:1所示序列，或由SEQ ID NO:1所示序列组成。
3.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述Her2蛋白的片段具有选自以下的一个或多个特征：
所述片段包含Her2蛋白的抗原表位，
所述片段的序列长度在50个氨基酸残基以内，和
所述片段包含SEQ ID NO:2所示序列，或由SEQ ID NO:2所示序列组成。
4.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述CEA蛋白的片段具有选自以下的一个或多个特征：
所述片段包含CEA蛋白的抗原表位，
所述片段的序列长度在50个氨基酸残基以内，和
所述片段包含SEQ ID NO:3所示序列，或由SEQ ID NO:3所示序列组成。
5.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物包含选自Survivin蛋白的片段、Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段的两种多肽，所述两种多肽的质量比为1:20～20:1，优选1:10～10:1，更优选1:1。
6.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物包含Survivin蛋白的片段、Her2蛋白的片段和CEA蛋白的片段三种多肽，所述三种多肽的质量比为(1～20):(1～20):(1～20)，优选(1～10):(1～10):(1～10)，更优选1:1:1。
7.如权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物还包括免疫增强剂，优选所述免疫增强剂为HMGB1的B box区的长5-50个氨基酸残基的片段，优选是含有SEQ IDNO:4所示序列的B Box区的片段或与该片段具有至少70％序列相同性的突变体。
8.如权利要求7所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物中免疫增强剂与其他任一种多肽的质量比为1:20～20:1，优选1:10～10:1，更优选15:7。
9.包含权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物中的任意一种或多种多肽的免疫调节剂。
10.包含权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物中的任意一种或多种多肽的细胞。
11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞具有选自下述的一项或多项特征：
所述细胞负载所述多肽；
所述细胞为抗原呈递细胞；
所述细胞表达I型和/或II型HLA；优选地，所述细胞表达的HLA分型为HLA-A2；
所述细胞选自巨噬细胞、B细胞和树突状细胞中的一种或多种；优选地，所述细胞为树突状细胞；优选地，所述树突状细胞来源于PBMC中的单核细胞；优选地，所述树突状细胞为永生化树突状细胞系或树突状细胞前体细胞系。
12.一种负载有多肽的细胞的制备方法，包括(1)使权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物或权利要求9所述的免疫调节剂与细胞接触，获得细胞-多肽混合物；(2)任选使(1)中所述细胞-多肽混合物与细胞促成熟因子接触，和(3)获得负载所述多肽的细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自下述的一项或多项特征：
所述细胞负载所述多肽；
所述细胞为抗原呈递细胞；
所述细胞表达I型和/或II型HLA；优选地，所述细胞表达的HLA分型为HLA-A2；
所述细胞选自巨噬细胞、B细胞和树突状细胞中的一种或多种；优选地，所述细胞为树突状细胞；优选地，所述树突状细胞来源于PBMC中的单核细胞；优选地，所述树突状细胞为永生化树突状细胞系或树突状细胞前体细胞系；
所述细胞促成熟因子选自TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP，优选IFN-γ、poly(I:C)和R848；
(1)中所述接触包括持续3小时-48小时的共孵育，优选在20-50℃、2-10％CO2下进行；
(2)中所述接触包括持续12小时-72小时的共孵育，优选在20-50℃、2-10％CO2下进行。
14.一种药物组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物、权利要求9所述的免疫调节剂和/或权利要求10-11中任一项所述的细胞。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含辅剂和/或药学上可接受的盐。
16.一种疫苗，包含权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物和/或权利要求10-11中任一项所述的细胞。
17.如权利要求16所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是肿瘤疫苗。
18.一种激活T细胞的方法，包括将权利要求10-11中任一项所述的细胞、权利要求9所述的免疫调节剂和/或权利要求16-17中任一项所述的疫苗与初始T细胞接触。
19.权利要求18所述方法获得的活化的T细胞。
20.权利要求1-8中任一项所述的多肽组合物、权利要求9所述的免疫调节剂、权利要求10-11中任一项所述的细胞、权利要求14-15中任一项所述的药物组合物、权利要求16-17中任一项所述的疫苗和/或权利要求19所述的T细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
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Non-Patent Citations (1)
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