JP2002512202A

JP2002512202A - メラノーマの免疫治療用のワクチンアジュバント

Info

Publication number: JP2002512202A
Application number: JP2000544352A
Authority: JP
Inventors: ガジェウスキー，トーマス・エフ; ファラリーノ，フランチェスカ; シャーマン，マシュウ・エル
Original assignee: アーチ・デヴェロップメント・コーポレイション; ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2002-04-23
Also published as: AU3865999A; NZ507829A; WO1999053949A9; AU767208B2; WO1999053949A2; CA2326406A1; EP1071450A2; WO1999053949A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物による悪性腫瘍薬および感染薬に対して指向される細胞傷害性Ｔリンパ球の産生の誘導法ならびに心身に有害な副作用を最小限にし、転移性メラノーマの治療を驚異的および劇的に改善するような疾患の治療法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本出願は、同時継続中である１９９８年１０月８日に提出された、米国特許出
願番号第０９／１６８，８３２号および同時継続中である１９９８年４月２３日
に提出された米国特許出願番号第０９／０６４，９６４号の一部継続出願である
。

【０００２】１．発明の分野。本発明は、一般に、免疫療法、腫瘍学、および感染症調節の分野に関する。よ
り詳細には、疾患またはメラノーマに対する予想外に強い免疫応答が、標準的な
化学療法で以前に認められていた身体に有害な副作用を伴わずに誘導されるよう
な様式での、組み合わせアジュバントを用いた感染症および癌（特に、メラノー
マ）の新規の治療方法に関する。

【０００３】２．関連技術の説明。メラノーマは、皮膚の色素細胞であるメラノサイトの癌である。転移性（第Ｉ
Ｖ期）悪性メラノーマ患者は、生存の中央値は約１年である（Ｂａｌｃｈら、１
９９３、Ｋｏｈ、１９９１）。現在の標準的な治療は、シスプラチン、ＤＴＩＣ
、およびＢＣＮＵなどの薬剤とインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインタ
ーロイキン−α（ＩＦＮ−α）などのサイトカインを用いるか用いない併用化学
療法からなる（Ｂａｌｃｈら、１９９３、Ｋｏｈ、１９９１、Ｌｅｇｈａａｎ
ｄＢｕｚａｉｄ、１９９３）。化学療法に対する応答率は、６０％程度である
と報告されているが、使用した治療計画とは無関係に約５％の患者しか長期生存
しない。明らかに、転移性メラノーマ治療に対する新規のアプローチが必要とさ
れている。

【０００４】従来の化学療法は、急成長している細胞の標的によって癌の成長を調節するこ
とを目的とする。しかし、この機能は特異的ではなく、骨髄細胞および腸管上皮
細胞などの多数の正常な細胞もまた、増殖が基底レベルになる。したがって、身
体の多数の正常細胞もまた、化学療法の毒作用に感受性を有し、従来の化学療法
は実質的には患者に罹患状態を与えているのである。

【０００５】免疫療法の魅力は、その特異性にある。抗原が宿主の正常細胞によって発現さ
れない腫瘍細胞上に発現された場合、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
は、理論的には、腫瘍細胞を選択的に死滅させるように活性化される一方で患者
の正常組織を容赦する。この終わりに、最近１０年間に、特異的腫瘍細胞死滅の
標的として作用することができるこのような腫瘍特異的抗原を同定するための多
大な試みが行われている（Ｂｏｏｎら、１９９４、Ｂｏｏｎら、１９９５）。

【０００６】癌の免疫治療への最初のアプローチは、一部成功した。アジュバントを用いる
か用いないで、照射腫瘍細胞をワクチン接種すると、応答率は１０〜２０％であ
った（Ｂｅｒｄら、１９９０）。カルメット・グラン杆菌（ＢＣＧ）などの非特
異的免疫増強剤はまた、低いが検出可能な応答速度を与える（Ｅｉｌｂｅｒら、
１９７６）。転移性腎細胞癌患者をＴ細胞成長因子ＩＬ−２で治療すると、応答
速度は１５〜２０％になり、数％の患者が長期生存した（Ｈａｗｋｉｎｓ，、１
９９６）。同様に、転移性メラノーマ用の標準的な化学療法にＩＬ−２加えるこ
とにより、応答率が増大した（Ｅｉｌｂｅｒら、１９７６）。まとめると、これ
らの所見は、免疫操作は特定の型のがん患者に利益をもたらすが、現在のアプロ
ーチでは最適ではないという概念を支持している。これらの治療に対する全応答
率が低いことを説明する１つの仮説は、これまでのアプローチが宿主によってす
でに開始されている免疫応答を増幅させることを目的としていることである。実
際、根本的な問題は、ほとんどの患者が抗腫瘍免疫応答がまったく適切に開始さ
れていないことにあろう。さらに、腫瘍抗原特異的免疫法には、細胞傷害性Ｔ細
胞活性の誘導が必要であるが、この目的を達成するための最適な方法については
ほとんど知られていない。

【０００７】腫瘍細胞に特異的に発現されるが、宿主起源のほとんどの正常な細胞には発現
されない抗原の分子的特徴づけは、癌の免疫治療における腫瘍特異的ワクチン接
種の可能性を開く。最近の数年間で、主にメラノーマ細胞系列におけるヒト腫瘍
抗原およびその遺伝子の同定において急速に広まっており、それらには以下に分
類されるいくつかのカテゴリーが含まれる。１）正常な細胞系列における点変異
、２）メラノサイト系列に対して限定的に分化する抗原、３）遺伝子のコード領
域中に含まれるようになるイントロン配列、４）ウイルス遺伝子産物、５）グリ
コシル化が不十分な正常遺伝子産物、および６）ほとんどの成人組織で正常に発
現しない発生的に制御された非変異遺伝子（Ｃｈｅｎら、１９９３）。これらの
抗原の免疫認識は、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ）分子の溝に結合した抗原ペプチド
と相互作用する特異的なＣＤ８⁺ＣＴＬを介して起こる。ＣＤ４^-Ｔ細胞によって
認識されるＭＨＣクラスＩＩ結合性エピトープもまた記載されている。

【０００８】最適環境下では、免疫応答の開始は、宿主の抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＡ
ＰＣによって提供される複数の補因子によって発現されるペプチド／ＭＨＣによ
って引き起こされる。いくつかの細胞型は、「専門の」ＡＰＣとして作用するこ
とができるようであり、それには、樹状細胞（ＤＣ）、活性化Ｂ細胞、および活
性化マクロファージが含まれる。最初の活性化後、ＡＰＣ相互作用によって誘導
されたＣＴＬは、宿主全体を移動し、腫瘍細胞上の同一のＭＨＣ／ペプチド複合
体を認識し、それらを死滅させると考えられている。この抗原特異的細胞溶解は
、多くががアポトーシスの誘導を介して媒介される。腫瘍保有個体では、Ｔ細胞
活性化および標的細胞認識のこの経路に従った１つまたはいくつかの段階に欠陥
があり得るという仮説が立てられる。

【０００９】ＭＡＧＥ−１は、初めてクローン化され、特徴づけされたヒト腫瘍抗原遺伝子
であった（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、１９９１）。これは、いくつか
のメラノーマ細胞系列によって発現されるが、精巣以外のいかなる成人組織によ
っても発現されない。従って、異常発現した正常遺伝子であるという上記のカテ
ゴリー６に分類される。ＭＡＧＥ−１は、少なくとも１２の関連遺伝子ファミリ
ーに属し、その多くが種々の腫瘍細胞型において発現される（ＤｅＰｌａｅｎ
ら、１９９４）。これらのうちの１つであるＭＡＧＥ−３は、試験した全メラノ
ーマ細胞の約２／３で発現することが見出されている。ＭＡＧＥ−３タンパク質
由来のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、およびＨＬＡ−Ｂ４４ＭＨＣ
分子の溝に結合することが確認され（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、１９
９１、ＶａｎＰｅｌら、１９９５、ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、１９
９４）、これらの各ペプチド／ＨＬＡの組み合わせを認識するＣＬＴも認められ
ている。ＨＬＡ−Ａ２は、ヒトにおける最も頻繁に発現するＨＬＡ対立遺伝子で
あり、それらの約５０％を占める。

【００１０】最近、欧州で、１２人のＭＡＧＥ−３⁺転移性メラノーマ患者に、ＨＬＡ−Ａ
１に結合するＭＡＧＥ−３ペプチドを毎月注射した（Ｍａｒｃｈａｎｄら、１９
９５）。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させた１００μｇまたは３
００μｇのペプチドを、任意の腫瘍位置から離れた２つの皮下部位に注射した。
強い毒性を示さなかったが、３人の患者は、腫瘍位置またはリンパ節の炎症由来
の軽い不快感を訴えた。６人の患者は、３ヶ月間の注射によって十分に完治した
。非常に驚いたことに、その６人のうち３人は、主に部分的応答を示し、全応答
率の２５％であった。

【００１１】ＭＡＧＥファミリー同定以来、さらにいくつかのメラノーマ抗原が特徴づけら
れ、それらにはＭｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、およびチロシナーゼが含まれる（
Ｏｌｄら、１９９６）。これのうちの１つ、Ｍｅｌａｎ−Ａは、正常なメラノサ
イトと同様に、試験した全てのメラノーマ細胞系列（Ｃｏｕｌｉｅら、１９９４
）の近位で発現する。従って、これはメラノサイト分化抗原をコードする上記カ
テゴリーの２に分類される。Ｍｅｌａｎ−Ａによってコードされたペプチドは、
ＨＬＡ−Ａ２に結合すると同定されている。

【００１２】１８人の転移性メラノーマを罹患したＨＬＡ−Ａ２⁺患者が、フロイント不完
全アジュバント中に乳化されたＭｅｌａｎ−Ａ由来のペプチドで免疫化された（
Ｃｏｒｍｉｅｒら、１９９７）。強い毒性は認められず、１２人の患者に免疫化
が認められた。しかし、腫瘍退行応答は認められず、これは比較的簡単なワクチ
ン接種法では、十分な知慮効果を得られないことを示している。以上から、これ
らの結果は、特に従来の化学療法の毒性と比較して、ヒトにおける腫瘍抗原ペプ
チドが一般的に安全であるということ支持している。

【００１３】Ｔリンパ球の活性化および分化において最近理解された利点は、ＣＤ８⁺ＣＴ
Ｌの最適な産生にきわめて重要なＡＰＣによって得られるいくつかの重要な同時
刺激因子が示されたことである。実際、さらなる同時刺激因子の非存在下で、抗
原のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を会したＴ細胞の刺激によって活性化されるの
ではなく、むしろクローンアネルギーと呼ばれる非応答性状態が誘導されること
が示された（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９０、Ｔａｎら、１９９３）。従って、同
時刺激分子の関与は、生産性の高いＴ細胞分化を開始させるための必須の成分で
ある。特異的な補因子は、出現する細胞の機能的表現型を決定する抗原とＴ細胞
との最初の遭遇の間および直後に存在する。ＣＤ８⁺Ｔ細胞について、主要な機
能的表現型は、Ｔｃ１およびＴｃ２と呼ばれる２つのサブセットに分類される（
Ｓａｄら、１９９５）。Ｔｃ１細胞は、高レベルのＩＦＮ−γおよびＴＮＦを産
生し、高い溶解活性を示す一方で、Ｔｃ２はＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する
が溶解性は低い（Ｃｒｏｎｉｎら、１９９５）。これは、Ｔｃ１型が腫瘍拒絶を
媒介する点で優れていることを示唆している。

【００１４】同時刺激因子であるＢ７ファミリーは、Ｂ７−１およびＢ７−２からなり、Ｉ
Ｌ−２を産生するためのＴ細胞の発生の指示およびＴ細胞の無反応およびアネル
ギーの誘導の阻害に重要であるようである（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１、Ｈａ
ｒｄｉｎｇら、１９９２、Ｇｉｍｍｉら、１９９３）。Ｂ７−１／Ｂ７−２は、
Ｔリンパ球の表面上で、ＣＤ２８およびＣＬＴＡ４と呼ばれるカウンターレセプ
ターと相互作用する。未処理のＴ細胞の活性化の間のＢ７の供給は、最初の応答
を起こす引き金となる。その時点で存在する特異的な外来性サイトカインは、得
られた活性化効果細胞の機能的表現型を決定する。ＩＬ−１２は高ＩＦＮ−γ産
生Ｔｃ１表現型を誘導する一方で、ＩＬ−４はＴｃ２細胞の発生を好むようであ
る（Ｓａｄら、１９９５）。これらの特徴は、ＣＤ４⁺ヘルパーＴリンパ球の特
徴と等しい（Ｆｉｔｃｈら、１９９３）。Ｂ７およびＩＬ−１２の供給により、
ｉｎｖｉｔｒｏで強い腫瘍抗原特異的ＣＴＬが産生される（Ｇａｊｅｗｓｋｉ
ら、１９９５）。ｉｎｖｉｖｏでのいくつかのマウスモデルでは、Ｂ７を発現
する免疫原生腫瘍のトランスフェクションにより、同系マウスによるＣＤ８⁺Ｔ
細胞依存性拒絶が起こる（ＴｏｗｎｓｅｎｄａｎｄＡｌｌｉｓｏｎ、１９９
３、Ｃｈｅｎら、１９９４）。ＩＬ−１２もまたＴ細胞依存性様式でマウス腫瘍
の退行を促進することができる（Ｂｒｕｎｄａら、１９９３）。ｉｎｖｉｖｏ
での宿主Ｂ７またはＩＬ−１２の阻害は、別の非常に免疫原生を有する腫瘍の拒
絶を防止し（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、１９９６、Ｆａｌｌａｒｉｎｏら，１９９６
）、これは、これらの２つの因子が腫瘍拒絶を媒介する免疫応答によって通常使
用されていることを示している。

【００１５】（発明の概要）発明は、疾患および感染に対して指向される免疫応答を誘導するのに予想外に
有効な、疾患および感染の改良された治療法を提供することにより先行技術の欠
点を克服した方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、転
移性メラノーマなどのメラノーマおよびウイルス感染の治療法に関する。本発明
者らは、記載の様式におけるアジュバントの投与が、従来技術またはアジュバン
トを単独でかまたは異なる組み合わせもしくは順番で投与した場合に基づいて予
想されるであろう効果よりもさらに優れた効果を有することを発見した。本発明
はさらに、従来の癌治療に付随する身体に有害な副作用を減少させるという利点
を提供する。

【００１６】本明細書中および添付の請求項ならびに長年にわたる特許法実務において使用
されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で明らか
に区別していない限り、一般に、「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」、お
よび他の複数形の表示を意味する。従って、例えば、「ａｃｅｌｌ」、「ａ
ｐｅｐｔｉｄｅ」、および「ａｎａｊｕｖａｎｔ」には、細胞の混合物、１つ
または複数のペプチド、および記載の複数のタイプのアジュバントが含まれ、「
ＩＬ−１２」の表示は、例えば、組換えヒトＩＬ−１２などの異なる種のＩＬ−
１２が含まれる。

【００１７】本明細書中で記載の、用語「組換えペプチド」は、他で特別に記載していない
限り、Ｔリンパ球によって認識することができる抗原由来の組換えペプチドを簡
潔にいうために使用される。「組換えペプチド」は、一般に、人為的に細胞（ま
たは動物）に与えられ得るペプチド分子である。用語「組換え」ペプチドは、一
般に、ヒトによる介入に由来しない、親細胞または親生物と異なる配列または順
序に「組換え」られているような自然界のプロセスによって移動され得るアミノ
酸配列、ペプチド、およびタンパク質にまで及ばない。

【００１８】本発明は、ＩＬ−１２およびペプチドでパルスされた抗原提示細胞を含む組成
物を得る工程と、前記組成物を免疫応答を誘導するのに有効な量を哺乳動物に投
与する工程とを包含する、哺乳動物の免疫応答の誘導法を提供する。１つの例示
的な系では、組成物（つまりアジュバント）には、ペプチドでパルスされている
かまたは負荷された抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＩＬ−１２が含まれる。

【００１９】本発明は、さらに、ＡＰＣには自家系細胞が含まれること、いくつかの例示的
な実施形態では、抗原提示細胞はリポ多糖で活性化されたＢ細胞、完全な脾細胞
、樹状細胞、線維芽細胞、または非分画末梢血単核球（ＰＭＢＣ）を含むことが
できることを提供する。勿論、本発明は、他の抗原提示細胞が本発明で有用であ
り、本明細書中に記載の例示的な細胞型に制限されないことが当業者に認識され
ることが理解される。

【００２０】ＡＰＣを、少なくとも１つの抗原由来の抗原ペプチドまたは組換えペプチドで
パルスするか負荷をかける。１つの実施形態では、ペプチドには、哺乳動物によ
る悪性腫瘍または感染に対して指向される細胞傷害性Ｔリンパ球（細胞傷害性Ｔ
細胞またはＣＴＬ）の産生によって特徴づけられる免疫応答を誘導することがで
きる抗原性フラグメントが含まれる。特に例示的な実施形態では、ペプチドには
、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する抗原の１つまたは
複数のフラグメントが含まれる（例示的な腫瘍抗原のリストとして表１および表
２を参照のこと）。表１および表２に列挙した抗原は、例示目的で示されており
、これらの例示的抗原が本発明を制限しないことが当業者に認識されることが理
解される。

【００２１】例示的系では、ペプチドには、メラノーマもしくは他の癌、またはウイルス、
細菌、寄生虫などの感染因子によって発現される１つまたは複数の抗原の１つま
たは複数のフラグメントが含まれる。本発明のいくつかの例示的な実施形態では
、ポリペプチドには、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｐ１９８
、Ｐ１Ａ，ｇｐ１００、またはチロシナーゼが含まれる。勿論、他の抗原の１つ
または複数のフラグメントを含むペプチドが本発明において有用であり、本発明
は本明細書に記載の例示的なペプチドおよび抗原に制限されないことが当業者に
認識されることが理解される。

【００２２】ＡＰＣは、任意の有効濃度のペプチドでパルスすることができる。特定の例示
的な系では、ＡＰＣには、約０．１μＭ〜１ｍＭのペプチドでパルスされた細胞
が含まれる。好ましい例示的系では、ＡＰＣには、約１μＭ〜１００μＭのペプ
チドでパルスされた細胞が含まれ、さらに好ましい実施形態では、約１０μＭ〜
５０μＭでパルスした細胞が含まれる。

【００２３】さらなる実施形態では、悪性腫瘍には、メラノーマまたは他の癌（前立腺、卵
巣、腎臓、肺、脳、心臓、大腸、骨、皮膚、精巣、または子宮の癌など）が含ま
れ、ウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘ
ルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）、またはアルボウイルス（節足動物媒介ウイルス）が含まれる（包括
的なリストおよびアルボウイルスについてはＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙｉｎＨｕ
ｍａｎａｎｄＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、７ｔｈｅｄ．、１９７９およ
びＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＤｉｓｅａｓｅＶｅｃｔｏｒｓ、Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓＣｏｌｏｒａｄｏ、１９９６（その両方が本明細書
中で参考として援用される）に記載されている）。別の実施形態では、感染には
、細菌感染または寄生虫感染が含まれる。

【００２４】哺乳動物には、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、およびヒトが含ま
れるが、これらに限定されない。

【００２５】特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物免疫応答の誘導法を提供し、ペプチ
ドパルスＡＰＣは、必要に応じて、哺乳動物に単回治療用量のＩＬ−１２と組み
合わせて単回治療用量で投与され、その後、複数回治療用量のＩＬ−１２が投与
される。

【００２６】投薬量は、免疫応答を誘導する任意の量であり得る。特定の実施形態では、Ａ
ＰＣの投与量は、１×１０⁶〜１×１０⁹／用量である。例として好ましい実施形
態では、ＡＰＣの投与量は、１×１０⁸／用量である。他の実施形態では、ＩＬ
−１２の投与量は、１ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｎｇ／ｋｇである。特に好ましい例
示的な実施形態では、３０ｎｇ／ｋｇ〜５０ｎｇ／ｋｇ／用量である。勿論、好
ましい投薬量は、優れた研究所での実施および標準的な医学的実施後に患者に個
別化されるべきであることが当業者に理解される。

【００２７】別の態様では、本発明は、ペプチドでパルスされた抗原提示細胞およびＩＬ−
１２を含むアジュバントまたは組成物を投与する工程を包含する、悪性腫瘍また
は感染症患者の治療法を提供する。

【００２８】特定の実施形態では、本発明は、ヒトにおける免疫応答を生じさせるためのｒ
ｈＩＬ−１２を含むか含まない腫瘍抗原パルス化自家系ＰＢＭＣを用いた組成物
を提供する。好ましい実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、Ｍａｇｅ３またはＭ
ｅｌａｎＡである。さらに好ましい実施形態では、Ｍａｇｅ３またはＭｅｌａｎ
Ａに加えて、ｒｈＩＬ−１２が提供される。

【００２９】（図面の簡単な説明）以下の図面は、本発明の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに示すもの
である。本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態の詳細な説明と組み合わ
せて、１つまたは複数のこれらの図面を参照することによってより正確に理解す
ることができる。

【００３０】（例示的な実施形態の説明）本発明は、腫瘍または感染因子由来の抗原に対して抗原特異的免疫刺激を特異
的に誘導するワクチンアジュバントの新規の使用法を開示する。この革新的な方
法によってパルスされた哺乳動物血液細胞は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴ
Ｌ）産生の誘導および腫瘍形成からの保護を示す。一般に、本方法は、腫瘍およ
び疾患の抗原と自家系末梢血細胞とを混合し、その後照射して動物または患者に
注射にて戻す。注射は、動物または患者における抗腫瘍応答または抗疾患反応答
を促進させるために免疫系を刺激する一助となるＩＬ−１２と同時投与される。
例示的な系では、本方法は、肥満細胞腫抗原Ｐ１９８およびＰ１Ａを用いたマウ
スおよびメラノーマ抗原ＭＡＧＥ−３およびＭｅｌａｎ−Ａを用いたヒトに適用
されている。容易に採取でき且つ２、３時間で迅速に調製することができる自家
末梢血細胞の使用は、長時間の精製および数週間かかる培養が必要で、大幅に治
療が遅れてしまう他の治療よりも著しく改善されている。さらに、自家系末梢血
細胞と抗原およびＩＬ−１２との組み合わせにより、腫瘍の増殖を予想外に強く
阻害して腫瘍を退行またはさらに消滅させ、さらに驚くべきことに、生存腫瘍攻
撃により、腫瘍が発症できない。

【００３１】ＣＴＬは、任意の感染に対する身体防御に直接関連しており、ウイルス感染細
胞を死滅させることが周知である。さらに、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子との関
連において外来抗原を認識するので、本発明は、癌治療に制限されず、ＭＨＣク
ラスＩ分子に結合する抗原ペプチドが自家系末梢血細胞と混合され得る感染症（
特にウイルス疾患）の治療に有用であり得る。抗原ペプチドが精製または単離状
態で得る本発明を実施する必要はない。

【００３２】本発明の方法は、感染症、他の治療で耐性を有するウイルス疾患または寄生虫
症（アルボウイルスまたはマラリアなどまたは有効なワクチンが公知ではないヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびヘルペスウイルスならびに特定のアルボウ
イルスなど）の治療に有用であることが予想される。

【００３３】本発明は、腫瘍再生などの疾患の再発を防止するように設計された監視治療お
よび脳炎またはマラリアなどのウイルス疾患または寄生虫症に対するワクチン接
種などの予防治療に有用でありうることがさらに予想される。

【００３４】従って、本発明は、ＣＴＬ産生において従来のアプローチより驚異的に有効で
あり、他の治療と比較してワクチンアジュバントの調製に必要とされる時間がよ
り少ないようにさらに改良された新規の方法論および免疫化プロトコールを提供
する。

【００３５】本発明のさらなる利点は、ワクチンアジュバントの投与による動物または患者
において、身体に害を及ぼす副作用が、例えあったとしてもほんのわずかである
ことである。

【００３６】ペプチドベースの免疫化ストラテジー。メラノーマ患者の免疫化を行うためには、ペプチドベースのワクチン接種の方
法論が必要である。明確なマウスＰ８１５系の臨床前モデル（Ｂｒｉｃｈａｒｄ
ら、１９９５、ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅら、１９９１、Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖ
ｅら．、１９８０、ＶａｎＰｅｌら、１９８５）としての使用および末梢血中
の特異的なＣＴＬの代理読み出しとしての検出により、複数の免疫化ストラテジ
ーを試験した。ペプチドのみ、いくつかの異なるアジュバント中のペプチド、ま
たはペプチド＋ＩＬ−１２で１週間間隔で３回免疫化したが、検出可能なＣＴＬ
を誘導できなかった。次に、ペプチド送達をＡＰＣに集中させるために、精製樹
状細胞（ＤＣ）をｅｘｖｉｖｏでパルスし、その後それらを再注射した。この
アプローチにより、１０％〜２０％のマウスがＣＴＬを産生した。しかし、予想
外であったが、ペプチドパルスＤＣ＋ＩＬ−１２を注射すると、１００％のマウ
スが特異的なＣＴＬを誘導した。１日目にペプチド負荷ＤＣを１回注射すれば十
分であり、有効性を持たせるために、ＩＬ−１２は、免疫後数日間の投与が必要
であった。

【００３７】各メラノーマ患者由来の精製ＤＣの産生は、数週間の細胞培養を必要とする面
倒な作業である。従って、以下の３つのさらなるＡＰＣ源を試験した。リポ多糖
で活性化されたＢ細胞、完全な脾細胞、および非分画化末梢決単核球（ＰＢＭＣ
）。面白いことに、腫瘍抗原ペプチドでパルスされたこれらの各細胞集団もまた
、１００％のマウスにおいてＣＴＬを産生するが、同様にＩＬ−１２を用いた場
合のみである。パルスＰＢＭＣ＋ＩＬ−１２で十分であるという事実は、腫瘍抗
原ペプチドベースのワクチンの調製に必要とされる手順を著しく簡潔にする。２
つの抗原ペプチドＰ１９８およびＰ１Ａを用いて首尾よく免疫化を行える。

【００３８】ペプチドパルスＡＰＣがヒト系において特異的なＣＴＬの産生を誘導すること
ができるかどうかを同定するために、活性化Ｂ細胞または樹状細胞を、ＨＬＡ−
Ａ２を発現する正常な個体から単離した。これらの細胞を、ＨＬＡ−Ａ２に結合
すると推測されるＭＡＧＥ−３由来のペプチドと共にインキュベートし、それを
用いて同一個体由来のＣＤ８⁺Ｔ細胞を刺激した。最初の刺激の間にＩＬ−１２
が含まれている場合のみ、ＭＡＧＥ−３を発現するメラノーマ細胞系列を溶解す
ることができる拡大後に特異的なＣＴＬが誘導された（ＶａｎｄｅｒＢｒｕ
ｇｇｅｎら、１９９４）。試験したメラノーマサンプル中で、ＨＬＡ−Ａ２が最
も頻繁に発現するＨＬＡ対立遺伝子であり、ＭＡＧＥ−３が最も頻繁に発現する
ＭＡＧＥ遺伝子であるので、このペプチド／ＨＬＡの組み合わせはヒト免疫化へ
の利用が示唆される。他の腫瘍抗原由来のペプチドであるＭｅｌａｎ−Ａもまた
、ＨＣＡ−Ａ２に結合し、ＣＴＬによって認識することができることが同定され
た。

【００３９】マウスモデルにおける腫瘍抗原特異的免疫化。記載の系が、多数の癌に適用可能であることが当業者に認識されることが理解
される。従って、本発明で使用することができる腫瘍、腫瘍抗体などの例示的リ
ストが、表１および表２に示される。例示的目的を別にすれば、腫瘍抗原Ｐ８１
５が使用される。

【００４０】

【表１】

【００４１】略語：Ａｂｓ、抗体；Ａｇｓ、抗原；ＥＧＦ，上皮細胞成長因子；ＧＩ、胃腸；
ＧＩＣＡ、胃腸関連抗原；ＧＰ、糖タンパク；ＧＹ、婦人科学的；ＨＭＦＧ、人
乳脂肪小球；Ｋｄ、キロダルトン；Ｍａｂｓ、モノクローナル抗体；Ｍ_r、分子
量；ＮＳ、特定せず；ＰＬＡＰ、胎盤アルカリホスファターゼ；ＴＡＧ、腫瘍関
連糖タンパク質；ＣＥＡ、癌胎児性抗原。

【００４２】脚注：ＣＡ１９−９Ａｇ（ＧＩＣＡ）は、シアロシルフルコシルラクトテトラオ
シルセラミド（別名シアル酸付加ルイスペンタグリコシルセラミドまたはシアル
酸付加ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ）；ｐ９７Ａｇｓは、コンドロイチン
硫酸プロテオグリカンであると考えられる；Ｍａｂ９・２・２７と反応する抗原
は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンと関連するシアル酸付加糖タンパクで
あると考えられる；特定されていない限り、ＧＹは、頸部、子宮頸部、子宮内膜
、卵管、卵巣、膣、または混合性ミューラー腫の癌を含み得る；特定されていな
い限り、ＧＩは、肺、小腸、脾臓、膵臓、胃、および食道を含み得る。

【００４３】

【表２】

【００４４】Ｐ８１５が肥満細胞であって、メラノーマ細胞系列ではないにもかかわらず、
このモデル系を用いて規定された腫瘍抗原免疫の原理は、一般に、他の腫瘍型に
も適用可能であるようである。このシステムの利点は複数ある。Ｐ８１５によっ
て発現された５つの腫瘍抗原は、ＣＴＬクローンによる認識によって同定され（
Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９５）、これらの抗原の２つをコードする遺伝子Ｐ１
Ａがクローン化され、特徴づけられた（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅら、１９９
１）。Ｐ８１５腫瘍細胞におけるＰ１Ａのゲノム配列は正常なマウスの細胞の配
列と同一であり、これにより、異常に発現される正常遺伝子であることが示され
る。それは、いくつかの肥満細胞系列によって発現されるが、精巣および胎盤以
外の正常組織においては発現されず、この方法でＭＡＧＥファミリーのヒト腫瘍
抗原遺伝子の発現を模倣する（ＶａｎＰｅｌら、１９９５）。さらに、免疫原
性ｔｕｍ^-変異体がＰ８１５の変異誘発によって産生されている（Ｕｙｔｔｅｎ
ｈｏｖｅら、１９８０）。これらの変異体は、正常に発現する遺伝子における点
変異の結果として少なくとも１つの新規の抗原を発現し（Ｓｉｂｉｌｌｅら、１
９９０、Ｗｏｌｆｅｌら、１９８７、ＤｅＰｌａｅｎら、１９８８）、これに
より、同系マウスの大多数によって拒絶される。ヒトメラノーマ抗原を産生する
点変異に関する記載（Ｃｏｕｌｉｅら、１９９５）は、さらに、Ｐ８１５系とヒ
ト腫瘍との間のさらに別の類似性を加えている。リン酸カルシウム沈殿によって
トランスフェクションを促進する、高度にトランスフェクト可能なＰ８１５の変
異体Ｐ１．ＨＴＲもまた産生されている（ＶａｎＰｅｌら、１９９５）。この
変異体は、トランスフェクションを必要とする全ての研究に使用されている。

【００４５】本明細書中で一例として使用されているＰ１９８ペプチドなどのｔｕｍ^-変異
体の独自の腫瘍抗原のいくつかによってコードされるペプチドが同定されている
。Ｐ１９８ペプチドは、Ｐ１Ａペプチドより親水性が高い。従って、最初のペプ
チドベースの免疫化研究は、より溶解性の高いＰ１９８ペプチドを用いて行われ
た。次いで、得られた情報により、Ｐ１Ａペプチドを用いて同様に試験された。
Ｐ１Ａを用いた研究は、生存腫瘍攻撃に対する防御および確立前の腫瘍の退行と
いう見地からｉｎｖｉｖｏでの免疫化の効率を測定するために重要である。こ
れらのタイプの研究は、腫瘍が自発的に拒絶されるので、Ｐ１９８を用いては不
可能であろう。

【００４６】本明細書中に記載の研究により、Ｂ７およびＩＬ−１２が活発な腫瘍抗原免疫
化の間に得られるという説得力のある証拠が得られる。Ｂ７は、宿主免疫細胞由
来のいくつかの環境下で明らかに使用することができるにもかかわらず、ＩＬ−
１２は明らかに使用することができない。

【００４７】６〜１０匹の雌ＤＢＡ／２マウスの群を、試験した各条件について処理した。
最初の研究では、未処理（非腫瘍保持）マウスを免疫化した。１μｇ／ｍｌのＰ
１９８ペプチドを有する種々のＡＰＣでパルスすることによって研究を行った。
次に、これらの手順を代理読み出しとして測定した末梢血由来のペプチド特異的
ＣＴＬ活性を有するＰ１Ａペプチドを用いて同一の様式で行った。サイトカイン
（特に、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）産生を、ペプチドパルス同系ＡＰＣまた
は抗原発現腫瘍細胞系列を用いた効果Ｔ細胞の再刺激後の並行研究において評価
した。

【００４８】免疫化のためのペプチドの至適用量を同定した。完全な同系脾細胞を、１０μ
ｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのＰ１Ａペプチドでパルスし、洗浄し、照射（２，
０００ｒａｄ）し、マウスに注射した。至適な注射の回数を評価した。アッセイ
するためのＴリンパ球源として末梢血を用いる利点の１つは、ＣＴＬ活性を測定
するためにマウスを屠殺する必要がないことである。この方法で、ＣＴＬ活性レ
ベルを、各免疫化の前に１週間間隔で試験した。このアプローチでは、患者を研
究するために使用される細胞は自家系である。全臨床モデルの一般的な目的は、
特定の手順を構築し、患者への使用に移行させることであった。至適な免疫化の
位置は、未だに知られていない。パルスしたＡＰＣは、皮下、皮内、静脈内、お
よび腹腔内に注射され、ＣＴＬ活性を以前と同様に測定した。

【００４９】非分画化リンパ球細胞集団が免疫化のために機能することができるにもかかわ
らず、混合物中に存在するＤＣのほとんどが実際には作用しないのかどうかは明
らかではなかった。非細胞およびＰＢＭＣは、いずれもＤＣ前駆体集団を含む。
それでもなお、本発明者らは、ＩＬ−１２が同様に投与される場合、多くの細胞
型が免疫化のためのＡＰＣとして作用していると結論付けた。この仮説を、パル
スした精製休止期Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、ＤＣ、および線維芽細胞と比較するこ
とによって厳格に試験した。ペプチドでパルスしてＩＬ−１２と同時注射したと
きにこれらの各クラスＩＭＨＣ⁺ＡＰＣ集団が特異的ＣＴＬを誘導する場合、
ＩＬ−１２の供給によりＡＰＣと無関係の性質が得られると結論付けることがで
きた。最終的に、ＰＢＭＣをマウスから単離して、類似の様式での免疫化のため
に使用した。十分な数のマウスＰＢＭＣの単離は困難であるが、ＰＢＭＣは、ヒ
トから単離するのが最も容易なＡＰＣ集団を構成するので、この細胞集団をＡＰ
Ｃ源として首尾よく使用することによって臨床状態により深くむすびつけられる
。

【００５０】次いで、読み出しとしてＣＴＬ誘導を用いて正の結果を得る条件を、腫瘍保護
について評価するために、生存Ｐ８１５またはＰ１．ＨＴＲ細胞を用いて免疫化
マウスを攻撃することによって模索する。腫瘍抗原遺伝子Ｐ１Ａでトランスフェ
クトされている関連腫瘍Ｌ１２１０も使用した。免疫応答の抗原特異性の基準と
して、Ｌ１２１０とＬ１２１０．Ｐ１Ａとの保護能力を比較した。次いで、腫瘍
保護アッセイにおいて認められた至適条件を、確立前の腫瘍を有するマウスの免
疫化に使用した。腫瘍を、皮下または腹腔内で確立させた。確立開始から４、７
、１０、または１４日後に、Ｐ１ＡパルスＡＰＣ＋ＩＬ−１２を用いた免疫化を
開始した。腫瘍増殖の退行率を測定した。本発明者らは、マウスモデルにおいて
確立前の腫瘍の拒絶を最も有効に誘導するプロトコールは、ヒト個体が同様に確
立前の腫瘍を保有している場合、ヒト患者に適用するために最も重要であると推
測した。

【００５１】ヒトにおけるペプチドパルスＡＰＣ。メラノーマ患者の血液由来のＡＰＣ供給源としての末梢血マクロファージを培
養し、ＭＡＧＥ−１由来のペプチドでパルスし、患者の皮下および腹腔内に注射
して戻した（Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、１９９５）。強い毒性は認められなかった。
免疫化部位の生検によってＭＡＧＥ−１特異的ＣＴＬの存在が確認されたが、こ
れは特異的な免疫応答が開始されたことを示唆している。ＡＰＣ供給源として非
分画ＰＢＭＣを用いたマウスモデルでの成功に基づいて、本発明者らは、免疫化
を成功させるためにマクロファージまたはＤＣのｉｎｖｉｔｒｏでの拡大のた
めの手順を行う必要がないであろうと結論付けた。非分画ＰＢＭＣの使用により
、ワクチンの調製が非常に簡便になり、潜在的な毒の発生源を回避するであろう
。

【００５２】ＩＬ−１２を用いたヒトにおける第１相／第２相試験。種々の悪性腫瘍患者における組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）の第１
相臨床試験を行った。ｒｈＩＬ−１２の単回試験用量を静脈内投与した後の２週
間、１日量を５日間３週間ごとに投与した。少なくとも４人の患者のコホートに
、３、１０、３０、１００、２５０、５００、または１０００ｎｇ／ｋｇ／日の
用量レベルでｒｈＩＬ−１２を投与した。毒性には、一過性の血球減少（治療後
２〜５日目が最低）、トランスアミナーゼおよびビリルビンの可逆的増加、一過
性高血糖、口内炎、ならびに毛細血管漏出症候群が含まれる。このスケジュール
での最大耐量は、５００ｎｇ／ｋｇ／日であり、いくつか腫瘍応答が認められた
。

【００５３】ｒｈＩＬ−１２の第２の第１相臨床試験を、１週間あたり３回で２週間の皮下
投与後１週間おくことによって行った。患者を、３、１０、３０、１００、およ
び３００ｎｇ／ｋｇ／日の用量レベルで治療した。以下に記載の第２相腎癌研究
時に臨床的保持を行った後試験を延期したので、最大耐量に達成しなかった。

【００５４】進行性腎細胞癌患者にｒｈＩＬ−１２を静脈内投与する２つの第２相試験を開
始した。５００ｎｇ／ｋｇ／日の用量を１週間に５回静脈投与し、その後１６日
間の休止期をおいた。思いがけず、１７人の患者中１２人が有害事象のために入
院を必要とし、４人が死亡した。死亡患者のうち２人は、ｒｈＩＬ−１２が原因
であり、２人は疾患の進行によるものである。従って、試験を延期した。第１相
試験と第２相試験との潜在的な相違を長い間検討した結果、毒性プロフィールは
ｒｈＩＬ−１２の投与スケジュールに強く依存していると考えられる。第１相試
験における毒性は、一日量を投与する前に単回の試験用量を投与することによっ
て明らかに低減される。

【００５５】これらの知見に基づいて、ｒｈＩＬ−１２の第３の第１相試験を完了した。６
人の患者のコホートを、１週間に３回の皮下投与を３週間にわたって行った後に
９日間の休止期をおき、３０、１００、および３００ｎｇ／ｋｇ／日の用量を投
与することによって治療した。強い毒性を示さなかったので、その後３人の患者
に５００ｎｇ／ｋｇ／日ｋの用量で治療した。２人の腎細胞癌患者に、軽い応答
が認められた。ｒｈＩＬ−１２のこの用量範囲およびスケジュールは、進行性悪
性腫瘍患者において十分に耐えられるようである。

【００５６】腫瘍抗原特異的免疫化へのアプローチの概要。上記の前臨床および第１相試験の結果に基づいて、本発明者らは、メラノーマ
患者の腫瘍抗原特異的免疫化についてのストラテジーを考察した。転移性メラノ
ーマ患者における第１相／第２相試験に着手した。患者に対して、最初にＨＬＡ
タイピングした。ＨＬＡ−２Ａ陽性患者の腫瘍生検を行い、ＲＴ−ＰＣＲ^TMを用
いたＭＡＧＥ−３およびＭｅｌａｎ−Ａの発現のためにスクリーニングを行った
。ＭＡＧＥ−３⁺腫瘍患者は、ＭＡＧＥ−３ペプチドを用いたワクチン接種に適
切であった。ＭＡＧＥ−３陰性であるがＭｅｌａｎ−Ａ陽性の腫瘍患者は、Ｍｅ
ｌａｎ−Ａペプチドを用いた免疫化に適切であった。

【００５７】末梢血を採取し、密度勾配遠心法によって分画してＡＰＣ源としてのＰＢＭＣ
を単離した。細胞を、適切なＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａｎ−Ａペプチドと共に
インキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁して、死滅するまで照射した。パル
ス細胞（５０〜１００×１０⁶）を、リンパ節の近位であるが腫瘍集団に隣接し
ない２つの部位に皮内注射した。安全で、前臨床モデルにおいて有効であり、流
入領域リンパ節へのワクチンを標的する目的において、皮下経路が好ましい。

【００５８】適切な患者を、ＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａｎ−Ａペプチドのいずれかで免疫
化するために各コホートに割り当てた。６人中３人の患者にペプチドパルスＰＢ
ＭＣのみ、表示のようにＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａｎ−Ａペプチドを併用して
治療した。残りのコホートについて、１、３、および５日目にｒｈＩＬ−１２を
免疫化部位の近位の１つに皮下注射した。各群の３〜６人の患者にｒｈＩＬ−１
２の用量を段階的に増量して安全で且つ免疫化が成功する至適用量を同定した。
投薬スケジュールは、最新の第１相試験のデータに基づいた。再免疫化を、各サ
イクルの１、３、および５日目にｒｈＩＬ−１２投与を３週間間隔で行った。各
免疫化の前に、末梢血を採取して、ペプチド特異的ＣＴＬ活性ならびにＩＦＮ−
γおよびＴＮＦ−αの産生についてアッセイした。遅延型過敏症反応の指標とな
る局所的炎症について、注射部位も試験した。臨床的応答を、第２の結果として
評価した。

【００５９】腫瘍抗原特異的免疫化アプローチの主要な利点の１つは、患者の腫瘍によって
発現される抗原は通常分析されないので、組換えＩＬ−２の注射などのより一般
的な免疫療法では不可能であった腫瘍退行に対する効果の特異的免疫応答を独立
して測定できることである。さらに、任意の首尾よく得られた応答は、未だ特徴
づけられていない抗原に対して指向されるようなので、検出されないであろう。
癌の免疫治療を改善する第１段階は、首尾よい免疫化の発生を同定できるかどう
かである。同定可能な場合のみ、癌治療におけるその真の潜在性を同定するため
にワクチン接種を改良することができる。

【００６０】免疫反応の適切な代理読み出しは、未だ知られていない。一般に、抗原特異的
細胞障害活性の誘導が所望の終点であると考えられている。しかし、誘導された
効果細胞の特性も同様に重要であろう。有望な候補として、サイトカインＩＦＮ
−γおよびＴＮＦ−αを産生するためのＣＴＬの活性化能力、Ｔｈ１／Ｔｃ１表
現型の特徴である。マウスモデルにおける研究により、Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型が
確立前の腫瘍の拒絶を媒介するのに最適であることが示唆された。

【００６１】患者の免疫化が成功する３つの基準を試験した。第１に、各免疫化後の各患者
から採取した血清サンプルを、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α含有量について評価
する。本発明者らは、有効に免疫化された患者は、各接種後にこれらのサイトカ
インが増大し、その後の各ワクチン接種を用いると増加の程度がより増大すると
結論付けた。これらのサイトカインは、当業者に周知の標準的なＥＬＩＳＡ法に
よって測定される。血清サンプルの段階希釈物を、標準の段階希釈物と比較した
。最大半減の吸収を示した希釈物を比較し、標準における公知の濃度に基づいて
その濃度を同定する。この代理読み出しは、日常的に行われているが、このアッ
セイの感度は、予想増加量を検出するには十分ではないであろう。

【００６２】第２のアッセイでは、ペプチドパルスＡＰＣでのＴリンパ球の再刺激、ＩＬ−
２での応答細胞の拡大、正確なＭＨＣ分子を発現するクロム標識化標的細胞の溶
解の測定によって評価し、ＭＡＧＥ−３ペプチドまたはＭｅｌａｎ−Ａペプチド
でパルスした凍結保存ＰＢＭＣ由来のＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａｎ−Ａ特異的
細胞溶解活性を測定する。コントロールには、非パルス標的およびＮＫ感受性標
的Ｋ５６２が含まれる。非放射性競合を、非特異的ＮＫ活性を排除するために非
放射Ｋ５６２細胞を用いて行った。

【００６３】第３の読み出しは、第１のアプローチと第２のアプローチの組み合わせである
。Ｔｈ１／Ｔｃ２表現型によって抗腫瘍効果を予測できるので、第２の方法にお
ける特異的Ｔ細胞の拡大によって産生された効果細胞を、ペプチドパルスＡＰＣ
で２４時間刺激し、上清をＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの存在についてアッセイ
する。検出不可能な血清レベルであっても、抗原特異的Ｔ細胞によるサイトカイ
ンの産生が容易に測定されるはずである。

【００６４】特異的ヒトワクチン接種研究の概要。難治性転移性疾患を有するメラノーマ患者のワクチン接種研究を、ｒｈＩＬ−
１２を有するか有さない腫瘍抗原ペプチドパルス自家系ＰＢＭＣを用いて行った
。特に、Ｍａｇｅ３およびＭｅｌａｎＡを用いた場合、図１０、図１１、および
図１２に記載のように１〜３回の免疫化の後にペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生Ｃ
Ｄ８⁺Ｔ細胞の産生が検出された。

【００６５】生物学的に機能的な等価物。本明細書中に記載の治療計画は、ＭＨＣクラスＩ細胞に結合する任意の抗原ペ
プチドを利用することができることが理解される。記載のＭＡＧＥ−３およびＭ
ｅｌａｎ−Ａの生物学的に機能的な等価物が記載される。当業者に理解されるよ
うに、組換えペプチドの構造の改変および変更を行うことができ、さらに類似ま
たはその他の所望の特徴を有する分子を得ることができる。例えば、特定のアミ
ノ酸は、例えば、Ｔ細胞抗原レセプターの抗原結合領域またはメラノーマ細胞の
ＨＬＡ分子などの構造が有する相互作用する結合能を明らかに損失することなく
タンパク質構造中のアミノ酸を他のアミノ酸と置換することができる。タンパク
質の相互作用能および性質がタンパク質の生物学的に機能的な活性と定義される
ので、特定のアミノ酸配列の置換がタンパク質配列（または、勿論その元となる
ＤＮＡコード配列）中に作製されても、類似の（アゴニストの）性質を有するタ
ンパク質を得ることができる。従って、それらの利用性および活性を明らかに損
失することなく、組換えタンパク質またはペプチド（または元となるＤＮＡ）の
配列中に種々の変更を行うことができることが発明者によって意図される。

【００６６】機能的等価物に関して、生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドの定
義において、固有とは、分子の規定の部分に作製され得るいくらかの変形に拘束
されるが、それでも受容可能なレベルの等価の生物学的活性を有する分子である
という概念であることが当業者に十分に理解される。従って、生物学的に機能的
な等価なペプチドとは、特定であるがほとんどまたは全てではないアミノ酸が置
換されたペプチドとして本明細書中に規定される。特に、小さなペプチドを考慮
する場合、より少ないアミノ酸を置換することができる。勿論、異なる置換を有
する別のタンパク質／アミノ酸の多数が容易に作製され、本発明によって使用さ
れることができる。

【００６７】特定の残基がタンパク質またはペプチドの生物学的または構造的特性に特に重
要であることが示された場合（例えば、抗原認識領域中の残基）、一般に、この
ような残基は交換することができないこともまた十分に理解される。

【００６８】アミノ酸置換は、一般に、比較的類似のアミノ酸側鎖置換基（例えば、それら
の疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ
、形、およびタイプの分析により、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは全
て正電荷の残基であり、アラニン、グリシン、およびセリンは全て類似のサイズ
の残基であり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは全て一般
に類似の形の残基であることが示された。従って、これらの考察に基づいて、ア
ルギニン、リジンおよびヒスチジン、アラニン、グリシンおよびセリン、ならび
にフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが本明細書にいて生物学的
に機能的な等価物として規定される。

【００６９】より定量的変化をもたらすために、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮するこ
とができる。各アミノ酸を、それらの疎水性および電荷の特徴に基づいた疎水性
親水性指標に割り当てた結果、以下のようになる。イソロイシン（＋４．５）、
バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、
システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１
．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）
、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）
、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５
）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．
９）、およびアルギニン（−４．５）。

【００７０】タンパク質に対する生物学的相互作用機能の付与における疎水性親水性指標の
重要性は、一般に、当該分野で公知である（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ、１９８２（本明細書中で参考として援用される））。特定のアミノ酸が類
似の疎水性親水性指標およびスコアを有する他のアミノ酸で置換されてもなお類
似の生物学的活性を保持し得ることが公知である。疎水性親水性指標に基づく変
化は、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸との置換が好ましく、±１以
内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより好ましい。

【００７１】類似のアミノ酸の置換は、特に、本発明の場合のように、生物学的に機能的な
等価タンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態において使用されることを意
図して作製される場合、親和性に基づいて有効に行うことができることもまた当
該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中で参考
として援用される）は、その近接したアミノ酸の親水性に影響を受け、その免疫
原性および抗原性（すなわち、タンパク質の生物学的特性）に相関するタンパク
質の局所的最大親水性の平均を記載している。

【００７２】米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下のアミノ酸に
親水性値を割り当てている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、ア
スパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋０．３±１）、セリン（＋０
．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）
、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）
、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）
、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チ
ロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（
−３．４）。

【００７３】類似の親水性値に基づいて変化させる場合、親水性値が±２以内でのアミノ酸
置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内が特により好ましい。

【００７４】考察がアミノ酸の変更から生じる機能的に等価なポリペプチドに集中している
が、遺伝コードを作成し、２つまたはそれ以上のコドンが同一のアミノ酸をコー
ドし得ることを考慮して、これらの変更がコードＤＮＡの変化によって達成する
ことができることが明らかである。このような実施形態ならびに他の用途（プロ
ーブおよびプライマーの設計など）で使用するために、アミノ酸およびそれらの
コドン表を以下に示す。

【００７５】

【表３】

【００７６】本明細書中で使用される、用語「機能的に等価なコドン」は、同一のアミノ酸
をコードするコドン（アルギニンまたはセリンの６つのコドンなど）をいうが、
生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンもいう（表記のコドン表を参照の
こと）。

【００７７】アミノ酸および核酸配列には、配列が上記の基準を満たす限り、付加残基（付
加Ｎ末端もしくはＣ末端アミノ酸）または５’もしくは３’配列を含むことがで
き、タンパク質発現が考慮される場合は生物学的なタンパク質活性の維持が含ま
れる、本発明に開示の配列の１つに記載されるように本質的に同一であることも
また理解される。アミノ酸配列の付加は、特に、例えば、コード配列の５’また
は３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード領域を含むか、遺伝子内に存在
することが公知の種々の内部配列（すなわち、イントロン）を含むことができる
か胡散配列に適用される。

【００７８】治療計画および投薬量。治療計画を本明細書中に記載したが、ＩＬ−１２を用いた治療は、秒、時間、
日、さらに週の範囲の間隔でペプチドパルスＡＰＣ投与の前または後に行うこと
ができる。実施形態において、ペプチドパルスＡＰＣおよびＩＬ−１２を別々に
患者に投与した場合、一般に、各送達時間の間に有効期間が切れないので、２つ
の組み合わせがレシピエントに対して都合よく組み合わされた効果をさらに発揮
することができるであろう。このような例において、両薬剤の間隔を約０．１〜
２４時間以内、さらに、１〜４時間以内、約１〜約２時間のみ遅れて接触させる
ことが好ましいと考えられる。状態によっては、治療時間を数日（１、２、３、
４、５、６、または７日間）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８
週間）の投与間隔に有意に延長することが好まれる。

【００７９】特定の環境において、ＩＬ−１２を組み合わせた１回を超えるペプチドパルス
ＡＰＣの投与が望ましいと考えられる。種々の組み合わせを使用することができ
る（ここで、ペプチドパルスＡＰＣは「Ａ」、ＩＬ−１２は「Ｂ」である）。

【００８０】 A/B/B B/A/A A/A/B A/B/A B/A/B B/B/A B/B/B/A B/B/A/B B/A/B/A B/A/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A B/A/B/B A/A/B/A A/B/B/B

【００８１】腫瘍細胞死滅を達成するために、両薬剤を腫瘍細胞を死滅させるのに有効な量
を組み合わせて患者に送達させる。これらの治療サイクルを複数回繰り返すか、
１度だけ送達させる。

【００８２】薬物療法に対する患者の応答に影響を与えることが周知の因子には、種、年齢
、体重、性、健康状態、妊娠、習慣、アレルギー、民族的起源、病歴、現在の病
状、および治療期間が含まれるが、これらに制限されないことが当業者に認識さ
れる。従って、当業者は、各患者への投薬量を個性化することの必要性を十分に
認知している。

【００８３】当業者はまた、適切な投薬量を選択する前に、治療すべき病状を考慮する。例
えば、癌治療に適切な投薬量は、癌の再発を防止するように設計されたその後に
続く監視治療のための所望の投薬量ではないかもしれない。

【００８４】従って、本発明の実施において、広範な種々の投薬量が有用であり、所望の投
薬量を患者に対して個性化することができることが認識される。例示的な場合で
は、１０〜５０μＭのペプチドをＡＰＣに負荷し、注射あたり１０×１０⁸個の
ＡＰＣを投与し、注射あたり３０〜５０ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１２を投与する。

【００８５】ＡＰＣに負荷されるペプチドの量は、最低で約０．１μｍから最高で約１ｍＭ
であり得る。これには以下の範囲が含まれることが理解される：０．１、０．２
、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７など、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５など、２０、２１、２２、２３
など、２５、２６、２７、２８など、３０、３１、３２、３３など、３５、３６
、３７など、４０、４１、４２など、４５、４６、４７など、５０、５１、５２
、５３など、６０、６１、６２など、７０、７１、７２など、８０、８１、８２
など、９０、９１、９２など、１００、１１０、１２０など、１５０、１６０、
１７０など、２００、２１０、２２０など、２５０、２６０、２７０など、３０
０、３１０、３２０、３３０など、３５０、３６０、３７０など、４００、４１
０、４２０など、４５０、４６０、４７０など、５００、５２５、５５０、５７
５など、６００、６２５、６５０など、７００、７２５、７５０など、８００、
８２５、８５０など、９００、９２５、９５０など、１０００μｍ。

【００８６】注射あたりのＡＰＣ数もまた、１×１０⁶から１×１０⁹まで変化させることが
できる。この範囲には約１×１０⁶と１×１０⁹との間の全ての用量が含まれるこ
とが理解される。注射あたりの範囲は以下が含まれる：１×１０⁶、２×１０⁶、
３×１０⁶、４×１０⁶、５×１０⁶、６×１０⁶、７×１０⁶、８×１０⁶、９×１
０⁶、１×１０⁷、２×１０⁷、３×１０⁷、４×１０⁷、５×１０⁷、６×１０⁷、
７×１０⁷、８×１０⁷、９×１０⁷、１×１０⁸、２×１０⁸、３×１０⁸、４×１
０⁸、５×１０⁸、６×１０⁸、７×１０⁸、８×１０⁸、および９×１０⁸個のＡＰ
Ｃ。

【００８７】投与可能なＩＬ−１２の量は、注射あたり、１ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｎｇ／ｋ
ｇの範囲である。この範囲には約１ｎｇ／ｋｇと約１０００ｎｇ／ｋｇとの間の
全ての用量が含まれることが理解される。従って、以下の範囲が含まれる：１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５など、
２０、２１、２２、２３など、２５、２６、２７、２８など、３０、３１、３２
、３３など、３５、３６、３７など、４０、４１、４２など、４５、４６、４７
など、５０、５１、５２、５３など、６０、６１、６２など、７０、７１、７２
など、８０、８１、８２など、９０、９１、９２など、１００、１１０、１２０
など、１５０、１６０、１７０など、２００、２１０、２２０など、２５０、２
６０、２７０など、３００、３１０、３２０、３３０など、３５０、３６０、３
７０など、４００、４１０、４２０など、４５０、４６０、４７０など、５００
、５２５、５５０、５７５など、６００、６２５、６５０など、７００、７２５
、７５０など、８００、８２５、８５０など、９００、９２５、９５０など、１
０００ｎｇ／ｋｇ。

【００８８】治療経路ペプチドパルス化ＡＰＣおよびＩＬ−１２は、静脈内、動脈内、腫瘍内、非経
口的または腹腔内に投与することができる。本発明において、好ましい投与経路
は皮下（ＳＣ）である。しかし、静脈内（ＩＶ）、動脈内および腹腔内（ＩＰ）
を使用することができる。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化
合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合さ
れた水で調製することができる。分散物もまた、グリセロール、液体のポリエチ
レングリコールおよびそれらの混合物ならびにオイルで調製することができる。
保存および使用の通常的な条件のもとで、これらの調製物は、微生物の増殖を防
止する保存剤を含有することができる。

【００８９】注射使用に好適な剤形には、無菌の水溶液または水性分散物、および無菌の注
射可能な溶液または分散物を即座に調製するための無菌の粉末が含まれる。すべ
ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジを容易に通過する程
度に流動的でなければならない。剤形は、製造および保存の条件下で安定でなけ
ればならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければなら
ない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコールなど）、それら
の適切な混合物、および植物オイルを含有する溶媒または分散媒体であり得る。
適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによっ
て、分散物の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして
界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の活動は、様
々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノー
ル、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合
、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）を含むことは好ましい。注射可
能な組成物の持続した吸収が、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニ
ウムおよびゼラチン）の組成物で使用することによって得ることができる。

【００９０】無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を、適切な溶媒に、上
記に列挙された様々なそれ以外の成分とともに配合することによって、そして必
要とされる場合には、その後のろ過滅菌によって調製される。一般に、分散物は
、様々な滅菌された有効成分を、基剤分散媒体と、上記に列挙された成分に由来
する必要とされる他の成分とを含有する無菌のビヒクルに配合することによって
調製される。無菌の注射可能な溶液が調製される無菌粉末の場合、好ましい調製
方法は、事前に無菌ろ過されたその液体から、有効成分とさらなる所望の成分と
の粉末が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。

【００９１】本明細書中で使用されている「薬学的に受容可能なキャリア」には、任意のす
べての溶媒、分散媒体、コーティング材、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および
吸収遅延剤などが含まれる。そのような媒体および薬剤を薬学的活性物質に使用
することは、この分野では周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分
と配合できない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用は可能である。補
助的な有効成分もまた組成物に配合することができる。

【００９２】好ましい経路としては考えられていないが、ペプチドパルス化ＡＰＣおよびＩ
Ｌ−１２のいずれかまたはその両方はまた、経口的に、例えば、不活性な希釈剤
または吸収可能な食用キャリアとともに投与することができ、あるいは、硬殻ゼ
ラチンカプセルまたは軟殻ゼラチンカプセルで包むことができ、あるいは錠剤に
圧縮することができ、あるいは食事の食物と直接配合することができる。経口的
治療投与の場合、活性化合物は、賦形剤とともに配合することができ、摂取可能
な錠剤、口内錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、
カシュ剤などの形態で使用することができる。そのような組成物および調製物は
、少なくとも０．１％の活性化合物を含有しなければならない。組成物および調
製物の割合は、当然ではあるが、変化させることができ、好都合には、ユニット
体の重量の約２％〜約６０％であり得る。そのような治療的に有用な組成物にお
ける活性化合物の量は、好適な投薬量が得られるような量である。

【００９３】錠剤、トローチ剤、ピル、カプセルなどはまた下記のものを含有することがで
きる。トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチン
などの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャ
ガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑
剤、スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤を加えることができ
る、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油またはサクランボ風味剤など
の風味剤。投薬単位形態がカプセルである場合、カプセルは、上記タイプの物質
に加えて、液体キャリアを含有することができる。様々な他の物質を、コーティ
ング剤として、あるいはそれ以外では投薬単位体の物理的形態を改変させるため
に提供され得る。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルは、シェラック、糖または
その両方でコーティングすることができる。エリキシル剤のシロップは、活性化
合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピ
ルパラベン、サクランボ香料またはオレンジ香料などの色素および風味剤を含有
することができる。当然ではあるが、任意の投薬単位形態を調製する際に使用さ
れる任意の物質は、薬学的に純粋でなければならず、用いられる量で実質的に非
毒性でなければならない。さらに、活性化合物は持続放出型の調製物および処方
物に配合することができる。

【００９４】治療有効性のスクリーニングおよびモニター本発明の範囲内において、処置の進行をモニターするために、あるいは処置の
一部としてモニターするために、細胞、腫瘍細胞または正常細胞または腫瘍細胞
と正常細胞との両方のいずれかが個体から取り出され得ることが考えられる。処
置の有効性は、クロマチンの凝縮レベルを測定するためにそのような細胞を取り
出して、ＤＡＰＩ染色によりそのような細胞を処理するによって、アポトーシス
のレベルを測定することによって、中性スフィンゴミエリナーゼの産生を測定す
ることによって、あるいは下記の方法などの他の方法によってモニターできると
考えられる。

【００９５】アポトーシスの誘導を定量する１つの具体的な方法は、ＤＮＡの一体性を測定
するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介のｄＵＴＰ−ビ
オチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイである（Ｇｏｒｃｚｙｃａ、１９
９３）。このアッセイは、酵素ターミナルトランスフェラーゼによる切断ＤＮＡ
鎖への標識ＵＴＰの取り込みをモニターすることによってＤＮＡの断片化を測定
する。取り込みは、エレクロスコピーあるいは細胞ソーティング方法論（例えば
、ＦＡＣＳ）によってモニターすることができる。

【００９６】処置の有効性をモニターできると考えられる別の方法は、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用である。

【００９７】ＥＬＩＳＡいくつかの好ましい免疫アッセイは、この分野で知られている様々なタイプの
ＥＬＩＳＡおよび放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を使用する免疫
組織化学的検出もまた特に有用である。しかし、検出はそのような技術に限定さ
れないことは容易に理解される。ウエスタンブロッティング、ドットブロッティ
ング、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＦＡＣＳ分析などもまた使用することができる。

【００９８】１つの例示的なＥＬＩＳＡにおいて、ＩＧＦγなどのサイトカインに対する抗
体が、ポリスチレン製マイクロタイタープレートのウエルなどのタンパク質親和
性を示す特定の表面に固定化される。次いで、反応物であるサイトカインを含有
する組成物がウエルに加えられる。結合させ、そして非特異的に結合した複合体
を除くために洗浄した後、結合したサイトカインとタンパク質との複合体を検出
することができる。検出は、一般に、検出可能な標識に結合された抗サイトカイ
ン抗体または抗腫瘍タンパク質抗体を加えることによって行われる。検出はまた
、第１の抗サイトカイン抗体または抗腫瘍タンパク質抗体を加え、その後、第１
の抗体に対する結合親和性を有し、検出可能な標識が結合している第２の抗体を
加えることによって行うことができる。

【００９９】用いられる形式にかかわらず、ＥＬＩＳＡは、コーティング、インキュベーシ
ョンまたは結合、非特異的に結合した分子種を除くための洗浄、および結合した
免疫複合体の検出などのいくつかの特徴を同様に有する。これらを下記に説明す
る。

【０１００】プレートを一次抗体でコーティングすることにおいて、プレートのウエルは、
抗体の溶液で、一晩または所定の時間にわたってインキュベーションされる。次
いで、プレートのウエルは、完全に吸着していない物質を除くために洗浄される
。次いで、ウエルの残っている利用可能な表面が、生体成分に対する結合に関し
て中性である非特異的なタンパク質で「コード」される。このようなタンパク質
には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、およびドライミルク溶液が含
まれる。コーティングによって、固定化表面での非特異的な吸着部位をブロッキ
ングすることができ、従って、タンパク質が非特異的に表面に結合することによ
って生じるバックグラウンドを減少させることができる。

【０１０１】本発明のＥＬＩＳＡにおいて、二次的または三次的な検出手段を使用すること
はより一般的であると考えられる。従って、第１のタンパク質をウエルに結合さ
せ、バックグラウンドを減少させる非反応性物質でコーティングし、次いで結合
しなかった物質を除くために洗浄した後、固定化表面は、タンパク質複合体を形
成させるのに効果的な条件下で第２の生物学的タンパク質と接触させられる。こ
の場合、複合体の検出には、標識された結合リガンドまたは抗体が必要である。

【０１０２】「タンパク質複合体を形成させるのに効果的な条件下で」は、そのような条件
が、好ましくは、腫瘍抗原およびサイトカインタンパク質を、ＢＳＡ、ウシガン
マグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ
などの溶液で希釈することを含むことを意味する。これらの加えられる薬剤はま
た、非特異的なバックグラウンドを減少させることを助ける傾向を有する。「適
切な」条件とは、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温
度および時間であることを意味する。インキュベーション工程は、典型的には、
約１時間〜２時間〜４時間であり、好ましくは２５℃〜２７℃の程度の温度であ
り、あるいは約４℃で一晩などであり得る。

【０１０３】ＥＬＩＳＡにおけるすべてのインキュベーション工程の後、複合体を形成して
いない物質が除かれるように接触表面が洗浄される。好ましい洗浄手順には、Ｐ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎなどの溶液、またはホウ酸緩衝液で洗浄することが含まれる。
試験サンプルと、最初に結合した物質との間で特異的な複合体を形成させ、続い
て洗浄した後、微量の結合した複合体の存在さえ検出することができる。

【０１０４】検出を行うために、好ましくは、検出を可能にする結合された標識を有する一
次抗体または二次抗体が提供される。好ましくは、標識は、適切な発色性基質と
インキュベーションしたときに発色をもたらす酵素である。従って、例えば、結
合した複合体は、免疫複合体を形成させるのに有利な時間および条件下で、ウレ
アーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはハイドロジェ
ンペルオキシダーゼとの結合抗体と接触させてインキュベーションすることがで
きる（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳ含有溶液において室温での２時
間のインキュベーション）。

【０１０５】標識抗体とインキュベーションし、続いて、未結合の物質を除くために洗浄し
た後において、標識の量が、例えば、尿素およびブロモクレゾールパープル、ま
たは酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には２，２’−アジノ−ジ（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）［ＡＢＴＳ］およびＨ₂Ｏ₂などの発色
性基質とインキュベーションすることによって定量される。この場合、定量は、
発色の程度を、例えば、可視分光光度計を使用して測定することによって行われ
る。

【０１０６】エキスビボ送達本発明において、ペプチドパルス化ＡＰＣおよびＩＬ−１２のいずれかまたは
その両方の全身的な送達が使用され得ることが考えられる。請求項に記載される
発明の実施において、エキスビボ操作によってＰＢＭＣを変化させたいことがさ
らに考えられる。エキスビボ遺伝子治療は、動物または患者から細胞を単離する
こと、核酸を細胞にインビトロで送達すること、次いで、改変された細胞を動物
またはヒトに戻すことをいう。これには、組織／器官を動物または患者から外科
的に取り出すこと、または細胞および組織の一次培養を含むことがある。

【０１０７】ＡＰＣは、全血の密度遠心分離によって単離されたＰＢＭＣから調製すること
ができる。骨髄から調製されるヒト単核細胞（ＭＮＣ）もまた、ＡＰＣとして使
用することができる。骨髄は、脛骨、大腿骨、脊椎、肋骨、骨盤、胸骨、ならび
に上腕骨、とう骨、尺骨、脛骨および腓骨から得ることができる。さらに、これ
らの細胞はまた、臍帯血、末梢血、またはサイトカイン動員末梢血から得ること
ができる。ヒト造血幹細胞の他の供給源には、胚卵黄嚢、胎児肝臓、胎児および
成人の脾臓、ならびに血液が含まれる。髄層を密度勾配で遠心分離して、チュー
ブの底部において、媒体の透明層、ＭＮＣおよび血漿媒体層を上部に含有する境
界層において赤血球のペレットを得る。次いで、境界層を、例えば、吸引を使用
して取り出すことができる。この層を１０００ｇで遠心分離することによって、
最終的にＭＮＣのペレットが得られる。次いで、このペレットを、ＦＡＣＳによ
る細胞ソーティングのために、適切な緩衝液に再懸濁することができる。単離さ
れたＭＮＣは、免疫学的に活性な細胞を拡大するためにインビトロで培養するこ
とができる。次いで、拡大された治療活性細胞は、ペプチドが負荷され、治療効
果を得るために患者に提供される。

【０１０８】ＡＰＣはまた、骨髄または末梢血に由来する樹状細胞であり得る。繊維芽細胞
はＡＰＣとして使用することができ、皮膚などの組織から培養することができる
。

【０１０９】下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにすることを目的とする
。下記の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において十分に機能する
ことが本発明者らにより発見された技術を表し、従って本発明の実施の好ましい
態様を構成していることが理解される。しかし、当業者は、本開示を考慮して、
多くの変化を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている
特定の実施形態において行うことができ、同様な結果または類似する結果が依然
として得られ得ることを理解しなければならない。

【０１１０】実施例１ペプチドパルス化ＡＰＣおよびｒｍＩＬ−１２による十分な免疫化は樹状細胞
を使用する必要性を回避する

【０１１１】材料および方法マウス。ＤＢＡ／２マウスを無パイロジェン施設で繁殖させて飼育した。８〜
１０週齢の雌性マウスを研究に使用した。

【０１１２】細胞株およびトランスフェクタント。Ｐ８１５肥満細胞種を、１０％ＦＣＳが
補充されたＤＭＥＭで培養し、３７℃および８％ＣＯ₂雰囲気下でインキュベー
ションした。Ｐ８１５の様々なクローンをこの研究に使用した：Ｐ１．ＨＴＲ、
高度のトランスフェクションが可能なＰ８１５の変化体；Ｐ１、Ｐ８１５の腫瘍
形成性クローン；Ｐ１９８、Ｐ８１５のｔｕｍ^-クローン；Ｐ５１１、Ｐ８１５
のアザグアニン耐性変化体；およびＰ１２０４、遺伝子Ｐ１Ａの欠失を有するＰ
８１５ＡＢ陰性変化体（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、１９８３）。Ｐ８１５．Ｂ７
−１細胞およびＰ１９８．Ｂ７−１細胞は、Ｐ１細胞およびＰ１９８細胞を、そ
れぞれ、ＰＣＲ^TMによりプラスミドｐｃＤＳＲαにクローン化されたＢ７−１ｃ
ＤＮＡ、およびネオマイシン耐性を付与するプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）とエレクトポレーションすること
によって得られた。Ｌ１２１０は、ＤＢＡ／２マウスに由来する白血病細胞株で
あり、Ｐ８１５細胞と同じ条件下で培養した。抗原Ｐ８１５ＡＢを発現するＬ１
２１０トランスフェクタント（Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ）は、Ｃ１Ａ．３．１コスミ
ド（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、１９９５）を、ネオマイシン耐性を付与するプラスミ
ドｐＳＶｔｋｎｅｏｂと同時エレクトロポレーションすることによって得られた
。Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７１細胞は、エレクトポレーションによって、（ピュ
ーロマイシン耐性遺伝子を含有する）プラスミドｐＥＦＢＯＳ（Ｇａｊｅｗｓｋ
ｉら、１９９５）にクローン化されたネズミＢ７−１ｃＤＮＡを用いてＬ１２１
０．Ｐ１Ａ細胞をトランスフェクションして、ピューロマイシインによる選抜お
よび限界希釈クローニングを行うことによって得られた。すべてのトランスフェ
クタントは、少なくとも２回の継代培養毎に選択薬物中で維持された；インビボ
注入のために、これらの細胞は、常に選択薬物の非存在下で培養されていた。

【０１１３】ＣＴＬクローン。ＣＴＬＰ１：５（抗原Ｐ８１５Ａに特異的なクローン）お
よびＰ１９８に特異的なｐ１９８．３ＣＴＬクローンを、放射線照射した５ｘ１
０⁶個のＤＢＡ／２脾臓細胞と、刺激因子としての放射線照射（１０，０００ｒ
ａｄ）した１０⁵個のＰ１細胞（クローンＰ１：５の場合）またはＰ１９８細胞
（クローンＰ１９８．３の場合）とを含有する１ｍｌの培養物で培養した。さら
に、培養は、サイトカインの供給源として、二次的な混合リンパ球培養（ＭＬＣ
）に由来する上清を５０％含有した。

【０１１４】腫瘍ペプチド。ペプチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製して、標準的な技術を
使用するアミノ酸分析によって特徴づけた。使用されたペプチドの一文字表記配
列を下記に示す：Ｈ−２Ｋ^d制限Ｐ１９８、ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ（配列番号１）
；およびＨ−２Ｌ^d制限Ｐ８１５ＡＢ、ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ（配列番号２）。

【０１１５】ｒｍＩＬ−１２。ｒｍＩＬ−１２の供給源として、最初の研究を、記載（Ｆａ
ｌｌａｒｉｎｏら、１９９６）に従ってトランスフェクションした哺乳動物細胞
で発現させて、それから精製したヘキサヒスチジン標識ＩＬ−１２融合タンパク
質を使用して行った。主要な研究はすべて、高度に精製されたｒｍＩＬ−１２を
使用して繰り返した。

【０１１６】抗原提示細胞の精製および調製。未処理のＤＢＡ／２雌性マウスから得られた
脾臓細胞を、下記の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための供給源として使用
した。

【０１１７】樹状細胞（ＤＣ）；脾臓細胞を、０．５％の正常マウス血清（ＮＭＳ）を含有
する培地で２回洗浄し、３７℃で２時間接着させた（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、１９
７９）。プレートを同じ培地で３回洗浄し、３７℃で一晩インキュベーションし
た。この２回目のインキュベーションを行った後、非接着性細胞をＤＣとして集
めた。ＦＡＣＳ分析によって、ｍＡｂＮ４１８を用いた染色によって評価され
る場合、７０％〜９０％がＤＣであることが示された。

【０１１８】未分画脾臓細胞；ＤＢＡ／２脾臓細胞の集団を、０．５％ＮＭＳを含有する培
地で２回洗浄し、次いで計数し、特異的腫瘍ペプチドとともにインキュベーショ
ンしてインビボまたはインビトロでの研究において使用した。

【０１１９】ＬＰＳブラスト（ｂｌａｓｔ）；この場合、脾臓細胞の懸濁物（１０ｘ１０⁶
／ｍｌ）を、１０ｃｍ²の組織培養ディッシュにおいて、ＬＰＳ（２５μｇ／ｍ
ｌ）の存在下、０．５％ＮＭＳを含有する培地で、３７℃で４８時間培養した。
次いで、生存する細胞を集め、３回洗浄して過剰なＬＰＳを除いた。抗Ｂ２２０
ｍＡｂおよび抗ＩｇＭを用いたＦＡＣＳ分析によって、約８０％の細胞が活性化
Ｂ細胞であることが示された。

【０１２０】休止Ｂ細胞；脾臓細胞を、０．５％ＮＭＳを含有する培地で２回洗浄し、３７
℃で２時間接着させた。非接着性細胞を除き、２回洗浄し、抗Ｔｈｙ−１ｍＡｂ
および抗ＭＡＣ−１（Ｍ１７０）ｍＡｂとともに４℃で３０分間インキュベーシ
ョンした。洗浄後、抗体と結合した細胞を、ウサギの補体を用いて３７℃で３０
分間処理することによって溶解した。細胞を再び洗浄し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐ
ａｑｕｅ上で沈降させた後に残った細胞を回収した。回収された細胞の９８％以
上が、抗Ｂ２２０抗体および抗ＩｇＭ抗体を用いたＦＡＣＳ分析に基づいてＢ細
胞であった。

【０１２１】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）；約１ｍｌの血液を、数匹のＤＢＡ／２マウスの
眼窩後から得た。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、単核細胞画分をＦｉｃｏ
ｌｌ勾配精製の後で回収した。

【０１２２】ＦＡＣＳ分析。１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＣＳおよび０．０２％ア
ジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）中の１ｘ１０⁶細胞を、ｖ底マイクロタイタ
ープレートにおいて、ＭＨＣのクラスＩに特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（３０−
６−７Ｓ）、Ｉ−Ａ^dに特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（ＭＫＤ６）、Ｂ７−１に
特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（１６−１０Ａ１）、Ｂ７−２に特異的なＦＩＴＣ
結合ｍＡｂ（ＧＬ１）、ＣＤ１１ｃに特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（Ｎ４１８）
またはＢ２２０に特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（ＲＡ３−６Ｂ２）を用いて４℃
で３０分間染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ
フローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＳａｎＪｏｓｅ
、ＣＡ）で分析した。１０，０００個の細胞を各サンプルについて集めた。デー
タを、ＬｙｓｉｓＩＩソフトウエアを使用することによって分析した。

【０１２３】ペプチドを用いたインビトロパルス化および腫瘍ペプチドパルス化ＡＰＣによ
る免疫化。すべてのペプチドパルス化を、ＦＣＳまたは他のタンパク質の非存在
下、ＤＰＢＳ中でのみ行った。ＡＰＣをＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄し、
５０ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）においてＰＢＳ中に５〜１０
ｘ１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を、５〜１０ｍｌの総容量において、Ｐ
１９８ペプチドまたはＰ１Ａペプチド（１μＭまたは１０μＭ）のいずれかとと
もに、時々攪拌しながら３７℃で１〜２時間インキュベーションした。次いで、
細胞を洗浄し、放射線照射（２０００ｒａｄ）を行い、各実験に関して示された
数のパルス化細胞が１００μｌのＤＰＢＳに送達され得るように再懸濁した。Ｄ
ＢＡ／２マウスを、両方の後肢肉趾に、１００ｍｌ中での示された細胞数（また
はＤＰＢＳのみ）で毎週免疫化した。いくつかの実験において、同じ細胞に、ｒ
ｍＩＬ−１２（肉趾あたり５０μｌに１０ｎｇ）が同時に投与され、その後、さ
らに、ｒｍＩＬ−１２が１日目および２日目に各肉趾に注射された。

【０１２４】混合リンパ球−腫瘍培養（ＭＬＴＣ）。ＭＬＴＣを、応答性リンパ球の供給源
として脾臓細胞またはＰＢＭＣのいずれかを使用して行った。脾臓細胞（５ｘ１
０⁶個）は、放射線照射（１０，０００ｒａｄ）した２ｘ１０⁵個のＰ１９８細胞
またはＬ１２１０．Ｐ１Ａ細胞で刺激されたか、あるいはＢ７−１でトランスフ
ェクションされた同じ細胞で刺激されたた。細胞を２４ウエルプレートにおいて
ウエルあたり２ｍｌ中でインキュベーションし、ＣＴＬ活性を６〜７日後に測定
した。末梢血リンパ球の刺激は、３ｘ１０⁵個のＦｉｃｏｌｌ精製ＰＢＭＣを、
１０⁵個の放射線照射刺激細胞（１０，０００ｒａｄ）および２ｘ１０⁶個の放射
線照射（２０００ｒａｄ）した正常な同系脾臓細胞と、４８ウエルプレートのウ
エルあたり１ｍｌで混合することによって行われた。ＣＴＬ活性を６〜７日後に
測定した。

【０１２５】クロム放出アッセイ。エフェクター細胞を、二連で、ｖ底マイクロタイタープ
レートで希釈し、最終容量が２００μｌの完全培地中で、２０００⁵¹Ｃｒ標識の
標的細胞と混合した。いくつかの実験では、エフェクター細胞に加える前に、１
０⁵個の非放射性競合細胞を標識標的細胞と混合した。３７℃で４時間インキュ
ベーションした後で上清を集め、放射能を、９６ウエルプレートカウンター（Ｐ
ａｃｋａｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。⁵¹Ｃｒの特異的
な放出の割合を記載に従って計算した。

【０１２６】インビボ腫瘍保護アッセイ。最後の免疫化を行った２週間後、マウスは、１ｘ
１０⁶個のＰ１．ＨＴＲ腫瘍細胞を１００μｌのＤＰＢＳで左脇腹にｓ．ｃ．注
射することによって抗原投与された。腫瘍サイズを、最大直径および最小直径を
測定することによって１週間について２回評価した。データは、各時点での腫瘍
直径の平均値として報告される。すべての実験は群あたり５匹のマウスを含み、
少なくとも２回繰り返した。

【０１２７】結果Ｐ１９８ペプチドパルス化脾臓由来樹状細胞は、Ｐ１９８に特異的なＣＴＬク
ローンによって認識されるが、Ｐ１９８に特異的なＴ細胞応答をインビボで効率
的に開始させることができない。ヒトのガン患者に適用できる腫瘍抗原ペプチド
に基づく免疫化法にするために、ペプチドパルス化樹状細胞を用いるワクチン接
種法をＰ８１５ネズミ腫瘍モデルで検討した。いくつかの腫瘍抗原遺伝子がＰ８
１５変化体およびその「ｔｕｍ^-」変化体からクローン化され、ＣＴＬによって
認識される特異的な抗原ペプチドが特徴づけられている。Ｋ^d制限抗原Ｐ１９８
およびＬ^d制限抗原Ｐ１Ａ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、１９８０）を詳しく調べ
た。樹状細胞を、Ｓｔｅｉｎｍａｎによって最初に記載された接着／脱接着法（
Ｓｔｅｉｎｍａｎら、１９７９）を使用してＤＢＡ脾臓から精製した。この方法
で単離されたＤＣは、＞９０％がＮ４１８⁺であり、高レベルのＢ７−１、Ｂ７
−２ならびにＭＨＣのクラスＩおよびクラスＩＩの分子を発現した（図１）。こ
れらの分子はまた、初期の同種異系の混合リンパ球反応における刺激において非
常に効果的であった。機能的なペプチド／ＭＨＣ複合体を細胞表面に提示するｓ
ＤＣの能力を評価するために、それらを様々な用量のＰ１９８ペプチドでパルス
化し、次いで、特異的なＣＴＬクローンのＣＴＬＰ１９８．６の存在下で培養
した。特異的なＰ１９８ペプチドでパルス化されたｓＤＣは、０．１ｎＭもの低
い濃度において用量依存的様式でＣＴＬＰ１９８．６によるＴＮＦの分泌を刺
激した（図２）。刺激の平坦化が約１００ｎＭのペプチドで生じた。Ｐ１９８ペ
プチドの非存在下で、あるいはＣＴＬクローンの非存在下で誘導されたｓＤＣは
、特異的なサイトカイン産生をもたらさなかった（図２）。

【０１２８】次に、Ｐ１９８ペプチドでパルス化されたｓＤＣを使用して、同系のＤＢＡマ
ウスをインビボで免疫化した。未処理のＤＢＡ／２マウスには、１μＭのＰ１９
８ペプチドがインビトロでパルス化された５ｘ１０⁵個のｓＤＣを３週間連続し
て毎週接種した。この濃度は、ＣＴＬクローンに関してインビトロで認められた
刺激の平坦化レベルがインビボで維持され得ることを確実にするが、低親和性の
ＴＣＲのＴ細胞を優先的に生成し得るあまりにも大きなペプチド濃度を避けるた
めに選ばれた。パルス化細胞を、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．または肉趾内（ｆ．ｐ．）
のいずれかで注射した。コントロール群にはＰＢＳを注射したか、またはペプチ
ドパルス期間中、ＰＢＳ中でのみインキュベーションされたｓＤＣを注射した。
３回目の免疫化を行った２週間後、脾臓細胞を集め、６日目のＭＬＴＣにおいて
インビトロで刺激した。免疫化スケジュールの一般的順序を図３に示す。刺激因
子細胞における同時刺激分子Ｂ７−１の存在により、抗腫瘍ＣＴＬ応答の検出が
改善され得ることが以前に示されている（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、１９９６）ので
、２つの異なる刺激条件を、ＭＬＴＣにおいて、コントロールのＰ１９８腫瘍細
胞またはＢ７−１トランスフェクションＰ１９８腫瘍細胞のいずれかで使用した
。溶解活性をＰ１９８および陰性のコントロール細胞株Ｐ５１１で試験した。図
４に示されているように、特異的なＣＴＬ誘導が、肉趾またはｉ．ｖ．のいずれ
かの免疫化経路を使用した場合、わずかに１０〜２０％のマウスで検出された。
Ｐ１９８ペプチドパルス化ｓＤＣがｉ．ｐ．投与された場合には、特異的なＣＴ
Ｌは検出されなかった。ＣＴＬ活性の大きさおよび特異的な細胞傷害性を有する
マウス数は、インビトロでの刺激が、同時刺激分子Ｂ７−１を発現する細胞の存
在下または非存在下で行われたときと同じであった（図４）。これらの結果は、
Ｐ１９８ペプチドでパルス化されたｓＤＣは、分化したＣＴＬクローンにインビ
トロでペプチドを正しく提示することができたが、大部分のマウスにおいて検出
可能なＣＴＬ活性をインビボで効率的に生じさせることができなかったことを示
している。

【０１２９】ｒｍＩＬ−１２との組み合わせでＰ１９８パルス化ｓＤＣにより免疫化された
マウスにおけるＣＴＬ応答。免疫原性Ｐ８１５腫瘍変化体がインビボで拒絶され
るときのＩＬ−１２の重要性は以前に明らかにされ（Ｆａｌｌａｒｉｎｏら、１
９９６）、そしてこのサイトカインは溶解性Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型を促進し得る
ので、外因性ｒｍＩＬ−１２を、Ｐ１９８パルス化ｓＤＣとともに免疫化プロト
コルのときに投与した。すべてのその後の免疫化を肉趾経路で行った。未処理の
ＤＢＡ／２マウスを、上記のように、１μＭのＰ１９８ペプチドでパルス化され
たｓＤＣで３週間連続して毎週免疫化した。さらに、ｒｍＩＬ−１２（１日あた
り肉趾について１０ｎｇ）を、免疫化当日およびその後の２日間、同じ部位に注
射した（図３）。コントロールマウスには、ペプチドの非存在下でインキュベー
ションされたｓＤＣ、ｓＤＣおよびｒｍＩＬ−１２、またはＰＢＳが投与された
。表１に示されるように、ペプチドパルス化ｓＤＣとともにｒｍＩＬ−１２を同
時に投与することによって、１００％のマウスにおいて特異的な抗Ｐ１９８細胞
溶解活性が得られたが、Ｐ１９８ペプチドパルス化ｓＤＣの注射は特異的なＣＴ
Ｌ活性を誘発しなかった。以前に認められているように、特異的なＣＴＬを検出
する能力は、Ｐ１９８．Ｂ７−１細胞を使用してＭＬＴＣにおいて刺激すること
によって改善されなかった。さらに、これらの実験において、匹敵し得るレベル
の溶解活性が、脾臓またはＰＢＭＣを抗原刺激化Ｔ細胞の供給源として使用した
ときに検出された（表４）。特異的なＣＴＬ生成を評価するためにＰＢＭＣをＴ
細胞の供給源として使用することによって、臨床的適用により近づいたシステム
が得られ、さらに、抗腫瘍免疫性の継続期間および腫瘍攻撃を拒絶する免疫化マ
ウスの能力を決定するためにマウスを生存させることができた。すべてのその後
のＣＴＬ測定は、ＰＢＭＣを使用して評価された。０日目だけに１回の大きな用
量ではなく、むしろ、０日目、１日目および２日目に低用量のｒｍＩＬ−１２を
投与することの根本的理由は、ＩＬ−１２を全身に分布させようとすることより
もむしろ、局所的な排液性リンパ節に対するＩＬ−１２の作用を偏らせることで
あり、そしてＴ細胞がＡＰＣと接触することが予想されるときに、ＩＬ−１２が
局所的なリンパ節を浸すことを確実にすることであった。実際、ｒｍＩＬ−１２
が各免疫化の０日目にだけ投与された場合、特異的なＣＴＬ活性が、より少数の
マウスにおいて検出された。他の研究において、ＩＬ−１２が０日目にだけ投与
された場合、ＣＴＬ活性は検出されなかった。まとめると、これらの結果は、外
因性ＩＬ−１２が同様に同時投与されたときに、Ｐ１９８ペプチドパルス化ｓＤ
Ｃによる免疫化はＣＴＬ応答を誘発することにおいてはるかに効果的であったこ
とを明らかにする。

【０１３０】

【表４】

【０１３１】^* ＤＢＡ／２マウス（６匹／群）を、図３に示されているように、１μＭのＰ１
９８ペプチドでパルス化された５ｘ１０⁵個のｓＤＣで免疫化した。ｒｍＩＬ−
１２を、各免疫化の０日目にだけ、あるいは０日目、１日目および２日目に注射
した。細胞溶解活性を、３回目の免疫化を行った２週間後に、脾臓細胞（第１欄
）またはＰＢＭＣ（第２欄）のいずれかを応答性細胞の供給源として使用して分
析した。マウスは、Ｅ：Ｔ比が１００：１における特異的な溶解が２５よりも大
きい場合、およびＰ１９８の溶解とＰ５１１の溶解との差が１５よりも大きい場
合に陽性と見なされた。

【０１３２】Ｐ１９８ペプチドパルス化脾臓細胞、Ｂ細胞またはＰＢＭＣによる免疫化は、
ｒｍＩＬ−１２が同時に投与された場合にインビボでＣＴＬ活性を誘導する。パ
ルス化ｓＤＣがインビボで免疫化する能力がＩＬ−１２により高められ得ること
によって、より簡便に得ることができ、従って、ヒトの免疫化プロトコルへの適
用がより容易になるＡＰＣの他の供給源を調べることが促進された。通常的には
、良好でないＡＰＣであるか、または単独で使用された場合には免疫寛容でさえ
ある細胞タイプを調べることもまた望ましかった。本発明者らの推論は、ＩＬ−
１２の投与によって、任意のクラスＩ⁺細胞は、インビボでの再拒絶のときにＣ
ＴＬ応答を開始させ得るということであった。この目的に対して、未分画の脾臓
細胞、ＰＢＭＣ、休止Ｂ細胞またはＬＰＳ活性化Ｂ細胞を未処理のＤＢＡ／２マ
ウスから調製した。図１には、これらの細胞集団に対するＭＨＣのクラスＩ分子
およびクラスＩＩ分子の発現レベル、ならびに同時刺激分子のＢ７−１またはＢ
７−２のレベルが示されている。

【０１３３】未分画の脾臓細胞およびＰＢＭＣを最初に調べ、ｓＤＣと比較した。これらの
実験において、各ＡＰＣ集団を等濃度のＰ１９８ペプチド（１μＭ）でパルス化
したが、マウスには、様々な数のペプチド負荷ＡＰＣを注射した。図５の結果に
より、パルス化ｓＤＣ単独による３回の毎週の免疫化は検出可能なＣＴＬを誘導
しなかったが、ｒｍＩＬ−１２のさらなる投与は１００％のマウスにおいてＣＴ
Ｌ活性が生じたことが確認される。驚くべきことに、ｒｍＩＬ−１２が免疫化プ
ロトコルで誘導された場合のみを除いて、Ｐ１９８ペプチドパルス化した全脾臓
細胞またはＰＢＭＣによる免疫化によってもまた、ＣＴＬ活性が十分に誘導され
た（図５）。しかし、ｓＤＣの場合に使用された数（５ｘ１０⁵個）と等価な数
の細胞で免疫化された少数のマウスの場合だけを除いて、より大きな数の脾臓細
胞またはＰＢＭＣ（１〜２０ｘ１０⁶個）がマウスに注射されたときにだけ、特
異的なＣＴＬ活性が誘導された。

【０１３４】脾臓細胞またはＰＢＭＣの塊は、定量的にはｓＤＣよりも効果的でないと考え
られた。なぜなら、脾臓細胞またはＰＢＭＣはペプチドとあまりよく結合しない
か、またはそうでなければ、Ｔ細胞との相互作用が悪いからであり、あるいは、
脾臓細胞またはＰＢＭＣは、Ｔ細胞の免疫刺激を実際に行う少数のＤＣをその内
部に含有しているからである。これらの点の取り組みを始めるために、Ｐ１９８
ペプチドでパルス化されたこれらの様々なＡＰＣが特異的な抗Ｐ１９８ＣＴＬク
ローンによるサイトカイン放出をインビボで刺激する能力を調べた。さらに、脾
臓Ｂ細胞を精製して、混在するＤＣの大部分を除き、ＬＰＳブラストを同様に比
較した。同じ数（１ｘ１０⁴個）の各ＡＰＣタイプを、Ｐ１９８ペプチドで濃度
を増大させながらパルス化し、放射線照射し、洗浄して、ＣＴＬクローンＰ１９
８．６とともに培養した。ＩＮＦ−γ含有量を４８時間後に上清で調べた。図６
に示されているように、各ＡＰＣタイプはＣＴＬクローンＰ１９８．６を刺激す
ることができた。しかし、脾臓細胞、ＰＢＭＣまたは休止Ｂ細胞を使用したとき
には、ｓＤＣと比較して、匹敵し得る応答を得るために、より大きなペプチド濃
度が必要であることが明らかであった。これらの結果は、ｓＤＣならびに他のタ
イプのＡＰＣは腫瘍ペプチドＰ１９８を特異的なＰ１９８．６ＣＴＬクローンに
提示することができたが、非ＤＣ性ＡＰＣは、Ｔ細胞との相互作用において、細
胞基準であまり効果的なかったことを示している。このような不完全性は、非Ｄ
Ｃ性ＡＰＣに関して、より大きなペプチド濃度を使用することによって克服する
ことができる。

【０１３５】次いで、より大きなペプチド濃度を使用することの作用を、インビボでの免疫
化のときに検討した。マウスを、前記のように、様々な数のＰ１９８ペプチドパ
ルス化したＢ細胞、脾臓細胞またはＰＢＭＣで、ｒｍＩＬ−１２とともに、０日
目、１日目および２日目に免疫化した。しかし、非ＤＣ性ＡＰＣを１０μＭペプ
チドで負荷し、一方、ｓＤＣを免疫化の前に１μＭのペプチドで負荷した。図７
に示されているように、１０倍大きなペプチド濃度が非ＤＣ性ＡＰＣ集団のパル
ス化のために使用されたときに、匹敵し得るレベルのＣＴＬ活性が細胞基準で誘
導された。精製されたＢ細胞が効果的に免疫化したという事実は、ＡＰＣ集団に
混在するＤＣが実際の免疫刺激を行い得る可能性に対する反証である。従って、
インビボで免疫化する、ＡＰＣのような非ＤＣの相対的な非効率性は、パルス化
細胞の数を増大させること、あるいはパルス化のために使用されるペプチドの濃
度を増大させることのいずれかによって克服することができる。

【０１３６】Ｐ８１５−ＡペプチドおよびＩＬ−１２でパルス化されたＰＢＭＣによる免疫
化は、生きた腫瘍の攻撃に対する保護を誘導する。ＰＢＭＣはヒト患者から容易
に得ることができることによって、ペプチド負荷ＰＢＭＣおよびＩＬ−１２は臨
床的に適用するための注目される方法になる。この可能性は、腫瘍ペプチドおよ
びＩＬ−１２でパルス化されたＰＢＭＣを投与することによって誘導される特異
的なＣＴＬの生成が、免疫化に使用されるエピトープを発現する腫瘍による攻撃
を拒絶する能力とも相関しているかどうかの検討を促進させた。この可能性を分
析するために、別のＰ８１５関連ペプチドを使用する必要があった。なぜなら、
Ｋ^dの関連でＰ１９８エピトープを発現する細胞株は、インビボでは自然に拒絶
されるｔｕｍ退行性細胞株であるからである。Ｌ^dによって提示されるタンパク
質Ｐ１Ａ（Ｌｅｈｅら、１９９２）の残基３５〜４３に対応するノナマーＰ８１
５Ａが選ばれた。実際、Ｐ１Ａは良好な抗原モデルである。なぜなら、ヒト腫瘍
におけるＭＡＧＥ遺伝子ファミリー（ＤｅＰｌａｅｎら、１９９４）と同様に
、Ｐ１Ａ遺伝子はいくつかのネズミ肥満細胞細胞株で発現しているが、精巣およ
び胎盤を除く成体組織では発現していないからである（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら
、１１９７）。

【０１３７】Ｐ１９８に関して、インビボにおいてＰ８１５Ａペプチドで負荷されたｓＤＣ
、全脾臓細胞、Ｂ細胞またはＰＢＭＣはすべて、インビボでこのエピトープを正
しく特異的な抗Ｐ８１５ＣＴＬ（Ｐ１：５と呼ばれる）に提示することができた
。Ｐ１９８に関して効果的であった同じパルス化法および免疫化法を使用して、
ＰＢＭＣをＰ８１５Ａペプチド（１０μＭ）で負荷し、ｒｍＩＬ−１２とともに
インビボで投与した。コントロールマウスには、ペプチドの非存在下およびＩＬ
−１２とともにインキュベーションされたＰＢＭＣ、ＩＬ−１２を伴わないＰＢ
ＭＣおよびペプチド、またはビヒクルＰＢＳのみが投与された。最後の免疫化を
行った２週間後に、すべてのマウスを、６日間のＭＬＴＣを行った後の末梢血に
おいて特異的な抗Ｐ８１５ＡのＣＴＬ活性について調べた。この場合も同様に、
２つの異なる刺激因子細胞をインビトロＭＬＴＣに使用した。１つは、遺伝子Ｐ
１Ａを発現するようにトランスフェクションされた同系の腫瘍Ｌ１２１０（Ｌ１
２１０．Ｐ１Ａ）であり、もう一方は、Ｐ１ＡおよびＢ７−１を発現する二重ト
ランスフェクタントであるＬ１２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７１細胞株であった。溶解活
性を、抗原Ｐ８１５Ａを発現するＰ８１５に対して調べ、そして遺伝子Ｐ１Ａの
発現を失ったＰ８１５変化体（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、１９８３）である陰性
コントール細胞株Ｐ１２０４について調べた。非特異的な溶解活性を除くために
、アッセイを、５０倍過剰量のＰ１２０４非標識（すなわち、非放射能）競合標
的細胞の存在下で行った。図８に示されているように、効果的なＣＴＬ誘導が、
マウスをｒｍＩＬ−１２とともにペプチド負荷ＰＢＭＣで免疫化したときにだけ
、１００％のマウスで得られた。Ｐ１９８ペプチドの場合に認められたこととは
対照的に、刺激因子細胞でのＢ７−１の発現は、ＭＬＴＣの感度を実際に増大さ
せ、より大きな検出可能なＣＴＬ活性が得られた。ＰＢＭＣに加えて、Ｐ１Ａペ
プチドパルス化脾臓細胞またはｓＤＣもまたＣＴＬ活性をインビボで十分に誘導
した。

【０１３８】上記のように、末梢血に由来するＣＴＬ活性を測定することによって、生きた
腫瘍によって攻撃される同じマウスを保護について評価することができる。ＣＴ
Ｌアッセイを行った１０日後、処置したマウスにＰ１．ＨＴＲ腫瘍細胞（１ｘ１
０⁶個）を脇腹の皮下に投与した。Ｐ１．ＨＴＲは、Ｐ８１５Ａエピトープを発
現するＰ８１５の高度トランスフェクション可能な変化体であり、固形腫瘍とし
てインビボで増殖し、未処理の同系ＤＢＡ／２マウスの約９０％で連続的に増殖
する（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、１９９６）。図９の結果は、Ｐ８１５Ａパルス化Ｐ
ＢＭＣおよびｒｍＩＬ−１２で免疫化されたマウスは特異的な抗Ｐ８１５ＡＣ
ＴＬを獲得しただけでなく、同じ抗原を発現する腫瘍による攻撃に対しても保護
されることを示している。同時に行われた実験において、免疫化されたマウスは
、Ｐ８１５のＰ１Ａ陰性変化体Ｐ１２０４を拒絶しなかった。このことは、抗原
特異性を示している。対照的に、マウスは、ｒｍＩＬ−１２が投与されす、Ｐ８
１５Ａペプチドで負荷されたＰＢＭＣが注射されたマウス、または未処理のＰＢ
ＭＣおよびｒｍＩＬ−１２が注射されたマウスは腫瘍攻撃から保護されなかった
（図９）。従って、ペプチドパルス化ＰＢＭＣおよびＩＬ−１２がＣＴＬ活性を
誘導する能力と腫瘍攻撃から保護する能力との間における良好な相関は明らかで
あった。実際、ＩＬ−１２の非存在下でのペプチド負荷ＰＢＭＣによる免疫化は
、特異的な抗腫瘍ＣＴＬの生成を促進することができないように、インビボで保
護的な免疫性を誘導しなかった。

【０１３９】実施例２転移性メラノーマ患者に対する効果的な腫瘍抗原特異的免疫化の代用アッセイ組織培養技術。Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉら（１９７４）の一般的な方法を、いくら
かの改変（ＧｌａｓｅｂｒｏｏｋおよびＦｉｔｃｈ、１９８０）をとともに使用
して、マウスのリンパ様細胞を培養した。すべてに細胞株をマイコプラズマに関
して定期的にスクリーニングして、マイコプラズマを含まない実験を維持するよ
うに注意した。ネズミ細胞に使用された基本培地はＤＭＥＭであり、ヒト細胞に
使用された基本培地はＲＰＭＩである。

【０１４０】ＡＰＣ部分集団の単離。脾臓を、麻酔をかけて頸部を脱臼させたマウスから手
術によって取り出す。細胞懸濁物をすりガラスの組織グラインダーによる均質化
によって調製し、結合組織片を３０秒間の低速遠心分離によって分離する。樹状
細胞を、新鮮な脾臓細胞を組織培養ディッシュで１．５時間培養し、非接着性細
胞を洗浄して除き、次いで、培養培地において３７℃で一晩培養することによっ
て調製する。非接着性細胞を穏やかな洗浄によって単離する。これらは、主とし
て樹状細胞である（Ｉｎａｂａら、１９８７）。Ｂ細胞を、接着性細胞の除去、
抗Ｔｈｙ−１ｍＡｂおよび補体によるＴ細胞の枯渇化、ならびにＰｅｒｃｏｌｌ
密度遠心分離によって精製する（Ｓｔａｃｋら、１９９４）。

【０１４１】マウスにおけるインビボ腫瘍研究。免疫化のために、２〜１０ｘ１０⁵個の様
々な種類のペプチドパルス化ＡＰＣを、容量が５０μｌのＤＰＢＳで調製する。
それらを１ｃｃのシリンジで２３ゲージの針により注射する。注射部位には、後
肢肉趾または脇腹の皮下、または尾静脈による静脈内が含まれる。生きた腫瘍細
胞の接種は、通常、脇腹の皮下に行われる。Ｐ１．ＨＴＲおよびそれ以外のＰ８
１５変化体の場合、５ｘ１０⁵個の細胞が、大部分のマウスにおける腫瘍増殖を
得るために使用された。腫瘍サイズを最大直径および最小直径で測定し、平均値
を各時点で計算する。動物に対する苦痛を最小限にするあらゆる努力を行う。

【０１４２】細胞溶解アッセイ。細胞溶解を、⁵¹Ｃｒ放出アッセイを使用して測定する。エ
フェクター細胞を集め、計数して、２ｘ１０⁶／ｍｌの濃度で再懸濁する。アッ
セイすべき標的をＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄で負荷し、洗浄して、２ｘ１０⁵／ｍｌで再懸
濁する。エフェクター細胞の連続希釈物をＶ底マイクロタイタープレートにおい
て１００μｌの容量で作製し、等容量の標識標的を加える。非放射能標の阻害の
ために、２０倍〜５０倍過剰の未標識標的をウエル毎に加える。プレートを軽く
遠心分離し、３７℃で４時間〜５時間インキュベーションする。⁵¹Ｃｒ放出を、
９６ウエルプレートガンマカウンターを使用して上清から測定する。自発的な放
出を標的細胞単独から測定する。最大放出を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解し
た標的細胞から測定する。⁵¹Ｃｒ放出の最大割合を記載（Ｌａｎｃｋｉら、１９
８７）に従って計算する。

【０１４３】ＥＬＩＳＡによるサイトカインアッセイ。いくつかのサイトカインを標準的な
ＥＬＩＳＡ技術によってアッセイする。調べられた主要なサイトカインは、ＩＦ
Ｎ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−４である。簡単に記載すると、９６
ウエルプレートを関連する抗サイトカインｍＡｂでコーティングし、洗浄し、次
いで非特異的ま結合を防止するためにタンパク質含有緩衝液でブロッキングする
。プレートを洗浄し、試験上清または標準品（通常、組換え体のサイトカイン）
の連続希釈物を二連で調製する。再度のインキュベーションおよび洗浄を行った
後、二次の抗サイトカインＡｂを加え、プレートをインキュベーションする。洗
浄後、プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合の三次Ａｂ、その後、着色
産物を生成する基質を使用して発色させる。プレートをＥＬＩＳＡリーダーで読
み取る。半最大希釈を標準と比較して、ｐｇ／ｍｌまたはＵ／ｍｌに換算する。

【０１４４】ＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａｎ−Ａの遺伝子発現に関するＰＣＲ^TM。ＭＡＧＥ
−３遺伝子またはＭｅｌａｎ−Ａ遺伝子の発現に関する腫瘍サンプルのＰＣＲ^TM 分析を、当業者によく知られている技術を使用する臨床免疫化プロトコルの一部
として行う。簡単に記載すると、凍結または新鮮な腫瘍サンプルに由来するメッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、グアニジン／塩化セシウム法を使用して単離
する。ｃＤＮＡを、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）₁₅を使用して標準的な方法
に従って調製する。

【０１４５】ＭＡＧＥ−３遺伝子およびＭｅｌａｎ−Ａ遺伝子の発現に関する腫瘍サンプル
のＲＴ−ＰＣＲ^TM分析を、下記のオリゴヌクレオチドおよびプログラムを使用し
て行う。ＭＡＧＥ−３のＰＣＲ^TMのために使用されるオリゴヌクレオチドプライ
マーを下記に示す。センス： 5(TGGAGGACCAGAGGCCCCC3( （配列番号３）アンチセンス： 5(GGACGATTATCAGGAGGCCTGC3( (配列番号４）

【０１４６】Ｍｅｌａｎ−ＡのＰＣＲ^TMのために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー
を下記に示す。センス：5(CTGACCCTACAAGATGCCAAGAG3( （配列番号５）アンチセンス：5(ATCATGCATTGCAACATTTATTGATGG3( （配列番号６）

【０１４７】 β−アクチンのコントロールに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを下記
に示す。センス：5(GGCATCGTGATGGACTCCG3(（配列番号７）アンチセンス：5(GCTGGAAGGTGGACAGCGA3(（配列番号８）

【０１４８】ＰＣＲ^TMを、５８℃のアニーリング温度で４０サイクル行う。ＰＣＲ^TM産物を
、１．５％ＥｔＢｒ染色アガロースゲルを使用して可視化する。ＰＣＲ^TM産物の
予想されるサイズは、ＭＡＧＥ−３の場合には７２５ｂｐであり、Ｍｅｌａｎ−
Ａの場合には６０５ｂｐであり、β−アクチンの場合には６１５ｂｐである。定
量化は行わなかった。

【０１４９】非常に少量の組織が得られた場合（例えば、ＣＴ誘導コア生検）、２回目のネ
スティッドＰＣＲ^TMを、実施例６に記載されている１回目よりも内部の１組のプ
ライマーを用いて行う。

【０１５０】ＨＬＡタイピング。当業者に周知の標準的方法を用いて、ＭＨＣクラスＩだけ
についてのＨＬＡタイピングを実施する。

【０１５１】ヒトＰＢＭＣの分離。各々の予定された免疫化の前及び最終免疫処置から３週
間後に、各患者から末梢血（約１００‐１５０ｃｃ）をヘパリンと共に採集する
。細胞をＤＰＢＳで２：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｈｙｐａｑｕｅ又はＬｙｍ
ｐｈｏｐｒｅｐ勾配に入れて、室温で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。
界面から単核細胞を採取し、ＤＰＢＳで洗浄して計数する。次にそれらを臨床プ
ロトコールで指示されているようにワクチン用又は凍結保存用に調製する。

【０１５２】細胞の凍結保存。約１０×１０⁶細胞を、５０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳ
Ｏ、及び４５％ＤＭＥＭ（マウス細胞用）又はＲＰＭＩ（ヒト細胞用）のいずれ
かを含む媒質１ｍｌに懸濁する。ラベルを貼付したバイアルを＜７０℃でひと晩
断熱室に置き、長期間保存のために液体窒素に移す。治療するメラノーマ患者か
らのＭＡＧＥ‐３特異的ＣＴＬ活性を測定するため、１本のバイアルの保存細胞
を解凍し、細胞を洗浄して計数する。次にそれらをプロトコールで指示されてい
るようにｉｎｖｉｔｒｏで刺激して増殖させる。

【０１５３】統計方法。各々の小さな用量コホート内で認められる毒性の頻度と治療によっ
て誘導される免疫学的変化を記述するために記述統計を作製する。しかし、予定
されている第ＩＩ相投与でえ、より正式な統計的推論が可能となるはずである。
処置の前に認められた免疫応答を対応あるｔ検定を用いて各々の免疫処置後の応
答と比較する。患者間で様々な基線レベルが予想されるので、対数変換を使用し
、処置後と基線応答間の平均比率について９５％信頼区間を作製する。さらに、
何回もの治療サイクルにわたる応答のパターンを調べるため、反復測度分散分析
を用いて基線値と各々の免疫後試験からのデータを分析する。

【０１５４】実施例３ペプチドでパルスしたＰＢＭＣプラスＩＬ‐１２によるヒトの免疫方法この実施例は、選択した転移性メラノーマの患者におけるＭａｇｅ３又はＭｅ
ｌａｎＡペプチドでパルスした自家系ＰＢＭＣプラス漸増用量のｒｈＩＬ‐１２
による免疫化の非無作為化試験の全般的プロトコールを概説する。プロトコール
は、患者自身の癌細胞が産生されているかどうかに依存して、Ｍａｇｅ３又はＭ
ｅｌａｎＡのペプチドと患者自身の血液細胞を含む混合物による免疫化から成る
。様々な用量の組換えヒトインターロイキン‐１２（ｒｈＩＬ‐１２）も投与す
る。Ｍａｇｅ３及びＭｅｌａｎＡは検討するメラノーマの大半によって産生され
る蛋白質である。これらの蛋白質の１つを産生する癌細胞は、それをより小さな
ペプチド断片に分解し、断片はＨＬＡ抗原を通して細胞の表面に固着する。細胞
傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はペプチド／ＨＬＡ結合物を認識して、それを発現
する腫瘍細胞を死滅させることができる。それ故、この実施例におけるプロトコ
ールのデザインは、身体を刺激して腫瘍細胞を特異的に死滅させるＣＴＬを産生
するというものである。

【０１５５】処置：患者の治療は、まず最初は３サイクルから成る。各治療サイクルは２１
日間で、第１日目に免疫化（ペプチドでパルスしたＰＢＭＣ）とｒｈＩＬ‐１２
の注入、３日目と５日目にｒｈＩＬ‐１２の注入、そして残りの１６日間で構成
される。３‐６名の患者の最初のコホートは、ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａ
でパルスしたＰＢＭＣだけを摂取する。ｒｈＩＬ‐１２の代わりとしてのプラセ
ボは投与しない。患者が客観的な応答を示すか又は疾患が安定している場合には
、３サイクルのさらなるセットの治療を継続する。

【０１５６】期間：患者は１年間まで試験に参加することができる。

【０１５７】患者数：３‐６名の患者のコホートを、ｒｈＩＬ‐１２なしで、並びに３０、
１００及び３００ｎｇ／ｋｇ／日の用量レベルのｒｈＩＬ‐１２で治療する。さ
らに１０名までの患者を推奨第ＩＩ相用量のｒｈＩＬ‐１２で治療する。３４名
までの患者をこの試験に登録する。各用量レベルの患者数を合計し（ＭＡＧＥ‐
３を摂取する患者とＭｅｌａｎ‐Ａを摂取する患者）、ＭＡＧＥ‐３あるいはＭ
ｅｌａｎ‐Ａのいずれを摂取しているかに関わりなく患者を連続的に登録する。

【０１５８】用量の段階的増加：用量を制限する毒性（ＤＬＴ）に遭遇しない限り、≧３名
の患者のコホートにおいてｒｈＩＬ‐１２の用量を段階的に増加する。一定の用
量レベルで最初の３名の患者のうち１名でＤＬＴが発生した場合には、最大許容
用量（ＭＴＤ）を越えたかどうかを調べるため、さらに３名の患者をその用量レ
ベルで治療する。２サイクル後、一定用量レベルで最初の３名の患者のうちいず
れもＤＬＴを経験しなければ、用量増加を次のレベルに進めることができる。Ｍ
ＴＤは、少なくとも３名の患者のうち２名又は６名の患者のうち２名がＤＬＴを
経験する用量レベルと定義する。推奨第ＩＩ相用量は、ＭＴＤより下の１つの用
量レベル又はＴ細胞応答によって測定したとき至適免疫化をもたらす用量のいず
れか低い方である。起こりそうにない状況ではあるが、ＤＬＴが１つのペプチド
に関してだけ認められ、他方のペプチドでは見られない場合には、そのペプチド
による免疫化を独立したコホートとしてさらに検討する。

【０１５９】患者の適格性選択基準は次の事柄を含む：１．組織学的に確認された転移性メラノーマ。２．少なくとも１２週間の平均余命。３．カルノフスキー作業状態指数≧７０。４．書面によるインフォームドコンセント。５．次のように定義される適切な造血、腎及び肝機能：絶対好中球数≧１５００μｌヘモグロビン≧９ｇ／ｄｌ血小板数≧１００，０００／μｌクレアチニン≦１．５×ＵＬＮＳＧＰＴ≦２×ＵＬＮビリルビン≦１．５×ＵＬＮカルシウム≦１１ｍｇ／ｄｌ６．ＨＬＡタイピング：患者はＨＬＡ‐Ａ２を発現しなければならない。７．ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａの発現：腫瘍はＲＴ‐ＰＣＲ^TM分析により
ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａを発現しなければならない。

【０１６０】除外基準は次の事柄を含む：１．重大な心臓血管疾患、又は医学的介入を必要とする不整脈。２．妊娠又は授乳中の女性。３．投与開始前４週間以内の生物学的治療。４．Ｂ型肝炎表面抗原に関するセロポジティブ。臨床で指示された場合には患者
を検査しなければならない。５．ＨＩＶ抗体に関するセロポジティブ。危険因子が同定された場合には患者を
検査しなければならない。６．重篤な併存感染症。７．全身性コルチコステロイド（生理的置換用量を除く）又は他の免疫抑制薬（
例えばサイクロスポリンＡ）の併用。８．臨床プロトコールへのコンプライアンスを制御不能にする、又は患者がイン
フォームドコンセントを与える能力を損なう可能性がある精神病。９．臨床的に重要な自己免疫疾患。１０．活動性胃腸出血又は制御できない消化性潰瘍。１１．炎症性腸疾患の既往歴。１２．未処置の脳転移。脳転移の処置を受けた患者は、この試験に登録する前に
コルチコステロイドから離脱し、臨床的に安定していなければならない。

【０１６１】適格性判定基準の例外は、主治医の見解として、そのような例外が患者への危
険度を不当に上昇させることがなければ、ケースバイケースとみなされる。ｒｈ
ＩＬ‐１２を伴わない、ペプチドでパルスしたＰＢＭＣの毒性が最小限であると
予想されるかぎりにおいて、そのような例外患者はｒｈＩＬ‐１２を摂取しない
コホートで治療することが好ましい。

【０１６２】

【表５】

【０１６３】¹ 登録前２８日以内に実施してもよい。² ＣＴスキャンは腫瘍の病期分類のための必要に応じて、ＰＤが顕らかにされ
るまでに実施する。³ 血清保存のため、凝固血液約１０ｍｌを採取する。⁴ 各サイクルの１日目に調製したＰＢＭＣのアリコートを後日のＣＴＬ評価の
ために凍結保存する。⁵ フォローアップは生存期間とする。⁶ ＰＰＤ及び想起抗原に関するＤＴＨは治療が完了したときにもう一度実施す
る。

【０１６４】薬剤情報／試験方法ＭＡＧＥ‐３とＭｅｌａｎ‐Ａペプチドは、ＭｕｌｔｉｐｌｅＰｅｐｔｉｄ
ｅＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡによるＧＭＰ基準に従って生成
する。ＨＬＡ‐Ａ２を発現し、ＭＡＧＥ‐３⁺腫瘍を有する患者には次のＭＡＧ
Ｅ‐３ペプチド（１字のアミノ酸名称を使用する）を使用する：ＦＬＷＧＰＲＡ
ＬＶ（配列番号９）。ＨＬＡ‐Ａ２を発現し、Ｍｅｌａｎ‐Ａ＋腫瘍を有する患
者には次のＭｅｌａｎ‐Ａペプチドを使用する：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号
１０）。

【０１６５】各々のペプチドは、それぞれ１ｇ入りの凍結乾燥バイアルとして提供される。
ＭＡＧＥ‐３ペプチドのバイアル１本をダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ）中２０μＭの濃度に還元し、５ｍｌアリコートとして−８０℃で保
存する。Ｍｅｌａｎ‐ＡペプチドはＤＭＳＯ中で還元し、その後ＤＰＢＳで希釈
する。この容量を等容量の自家系ＰＢＭＣに加えて、各ワクチンの調製時間イン
キュベート（ペプチドパルス）する。

【０１６６】ｒｈＩＬ‐１２はＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，ＭＡ）によって製造され、提供される。ｒｈＩＬ‐１２薬剤製品は、弱真空
下の５ｍｌバイアルに入った凍結乾燥粉末として供給される。各バイアルはｒｈ
ＩＬ‐１２５０μｇを含む。バイアルは単回使用のみを意図したものである。
製品を還元するための注射用滅菌水（ＷＦＩ）を供給する。静菌ＷＦＩを使用し
てはならない。凍結乾燥ｒｈＩＬ‐１２は、確実な冷蔵施設において２‐８℃で
保存しなければならない。ＷＦＩは室温で保存してもよい。還元後、製剤は２‐
８℃で２時間安定である。注射器に充填した単位製剤は室温においてもよいが、
調製後４時間以内に使用しなければならない。凍結乾燥ｒｈＩＬ‐１２は５又は
１ｍｌのＷＦＩで還元する。還元は約１分間で完了する。

【０１６７】スクリーニングと他の試験前検査がすべて完了すれば、初回免疫とｒｈＩＬ‐
１２の注射のために患者を入院させる。

【０１６８】標準的方法に従ってＰＢＭＣを調製する。標準的な静脈切開手法を用いて、防
腐剤不含のヘパリン０．６ｃｃが入った６０ｃｃ注射器２‐３本に末梢血約１０
０‐１５０ｍｌを直接採集する。末梢血サンプルのアリコート（少なくとも１０
×１０⁶細胞）を後日の基線免疫試験の評価のために凍結保存する。Ｌｙｍｐｈ
ｏｐｒｅｐ勾配（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）での遠心分離によってＰＢＭＣを単離し
、計数して、ＤＰＢＳ中で洗浄し、４０×１０⁶細胞／ｍｌの濃度でＤＰＢＳに
懸濁する。等容量の当該ペプチド溶液（ＤＰＢＳ中２０μＭで調製）を加えて、
静かに揺り動かしながら３７℃で１時間インキュベートする。次に細胞を致死的
に照射し（２０００ｃＧｙ）、ＤＰＢＳで１回洗浄して、０．５ｍｌ中５０×１
０⁶の濃度でＤＰＢＳに懸濁する。１ｃｃ注射器と２１ｇ針を用いて、ペプチド
負荷したＰＢＭＣの懸濁液を２つの部位に均一に分けて皮下注射する。好ましい
注射部位は、腫瘍塊の近くではなく、ドレーンを設置するリンパ節位置の近くで
ある。適切な部位の例は大腿基部、上腕、あるいは下腹壁であろう。

【０１６９】パルスしたＰＢＭＣの接種後できる限り速やかに、３ｃｃ注射器と２５ｇ針を
用いて患者に割り当てられた用量レベルのｒｈＩＬ‐１２を２つの免疫部位の１
箇所のすぐ近くに皮下注射する。患者がｒｈＩＬ‐１２なしでワクチン接種だけ
を受ける場合、プラセボ注射は行わない。

【０１７０】各々の注射部位の様相を免疫の直前、１時間後及び２４時間後に記録する。一
部の場合には、炎症を記録するためにメートル定規と共に写真を撮影する。

【０１７１】血液サンプル（ｒｅｄｔｏｐＶａｃｃｕｔａｉｎｅｒ管に１０ｃｃ）を免
疫の直前、１２時間後、２４時間後及び６日後に採取する。血清を分離し、後程
サイトカインレベルを測定するために−２０℃で保存する。

【０１７２】外来患者として３日目と５日目に、ｒｈＩＬ‐１２（患者に割り当てられてい
る場合）を初回注射とほぼ同じ位置に皮下注射する。

【０１７３】免疫化の手順全体を２１日ごとに反復する。１つのコースは３サイクルから成
る。ペプチドでパルスしたＰＢＭＣとＩＬ‐１２のその後のサイクルの注射は、
炎症の局所徴候によって禁止されないかぎり、最初のサイクルとほぼ同じ部位に
行うものとする。

【０１７４】実質的な数のサンプルが採集されれば、ペプチド特異的ＣＴＬ活性とサイトカ
インレベルを測定するためのアッセイを実施する。

【０１７５】毒性に基づく治療変更国立癌研究所の一般的毒性判定基準尺度を用いて毒性を等級付ける。用量を制
限する毒性をグレード３又はそれ以上と定義し、次の修正を加える。

【０１７６】

【表６】

【０１７７】２回の治療中止を認める。患者が毒性のために３回目の中止を必要とする場合
、あるいは毒性が３週間以内に適格基準に回復しない場合には、患者は試験から
脱落する。最初の用量レベルについては用量の低減を認め、これはペプチドでパ
ルスした自家系ＰＢＭＣ単独による免疫化から成る。

【０１７８】グレード３を越える、あるいは上記の表の６、７又は８番を満たす毒性は有害
体験としてＦＤＡとＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅに報告する。

【０１７９】起こりそうにない状況ではあるが、ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａペプチド
単独に関して異常な又は用量を制限する毒性が認められた場合には、そのペプチ
ドによる治療を独立したコホートとして検討する。

【０１８０】補助治療必要に応じて鎮吐薬や鎮痛薬のような薬剤で対症治療を行ってもよい。但し、
コルチコステロイドの投与については、患者が試験から脱落することを必要とす
る。

【０１８１】毒性モニタリング患者の各来院時に（試験スケジュール参照）、有害体験の発生とその性質に関
してモニターし、質問する。事象は、患者を試験に適格と認めた最初の状態とは
異なる生理的又は心理的状態の変化と定義する。

【０１８２】治療の評価治療を受けている期間中は少なくとも２週間ごとに（通常はサイクルの１日目
と７日目）、腫瘍の進行の証拠が認められるまでは８週間ごとに、さらに患者が
来院できるかぎり８‐１２週間ごとに患者を評価する。即時毒性をモニターする
ために各々のｒｈＩＬ‐１２注射後１時間患者を観察する。

【０１８３】腫瘍後退の評価がこの試験における二次エンドポイントである。腫瘍塊を二次
元測定で注意深く特性付ける。

【０１８４】部分的応答（ＰＲ）の判定基準：治療に先立って同定したインジケーター病巣
の最大垂直径の積の合計の５０％減少。

【０１８５】完全応答（ＣＲ）の判定基準：新しい病巣の出現を伴わない、腫瘍のすべての
証拠の完全な消失。

【０１８６】進行性疾患（ＰＤ）の判定基準：新しい病巣の出現；及び／あるいはインジケ
ーター病巣の最大垂直径の積の合計の５０％の増加。最初のＭＡＧＥ‐３ペプチ
ド免疫体験において腫瘍サイズの初期増加のあとに腫瘍縮小が認められたことか
ら、このカットオフを選択した；及び／あるいは何らかの腫瘍の再出現。

【０１８７】安定疾患（ＳＤ）の判定基準：部分的応答、完全応答、あるいは進行性疾患の
判定基準に合致しないもの。

【０１８８】患者の評価の際の治療／フォローアップの決定ＰＲ又はＳＤの判定基準に合致する患者は、３サイクルのさらなる複数回のコ
ースで再治療することができる。ＣＲの患者は、３サイクルの追加コースを１回
受けてもよく、その後治療を停止する。

【０１８９】分子／免疫学的検討標準的方法を用いてＨＬＡタイピングを実施する。

【０１９０】標準的なＥＬＩＳＡ手法を用いてＩＦＮ‐γ及びＴＮＦ‐αの血清レベルを評
価する。

【０１９１】循環ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａ特異的ＣＴＬの存在を分析する。簡単に
述べると、磁気ビーズを使用してＣＤ８⁺ＰＢＬを分離する。ＣＤ８^-個体群を当
該ＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａペプチドでパルスし、照射して（２０００ｃ
Ｇｙ）、ＩＬ‐２と共にスティミュレーター細胞として加える。１週間後、応答
細胞を同じようにして再び刺激する。さらに１週間後、ＨＬＡ‐Ａ２を発現する
ペプチドパルスしたＢ細胞系（Ｔ２細胞）に対するクロム放出によって細胞溶解
活性を測定する。陰性対照は、パルスしていないＴ２細胞系とＮＫ感受性標的Ｋ
５６２を含む。標識していないＫ５６２細胞とコールド（非放射能）競合を実施
して、非特異的ＮＫ活性を排除する。

【０１９２】統計的考察認められた毒性の頻度と各々の小さな用量コホートによって誘導される免疫学
的変化を記述するために記述統計を作製する。予定されている第ＩＩ相投与では
、より正式な統計的推論ができるように十分な数の患者（１３‐１６名）を検討
する。処置前の免疫応答を対応あるｔ検定を用いて各々の免疫処置後の応答と比
較する。患者間で様々な基線値が予想されるので、対数変換を使用し、処置後と
基線応答間の平均比率について９５％信頼区間を作製する。さらに、何回もの治
療サイクルにわたる応答のパターンを調べるため、反復測度分散分析を用いて基
線値と各々の免疫後の結果を分析する。

【０１９３】病理学的考察この治験に参加する患者は、既に組織学的に確認された悪性メラノーマを有し
ている。ＲＴ‐ＰＣＲ^TMによってＭＡＧＥ‐３又はＭｅｌａｎ‐Ａ遺伝子の発現
を調べるため、腫瘍の生検はこのプロトコールの必要部分である。標本の病理学
的診断を確認するため、標準的な組織学的検査を実施する。

【０１９４】実施例４ヒトワクチン接種試験の概要この実施例は、Ｍａｇｅ３ペプチド又はＭｅｌａｎＡペプチドと共にインキュ
ベートしたＰＢＭＣプラス０‐１００ｎｇ／ｋｇの範囲の割当て用量のｒｈＩＬ
‐１２で免疫した患者に関する結果を提供する。指示されたようにＭａｇｅ３又
はＭｅｌａｎＡペプチドのいずれかを用いてペプチドパルスしたＰＢＭＣ単独又
はｒｈＩＬ‐１２を免疫部位の近くに皮下投与して患者を治療した。免疫後、ペ
プチド特異的ＣＴＬ活性とサイトカイン産生、特にＩＦＮ‐γについてのアッセ
イを実施した。臨床応答についてのデータも提示する。略語、定義及び方法は、
先に実施例３において述べた通りであった。

【０１９５】患者の適格性：全般的選択基準は実施例３で述べた通りであった。追加判定基準は次の通りで
ある：１．ＫＰＳ０‐１、ｒｈＩＬ‐１２を受容する無傷の器官機能、ＨＬＡ‐Ａ２
陽性；複数の事前治療は許容される、平均余命１２週間。２．生検又は手術によって採取した腫瘍、及びＲＴ‐ＰＣＲ^TMによって評価した
Ｍａｇｅ３及びＭｅｌａｎＡの発現。小さな生検試料について実施したネストＰ
ＣＲ^TM。抗原を発現する患者だけを許容する。Ｍａｇｅ３を優先して扱う。

【０１９６】ワクチン接種の準備各々のワクチン接種のために、１００ｃｃのヘパリン加血を採取し、Ｌｙｍｐ
ｈｏｐｒｅｐ遠心分離によってＰＢＭＣを単離する。細胞の一部を別にとり、凍
結保存用にＣＤ８⁺とＣＤ８^-分画に分ける。

【０１９７】ＰＢＭＣをＭａｇｅ３ペプチド（１０μＭ）又はＭｅｌａｎＡペプチド（５０
μＭ）と共にＤＰＢＳ中３７℃で１時間インキュベートした。ペプチド濃度は、
Ｔ２細胞でのＨＬＡ‐Ａ２発現の安定化のための最小至適用量に基づいて選択し
た。

【０１９８】パルスしたＰＢＭＣを照射し（２０００ｒａｄ）、遠心分離して、注射用にＤ
ＰＢＳ２ｃｃ中に懸濁した。

【０１９９】パルスしたＰＢＭＣの注射は、上腕又は脚基部のいずれかに２部位に分けて皮
下で実施した。

【０２００】割当てられた用量レベル（ｎｇ／ｋｇ）のｒｈＩＬ‐１２を、２つのワクチン
部位の１つの近くに皮下注射した。

【０２０１】手順全体を３週間ごとに反復し、３サイクルごとに臨床再評価を行った。

【０２０２】分析所与の１名の患者からのすべてのサンプルを解凍し、ｉｎｖｉｔｒｏで同時
に再刺激して、Ｔ細胞の機能分析をバッチ方式で実施した。

【０２０３】試験のためのＣＤ８⁺Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増殖は、最小活性化条件を用
いて実施した：ＡＰＣとしてペプチドでパルスしたＣＤ８陰性細胞、各々の刺激
の２日目に１０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ‐２だけを加え、６日目に１回刺激し、その
後４‐５日目に２度目の刺激を行った。

【０２０４】進行性の患者について可能なときには、抗原陰性腫瘍細胞の増殖を調べるため
フォローアップ生検を実施した。

【０２０５】ワクチン治験の要約を下記に示す：

【０２０６】

【表７】

【０２０７】結果腫瘍抗原ペプチドでパルスした自家系ＰＢＭＣプラスｒｈＩＬ‐１２を用いて
抗療性転移性疾患のメラノーマ患者のワクチン接種を明らかにした。このアプロ
ーチは樹状細胞増殖よりも速やかで容易である。

【０２０８】図１０、図１１及び図１２に示すように、１‐３回の免疫後ペプチド特異的な
ＩＦＮ‐γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の生成を検出した。ＭｅｌａｎＡ特異的応答はＭ
ａｇｅ３特異的応答よりも早期に検出されると思われた。部分的臨床応答及び実証された抗原喪失腫瘍変異体に関する選択は、これらの
抗原の各々に対してプライムしたＴ細胞が抗腫瘍作用を及ぼしうることを示唆し
ている。

【０２０９】実施例５ＭＰＳにおけるＧＭＰグレードのＭＰＳ‐３８ペプチド、パートＮｏ．６００
０３８、ロットＮｏ．９６０２０の製造

【０２１０】ペプチド配列：ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号９）；分子量＝１０５８．３、ヒドロキシル基
がカルボキシル末端でバリンに結合している。

【０２１１】樹脂上のペプチドの合成（ＭＤ‐１４Ｒｅｖ．５）合成に用いる手順は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）の原著論文に述べら
れている全般的手順に小さな変更を加えたものである。合成は、溶媒の洗浄を容
易にし、保持体を濾過するためのフリット漏斗の付いた１０００ｍＬ反応容器中
で実施した。３０ｇ（バッチサイズ）のＢｏｃ‐Ｌ‐バリンＭｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ樹脂を用いて１．０４ｍｅｑ／ｇの置換で合成を開始した。ペプチド鎖の構築
全体を通じてＢｏｃ化学を使用した。ＴＦＡ脱保護段階を除いてすべての溶媒洗
浄の計算は出発樹脂１０ｍＬ／ｇに基づいた。ＴＦＡ脱保護段階については、完
全なＢｏｃ除去を確保するため慎重を期して、洗浄は出発樹脂１５ｍＬ／ｇに基
づいた。アミノ酸はすべてＤＩＣ又はＤＩＣ／ＨＯＢｔを活性化剤として用いて
結合した。アミノ酸、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の計算は、３倍過剰の置換及び使用する樹脂の
出発量に基づいた。

【０２１２】結合はすべて２回のニンヒドリン試験によってモニターした。樹脂と溶媒の混
合は発泡窒素によって実施した。

【０２１３】アミノ酸の再結合（ＭＤ‐Ｉ．ＩＡ）：陽性ニンヒドリン試験結果を示した結合段階に関して、アミノ酸の３つの等価
物とＤＩＣに関して再結合を実施した。これらはＰｈｅ¹とＬｅｕ²を含む。プロ
リンへの結合に対する予防策として、Ｇｌｙ⁴を再結合した。

【０２１４】完全な鎖の構築後、最終的なＢｏｃ除去を実施した。樹脂上に生じたペプチド
を窒素で乾燥し、計量した。収率は〜６８．１ｇあるいは１０４％の理論的樹脂
重量増加であった。

【０２１５】前開裂ホルミルの除去（ＭＤ‐１９Ｒｅｖ．１）：２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いてトリプトファン残基上のホルミル保護
基を除去した。慎重を期して、保護基の除去を確実にするためこの段階を２回実
施した。樹脂の最終的な収率は、理論的収率の９２％に相当する６１．６ｇであ
った。

【０２１６】ＨＦ開裂とペプチドの側鎖の脱保護（ＭＤ‐２Ｒｅｖ．４）：ホルミル基の除去の完了後、縮合ＨＦ／アニソール混合物（１７５ｍＬ／３５
ｍＬ）でアミノ酸側鎖を脱保護しながら、樹脂上のペプチド４０ｇを樹脂から開
裂した。０℃で６０分間反応を実施し、その後窒素によりＨＦとアニソールを〜
３時間で蒸発させた。開裂したペプチドをエチルエーテル各２００ｍＬで３回洗
浄して残存するアニソールを除去した。１０％水性ＨＯＡｃ各２００ｍＬを３回
用いてペプチドを樹脂から抽出した。１０％ＨＯＡｃ／ペプチド溶液を一緒にし
て、１２００ｍＬ凍結乾燥フラスコに入れ、ＶｉｒｔｉｓＦＭ２５ＥＬ凍結乾
燥器で〜１７時間凍結乾燥した。収率は理論的数値の１０１％で、粗ペプチド２
０ｇを生じた。

【０２１７】開裂したペプチド樹脂を５０％ＡＣＮ／５０％（１０％ＨＯＡｃ／Ｈ₂０）溶
液で追加洗浄すると無視しうる量の追加物質が生じ、質もより低劣であると思わ
れた。これらの洗浄からの産物は廃棄した。

【０２１８】粗ペプチドをＨＰＬＣによって分析し、純度は〜６３％と測定された。上述し
た条件下で、ペプチドは〜９分で溶出した。

【０２１９】

【表８】

【０２２０】粗ペプチドの精製：逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し、ＣＩｓ樹脂を固定相
としてペプチドを精製した。ＴＦＡを緩衝液として用いる１段階精製で所望する
純度を得た。これは精製ペプチドのＴＦＡ塩を生じた。

【０２２１】ＴＦＡ精製（ＭＤ‐１８Ｒｅｖ．３）：合計１‐２ｇを１０％酢酸５０‐１００ｍＬに溶解した。溶液を８０ｍＬ／分
で専用の分取カラムに充填した。

【０２２２】

【表９】

【０２２３】括弧内の勾配パラメーターは初期に使用した：Ｇ０３０４およびＧ０３０５。
よりゆっくりとした勾配を後に使用して、不純物からのペプチドの分離を増加さ
せた（代表的な調製用ＨＰＬＣクロマトグラムおよびペプチド溶出パターンにつ
いては図３参照）。

【０２２４】純粋なペプチドを含むと信じられる各画分１０μｌを混合し、ＨＰＬＣにより
分析した。最大数の画分が所望の純度の単一のピークをもつトレースを示すまで
、画分を削除または加えた。

【０２２５】

【表１０】

【０２２６】各ロットの精製ペプチドＴＦＡ塩を、個々に１２００ｍＬのバーチス凍結乾燥
フラスコ中でシェル凍結させ、バーチスＦＭ２５ＥＬ凍結乾燥器で凍結乾燥した
。精製からの副画分は回収しなかった。

【０２２７】精製ペプチドＴＦＡ塩のプール（ＭＤ−ＳＲｅｖ．２）：全９．８ｇの純粋なペプチドのＴＦＡ塩が、２０ｇの粗ペプチドの精製から収
率４９％で得られた。全１３ロットを、酢酸塩に交換するために調製した。プロ
セス点検として、各ロットのサンプルを、４１７ｒａｇ毎に１ｍｇを、一緒にプ
ールし、９０％ＨＯＡｃ／ミリＱ水に５ｍｇ／ｍＬで溶かし、ＨＰＬＣにより分
析した。この「ミニプール」の純度は〜９９％であった。各精製ロットは個々に
１０％ＨＯＡｃ／ＷＦＩに溶かした。

【０２２８】ダウエックス上でトリフルオロ酢酸塩のペプチドを酢酸塩へ交換（ＭＤ−２１
Ｒｅｖ０）：全９．８ｇのペプチドを、５００ｍＬの１０％ＨＯＡｃ／ＷＦＩに溶かした。
ペプチドの塩基性部位および交換する量に等価な約３倍過剰のダウエックス１×
２−１００（１−クロライドイオン交換レジン）を使用して酢酸塩への変換を達
成した。全５３ｇのダウエックスを使用してカラムを充填した。カラムのダウエ
ックスを、ＷＦＩ、１ＭＮａＯＨ／ＷＦＩ、ＷＦＩ、および２５％酢酸／ＷＦ
Ｉで、特定の目的のカラム上にペプチドをのせる前に、連続的に洗浄した。ペプ
チドを、３カラム容量の１０％ＨＯＡｃ／ＷＦＩを用いてカラムから溶出した。
ペプチド溶液を１２００ｍＬバーチス凍結乾燥フラスコ中でシェル凍結し、〜６
６時間バーチスＦＭ２５ＥＬ凍結乾燥器で凍結乾燥した。生成物を秤量すると、
８．２ｇのペプチド酢酸塩が、９１％の理論値で得られた。

【０２２９】パッケージングおよび標識（ＭＤ−９Ｒｅｖ．２）生成物を、ポリプロピレン閉じ口を有する低密度ポリエチレン容器にパッケー
ジングし、アルゴンで覆い、パラフィンで封をした。１ｇの２つの容器をＲＭＳ
３０００４３Ｒｅｖ．０−ａ．に従って標識した（標識情報については添付２参
照）。

【０２３０】

【表１１】

【０２３１】６回の複数の注入により、平均ピーク面積は１０２６７８５２±８１８４０、
ＲＳＤ＜１．０％となった。純度は９９．４％±０．１％であった。ペプチドピ
ークの保持時間は、１６．７±０．１分であった。分析は０．０４−０．８ｒａ
ｇ／ｍＬまで線形である。データは添付２に要約する。

【０２３２】生成物リリースおよび出荷：生成物は、バッチ記録が、ＱＣにより審査および承認され、生成物を試験して
規格に合致すると判明した後に発売のためにリリースされた。ペプチドは、ドラ
イアイス上で出荷された。

【０２３３】材料アミノ酸およびレジン：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−バリンメリーフィールドレジン、Ｎ
−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン（トシル）、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンＨ₂Ｏ、Ｎ−
Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン、Ｎ−Ｂｏｃ−グリシン、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−トリプトファ
ン（ホルミル）、Ｎ−Ｂｏｃ−フェニルアラニン、およびＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロ
リン。

【０２３４】

【表１２】

【０２３５】実施例６免疫化のためのＭＡＧＥ−３／Ａ２ペプチドパルスヒトＰＢＭＣの調製１５分間フロードラフト中でＵＶ光を照射し、その後停止する。ドラフトのス
イッチを入れ、ロッカルでその後７０％ＥＴＯＨで内部を清浄する。試薬を集め
、ドラフトに置く（リンホプレップ、ＤＰＢＳ、５０ｍｌチューブ、２５０ｍｌ
チューブ、３ｃｃシリンジ、１６ｇ針、細胞計測用チューブ、トリパンブルー、
凍結バイアル、ヘパリン、赤い使い捨てバッグ）。標識チューブ（血液１５ｍｌ
あたり５０ｍｌチューブ１個；典型的には計６−８）、凍結バイアル（２）、並
びに患者のＩＤと日付のついた３ｃｃシリンジ。手を洗い；着衣と無菌手袋を着
用する。

【０２３６】１０ｍｌリンホプレップを、各５０ｍｌチューブに分取する。患者から単離し
たヘパリン処理末梢血サンプルを得、容量を推定する。１血液容量のＤＰＢＳを
２５０ｍｌチューブに加え、１／１００容量の無菌ヘパリン（保存液１０，００
０Ｕ／ｍｌ）に加える。ヘパリン処理末梢血を、ＤＰＢＳを含むチューブに加え
、穏やかに混合する。３０−３５ｍｌの希釈ヘパリン処理血液を、各５０ｍｌチ
ューブのリンホプレップ上に重層する。２０分間、１０００ｒｐｍ、２０℃で遠
心分離する。約８０％の上層を除去し廃棄する（血小板を削除）。２０分間、２
５００ｒｐｍ、２０℃で遠心分離する（ソーバールＲＴ６００Ｂで設定５番）。
界面から細胞を除去し、それらを２つの新しい５０ｍｌチューブに移す。

【０２３７】各チューブ中でＤＰＢＳで容量を４５ｍｌとし、ピペットして再度懸濁する。
５分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を吸引し；ペレットを全５ｍｌＤＰ
ＢＳに再度懸濁し、１つのチューブにプールする。トリパンブルー（４０：１希
釈）で細胞を計測する。期対される収率は、血液１ｍｌあたり１−２×１０⁶細
胞である。ＣＤ８細胞の分離のために２０×１０⁶細胞をとっておき、ワクチン
用に８０−１００×１０⁶細胞を凍結し保持する。ＭＡＧＥ−３またはＭｅｌａ
ｎ−Ａペプチド（ＤＰＢＳ中２０μＭで５ｍｌ）のチューブを３７℃インキュベ
ーター中で加熱することにより解凍する。細胞を、ペプチドを含むチューブに移
し、ピペットで混合する。３７℃のインキュベーターに１時間入れ；反転させて
３０分間混合する。

【０２３８】インキュベート中、ＣＤ８分画を調製し、取っておく細胞アリコートを凍結す
る。細胞をインキュベーターから取り出し、サンプルを２０００ｒａｄ（１２．
８分）で照射する。反転して混合し、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。上
清を吸引し；１ｍｌＤＰＢＳ中にペレットを再度懸濁する。トリパンブルーで細
胞を計測し、生存率を記録する。

【０２３９】５０μｌの最終細胞懸濁液およびペプチド／ＤＰＢＳ溶液を、無菌試験および
エンドトキシンアッセイのために取り出す。１ｍｌの各ＤＰＢＳおよび使用する
リンホプレップをとり、個々の培養チューブに移す。これらを汚染について評価
するために微生物学研究室に患者ＩＤと共に提出する。エンドトキシンアッセイ
を実施し、結果を記録する。

【０２４０】細胞懸濁液をトラップにより再度懸濁する。１６ｇ針を使用して３ｃｃシリン
ジにサンプルを入れ；針を除去し、シリンジに蓋をする。シリンジを患者ＩＤで
標識したジップロック袋に入れる。ワクチンは、５／８インチの２３ｇ針を使用
する皮下注射の準備が整っている。

【０２４１】実施例７固体腫瘍サンプルからのメラノーマ抗原の分析腫瘍サンプルの収集腫瘍サンプルを、ＯＲ、放射線部屋、または診療所で得、氷上の無菌等張溶液
（ＰＢＳまたは等張食塩水）に入れ、研究室に直接もってきた。患者（氏名、Ｍ
Ｒ番号、腫瘍部位）についての全情報を腫瘍記録本に書き込む。

【０２４２】腫瘍サンプルの処理得られた腫瘍の量に応じて、発明者は、ＲＮＡを抽出するグアニジンホモジネ
ートを作成することを試み；液体窒素中でバイアルを凍結し、凍結記録本にその
記録をつけ；ヒアルロニダーゼ（８５Ｕ／ｍｌ）およびコラゲナーゼ（１Ｕ／ｍ
ｌ）のＤＭＥＭ溶液にいくらかをホモジナイズし、細胞系およびおそらくクロー
ンを増殖させる。腫瘍を、できるだけ多くの腫瘍が細胞懸濁液に分離するまで、
ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼに放置する（通常数時間が必要である）。腫瘍
が大きすぎる場合、無菌器具および技術を使用して小片に切断し、常に腫瘍サン
プルは氷上に維持する。

【０２４３】簡潔には、グアニジンホモジネートを調製するために（ＲＮＡアーゼ非含有試
薬を使用し、サンプルをできるだけ氷上に維持する）、グアニジン中でホモジナ
イズする組織を秤量する。グアニジン溶液を直接サンプルに加える。サンプルが
＜５０ｍｇであれば、０．５ｃｃのグアニジンを加える。サンプルが＞５０ｍｇ
であれば、３．２ｃｃのグアニジンを加える。サンプルを、電気ホモジナイザー
（パワーゲン１２５；フィッシャー）を使用して、氷上でホモジナイズする。使
い捨て無菌発生装置を、各別々の腫瘍サンプルに使用する。各サンプルについて
ＳＤＳ１％およびエタノール７０％を用いて常にホモジナイザーを清浄にする。
できるだけ多くの固体腫瘍がホモジナイズされるまでサンプルをホモジナイズす
る。ホモジネートを３，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離する。上清を吸
引して、これは、長期貯蔵用に−７０℃で貯蔵できる。

【０２４４】簡潔には、塩化セシウムＲＮＡ抽出に、ＣｓＣｌ溶液の上端にグアニジン溶解
液を注意深くのせる。元のサンプルが＜５０ｍｇである場合、０．８ｃｃのウル
トラクリア遠心チューブ（ベックマン）を使用する。０．５ｃｃグアニジン溶解
液／．１７ｃｃＣｓＣｌがあることに注意する。元のサンプルが＞５０ｍｇであ
る場合、５ｍｌのウルトラクリア遠心チューブ（ベックマン）を使用し、３．２
ｃｃグアニジン／１．１ｃｃＣｓＣｌを使用する。３５，０００ｒｐｍで１８時
間２０℃でＳＷ５０．１ローター（一晩）（最大速度でブレーキをかけない）で
超遠心分離する。超遠心分離後、ハンドピペッティングにより大半の上清を除去
する（ＲＮＡがチューブの底にペレット化し、しばしば眼に見えない）。チュー
ブをひっくり返して適切なキャリアに置き、残りの液体を流す。

【０２４５】超遠心チューブを、チューブサイズに応じて底から〜０．５−１ｃｍに切断す
る（小さい遠心チューブを短く切り、チューブを正立させる）。

【０２４６】ＲＮＡアーゼ非含有水（１００μｌ）をコップにピペッティングし、適切に標
識した氷上のエッペンドルフチューブに移すことにより、ＲＮＡペレットを溶解
する。コップを追加の１００μｌのＲＮＡアーゼ非含有水で濯ぎ、それをエッペ
ンドルフチューブに加える。

【０２４７】２０μｌの酢酸ナトリウム３Ｍ（ＮａＡｃ）および２５０μｌのフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、ボルテックスをかける。サンプル
はこの部分の手順中、できるだけ氷上に維持する。

【０２４８】一定のアングルローター（１２，０００ｒｐｍ）を使用して５分間４℃でチュ
ーブを遠心する。水層を新しいエッペンドルフチューブに移し、２５０μｌのク
ロロホルムを加える。ボルテックスにより混合する。上記のように再度遠心し、
上水層を取り出し新しいエッペンドルフチューブに入れる。６００μｌの無水エ
タノールを加え、反転させて穏やかに混合する。−２０℃で３０分間放置する。
次いで、一定アングルローター（１２，０００ｒｐｍ）を使用して４℃で１５分
間遠心する。上清を廃棄し、１５０μｌの７０％エタノールを加える。ボルテッ
クスにより混合する。一定アングルローター（１２，０００ｒｐｍ）を４℃で使
用して５分間再度遠心する。上清を廃棄し、ＲＮＡをドラフト中でチューブを開
けて乾燥させる。

【０２４９】穏やかにピペッティングすることにより７μｌのＲＮＡアーゼ非含有水にＲＮ
Ａを溶解する。インビトロゲンＤＮＡ検査法を使用して収量を定量する。１μｌ
のＲＮＡアーゼを各サンプルに加える。サンプルはこの段階で−７０℃で貯蔵し
得る。

【０２５０】ＲＮＡ調製物から汚染ＤＮＡを除去するために（ギブコ増幅等級ＲＮＡアーゼ
を使用して）、以下を、氷上の小さなマイクロ遠心チューブに加える：反応を清
浄化するための、１μｇのＤＮＡアーゼあたり１μｇまでのＲＮＡ；１μｌの１
０×ＤＮＡアーゼ緩衝液（ギブコ）；１μｌのＤＮＡアーゼ増幅等級（ギブコ）
；および容量を１０μｌとするＲＮＡアーゼ非含有水。

【０２５１】サンプルを室温で１５分間インキュベートする。１μｌの２５ｍＭＥＤＴＡ
（ギブコ）を加え、６５℃で水浴中で１０分間加熱する。サンプルはｃＤＮＡ合
成の準備が整っている。

【０２５２】ｃＤＮＡ合成可能であれば２０μｌの反応液あたり１μｇまでのＲＮＡを使用する。逆転写
反応のためにエッペンドルフ中でマスター混液を作成し、これは、ａ．２０μｌの反応液あたり１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ；ギブコ）ｂ．２０μｌの反応液あたり４μｌの５×第一鎖緩衝液（ギブコ）ｃ．２０μｌの反応液あたり２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ；ギブコ）ｄ．２０μｌの反応液あたり１μｌのＲＮＡアジン（４０Ｕ／μｌ；プロメガ）
ｅ．２０μｌの反応液あたり１μｌの逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ；ギブコ）を
含む。

【０２５３】別々に標識したエッペンドルフ中に、１μｌのオリゴｄＴプライマー（０．５
μｇ／μｌ）を加え、１０μｌの各ＲＮＡサンプルを適切な標識チューブに加え
る。９μｌのマスター混液（上記由来）を各サンプルに加える。ボルテックスを
かけ、３７℃の水浴中に１時間入れる。インキュベート後に３０μｌの滅菌水を
各サンプルに加え、適切に標識したボックスの−２０℃の冷凍庫に入れる。メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、チロシナーゼ、およびＭｅｌａｎ−
Ａ）の存在を決定するＰＣＲ^TM条件

【０２５４】５０μｌの反応液のために、ａ．１反応あたり１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ；ギブコ）ｂ．１反応あたり５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ギブコ）ｃ．１反応あたり１．５μｌのＭｇＣｌ₂（５０ｍＭ；ギブコ）ｄ．１反応あたり０．３μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ）の添加により、エッペンドルフ中にマスター混液を作成する。

【０２５５】ｃＤＮＡサンプル、プライマーおよびマスター混液を以下の通りに混合する：ａ．７．８μｌのマスター混液ｂ．３μｌのｃＤＮＡサンプルｃ．２μｌの各プライマー（５’および３’）；全４μｌｄ．３５．２μｌの滅菌水。

【０２５６】最後に鉱油を加える。同じ以下の条件および４０サイクル：ａ．９４℃で４分間前もって置くｂ．次いで９４℃で１分間ｃ．次いで５８℃で２分間ｄ．次いで７２℃で３分間ｅ．７２℃で５分間伸長を使用して、全抗原性プライマーについてＰＣＲ^TMを実施する。

【０２５７】ネストＰＣＲ^TM反応を、同じ上記のＰＣＲ^TM条件および４０サイクルを使用し
て実施する。一次ＰＣＲ^TM反応由来の生成物を、２μｌの一次ＰＣＲ^TM生成物を
１８μｌの滅菌水に加えることにより、１：１０に希釈する。次いで、２μｌの
この希釈液をネスト反応に使用する。プライマーは、到着時に１ｍｌ滅菌水で全
て再構成し、次いで、使用前に約１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。

【０２５８】一次プライマー鋳型は以下の通りである。 B-アクチン (5'プライマー) GGCATCGTGATGGACTCCG（配列番号１１） B-アクチン (3'プライマー) GCTGGAAGGTGGACAGCGA（配列番号１２） MAGE-1 (5'プライマー) CGGCCGAAGGAACCTGACCCAG（配列番号１３） MAGE-1 (3'プライマー) GCTCCGACCCTCACTGGGTTGCC（配列番号１４） MAGE-3 (5'プライマー) TGGAGGACCAGAGGCCCCC （配列番号１５） MAGE-3 (3'プライマー) GGACGATTATCAGGAGGCCTGC（配列番号１６）チロシナーゼ (5'プライマー) GGATAGCGGATGCCTCTCAAAG（配列番号１７）チロシナーゼ (3'プライマー) CCCAAGGAGCCATGACCAGAT（配列番号１８） Melan-A (5'プライマー) CTGACCCTACAAGATGCCAAGAG（配列番号１９）及び Melan-A (3'プライマー) ATCATGCATTGCAACATTTATTGA TGG AG（配列番号２０）

【０２５９】ネストプライマー鋳型は以下の通りである。 MAGE-1 (5'プライマー) CTTCAGGTTTTCAGGGGACAGGCC（配列番号２１） MAGE-1 (3'プライマー) CTGTCGAGTGAAGTTGATGGTAGTGG（配列番号２２） MAGE-3 (5'プライマー) TCACATGCTCCCTCTCTCCCCAGGCC（配列番号２３） MAGE-3 (3 'プライマー) ATCTGATTGTCACCCAGCAGGCCATC（配列番号２４）チロシナーゼ(5'プライマー) GCATGCACAATGCCTTGCACATCTATA（配列番号２５）チロシナーゼ (3'プライマー) TGTAGTCTTGAAAAGAGTCTGGGTCTG（配列番号２６
） Melan-A (5'プライマー) TCTTACACCACGGCTGAAGAGGCC（配列番号２７）

【０２６０】全てのＰＣＲ^TM産物を、臭化エチジウムで１．５％アガロースゲル上で走行さ
せた。一次ＰＣＲ^TMの腫瘍抗原バンドのサイズを以下に示す：

【０２６１】

【表１３】

【０２６２】本明細書に開示し特許請求の範囲に記載した全ての組成物および方法は、本開
示に鑑みれば過度の実験を行うことなく製造および実施できる。本発明の組成物
および方法は、好ましい実施形態について記載されているが、本発明の概念、精
神および範囲から逸脱することなく、変化を、組成物および方法、並びに本明細
書に記載の段階または段階序列に適用し得ることは、当業者には明らかである。
より具体的には、化学および生理学の両方に関連した物質を、本明細書に記載の
物質と置換し得、同じまたは類似の結果が得られるであろうことは明らかである
。当業者には明らかなこのような類似の置換および修飾は、添付の特許請求の範
囲により定義される本発明の精神、範囲および概念内と考えられる。

【０２６３】＜参考文献＞以下の参考文献は、本明細書に示される方法及び詳記を補足する例示的な方法
及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとす
る。 Balch, Houghton, Peters, "Cutaneous Melanoma," In: Cancer: Principals
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sing MAGE-3," Eur. J. Immunol., 24:3038, . 1994 Van der Bruggen, Traversari, Chomez, Lurquin, De Plaen, Van den Eynde, K
nuth, Boon, "A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lympho
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om mouse mastocytoma P815," Somat/c. Cell Mol. Genet., 11:467, 1985.
Van Pel, Van der Bruggen, Coulie, Brichard, Lethe, Van den Eynde, Uytten
hove, Renauld, Boon, "Genes coding for tumor antigens recognized by cyto
lytic T lymphocytes," Immunol Rev., 145:229, 1995. Wolfel, Van Pel, De Plaen, Lurquin, Maryanski, Boon, "Immunogenic (tum-)
variants obtained by mutagenesis of mouse mastocytoma P815. VIII. Det
ection of stable transfectants expressing a tum- antigen with a cytolyti
c T cell stimulation assay," Immunogenetics, 26:178-187, 1987.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本研究で使用した種々のＡＰＣによる表面マーカーの発現を示す図である。脾
臓のＤＣ（ｓＤＣ）、非分画ＰＢＭＣ、精製Ｂ細胞、および非分画脾細胞を、実
施例１に記載のように、未処理ＤＢＡ／２マウスから調製した。次いで、細胞を
、表示のＦＩＴＣ結合ｍＡｂｓで染色し、フローサイトメトリーで分析した。デ
ータは、代表的な少なくとも２つの異なる複製である。

【図２】種々の用量のＰ１９８腫瘍ペプチドでパルスしたｓＤＣで刺激したＣＴＬＰ
１９８．６クローンによるＴＮＦの産生を示す図である。ｓＤＣを、表示の濃度
のＰ１９８ペプチドでパルスし、洗浄し、Ｐ１９８特異的ＣＴＬクローンＰ１９
８．６有り（黒塗り）および無し（白抜き）と２４時間同時培養した。上清のＴ
ＮＦ含有量を、ＷＥＨＩ−１６４細胞に対するその毒性を同定することによって
評価した。

【図３】Ｐ１９８ペプチド負荷ＡＰＣでの免疫化の模式図である。全ての免疫化研究に
おいて、ＤＢＡ／２マウス（通常、５匹／群）を、毎週３週間継続して種々のペ
プチド負荷ＡＰＣで注射した。いくつかの研究において、ｒｍＩＬ−１２もまた
投与し、ペプチドパルスＡＰＣと共に各免疫日（０、１、および２日目）に注射
した。最後の免疫化の２週間後、脾細胞またはＰＢＭＣを、適切な腫瘍細胞で再
刺激し、培養の６〜７日目に特異的な細胞溶解活性を測定した。

【図４】Ｐ１９８ペプチドパルスｓＤＣでの免疫化後の特異的なＣＴＬ活性を有するマ
ウスの産生を示す図である。ＤＢＡ／２マウス（５群）を、ＤＰＢＳ中の５×１
０⁵のＰ１９８パルスｓＤＣで毎週３週間継続してｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、または
後ろの両支脚皿（ｆ．ｐ．）の間で分けて免疫化した。最後の免疫化の２週間後
、刺激因子としてＰ１９８細胞（白抜きのバー）またはＰ１９８．Ｂ７−１細胞
（黒塗りのバー）を用いてＭＬＴＣを行った。細胞溶解活性を、非放射性標的と
して非標識のＰ５１１の存在下で、Ｐ１９８またはＰ５１１に対して６日目に分
析した。ｓＤＣのみまたはＰＢＳを投与したコントロールマウスは、いずれも検
出可能なＣＴＬを誘導しなかった。マウスを、Ｅ：Ｔ比が１００：１での特異的
な溶解が２５を超える場合、およびＰ１９８およびＰ５１１の間の溶解の差が１
５を超える場合は陽性とみなした。２つの研究で類似の結果が認められた。

【図５Ａおよび図５Ｂ】未処理のマウスの、ｒｍＩＬ−１２と組み合わせたＰ１９８ペプチドでパルス
した種々のＡＰＣでの免疫化を示す図である。未処理のＤＢＡ／２マウスを、実
施例および図３に記載のように、ｒｍＩＬ−１２有り（図５Ａ）または無し（図
５Ｂ）の、Ｐ１９８ペプチドパルスｓＤＣ、脾細胞、またはＰＢＭＣで免疫した
。各ＡＰＣ型のパルスのためにペプチド（１μＭ）を使用した。注射あたり、ｓ
ＤＣ（５×１０⁵）を使用した。脾細胞について、２０×１０⁶（脾臓１）、２×
１０⁶（脾臓２）、または５×１０⁵（脾臓３）の細胞を使用した。ＰＢＭＣにつ
いて、２×１０⁶（ＰＢＭＣ１）、１×１０⁶（ＰＢＭＣ２）、または５×１０⁵
（ＰＢＭＣ３）の細胞を使用した。最後の免疫化の２週間後、ＰＢＭＣを単離し
、Ｐ１９８細胞を刺激因子として使用して６日目のＭＬＴＣを刺激した。刺激因
子としてＰ１９８．Ｂ７−１細胞を用いた場合と類似の結果を得た。各マウス由
来の溶解を、抗原の正の標的のＰ１９８および負の標的としてのＰ５１１に対し
て評価した。非標識Ｐ５１１細胞を、競合細胞として添加して、非特異的活性を
排除した。各黒丸は、Ｅ：Ｔ比が３０：１での各マウスから得た溶解活性を示す
。Ｐ５１１に対する溶解は、同じＥ：Ｔ比で１０％未満であった。

【図６】Ｐ１９８ペプチドでパルスした異なる型のＡＰＣを用いて刺激したＣＴＬＰ
１９８．６クローンによるＩＦＮ−γの産生を示す図である。ＤＢＡ由来のｓＤ
Ｃ、非分画脾細胞、休止期Ｂ細胞、ＬＰＳ活性化脾細胞、ＰＢＭＣ、またはＰ５
１１腫瘍細胞を、種々の濃度のＰ１９８ペプチドでパルスし、洗浄し、ＣＴＬ
Ｐ１９８．６クローンと共に４８時間同時培養した。上清のＩＦＮ−γの含有量
を、特異的ＥＬＩＳＡを用いて評価した。任意のＡＰＣの非存在下での同一のＣ
ＴＬＰ１９８．６によるＩＦＮ−γの産生は、２０Ｕ／ｍｌ未満であり、照射
Ｐ１９８腫瘍細胞の存在下で培養した同一のＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生は
、約８００Ｕ／ｍｌであった。

【図７】Ｐ１９８ペプチドパルスＡＰＣ＋ｒｍＩＬ−１２で免疫化したマウス由来のＣ
ＴＬによるＰ１９８標的細胞の溶解を示す図である。ＤＢＡ／２マウスを、上記
のようにｒｍＩＬ−１２と共にＰ１９８ペプチドでパルスしたｓＤＣ（５×１０ ⁵ ）、Ｂ細胞（０．５〜２０×１０⁶）、脾細胞（０．５〜２０×１０⁶）、また
はＰＢＭＣ（０．５〜２×１０⁶）で毎週３週間にわたり注射した。ｓＤＣを１
μＭペプチドでパルスした一方で、他の細胞を１０μＭペプチドでパルスした。
最後の免疫化の２週間後、ＰＢＭＣを単離し、照射Ｐ１９８細胞の存在下で７日
間ｉｎｖｉｔｒｏで刺激した。次いで、⁵¹Ｃｒ標識Ｐ１９８細胞（黒丸）およ
びＰ５１１細胞（白丸）に対する溶解活性を評価した。

【図８Ａ〜図８Ｄ】ｒｍＩＬ−２を有りまたは無しでのＰ１ＡペプチドパルスＰＢＭＣで免疫化し
た各ＤＢＡ／２マウスから得たＣＴＬ活性を示した図である。未処理のＤＢＡ／
２マウス（５匹／群）を、Ｐ１Ａペプチド（１０μＭ）単独（図８Ａ）またはｒ
ｍＩＬ−１２との組み合わせて（図８Ｂ）パルスした２×１０⁶照射ＰＢＭＣで
毎週、３週間にわたり免疫化した。コントロールマウスを、非パルスＰＢＭＣ＋
ｒｍＩＬ−１２（図８Ｃ）またはＤＰＢＳ（図８Ｄ）で注射した。最後の免疫化
の２週間後、ＰＢＭＣを単離し、ＬＩ２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７−１細胞で刺激し、
６日目にＰ５１１およびＰ１２０４標的細胞に対する細胞溶解活性を評価した。

【図９】Ｐ１Ａ負荷ＰＢＭＣ＋ｒｍＩＬ−１２で免疫化したマウスにおける生存Ｐ１．
ＨＴＲ腫瘍攻撃に対する保護を示す図である。未処理のＤＢＡ／２マウス（５匹
／群）を、図３に記載のスケジュールに従って、ＤＰＢＳ（黒三角）、ＰＢＭＣ
＋ｒｍＩＬ−１２（白三角）、Ｐ１Ａで負荷したＰＢＭＣ（白四角）、またはｒ
ｍＩＬ−１２と組み合わせたＰＢＭＣ−Ｐ１Ａ（黒四角）で、毎週３週間にわた
り免疫化した。ＣＴＬアッセイ（図８に示す）の１０日後、全てのマウスを、１
０×１０⁶生存Ｐ１ＨＴＲ腫瘍細胞を用いて左隣にｓ．ｃ．で攻撃した。表示
の時間で双方向性測定を行い、記録した。少なくとも２つの研究で類似の結果を
得た。

【図１０】難治性転移性疾患を有するメラノーマ患者のワクチン接種を、ｒｈＩＬ−１２
有さない腫瘍抗原ペプチドパルス自家系ＰＢＭＣを用いて行った。ペプチド特異
的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の産生を、Ｍａｇｅ３（１０μｍ）またはＭｅ
ｌａｎＡ（５０μｍ）で１〜３回免疫化した後検出した。ＭｅｌａｎＡ特異的応
答は、Ｍａｇｅ−３特異的応答よりも早く検出されるようである。

【図１１】難治性転移性疾患を有するメラノーマ患者のワクチン接種を、３０ｎｇ／ｋｇ
のｒｈＩＬ−１２を有する腫瘍抗原ペプチドパルス自家系ＰＢＭＣを用いて行っ
た。ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の産生を、Ｍａｇｅ３（１０
μｍ）またはＭｅｌａｎＡ（５０μｍ）で１〜３回免疫化した後検出した。Ｍｅ
ｌａｎＡ特異的応答は、Ｍａｇｅ−３特異的応答よりも早く検出されるようであ
る。

【図１２】難治性転移性疾患を有するメラノーマ患者のワクチン接種を、３０ｎｇ／ｋｇ
のｒｈＩＬ−１２を有する腫瘍抗原ペプチドパルス自家系ＰＢＭＣを用いて行っ
た。ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の産生を、Ｍａｇｅ３（１０
μｍ）またはＭｅｌａｎＡ（５０μｍ）で１〜３回免疫化した後検出した。SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Gajewski, Thomas F. Fallarino, Francesca (ii) TITLE OF INVENTION: VACCINE ADJUVANTS FOR IMMUNOTHERAPY OF MELANOMA (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 28 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Arnold, White & Durkee (B) STREET: P.O. Box 4433 (C) CITY: Houston (D) STATE: Texas (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 77210-4433 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US Unknown (B) FILING DATE: Concurrently Herewith (C) CLASSIFICATION: Unknown (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 09/064,964 (B) FILING DATE: 23-APR-1998 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Wilson, Mark B. (B) REGISTRATION NUMBER: 37,259 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: ARCD:301 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (512)418-3000 (B) TELEFAX: (512)474-7577 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Lys Tyr Gln Ala Val Thr Thr Thr Leu 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: TGGAGGACCA GAGGCCCCC 1 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/12 39/12 Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 17/00 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 35:12） //(Ａ６１Ｋ 38/00 35:18） 35:12） 35:28） (Ａ６１Ｋ 38/00 37/02 35:18） (Ａ６１Ｋ 38/00 35:28） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ガジェウスキー，トーマス・エフアメリカ合衆国イリノイ州60615，シカゴ，イースト・マディソン・パーク 1362，＃３ (72)発明者ファラリーノ，フランチェスカイタリア国，イー06062 エッセ・リタルド 26，エイッタ・デラ・ピエーヴェ (72)発明者シャーマン，マシュウ・エルアメリカ合衆国マサチューセッツ州02140，ケンブリッジ，ケンブリッジ・パーク・ドライヴ 87，ニュートン・ジェネティクス・インスティテュート，ジャネット・ロード 33 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 DA12 NA05 ZB262 ZB332 4C085 AA03 BA51 BB01 FF13 4C087 AA01 AA02 BB33 BB36 BB44 NA05 ZB26 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）ＩＬ−１２を含む組成物を準備するステップと、ｂ）ペプチドでパルスした抗原提示細胞を含む組成物を準備するステップと、ｃ）免疫応答を誘導するために有効な量の、前記ＩＬ−１２を含む組成物と、前記ペプチドでパルスした抗原提示細胞を含む組成物とを哺乳動物に投与するス
テップとを含む哺乳動物の免疫応答の誘導方法。
【請求項２】前記抗原提示細胞が自己のものである請求項１に記載の方法
。
【請求項３】前記抗原提示細胞が、リポ多糖によって活性化されたＢ細胞
、脾細胞全体、樹状細胞、線維芽細胞、および非分画末梢血単核球からなる群か
ら選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記抗原提示細胞が、非分画末梢血単核球である請求項３に
記載の方法。
【請求項５】前記ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩ
Ｉ分子に結合する抗原に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記抗原が、メラノーマ抗原である請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記抗原が、ウイルス抗原である請求項５に記載の方法。
【請求項８】前記メラノーマ抗原が、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、Ｍｅ
ｌａｎ−Ａ、Ｐ１９８、Ｐ１Ａ、ｇｐ１００、およびチロシナーゼからなる群か
ら選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】前記メラノーマ抗原が、ＭＡＧＥ−１である請求項６に記載
の方法。
【請求項１０】前記メラノーマ抗原が、ＭＡＧＥ−３である請求項６に記
載の方法。
【請求項１１】前記メラノーマ抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａである請求項６に
記載の方法。
【請求項１２】前記メラノーマ抗原が、Ｐ１９８である請求項６に記載の
方法。
【請求項１３】前記メラノーマ抗原が、Ｐ１Ａである請求項６に記載の方
法。
【請求項１４】前記メラノーマ抗原が、ｇｐ１００である請求項６に記載
の方法。
【請求項１５】前記メラノーマ抗原が、チロシナーゼである請求項６に記
載の方法。
【請求項１６】前記メラノーマ抗原が、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、Ｍ
ｅｌａｎ−Ａ、Ｐ１９８、Ｐ１Ａ、ｇｐ１００、およびチロシナーゼからなる群
から選択される抗原の少なくとも１つを含む抗原の組み合わせである請求項６に
記載の方法。
【請求項１７】前記抗原提示細胞が、０．１μＭ〜１ｍＭの量のペプチド
でパルスされる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記量が１０〜５０μＭである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記免疫応答が、前記哺乳動物によるＭＨＣクラスＩ分子
またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球の産
生を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記投与が、１回治療用量の抗原提示細胞と、１回または
複数の治療用量のＩＬ−１２とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】前記抗原提示細胞の用量が、１×１０⁶〜１×１０⁹の量で
投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記抗原提示細胞の用量が、約１×１０⁸である請求項２
１に記載の方法。
【請求項２３】前記ＩＬ−１２の用量が、１ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｎｇ／
ｋｇの量で投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】前記ＩＬ−１２の用量が、３０〜５００ｎｇ／ｋｇである
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記哺乳動物が、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項２６】前記哺乳動物が、罹患している請求項１に記載の方法。
【請求項２７】前記疾患が、メラノーマである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記疾患が、ウイルスである請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】ペプチドでパルスされた抗原提示細胞を含む組成物と、Ｉ
Ｌ−１２を含む組成物とを投与するステップを包含する罹患した動物の治療方法
。
【請求項３０】前記疾患が、メラノーマである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記疾患が、ウイルス感染である請求項２９に記載の方法
。
【請求項３２】前記抗原提示細胞が、自己のものである請求項２９に記載
の方法。
【請求項３３】前記抗原提示細胞が、リポ多糖によって活性化されたＢ細
胞、脾細胞全体、樹状細胞、線維芽細胞、および非分画末梢血単核球からなる群
から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記抗原提示細胞が、非分画末梢血単核球である請求項３
３に記載の方法。
【請求項３５】前記ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラス
ＩＩ分子に結合する抗原に由来する請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】前記抗原が、ウイルスである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】前記抗原が、メラノーマ抗原である請求項３５に記載の方
法。
【請求項３８】前記メラノーマ抗原が、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、Ｍ
ｅｌａｎ−Ａ、Ｐ１９８、Ｐ１Ａ、ｇｐ１００、およびチロシナーゼからなる群
から選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】前記抗原提示細胞が、０．１μＭ〜１ｍＭの量のペプチド
でパルスされる請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】前記量が、１０〜５０μＭである請求項３９に記載の方法
。
【請求項４１】前記投与が、１回治療用量のＩＬ−１２と組み合わせた１
回治療用量のペプチドでパルスした抗原提示細胞の投与後に、複数回治療用量の
ＩＬ−１２の投与を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】前記抗原提示細胞の用量が、１×１０⁶〜１×１０⁹の量で
投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記抗原提示細胞の用量が、約１×１０⁸である請求項４
２に記載の方法。
【請求項４４】前記ＩＬ−１２の用量が、１ｎｇ／ｋｇ〜１０００ｎｇ／
ｋｇの量で投与される請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】前記ＩＬ−１２の用量が、３０〜５００ｎｇ／ｋｇである
請求項４４に記載の方法。