MXPA00010378A - Combinacion de celulas que presentan antigenos pulsadas con antigenos e interleucina 12 para terapia contra tumores y virus - Google Patents

Abstract

La invención provee métodos para inducir la producción de linfocitos T citolíticos dirgidoscontra malignidad o agentes infecciosos por un mamífero, y el tratamiento de dicha enfermedad de tal manera que los efectos colaterales deletéreos se reducen al mínimo y el tratamiento de melanomas metastásicos se mejora de manera sorprendente y drástica.

Description

COMBINACIÓN DE CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTIGENOS PULSADAS CON ANTIGENOS E INTERLEUCINA-12 PARA TERAPIA CONTRA TUMORES Y VIRUS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente solicitud es en parte una continuación de la solicitud de patente copendiente de E.U.A. serie No. 09/168,832, presentada el 8 de octubre de 1998, y la solicitud de patente copendiente de E.U.A. serie No. 10 09/064,964, presentada el 23 de abril de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a los campos de 15 inmunoterapia, oncología y control de enfermedades infecciosas. Más particularmente, se refiere a métodos novedosos para el tratamiento de enfermedades infecciosas y cánceres, en particular melanomas, con un adyuvante en combinación o adyuvante de tal manera que se induce una respuesta inmune inesperadamente fuerte dirigida contra las enfermedades o 20 melanomas sin los efectos secundarios perjudiciales que se han observado previamente con la quimioterapia estándar.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El melanoma es un cáncer de la célula pigmentada de la piel, el ^^ melanocito. Los pacientes con melanoma metastásico maligno (etapa IV) 5 tienen una sobrevivencia media de aproximadamente un año (Balch eí al., 1993; Koh, 1991 ). El tratamiento estándar actual consiste en la combinación de quimioterapia con agentes tales como cisplatina, DTIC y BCNU, con o sin citocinas tales como interleucina-2 (IL-2) o interferón-a (IFN-a) (Balch et al., 1993; Koh, 1991 ; Legha y Buzaid, 1993). Se ha reportado que los índices de 10 respuesta a la quimioterapia son tan altos como 60%, pero sólo aproximadamente 5% de los pacientes experimentan sobrevivencia a largo plazo, sin importar el régimen terapéutico utilizado. Claramente, se requieren nuevos procedimientos para el tratamiento del melanoma metastásico. La quimioterapia convencional busca controlar el crecimiento del 15 cáncer mediante la localización de células que crecen rápidamente. Sin embargo, esta función no es específica, ya que muchas células normales, tales como las de la médula ósea y el epitelio intestinal, tienen también un nivel basal de proliferación. Por lo tanto, muchas células normales del cuerpo son también susceptibles a los efectos tóxicos de la quimioterapia, por lo que 20 la quimioterapia convencional puede impartir un grado sustancial de morbilidad al paciente. El atractivo de la inmunoterapia es su carácter específico. Si se expresaran antígenos sobre las células tumorales que no fueron expresadas por las células normales del hospedero, entonces teóricamente los linfocitos T citolíticos (CTL) específicos podrían ser activados para destruir selectivamente a las células tumorales, mientras se limitan a los tejidos normales del paciente. Para este fin, se ha hecho un esfuerzo considerable en la última 5 década por identificar dichos antígenos específicos de tumores que puedan funcionar como objetivos para la destrucción de células tumorales específicas (Boon et al., 1994; Boon et al., 1995). Los enfoques iniciales a la ¡nmunoterapia del cáncer han tenido éxito limitado. Las vacunaciones con células tumorales irradiadas, con o sin adyuvantes, han generado índices de respuesta de 10-20% (Berd eí al., • 1990). Potenciadores inmunes no específicos tales como Calmette-Guerin de Bacillus (BCG), también han dado índices de respuesta bajos pero detectables (Eilber eí al., 1976). El tratamiento de pacientes con carcinoma metastásico de células renales con el factor de crecimiento de células T IL-2, ha dado como resultado índices de respuesta de 15 a 20%, en donde varios porcentajes de pacientes experimentan una sobrevivencia significativa a largo plazo (Hawkins, 1996). Del mismo modo, la adición de IL-2 a la quimioterapia • estándar para el tratamiento del melanoma metastásico, puede dar como resultado índices de respuesta incrementados (Eilber ef al., 1976). En conjunto, estas observaciones apoyan el concepto de que la manipulación inmune tiene el potencial de beneficiar a los pacientes con ciertos tipos de cáncer, pero indica claramente que las alternativas actuales son subóptimas. Una hipótesis para explicar los bajos índices de respuesta general a estas terapias, es que las alternativas hasta ahora han buscado amplificar la respuesta inmune que ya ha sido iniciada por el hospedero. De hecho, el problema fundamental puede ser que la mayoría de los pacientes no inician apropiadamente una respuesta inmune antitumoral. Además, la inmunización • 5 específica de antígenos tumorales requerirá la inducción de la actividad de células T citolíticas, y poco se sabe respecto al método óptimo para lograr este objetivo. La caracterización molecular de antígenos expresados específicamente en células tumorales, pero no en la mayoría de las células normales de origen en el hospedero, ha abierto la posibilidad de una vacunación específica de tumores en la inmunoterapia del cáncer. Los últimos años han sido testigo de una rápida expansión en la identificación de antígenos tumorales humanos, y sus genes, principalmente en las líneas de células de melanoma, que comprenden varias categorías distintas: 1 ) mutaciones de punto en genes celulares normales; 2) antígenos de diferenciación restringida al linaje de melanocitos; 3) secuencias de intrón que son incluidas en la región de codificación de un gen; 4) productos de genes virales; 5) productos subglucosilados de genes normales; y 6) genes no mutados regulados durante el desarrollo que no se expresan normalmente en la mayoría de los tejidos del adulto (Chen eí al., 1993). El reconocimiento inmune de estos antígenos ocurre mediante CTL CD8+ específicos que interactúan con péptidos antigénicos unidos a una ranura en las moléculas MHC (HLA) clase I. También se han descrito epítopes de unión a MHC clase II reconocidos por células T CD4". Bajo circunstancias óptimas, el inicio de una respuesta inmune es desencadenado por complejos de péptido/MHC expresados por células 5 que presentan antígeno (APC) del hospedero, y requiere adicionalmente cofactores múltiples provistos por APC. Varios tipos de células parecen ser capaces de funcionar como APC "profesionales", ¡ncluyendo células dendríticas (DC), células B activadas y macrófagos activados. Después de la activación inicial, se piensa que los CTL inducidos por interacciones con APC migran a través del hospedero, reconocen el mismo complejo de MHC/péptido • en las células tumorales, y son inducidos para destruirlas. Esta citólisis específica del antígeno es mediada principalmente mediante inducción de apoptosis. Se ha formulado la hipótesis de que uno o varios pasos a lo largo de esta vía de activación de células T, y el reconocimiento de células objetivo, pueden ser defectuosos en individuos que poseen tumores. MAGE-1 fue el primer gen de antígeno tumoral humano que fue clonado y caracterizado (Van der Bruggen eí al., 1991 ). Es expresado por • varias líneas de células de melanoma, pero no por cualquier tejido del adulto excepto el testículo. Por lo tanto, se sitúa en la categoría 6 indicada anteriormente, siendo un gen normal que es expresado anormalmente. MAGE-1 pertenece a una familia de por lo menos 12 genes relacionados, muchos de los cuales son también expresados en varios tipos de células tumorales (De Plaen eí al., 1994). Uno de estos, MAGE-3, se ha encontrado ^^^^^^j^jfcg^^ es expresado en aproximadamente dos terceras partes de todas las muestras de melanoma puestas a prueba. Se han identificado péptidos derivados de la proteína MAGE-3 que se unen a las ranuras de las moléculas MHC HLA-A1 , HLA-A2 y HLA-B44 (Van der Bruggen eí al., 1991 ; Van Peí eí al., 1995: Van der Bruggen eí al., 1994), y también se han observado C1 L que reconocen cada una de estas combinaciones de péptido-HLA. HLA-A2 es el alelo HLA expresado con más frecuencia en humanos, y está presente en aproximadamente 50% de los individuos. Recientemente, 12 pacientes con melanoma metastásico MAGE-3+ fueron inyectados en Europa a intervalos mensuales con el péptido MAGE-3 que se une a HLA-A1 (Marchand eí al., 1995). 100 o 300 µg de péptido fueron inyectados en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) en 2 sitios subcutáneos distantes de cualquier localización de tumor. No hubieron toxicidades importantes, y 3 pacientes experimentaron molestia moderada de inflamación en ubicaciones del tumor o nodulos linfáticos. Seis pacientes estuvieron bastante bien para completar 3 inyecciones mensuales. Más bien sorprendentemente, 3 de los 6 pacientes demostraron respuestas parciales importantes, dando un índice de respuesta general de 25%. Debido a la identificación de la familia MAGE, se han caracterizado varios antígenos de melanoma adicionales incluyendo Melan-A, gp100 y tirosinasa (Oíd eí al., 1996). Uno de estos, Melan-A, es expresado por casi todas las líneas de células de melanoma puestas a prueba (Coulie eí al., 1994), así como también en melanocitos normales. Se sitúa por lo tanto en la categoría 2 anterior, codificando para un antígeno de diferenciación de melanocitos. Se ha identificado un péptido codificado por Melan-A que se une a HLA-A2. ^* Dieciocho pacientes HLA-A2+ con melanoma metastásico fueron inmunizados con un péptido derivado de Melan-A emulsificado en adyuvante incompleto de Freund (Cormier eí al., 1997). No se observaron toxicidades importantes, y se demostró evidencia de inmunización en 12 pacientes. Sin embargo, no se observaron respuestas de regresión del tumor, indicando que esta estrategia de vacunación más bien directa no fue suficiente para generar un efecto terapéutico. En conjunto, estos resultados apoyan la seguridad • general de los péptidos de antígeno tumoral en humanos, especialmente en comparación con las toxicidades de la quimioterapia convencional. Los avances recientes en el conocimiento de la activación y diferenciación de linfocitos T, han indicado varios factores coestimuladores clave provistos por APC que son vitales para la generación óptima de CTL CD8+. De hecho, se ha mostrado que la estimulación de células T mediante el receptor de células T para antígeno (TCR) en ausencia de otros factores • coestimuladores no induce activación, sino más bien un estado sin respuesta denominado anergia clonal (Schwartz, 1990; Tan eí al., 1993). De esta manera, la participación de moléculas coestimuladoras es un componente esencial para iniciar la diferenciación productiva de células T. Los cofactores específicos presentes durante e inmediatamente después del encuentro inicial de células T con antígenos, determinan el fenotipo funcional de las células que surgen. Para células T CD8+, los fenotipos funcionales principales se sitúan en dos subconjuntos designados como Tc1 y Tc2 (Sad eí al., 1995). Las células Tc1 producen altos niveles de IFN-? y FNT y tienen alta actividad lítica, mientras que las células Tc2 producen IL-4 e IL-5 y son poco líticas • 5 (Cronin eí al., 1995). Se ha sugerido que una respuesta de tipo Tc1 podría ser superior para mediar el rechazo de tumores. La familia B7 de moléculas coestimuladoras, formadas de B7-1 y B7-2, parece ser importante para instruir a las células T en desarrollo para que produzcan IL-2, y para evitar la inducción de la falta de respuesta o anergia de las células T (Linsley eí al., 1991 ; Harding eí al., 1992; Gimmi eí al., 1993). B7- • 1/B7-2 ¡nteractúan con dos contrarreceptores designados como CD28 y CTLA4, sobre la superficie de los linfocitos T. La provisión de B7 durante la activación de células T no afectadas, es el disparo que desencadena la respuesta inicial. En este punto, las citocinas exógenas particulares presentes determinan el fenotipo funcional de las células efectoras activadas resultantes. IL-12 parece inducir un fenotipo Tc1 de alta producción de INF-?, mientras que IL-4 favorece el desarrollo de células Tc2 (Sad eí al., 1995). Estas • características son paralelas a las de los linfocitos T auxiliares CD4+ (Fitch eí al., 1993). La provisión de B7 e IL-12 permite la generación de CTL potentes específicos de antígenos tumorales in vitro (Gajewski eí al., 1995). En varios modelos en murinos in vivo, la transfección de tumores inmunógenos para expresar B7, ha dado como resultado rechazo dependiente de células T CD8+ por ratones singénicos (Townsend y Allison, 1993, Chen eí al., 1994). IL-12 puede facilitar también la regresión de tumores en murinos en forma dependiente de células T (Brunda eí al., 1993). El bloqueo de B7 o IL-12 en el hospedero in vivo, evita el rechazo de tumores de otra manera muy — . ¡nmunógenos (Gajewski eí al., 1996; Fallarino eí al., 1996), indicando que estos dos factores son utilizados normalmente por la respuesta inmune que media el rechazo del tumor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para superar las • deficiencias de la técnica anterior, proveyendo métodos mejorados para el tratamiento de enfermedades e ¡nfecciones, y que son inesperadamente eficaces para inducir respuestas inmunes dirigidas contra enfermedades e infecciones. En algunas modalidades preferidas, la invención se refiere al tratamiento de melanomas, tales como melanomas metastásicos, e infecciones virales. Los inventores han descubierto que la administración de los adyuvantes en la forma descrita anteriormente, es mucho más eficaz de lo • que se habría predicho con base en la técnica anterior, o cuando los adyuvantes son administrados solos o en una combinación u orden diferentes.

La invención provee la ventaja adicional de reducir los efectos secundarios perjudiciales que se han asociado previamente con las terapias del cáncer. Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas y de conformidad con la práctica de leyes de patente persistentes, las formas singulares "un" "una" y "la" significan generalmente "por lo menos una", "una o más", y otras referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, las referencias a "una célula", "un péptido", y un "un adyuvante", incluyen mezclas de células, uno o • 5 más péptidos y una pluralidad de adyuvantes del tipo descpto; y la referencia a "IL-12" incluye especies diferentes tales como IL-12, por ejemplo, IL-12 recombinante de humano, etc. Como se usa en la presente, el término "un péptido recombinante" a menos que se señale expresamente otra cosa, se usa para referirse en forma concisa a un péptido recombinante que se deriva de un • antígeno que puede ser reconocido por linfocitos T. Los "péptidos recombinantes", son generalmente moléculas de péptido que pueden ser provistos a células (o animales) por la mano del hombre. El término "péptido recombinante" no se extiende generalmente a secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas, que pudieron haber sido movidos mediante un procedimiento de naturaleza tal que se han "recombinado" en una secuencia u orden diferente de la célula u organismo original de los cuales se derivaron sin • intervención del hombre. La invención provee un método para inducir una respuesta inmune en mamíferos, que comprende: proveer una composición que comprende IL-12 y células que presentan antígeno pulsadas con péptido, y administrar la composición a un mamífero en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune. En un sistema ilustrativo la composición, o adyuvante, comprende células que presentan antígeno (APCs) pulsadas o cargadas con péptido, e IL-12. La invención provee además que las APCs comprenden células autológas, y en algunas modalidades ilustrativas, las células que tienen antígeno pueden comprender células B activadas por lopopolisacárido, células de bazo intactas, células dendríticas, fibroblastos o células mononucleares de sangre periférica (PMBC) no fraccionadas. De hecho, se entiende que el experto en la técnica reconocerá que otras células que presentan antígeno pueden ser útiles en la invención, y que la invención no está limitada a los ejemplos de tipos de células que se describen en la presente. Las APCs son pulsadas, o cargadas, con péptido antigénico o péptido recombinante derivado de por lo menos un antígeno. En una modalidad, el péptido comprende un fragmento antigénico capaz de inducir una respuesta inmune que se caracteriza por la producción de linfocitos T citolíticos (células T citolíticas o CTLs), los cuales son dirigidos contra una malignidad o infección por un mamífero. En un ejemplo de modalidad particular, el péptido comprende uno o más fragmentos de un antígeno que se une a moléculas MHC clase I o MHC clase II (véase cuadros 1 y 2 para listas de ejemplos de antígenos tumorales). Se entiende que los antígenos mencionados en los cuadros 1 y 2 se proveen con fines ilustrativos, y que el experto en la técnica reconocerá que la invención descrita no está limitada a estos antígenos ilustrativos.

En un sistema ilustrativo, los péptidos comprenden uno o más fragmentos de uno o más antígenos expresados por tumores de melanoma u otros cánceres, o agentes infecciosos tales como virus, bacterias, parásitos y ^* similares. En algunas modalidades ilustrativas de la invención, el péptido 5 comprende MAGE-1 , MAGE-3, Melan-A, P198, P1A, gp100 o tirosinasa. De hecho, se entiende que el experto en la técnica reconocerá que los péptidos que comprenden uno o más fragmentos de otros antígenos pueden ser útiles en la invención, y que la misma no está limitada a los ejemplos de péptidos y antígenos que se describen en la presente. 10 Las APCs pueden ser pulsadas con cualquier concentración # efectiva de péptido. En un sistema ilustrativo en particular, las APCs comprenden células pulsadas con aproximadamente 0.1µM-1 mM de péptido. En un sistema ilustrativo preferido, las APCs comprenden células pulsadas con aproximadamente 1 µM-100µM de péptido, y en una modalidad preferida adicional, con aproximadamente 10µM-50µM. En una modalidad adicional, la malignidad comprende un melanoma u otro cáncer, tal como cáncer de próstata, ovario, riñon, pulmón, # cerebro, mama, colon, hueso, piel, testículo o útero, y los virus comprenden retrovirus, adenovirus, virus vaccinia, virus de herpes, virus adenoasociados, lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), o arbovirus (virus llevado por artrópodos) (listas y descripciones amplias de arbovirus, se proveen en Entomology in Human and Animal Health, séptima edición, 1979, y The Biology of Disease Vectors, University Press Colorado, 1996, las cuales se incorporan en la presente como referencia). En otra modalidad, la infección comprende una infección bacteriana o parasitaria. Los mamíferos incluyen pero no están limitados a, equinos, ganado vacuno, felinos, caninos, ratas, ratones y humanos. 5 En una modalidad particular, la invención provee un método para inducir una respuesta inmune en mamíferos, en donde las APCs pulsadas con péptido son administradas a un mamífero que necesita del mismo, en una dosis terapéutica individual en combinación con una dosis terapéutica individual de IL-12, seguido de dosis terapéuticas múltiples de IL-12. • 10 La dosificación puede ser cualquiera que induzca una respuesta inmune. En ciertas modalidades, la cantidad de APCs administradas comprende 1x106 - 1x109 por dosis. En ejemplos de modalidades prefepdas, la cantidad de APCs administradas comprende aproximadamente 1x108 por dosis. En otras modalidades, la cantidad de IL-12 administrada comprende 1 ng/kg-1000ng/kg. En ciertos ejemplos de modalidades preferidas, la cantidad de IL-12 administrada comprende 30-50ng/kg por dosis. En efecto, será entendido por el experto en la técnica que la dosificación prefepda debe ser • individualizada para el paciente siguiendo prácticas de laboratorio y prácticas médicas estándar adecuadas. 20 En otro aspecto, la invención provee un método para tratar a un paciente con una malignidad o infección, el cual comprende administrar un adyuvante o composición que comprenda células que presenten antígeno pulsadas con péptido, e IL-12.

En una modalidad en particular, la invención provee una composición usando PBMC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral con y sin rhlL-12 para producir una respuesta inmune en humanos. En modalidades preferidas, el péptido de antígeno tumoral es Mage3 o MelanA. En otras modalidades preferidas, se provee rhlL-12 además de Mage3 o MelanA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar mejor ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser mejor entendida con relación a uno o más de estos dibujos en combinación con la descppción detallada de modalidades específicas presentadas en la misma. La figura 1 se refiere a la expresión de marcadores de superficie por las diferentes APCs usadas en este estudio. Células DC esplénicas (sDC), PBMC no fraccionadas, células B purificadas y esplenocitos no fraccionados, fueron preparados a partir de ratones DBA/2 no afectados como se describe en el ejemplo 1. Las células fueron teñidas entonces con los mAbs indicados conjugados con FITC, y analizadas mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de por lo menos dos réplicas separadas. La figura 2 se refiere a la producción de FNT por el clon P198.6 de CTL estimulado con sDC pulsadas con varias dosis del péptido tumoral p198. sDC fueron pulsadas con las concentraciones indicadas del péptido P198, lavadas y co-cultivadas con (símbolos oscuros) o sin (símbolos claros) el clon P198.6 de CTL específico de P198 durante 24 horas. El contenido de FNT del sobrenadante se evaluó determinando su toxicidad sobre células • 5 WEHI-164. La figura 3 se refiere a un esquema de inmunización con APCs cargadas con péptido P198. En todos los estudios de inmunización, ratones DBA/2 (usualmente 5 por cohorte) fueron inyectados semanalmente durante tres semanas consecutivas con varias APCs cargadas con péptido. Se administró también rmlL-12 en algunos estudios, y fue inyectada junto con « APC pulsadas con péptido en el día de cada inmunización en el día 0, y de nuevo en los días 1 y 2, según se muestra. Dos semanas después de la última inmunización, células de bazo o PBMC fueron reestimuladas con las células tumorales apropiadas, y la actividad citolítica apropiada se determinó después de 6 a 7 días de cultivo. La figura 4 se refiere a la proporción de ratones con actividad de CTL específica después de inmunización con sDC pulsadas con el péptido • P198. Ratones DBA/2 (cohorte 5), fueron inmunizados semanalmente durante 3 semanas consecutivas con 5 x 105 sDC pulsadas con P198 en DPBS i.v, i.p o divididas entre ambos cojinetes de las patas traseras (f.p). Dos semanas después de la última inmunización, se llevó a cabo una MTLC con células P198 (barras claras), o células P198.B7-1 (barras oscuras) como estimuladores. Se analizó la actividad citolítica en el día 6 contra P198 o P511 en presencia de P511 no marcada como objetivo en frío. Los ratones control recibieron sDC solas o PBS, y ninguna de estas células indujo CTL detectables. Los ratones fueron considerados como positivos si la lisis específica a la relación E:T 100:1 era mayor de 25, y si la diferencia entre la lisis de P198 y P511 era mayor de 15. Se observaron resultados similares en los dos estudios. Las figuras 5A y 5B se refieren a la inmunización de ratones no afectados con varias APCs pulsadas con péptido P198 en combinación con rmlL-12. Ratones DBA 2 no afectados fueron inmunizados con sDC pulsadas con péptido P198, esplenocitos o PBMC con (figura 5A) o sin (figura 5B) rmlL-12, como se describe en el ejemplo y en la figura 3. Se usó péptido (1 µM) para cada pulso de cada tipo de APC. Se usaron sDC (5 x 105) por inyección; para esplenocitos, se usaron 20 x 106 (bazo 1 ), 2 x 106 (bazo 2) o 5 x 105 (bazo 3) células; para PBMC, se usaron 2 x 106 (PBMC 1 ), 1 x 106 (PBMC 2) o 5 x 105 (PBMC 3) células. Dos semanas después de la última inmunización, PBMC fueron aisladas y estimuladas en un MLTC en el día 6 usando células P198 como estimuladores. Se obtuvieron resultados similares usando células P198.B7-1 como estimuladores. Se evaluó la lisis de ratones individuales contra el objetivo P198 positivo a antígeno y contra P511 como objetivo negativo. Se añadieron células P511 no marcadas como células competidoras para eliminar la actividad no específica. Cada círculo oscuro representa la actividad lítica obtenida de un ratón individual a la relación E:T de 30:1. La lisis contra P511 fue menor del 10% a la misma relación E:T.

La figura 6 se refiere a la producción de IFN-? por el clon P198.6 de CTL estimulado con diferentes tipos de APCs pulsadas con el péptido P198. sDC derivadas de DBA, esplenocitos no fraccionados, células B en ^^ reposo, células de bazo activadas por LPS, PBMC, o células tumorales P511 , 5 fueron pulsadas con concentraciones variables del péptido P198, lavadas, y entonces cocultivadas con el clon P198.6 de CTL durante 48 horas. El contenido de IFN-? de los sobrenadantes se evaluó usando una ELISA específica. La producción de IFN-? por el clon P198.6 de CTL en ausencia de cualquier APC, fue menor de 20 U/ml, y la producción de IFN-? del mismo clon 10 de CTL cultivado en presencia de células tumorales P198 irradiadas, fue de aproximadamente 800 U/ml. La figura 7 se refiere a la lisis de células objetivo P198 por CTL de ratones inmunizados con APCs pulsadas con péptidos P198 más rmlL-12. Ratones DBA/2 fueron inyectados semanalmente durante 3 semanas con sDC pulsadas con péptido P198 (5 x 105), células B (0.5-20 x 106), células de bazo (0.5-20 x 106) o PBMC (0.5-2 x 106) junto con rmlL-12, como se describió jjk anteriormente. Las sDC fueron pulsadas con 1 µM de péptido, mientras que las otras células fueron pulsadas con 10 µM de péptido. Dos semanas después de la última inmunización, PBMC fueron aisladas y estimuladas in w'íro durante 7 días en presencia de células P198 irradiadas. Se evaluó entonces la actividad lítica contra células P198 marcadas con 51Cr (círculos oscuros) y células P511 (círculos claros).

Las figuras 8A a 8D se refieren a la actividad de CTL obtenida de ratones DBA/2 individuales inmunizados con PBMC pulsadas con péptido P1A con o sin rmlL-12. Ratones DBA/2 no afectados (5 por cohorte) fueron inmunizados semanalmente durante 3 semanas con 2 x 106 PBMC irradiadas • pulsadas con péptido P1A (10 µM) solo (figura 8A) o en combinación con rmlL-12 (figura 8B). Ratones control fueron inyectados con PBMC no pulsadas más rmlL-12 (figura 8C) o con (DPBS (figura 8D). Dos semanas después de la última inmunización, PBMC fueron aisladas y estimuladas con células L1210.P1A.B7-1 , y se evaluó la actividad citolítica en el día 6 contra células objetivo P511 y P1204. • La figura 9 se refiere a la protección contra desafío con tumor P1.HTR vivo en ratones inmunizados con PBMC cargadas con P1A más rmlL- 12. Ratones DBA/2 no afectados (5 por cohorte), fueron inmunizados semanalmente durante 3 semanas con DPBS (triángulos oscuros), PBMC más rmlL-12 (triángulos claros), PBMC cargadas con P1A (cuadros claros) o con PBMC-P1A en combinación con rmlL-12 (cuadros oscuros), de conformidad con el programa mostrado en la figura 3. Diez días después de la • prueba de CTL, (mostrada en la figura 8), todos los ratones fueron desafiados s.c. en el flanco izquierdo con 1 x 106 células tumorales P1.HTR vivas. Se hicieron mediciones bidimensionales en los tiempos indicados. Se obtuvieron resultados similares en por lo menos dos estudios. La figura 10 se refiere a que se demostró la vacunación de pacientes de melanoma con enfermedad metastásica refractaria usando PBMC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral sin rhlL-12. Se detectó la generación de células T CD8+ que producen IFN-? específica de péptido después de 1 a 3 inmunizaciones con Mage3 (10µm) o MelanA (50µm). Respuestas específicas de MelanA parecieron ser detectadas antes • 5 que respuestas específicas de Mage3. La figura 11 se refiere a que se demostró la vacunación de pacientes de melanoma con enfermedad metastásica refractaria usando PBMC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral con 30ng/kg de rhlL-12. Se detectó la generación de células T CD8+ que producen IFN-? j 10 específica de péptido después de 1 a 3 inmunizaciones con Mage3 (10µm) o MelanA (50µm). Respuestas específicas de MelanA parecieron ser detectadas antes que respuestas específicas de Mage3. La figura 12 se refiere a que se demostró la vacunación de pacientes de melanoma con enfermedad metastásica refractaria usando 15 PBMC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral con 30ng/kg de rhlL-12. Se detectó la generación de células T CD8+ que producen IFN-? específica de péptido después de 1 a 3 inmunizaciones con Mage3 (10µm) o • MelanA (50µm).

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS La invención describe métodos novedosos para usar un adyuvante de vacuna el cual induce específicamente estimulación inmune específica de antígeno contra un antígeno derivado de un tumor o agente infeccioso. Se ha demostrado que células sanguíneas de mamífero que son pulsadas mediante este método innovador, inducen la producción específica de linfocitos T citolíticos (CTL), y brindan protección ante la tumorigénesis. En • 5 general, el método mezcla el antígeno de tumor o enfermedad con células sanguíneas periféricas autólogas las cuales pueden ser irradiadas e inyectadas de vuelta en el animal o paciente. La inyección es co-administrada con IL-12 que ayuda a estimular al sistema inmune para promover una respuesta anti-neoplásica o anti-enfermedad en el animal o paciente. En ejemplos de sistemas, este método se ha aplicado a ratones usando los • antígenos tumorales de mastocinoma P198 y P1A, y a humanos usando los antígenos de melanoma MAGE-3 y Melan-A, El uso de células sanguíneas periféricas autólogas, las cuales pueden ser cosechadas fácilmente y preparadas rápidamente en unas cuantas horas, provee una mejora significativa sobre otras terapias que requieren técnicas de purificación y cultivo tardías de varias semanas, causando de esta manera un retraso crítico en el tratamiento. Además, la • combinación de células sanguíneas periféricas autólogas con antígeno e IL- 12, produce una inhibición inesperadamente alta de crecimiento del tumor, de modo que ocurre regresión o incluso desaparición del tumor, y extraordinariamente, los desafíos de tumores vivos pueden no dar como resultado ocurrencia del tumor. •--> Las CTLs intervienen directamente en las defensas del cuerpo contra cualquier infección, y son bien conocidas por destruir células infectadas por virus. Además, puesto que las CTLs reconocen antígenos extraños en el ^^ contexto de moléculas MHC clase I, la invención no está restringida al 9 5 tratamiento de cánceres, sino puede ser útil en el tratamiento de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades virales, para las cuales un péptido antigénico que se une a moléculas MHC clase I se puede mezclar con células sanguíneas periféricas autólogas. No es necesario para la práctica de la invención, que el péptido antigénico sea provisto en un estado purificado o aislado. • Se prevé que los métodos de la invención serán útiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas, virales o parasitarias que son resistentes a otras terapias, como en el caso de arbovirus o malaria, o para las cuales no se conocen vacunas efectivas, como en el caso del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus de herpes y ciertos arbovirus. Se prevé además que esta invención puede ser útil en terapias de vigilancia diseñadas para evitar la recurrencia de enfermedad, como en • regeneración de tumores, y en terapias preventivas tales como vacunación contra enfermedades virales o parasitarias, tales como encefalitis o malaria.

De esta manera, esta invención provee metodología y protocolos de inmunización novedosos, que son sorprendentemente más efectivos en la generación de CTLs que las alternativas convencionales, y tiene la mejora adicional de requepr menos tiempo para preparar el adyuvante o adyuvantes de vacuna comparativamente con otras terapias. Otra ventaja de esta invención es que ocurren pocos efectos perjudiciales secundarios (si es que existe alguno) en el animal o paciente W 5 mediante la administración del adyuvante de vacuna.

Estrategias de inmunización a base de péptidos Para avanzar hacia la inmunización de pacientes con melanoma, se requirió una metodología para vacunación a base de péptidos. Usando el sistema P815 de murino bien definido como modelo preclínico (Brichard eí al., • 1995; Van den Eynde eí al., 1991 ; Uyttenhove eí al., 1980; Van Peí eí al., 1985) y la detección de CTL específicos en sangre periférica como lectura sustituta, se examinaron estrategias de inmunización múltiples. Tres inmunizaciones subcutáneas semanales con péptido solo, péptido en varios adyuvantes diferentes, o péptido más IL-12, no pudieron inducir CTL detectables. Después, para enfocar el suministro de péptidos sobre APC, se intentó la pulsación ex vivo de células dendríticas (DC) purificadas, seguido de • su inyección. Este procedimiento produjo la generación de CTL en 10 a 20% de los ratones. Sin embargo, la inyección de DC pulsada con péptidos más IL- 20 12, indujo inesperadamente CTL específicos en 100% de los ratones. Aunque una sola inyección de DC cargadas de péptidos en el día 1 fue suficiente, fue necesario administrar IL-12 durante varios días después de la inmunización para que fuera eficaz.

La generación de DC purificadas a partir de cada paciente de melanoma sería una tarea problemática, requiriendo varias semanas de cultivo de células. Por lo tanto, se examinaron otras tres fuentes de APC: células B activadas por lipopolisacárido, células de bazo intactas y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no fraccionadas. Resulta interesante saber que cada una de estas poblaciones de células pulsadas con péptido de antígeno tumoral, generaron también CTL en 100% de los ratones, pero sólo si IL-12 fue provista también. El hecho de que las PBMC pulsadas más IL-12 fueron suficientes, simplifica en forma considerable el procedimiento que se requiere para preparar la vacuna a base de péptidos de antígeno tumoral. Se logró una inmunización exitosa con dos péptidos antigénicos, P198 y P1A. Para determinar si APC pulsadas con péptidos podrían inducir la generación de CTL específicos en el sistema humano, células B activadas o células dendríticas fueron aisladas de un individuo normal que expresa HLA-A2. Estas células fueron incubadas con un péptido derivado de MAGE-3 que se pronosticó se une a HLA-A2, y se usaron para estimular células T CD8+ del mismo individuo. Sólo si se incluyó IL-12 durante la estimulación inicial, hubieron CTL específicos inducidos después de la expansión, lo cual podría lisar a las células de melanoma que expresan MAGE-3 (Van der Bruggen eí al., 1994). A pesar de que HLA-A2 es el alelo HLA que se expresa con más frecuencia, y MAGE-3 es el gen MAGE que se expresa con más frecuencia entre las muestras de melanoma examinadas, esta combinación de péptido/HLA es sugerida para inmunizaciones en humanos. También se ha identificado un péptido derivado de otro antígeno tumoral, Melan A, que se une a HCA-A2, y puede ser reconocido por CTLs.

. Inmunización específica de antíqenos tumorales en un modelo en murinos Se entiende que el experto en la técnica reconocerá que el sistema descrito puede ser aplicable a cualquier número de cánceres. De esta manera, una lista ilustrativa de tumores, anticuerpos tumorales, etc., se B 10 provee en los cuadros 1 y 2 para los cuales se puede usar la invención • descrita. Sin embargo, para los propósitos de proveer un ejemplo de ilustración, se usará el antígeno tumoral P815.

• CUADRO 1 Antígenos marcadores de tumores sólidos y anticuerpos monoclonales correspondientes • • • . ^Éi ^g i^^í -r1 CUADRO 1 (continuación) • 15 20 CUADRO 1 (continuación) 15 • CUADRO 1 (continuación) • • • CUADRO 1 (continuación) • 15 20 CUADRO 1 (continuación) CUADRO 1 (continuación) • • • -Ai- CUADRO 1 (continuación) F.

• CUADRO 1 (continuación) • • 20 Abreviaturas: Abs, anticuerpos; Ags, antígenos; EGF, factor de crecimiento epidérmico; Gl, gastrointestinal; GICA, antígeno asociado a enfermedad gastrointestinal; GP glicoproteína; GY, ginecológico; HMFG, glóbulo de grasa de leche humana; Kd, kilodaltons; Mabs, anticuerpos 5 monoclonales; Mr, peso molecular; NS, no especificado; PLAP, fosfatasa alcalina placentaria; TAG, glucoproteína asociada a tumores; CEA, antígeno carcinoembrionario. Notas de pie: el Ag CA 19-9 (GICA) es sialosilfucosilactotetraosilceramida, denominado también ceramida pentaglucosílica sialilada de Lewis o lacto-N-fucopentaosa II sialilada; se • piensa que el Ags p97 es proteoglucano de sulfato de condroitina; se piensa que los antígenos reactivos con Mab 9-2-27 son glucoproteínas sialiladas asociadas con proteoglucano de sulfato de condroitina; a menos que se especifique, GY puede incluir cánceres del cérvix, endocérvix, endometrio, trompa de falopio, ovario, vagina o tumor Mullerian mixto; a menos que se especifique, Gl puede incluir cánceres del hígado, intestino delgado, bazo, páncreas, estómago y esófago. • CUADRO 2 Líneas y fuentes de células tumorales humanas • • • 20 CUADRO 2 (continuación) CUADRO 2 (continuación) Melanoma maligno, metástasis de tejido subcutáneo Melanoma maligno, metástasis de pulmón Melanoma maligno, metástasis de nodulo linfático Melanoma maligno, metástasis de sistema linfático Melanoma maligno, metástasis de la piel del muslo Melanoma maligno, metástasis de nodulo linfático • Melanoma maligno, metástasis de nudo axilar Melanoma maligno, metástasis de nudo Melanoma maligno Melanoma maligno Adenocarcinoma, ovario, consistente con primario Adenocarcinoma, ovario, metástasis de suberosa de trompa de falopio Adenocarcinoma, ovario, ascites malignos Adenocarcinoma, ovario Adenocarcinoma, páncreas, metástasis de hígado Adenocarcinoma, páncreas Carcinoma, próstata, metástasis de cerebro Rabdomiosarcoma 10 Sarcoma osteogénico, primario • Osteosarcinoma anaplástico contra sarcoma de Ewing, hueso Leiomiosarcoma primario de vulva. Fibrosarcoma Liposarcoma Sarcoma sinovial de axila Condrosarcoma húmero Sarcoma osteogénico primario de hueso Fibroblastos de piel Carcinoma gástrico Carcinoma embrionario, testículo, metástasis de nodulo linfático Carcinoma embrionario, malignidad consistente con metástasis de pulmón Carcinoma embrionario, malignidad consistente con metástasis de pulmón Carcinoma de tiroides CUADRO 2 (continuación) • • CUADRO 2 (continuación) • • Aunque P815 es un mastocitoma y no una línea de células de melanoma, es probable que los principios de inmunidad a antígenos tumorales 20 definidos con este sistema modelo, sean generalmente aplicables a otros tipos de tumores. Las ventajas del sistema son múltiples. Cinco antígenos tumorales expresados por P815 han sido identificados de acuerdo con su reconocimiento por clones de CTL (Brichard eí al., 1995), y el gen P1A que codifica para estos dos antígenos ha sido clonado y caracterizado (Van den Eynde eí al., 1991 ). La secuencia genómica de P1A en células tumorales P815 es idéntica a la encontrada en células normales de ratón, indicando que es un gen normal que es expresado anormalmente. Es expresado por varias líneas de células de mastocitoma, pero no en tejidos normales, excepto por el testículo y la placenta, y de esta forma simula la expresión de los genes de antígeno tumoral de humano de la familia MAGE (Van Pet eí al., 1995). Además, se han generado variantes tum" ¡nmunógenas mediante mutagénesis de P815 (Uyttenhove eí al., 1980). Estas variantes expresan por lo menos un neoantígeno como resultado de mutaciones de punto en genes normalmente expresados (Sibille eí al., 1990; Wolfel eí al., 1987; De Plaen eí al., 1988), dando como resultado su rechazo por la mayoría de los ratones singénicos. La descripción de una mutación de punto que genera un antígeno de melanoma humano (Coulie eí al., 1995), añade otro paralelo más entre el sistema de P815 y tumores humanos. Se ha generado también una variante altamente transfectable de P815, P1.HTR, que facilita la transfección mediante precipitación con fosfato de calcio (Van Peí eí al., 1995). Esta variante se ha usado para todos los estudios que requieren transfección. Se han definido péptidos codificados por varios de los antígenos tumorales únicos de las variantes tum", tales como el péptido P198 usado en uno de los ejemplos de la presente. El péptido P198 es más hidrofílico que el péptido P1A. Por lo tanto, se llevaron a cabo estudios iniciales de inmunización basada en péptidos usando el péptido P198 más soluble. La información obtenida se examinó también usando también el péptido P1A. Los estudios con P1A son importantes para medir la eficacia de la inmunización in vivo en términos de protección contra desafío a tumores vivos y regresión de tumores preestablecidos. Estos tipos de estudio no serán posibles con P198, • 5 debido a que este tumor es rechazado espontáneamente. Los estudios descritos en la presente proveen evidencia convincente de que B7 e IL-12 deben ser provistos durante la inmunización activa a antígenos tumorales. Aunque aparentemente B7 puede ser reclutado bajo algunas circunstancias a partir de células inmunes hospederas, aparentemente este no es el caso para IL-12. • Cohortes de 6 a 10 ratones DBA/2 hembras fueron tratadas para cada condición examinada. En los primeros estudios, ratones no afectados (que no presentan tumores), fueron inmunizados. Los estudios se llevaron a cabo pulsando diferentes APC con péptido P198 a 1 µ/ml. Estos procedimientos se llevaron a cabo después usando el péptido P1A en forma idéntica, en donde la actividad de CTL específica de péptidos de sangre periférica se midió como una lectura sustituta. La producción de citocina, • particularmente IFN-? y FNT-a, se evaluó en estudios paralelos después de la reestimulación de células T efectoras con APCs singénicas pulsadas con péptido o líneas de células tumorales que expresan antígeno. Se determinó la dosis óptima de péptido para inmunización. Esplenocitos singénicos intactos son pulsados con 10 o 1 µg/ml de péptido P1A, lavados, irradiados (2,000 rad) e inyectados en los ratones. Se evaluó el número óptimo de inyecciones. Una ventaja de usar sangre periférica como fuente de linfocitos T para realizar la prueba, es que no es necesario sacrificar a los ratones para medir la actividad de CTL. De esta manera, los niveles de actividad de CTL se examinaron a intervalos semanales antes de cada * inmunización. Este procedimiento es análogo al usado para estudios en pacientes. Un objetivo general del modelo preclínico fue construir un procedimiento específico que fuera transferido entonces para su uso en pacientes. Se desconoce aún la localización óptima de la inmunización. APC pulsadas fueron inyectadas subcutáneamente, iptradérmicamente, intravenosamente e intraperitonealmente, y se midió la actividad de CTL como • se describió anteriormente. Aunque las poblaciones de células linfoides no fraccionadas pueden funcionar para inmunización, no fue claro si las pocas DC presentes en la mezcla fueron realmente responsables de este efecto. Las células de bazo y PBMC contienen una población de precursores de DC. Sin embargo, los inventores razonaron que muchos tipos de células pueden funcionar como APC para inmunización, siempre que se administre también IL-12. La • hipótesis se puso a prueba rigurosamente comparando células B en reposo purificadas pulsadas, células B activadas, DC y fibroblastos. Si cada una de estas poblaciones de APC MHC+ clase I indujo CTL específicos cuando fueron pulsadas con péptido y coinyectadas con IL-12, entonces se podría hacer la conclusión de que la provisión de IL-12 hace que la naturaleza de la APC sea irrelevante. Por último, se aislaron PBMC de ratones y se usaron para inmunización en forma similar. El aislamiento de números suficientes de PBMC de ratón es difícil, pero el éxito usando esta población de células como fuente de APC se aproxima más estrechamente a la situación clínica, ya que PBMC constituye la población de APC más fácil de aislar de humanos. • 5 Se exploraron entonces condiciones que generaron resultados positivos usando inducción de CTL como lectura desafiando ratones inmunizados con P815 vivo o células P1.HTR para evaluar la protección ante tumores. Se usó también un tumor relacionado, L1210, que había sido transfectado con el gen de antígeno tumoral P1A. Una comparación de la capacidad para proteger contra L1210 contra L1210.P1A sirvió como medida %w del carácter específico del antígeno de la respuesta inmune. Las condiciones óptimas observadas en las pruebas de protección ante tumores fueron transferidas entonces a la inmunización de ratones que poseen tumores preestablecidos. Se establecieron tumores subcutáneamente o intrapeptonealmente. Comenzando 4, 7, 10 o 14 días después, se inició la inmunización con APC pulsadas con P1A más IL-12. Se determinó la velocidad de regresión de crecimiento del tumor. Los inventores dedujeron que los protocolos que son más eficaces para inducir el rechazo de tumores preestablecidos en el modelo en ratones, pueden ser más importantes para aplicarse a pacientes humanos, ya que estos individuos poseerán también tumores preestablecidos.

APC pulsadas con péptido en humanos Macrófagos de sangre periférica como fuente de APC han sido cultivados de la sangre de pacientes con melanoma, pulsados con un péptido derivado de MAGE-1 , e inyectados de vuelta en los pacientes subcutáneamente e intravenosamente (Mukherji eí al., 1995). No se observaron toxicidades importantes. La biopsia de los sitios de inmunización reveló la presencia de CTL específicos de MAGE-1 , sugiriendo que se inició una respuesta inmune específica. Con base en el éxito obtenido en el modelo en ratones usando PBMC no fraccionadas como fuente de APC, los inventores razonaron que pudo no ser necesario llevar a cabo un procedimiento para la expansión in vitro de macrófagos o DC para obtener una inmunización exitosa. El uso de PBMC no fraccionadas simplificaría considerablemente la preparación de la vacuna, y evitaría fuentes potenciales de toxicidad.

Experiencia de fase l/ll con IL-12 en humanos Se llevó a cabo un estudio clínico de fase I de IL-12 humana recombinante (rhlL-12) en pacientes con varias malignidades. Se administró una dosis de prueba individual de rhlL-12 intravenosamente, seguido en 2 semanas por una dosis diaria durante 5 días, cada 3 días. Las cohortes de por lo menos 4 pacientes recibieron rhlL-12 a niveles de dosis de 3, 10, 30, 100, 250, 500 o 1000 ng/kg/día. Las toxicidades incluyeron citopenias transitorias (los puntos más bajos ocurriendo 2 a 5 días después del tratamiento), incrementos reversibles de transaminasas y bilirrubina, híperglucemia transitoria, estomatitis y síndrome de derrame capilar. La dosis máxima tolerada en este programa fue de 500 ng/kg/día, y se observaron varias respuestas al tumor. 5 Se llevó a cabo un segundo estudio clínico de fase I de rhlL-12, utilizando administración subcutánea 3 veces a la semana durante 2 semanas, seguido de una semana. Los pacientes fueron tratados a niveles de dosis de 3, 10, 30, 100 y 300 ng/kg/día. No se logró la dosis máxima tolerada, ya que la prueba fue suspendida después de que se aplicó una retención clínica en los estudios de carcinoma de células renales de fase II descritos • más adelante. Se iniciaron 2 estudios de fase II de rhlL-12 administrada intravenosamente a pacientes con carcinoma avanzado de células renales. Se administró intravenosamente la dosis de 500 ng/kg/día 5 veces por semana, seguido de un período de descanso de 16 días. Inesperadamente, 12 de los 17 pacientes enrolados requirieron hospitalización por eventos adversos, y hubo 4 muertes de pacientes. Dos de ellas fueron atribuidas a rhlL-12, y dos • fueron relacionadas a enfermedad progresiva. Por lo tanto, se suspendió la prueba. Después de una investigación prolongada en las diferencias potenciales entre las pruebas de fase I y fase II, pareció que el perfil de toxicidad fue altamente dependiente del programa de administración de rhlL- 12. Aparentemente, la toxicidad en el estudio de fase I fue atenuada por la dosis de prueba individual administrada antes de la dosificación diaria.

Con base en estas observaciones, se concluyó un tercer estudio de fase I de rhlL-12. Las cohortes de 6 pacientes fueron tratadas mediante , inyección subcutánea 3 veces por semana durante 2 semanas, seguido de un A período de descanso de 9 días, a dosis de 30, 100 y 300 ng/kg/día. No hubo toxicidades importantes, y 3 pacientes fueron tratados entonces a una dosis de 500 ng/kg/día. Dos pacientes con carcinoma de células renales parecieron i mostrar una respuesta menor. Esta escala de dosificación y el programa de rhlL-12 parecieron ser bien tolerados en pacientes con malignidades avanzadas. • 1 0 Repaso del procedimiento de inmunización específica a ' antíqenos tumorales t Con base en los resultados de fase I y preclínicos anteriores, los inventores concibieron una estrategia para la inmunización específica a antígenos tumorales en pacientes con melanoma. Se llevó a cabo un estudio de fase l/ll en pacientes con melanoma metastásico. Los pacientes fueron -^ tipificados primero para HLA. Los pacientes HLA-A2-positivos sufrieron una biopsia del tumor para seleccionar la expresión de MAGE-3 y Melan-A usando RT-PCR™. Pacientes con tumores MAGE-3+ fueron elegibles para vacunación con péptido MAGE-3. Los pacientes con tumores que fueron MAGE-3- negativos pero Melan-A-positivos, fueron elegibles para inmunización con péptido Melan-A.

Se obtuvo sangre periférica y se fraccionó mediante centrifugación de densidad para aislar PBMC como fuente de APC. Las células fueron incubadas con el péptido MAGE-3 o Melan-A apropiado, ^^ lavadas, resuspendidas en PBS, e irradiadas letalmente. Las células pulsadas 5 (50-100x106) fueron inyectadas subcutáneamente en 2 sitios, cerca del nodulo linfático, pero no adyacentes a una masa tumoral. Se prefirió la vía subcutánea por razones de seguridad, eficacia en el modelo preclínico, y el objetivo de dirigir la vacuna a un nodulo linfático drenante. Pacientes elegibles fueron asignados a las cohortes respectivas, siendo inmunizados con péptido MAGE-3 o Melan-A. Tres a seis pacientes • fueron tratados con PBMC sola pulsada con péptido, usando péptido MAGE-3 o Melan-A, según se indicara. Para las cohortes restantes, se administró subcutáneamente rhlL-12 cerca de uno de los sitios de inmunización en los días 1 , 3 y 5. La dosis de rhlL-12 fue intensificada en cohortes de 3 a 6 pacientes cada uno, para determinar una dosis óptima con respecto a seguridad e inmunización exitosa. El programa de dosificación se basó en los datos de fase I más recientes. La reinmunización se llevó a cabo a intervalos • de 3 semanas, con la administración de rhlL-12 en los días 1 , 3 y 5 de cada ciclo. Antes de cada inmunización, se obtuvo sangre periférica para poner a prueba la actividad de CTL específica de péptidos y la producción de IFN-? y FNT-a. Los sitios de inyección fueron examinados también para inflamación local indicativa de una reacción de hipersensibilidad de tipo retrasada. La respuesta clínica se evaluó como un resultado secundario.

Una ventaja importante del procedimiento de inmunización específico de antígeno tumoral, es la capacidad para medir una respuesta inmune específica independientemente de un efecto sobre la regresión del - *. tumor, lo cual no ha sido posible con inmunoterapias más genéricas, tales como inyección de IL-12 recombinante, debido a que los antígenos expresados por el tumor del paciente no son analizados normalmente. Además, cualquier respuesta exitosamente generada podría ser dirigida contra antígenos que aún no han sido caracterizados y, por lo tanto, no sería detectada. Un primer paso para mejorar la inmunoterapia del cáncer, es 10 determinar si ha ocurrido o no una inmunización exitosa; sólo entonces, se • puede mejorar la vacunación para determinar su potencial real en la terapia del cáncer. La lectura sustituía apropiada de la inmunización aún es desconocida. Se pensó generalmente que la inducción de la actividad citolítica 15 específica de antígeno es el punto final deseado. Sin embargo, otras propiedades de las células efectoras inducidas podrían ser críticas. Un candidato probable es la capacidad del CTL activado para producir las • citocinas IFN-? y FNT-a, una característica de un fenotipo Th1/Tc1. Los estudios en el modelo en murinos han sugerido que un fenotipo Th1/Tc1 20 podría ser óptimo para mediar el rechazo de tumores preestablecidos. Se examinaron 3 medidas de inmunización exitosa de pacientes. En primer término, las muestras de suero obtenidas de cada paciente después de cada inmunización se ponen a prueba para contenido de IFN-? y FNT-a.

Los inventores razonaron que los pacientes efectivamente inmunizados muestran un ¡ncremento en estas citocinas después de cada inoculación, y que la magnitud del incremento es mayor con cada vacunación subsecuente. Estas citocinas se miden mediante técnicas ELISA estándar bien conocidas • 5 por los expertos en la técnica. Se comparan diluciones en serie de la muestra de suero con diluciones en serie de un estándar. Se comparan las diluciones que dan la absorción media máxima, y la concentración se determina con base en la concentración conocida del estándar. Esta lectura sustituta se puede llevar a cabo habitualmente, pero la sensibilidad de la prueba podría no ser suficiente para detectar los incrementos esperados. La segunda prueba mide la actividad citolítica específica de MAGE-3 o MelanA a partir de las PBMC criopreservadas, la cual se evalúa reestimulando a los linfocitos T con APC pulsadas con péplido, expandiendo las células que exhiben respuesta con IL-2, y midiendo la lisis de células objetivo marcadas con cromo que expresan las moléculas MHC correctas y pulsadas con péptido MAGE-3 o MelanA. Los controles incluyen objetivos no pulsados y el objetivo K562 sensible a NK. La competencia en frío se lleva a cabo con células K562 no marcadas radiactivamente para eliminar la actividad de NK no específica. 20 La tercera lectura es una combinación del primer y segundo procedimientos. Debido a que un fenotipo Th1/Tc2 podría pronosticar eficacia antitumoral, las células efectoras generadas después de la expansión de células T específicas en el segundo método, son estimuladas durante 24 horas con APC pulsadas con péptido, y los sobrenadantes son puestos a prueba para la presencia de IFN-? y FNT-a. Incluso si los niveles en suero son indetectables, la producción de citocina por las células T específicas de antígeno debe ser fácilmente medible. • 5 Esbozo de un estudio de vacunación específico en humanos Se llevó a cabo un estudio de vacunación de pacientes con enfermedad metastásica refractaria usando PBMC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral y sin rhlL-12. En particular, usando Mage3 y 10 MelanA, se detectó la generación de células T CD8+ que producen IFN-? • específicas de péptido después de 1 a 3 inmunizaciones, como se muestra en las figuras 10, 11 y 12.

Equivalentes biológicos funcionales 15 Se entiende que el régimen terapéutico descrito en la presente se puede utilizar con cualquier péptido antigénico que se une a moléculas MHC clase I. Para los péptidos MAGE-3 y Melan A descritos, se describen • equivalentes biológicos funcionales. Como será entendido por los expertos en la técnica, se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura del péptido recombinante, y obtener aún una molécula que tenga características similares o de otra manera deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en la estructura de una proteína sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de receptores de antígeno de células T o sitios de unión en moléculas HLA de células de melanoma. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza una proteína lo que define la actividad biológica funcional de esa proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia de proteína (o, de hecho, su secuencia de codificación de ADN subyacente), y obtener no obstante una proteína con propiedades similares (agonísticas). Es así contemplado por el inventor que se pueden hacer varios cambios en la secuencia de proteínas o péptidos recombinantes (o ADN subyacente) sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. En términos de equivalentes funcionales, es también bien entendido por los expertos en la técnica que, inherente en la definición de una proteína o péptido equivalente biológicamente funcional, es el concepto que existe un límite en el número de cambios que se pueden hacer dentro de una porción definida de la molécula, y dar como resultado aún una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalenle. Los péptidos equivalentes biológicamente funcionales se definen de esta manera como aquellos péptidos en los cuales algunos aminoácidos (no la mayoría o todos) pueden ser sustituidos. En particular, en donde están involucrados péptidos pequeños, se pueden cambiar menos aminoácidos. En efecto, se puede obtener y usar fácilmente una pluralidad de diferentes proteínas/péptidos con diferentes sustituciones de conformidad con la invención.

También es bien entendido que donde se muestra que ciertos residuos son particularmente importantes para las propiedades biológicas o estructurales de una proteína o péptido, por ejemplo, residuos en la región de reconocimiento antigénico, dichos residuos pueden no ser generalmente F 5 intercambiados. Las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrofóbico o hidrofílico, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, revela que la arginina, lisina e histidina son residuos con carga • positiva; que la alanina, glicina y serina son de un tamaño similar; y que la fenilalanina, triptófano y tirosina tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, con base en estas consideraciones, la arginina, lisina e histidina; la alanina, glicina y serina; y la fenilalanina, triptófano y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales. Se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos para llevar a cabo cambios más cuantitativos. A cada aminoácido se le ha • asignado un índice hidropático con base en sus' características de hidrofobicidad y carga, éstos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (- 1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (-4.5).

La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado en la presente a manera de referencia). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar, y conservar aún una actividad biológica similar. Para hacer cambios con base en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, se prefieren particularmente aquéllos que están dentro de ±1 y se prefieren todavía más particularmente aquéllos dentro de ±0.5. Se entiende también en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse en forma efectiva con base en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido equivalente funcional biológico creado de esta manera esté diseñado para usarse en modalidades inmunológicas, como en el presente caso. La patente de E.U.A. No. 4,554,101 , incorporada en la presente a manera de referencia, indica que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de E.U.A. No. 4,554,101 , se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1 ); glutamato (+3.0 ± 1 ); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1 ); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). • 5 Para hacer cambios con base en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, se prefieren particularmente aquéllos que están dentro de ±1 y se prefieren todavía más particularmente aquéllos dentro de ±0.5. 10 Aunque la descripción se ha enfocado en polipéptidos funcionalmente equivalentes que se originan a partir de cambios de aminoácidos, se apreciará que estos cambios pueden llevarse a cabo mediante la alteración del ADN de codificación; teniendo en consideración también que el código genético es degenerado y que dos o más codones pueden codificar para el mismo aminoácido. A continuación se presenta un cuadro de aminoácidos y sus codones para usarse en dichas modalidades, así como para otros usos, tales como en el diseño de sondas y cebadores y similares.

CUADRO DE CODONES Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU • Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU 10 Isoleucina He I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAÁ CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en la presente para referirse a codones que codifican para el mismo aminoácido, tales como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a ^* codones que codifican para aminoácidos biológicamente equivalentes (véase Cuadro de Codones arriba). También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales o secuencias 5' o 3', y aún ser esencialmente como las descritas en una de las secuencias descritas en la presente, siempre 10 y cuando la secuencia satisfaga los criterios descritos arriba, incluyendo el • mantenimiento de la actividad de proteínas biológicas cuando esté implicada la expresión de proteínas. La adición de secuencias terminales aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificadoras flanqueando cualquiera de las 15 porciones 5' o 3' de la región de codificación o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, los cuales se sabe que ocurren dentro de genes.

Regímenes terapéuticos v dosificación 20 En a presente se describe un régimen terapéulico; sin embargo, el tratamiento con IL-12 puede anteceder o seguir la administración de APC pulsadas con péptidos en intervalos que varíen de segundos a horas a días hasta incluso semanas. En modalidades en las que se administran APC pulsadas con péptidos e IL-12 por separado al paciente, se aseguraría generalmente que un periodo de tiempo significativo no expirara entre el tiempo de cada suministro, para que la combinación de los dos aún fuera capaz de ejercer un efecto óptimamente combinado en el receptor. En tales • casos, se contempla que podría ponerse en contacto a los pacientes con ambos agentes dentro de aproximadamente 0.1 a 24 horas unos de otros e, incluso, dentro de aproximadamente 1 a 4 horas unos de otros, prefiriéndose con un tiempo de retraso de sólo aproximadamente 1 horas a aproximadamente 2 horas. En algunas situaciones, es deseable extender el periodo de tiempo de tratamiento en forma significativa; en donde pasen • varios días (1 , 2, 3 4, 5, 6 ó 7) a varias semanas (1 , 2, 3 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas. También es concebible que se desee más de una administración de APC pulsadas con péptidos en ciertas circunstancias en combinación con IL-12. Pueden emplearse varias combinaciones, en donde APC pulsadas con péptido sea "A" e IL-12 sea "B". A B/B B/A/A A/A/B • A/B/A B/A B B/B/A B/B/B/A B/B/A/B B/A/B/A B/A/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A A/A/A/B B/AA/A A/B/A/A B/A/B/B A/A/B/A A/B/B/B Para lograr la eliminación de células tumorales, se suministran ambos agentes a un paciente en una cantidad combinada efectiva para eliminar las células tumorales. Estos ciclos de tratamiento pueden repetirse ^^ varias veces, o suministrarse sólo una vez. 5 El experto en la técnica reconocerá que los factores que se sabe bien que influencian la respuesta del paciente a terapia con fármacos incluyen, pero no están limitados a, especie, edad, peso, género, salud, embarazo, adicciones, alergias, origen étnico, condiciones médicas anteriores, condición médica actual y longitud del tratamiento. De esta manera, el experto 10 en la técnica estará bien familiarizado con la necesidad de individualizar las dosis a cada paciente. El experto en la técnica también considerará la condición que será tratada antes de seleccionar la dosis adecuada. Por ejemplo, una dosis que sea adecuada para el tratamiento de un cáncer podría no ser la dosis deseada para terapia de vigilancia subsecuente diseñada para prevenir la recurrencia del cáncer. De esta manera, se reconoce que en la práctica de la invención puede ser útil una amplia variedad de dosis, y que la dosis deseada es individualizada al paciente. En un caso ilustrativo, se carga péptido de 10-50 µM sobre APCs, se administran 10x108 APCs por inyección y se administran -50 ng/kg de IL-12 por inyección. No obstante, la cantidad de péptido cargada sobre APCs puede ser tan pequeña como de aproximadamente 0.1 µm a tanto como 1 mM. Se entiende que esta escala incluye 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, etc.; 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, etc.; 20, 21 , 22, 23, etc.; 25, 26, 27, 28, etc.; 30, 31 , 32, 33, etc.; 35, 36, 37, etc.; 40, 41 , 42, etc.; 45, 46, 47, etc.; 50, 51 , 52, 53, etc.; 60, 61 , 62, etc.; 70, 71 , 72, etc.; 80, 81 , 82, etc.; 90, 91 , 92, • 5 etc.; 100, 110, 120, etc.; 150, 160, 170, etc.; 200, 210, 220, etc.; 250, 260, 270, etc.; 300, 310, 320, 330, etc.; 350, 360, 370, etc.; 400, 410, 420, etc.; 450, 460, 470, etc.; 500, 525, 550, 575, etc.; 600, 625, 650, etc.; 700, 725, 750, etc.; 800, 825, 850, etc.; 900, 925, 950, etc.; 1000 µm. El número de APCs por inyección también puede variar de 1x106-1x109. Se entiende que esta escala es inclusiva de todas las dosis entre • aproximadamente 1x106 y 1x109. Así, esta escala incluye 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108 y 9x108 APCs por inyección. 15 La cantidad de IL-12 que puede administrarse de 1 ng/kg - 1000 ng/kg por inyección. Se entiende que esta escala incluye todas las dosis entre aproximadamente 1 ng/kg y aproximadamente 1000 ng/kg. Así, esta • escala incluye 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, etc.; 20, 21 , 22, 23, etc.; 25, 26, 27, 28, etc.; 30, 31 , 32, 33, etc.; 35, 36, 37, etc.; 40, 41 , 42, etc.; 45, 46, 47, etc.; 50, 51 , 52, 53, etc.; 60, 61 , 62, etc.; 70, 71 , 72, etc.; 80, 81 , 82, etc.; 90, 91 , 92, etc.; 100, 110, 120, etc.; 150, 160, 170, etc.; 200, 210, 220, etc.; 250, 260, 270, etc.; 300, 310, 320, 330, etc.; 350, 360, 370, etc.; 400, 410, 420, etc.; 450, 460, 470, etc.; 500, 525, 550, 575, etc.; 600, 625, 650, etc.; 700, 725, 750, etc.; 800, 825, 850, etc.; 900, 925, 950, etc.; 1000 ng/kg.

Rutas de tratamiento • 5 APC pulsadas con péptidos e IL-12 pueden administrarse intravenosamente, ¡ntraarterialmente, intratumoralmente, parenteralmente o intraperitonealmente. En la invención, las rutas de administración que se prefieren son subcutánea (SC); sin embargo, pueden usarse intravenosa (IV), ¡ntraarterial e intraperitoneal (IP). Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse • en agua mezcladas adecuadamente con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones de almacenamiento y uso ordinarias, estas preparaciones pueden contener un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la • preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista un fácil manejo en jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede ofrecerse por medio de varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ofrecerse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los demás ingredientes numerados arriba, según se requiera, seguida por la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de aquellos numerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación que se prefieren son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente filtrada y esterilizada. Según se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, 5 recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, isotónicos y agentes de retraso de absorción y similares. Se conoce bien en la técnica el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas. Excepto por el caso en el que algún medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas.

También pueden incorporarse en las composiciones ingredientes activos • complementarios. Aunque no se contempla como una ruta preferida, cada uno o ambos de las APCs pulsadas con péptidos e IL-12 también pueden administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o encerrarse en cápsulas de gelatina de coraza suave o dura, o comprimirse en tabletas, o incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para administración terapéutica oral, el compuesto • activo puede ser incorporado con excipientes y usarse en forma de tabletas ingeribles, pastillas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 0.1 % del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede ser convenientemente de entre alrededor de 2 a aproximadamente 60% del peso de la unidad. La cantidad de compuestos activos en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, tal como goma tragacanto, 5 acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina puede añadirse, o un agente saborizante, tal como canela, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosis unitaria sea una cápsula, puede contener, • además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes varios otros materiales tales como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la dosis unitaria. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas pueden ser recubiertas con goma laca, azúcar o ambas.

Un jarabe o elixir puede contener los compuestos activos sacarosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservadores, un colorante y saborizante, tal como saborizante de cereza y naranja. Por • supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosis unitaria debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación prolongada.

Análisis v monitoreo de la efectividad de la terapia Se contempla que en el contexto de la presente invención se pueden remover de un individuo células, ya sea tumorales, normales o células ^^ tanto tumorales como normales, para monitorear el progreso del tratamiento o como parte del tratamiento. Se espera que podría monitorearse la efectividad del tratamiento removiendo tales células y tratando dichas células con tinción DAPI para determinar el nivel de condensación de cromatina, medir el nivel de apoptosis, medir el nivel de producción de esfingomielinasa neutra u otros métodos tales como los siguientes. 10 Un método particular para determinar la inducción de apoptosis son pruebas de marcado de extremo mellado con dUTP-biotina mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TÚNEL), las cuales miden la integridad del ADN (Gorczyca, 1993). Esta prueba mide la fragmentación del ADN monitoreando la incorporación de UTP marcada en cadenas de ADN quebradas por la enzima transferasa terminal. La incorporación puede monitorearse mediante electroscopia o mediante metodologías de selección de células (por ejemplo, FACS). Otro método con el cual se espera poder monitorear la efectividad del tratamiento es el uso de pruebas inmunoabsorbentes 20 enlazadas por enzima (ELISAs).

ELISAS Ciertos inmunoensayos que se prefieren son los diferentes tipos de ELISAs y radioinmunoensayos (RÍA) conocidos en la técnica. La detección • inmunohistoquímica usando cortes de tejido también es particularmente útil.

Sin embargo, se apreciará fácilmente que la detección no está limitada a dichas técnicas, y que también pueden usarse análisis de bandas de proteínas, ELISPOT, FACS y similares. En un ELISA ejemplar, un anticuerpo contra una citocina, tal como IFG?, es inmobilizado sobre una superficie seleccionada que exhiba A 10 afinidad a proteína, tal como una cavidad en una placa de microtitulación de poliestireno. Después, se añade a las cavidades una composición que contenga la contraparte de citocina. Después de unir y lavar para remover complejos unidos no específicamente, el complejo de proteína de citocina unido puede ser detectado. La detección se logra generalmente mediante la 15 adición de un anticuerpo de proteína anti-citocina o anti-tumoral que sea enlazado a un marcador detectable. La detección también puede lograrse mediante la adición de un primer anticuerpo de proteína anti-citocina o anti¬ • tumoral, seguido por un segundo anticuerpo que tenga afinidad de unión para el primer anticuerpo, con el segundo anticuerpo siendo enlazado a un 20 marcador detectable. Sin importar el formato empleado, los ELISAs tienen ciertas características en común, tales como recubrimiento, incubación o unión, lavando para remover especies unidas no específicamente, y detectando los complejos inmunes unidos. Estos se describen como sigue. Para recubrir una placa con el anticuerpo primario, generalmente ^ se incuban las cavidades de la placa con una solución del agente, ya sea 5 durante la noche o durante un periodo de horas especificado. Las cavidades de la placa serán lavadas después para remover material incompletamente adsorbido. Cualquier superficie disponible restante de las cavidades se "recubre" después con una proteína no específica que sea neutra con respecto a la unión a los componentes biológicos. Estas incluyen albúmina de 10 suero de bovino (BSA), caseína y soluciones de leche en polvo. El • recubrimiento permite bloquear sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización y de esta manera reduce el fondo causado por la unión no específica de proteínas sobre la superficie. En los ELISAs de la presente invención, probablemente será 15 más usual el uso de un medio de detección secundario o terciario. Así, después de la unión de la primera proteína a la cavidad, del recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo y del lavado para remover • material no unido, la superficie de inmovilización es puesta en contacto con la segunda proteína biológica bajo condiciones efectivas para permitir la 20 formación del complejo de proteínas. La detección del complejo requiere después un ligando o anticuerpo de unión marcado. "Bajo condiciones efectivas para permitir la formación del complejo de proteínas" significa que las condiciones incluyen preferiblemente diluir el antígeno tumoral y proteínas de citocina, con soluciones tales como BSA, gamaglobulina de bovino (BGG) y solución salina de pH regulado con fosfato (PBS)/Tween. Estos agentes añadidos también tienden a asistir en la reducción del fondo no específico. Las condiciones "adecuadas" también • 5 significan que la incubación es a una temperatura y durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir la unión efectiva. Los pasos de incubación son típicamente de alrededor de 1 a 2 a 4 horas, a temperaturas preferiblemente en el orden de 25° a 27°C, o pueden ser durante la noche a aproximadamente 4°C o más. 10 Después de todos los pasos de incubación en un ELISA, la • superficie puesta en contacto es lavada para remover de esta manera material no complejado. Un procedimiento de lavado que se prefiere incluye lavar con una solución tal como PBS/Tween, o regulador de pH de borato. Después de la formación de complejos específicos entre la muestra de prueba y el material unido originalmente, y el lavado subsecuente, puede determinarse la ocurrencia cantidades todavía más pequeñas de complejos unidos. Para proveer la detección, se proveerá preferiblemente un primer • o segundo anticuerpo que tenga un marcador asociado para permitir la detección. De preferencia, el marcador será una enzima que genere desarrollo de color después de la incubación con un substrato cromogénico adecuado. De esta manera, por ejemplo, sería deseable poner en contacto e incubar los complejos unidos con un anticuerpo conjugado a ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o hidrógeno peroxidasa durante un periodo de tiempo y bajo condiciones que favorezcan el desarrollo de formación de inmunocomplejos (por ejemplo, incubación durante dos horas a temperatura ambiente en una solución que contenga PBS tal como PBS-Tween). ^^ Después de la incubación con el anticuerpo marcado, y después 9 5 del lavado para remover material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo, mediante incubación con un substrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil- benzotiazolino-6-sulfónico) [ABTS] y H202, en el caso de peroxidasa como el marcador de enzima. La cuantificación se logra después midiendo el grado de 10 generación de color, por ejemplo, usando un espectrofotómetro de espectros • visibles.

Suministro ex vivo En la presente invención, se contempla que puede usarse el suministro sistémico tanto de APCs pulsadas con péptido como de IL-12. Se contempla además que en la práctica de esta invención podría desearse alterar la PBMC mediante manipulación ex Vo. La terapia génica ex vivo se • refiere al aislamiento de células a partir de un animal o paciente, el suministro de un ácido nucleico en las células in vitro y después el regreso de las células modificadas a un animal o individuo. Esto puede implicar la remoción quirúrgica de tejido/órganos de un animal o paciente o el cultivo primario de células y tejidos.

Las APCs pueden prepararse a partir de PBMC aisladas mediante centrifugación de densidad de sangre entera. Células mononucleares humanas (MNC), preparadas de médula ósea también pueden • usarse como APCs. La médula ósea puede obtenerse de las tibias, fémures, espina, costillas, caderas, esternón, así como del húmero, radio, ulna, tibia y fíbula. Además, estas células también pueden obtenerse de sangre de cordón, sangre periférica o sangre periférica mobilizada con citocina. Otras fuentes de células madre hematopoyéticas humanas incluyen saco de yema embriónica, fetal y de bazo de adulto, y sangre. La capa de médula es centrifugada sobre un gradiente de densidad para producir una pella de glóbulos rojos en el fondo • del tubo, una capa de medio transparente, una capa interfacial que contenga la MNC y una capa de medio de plasma encima. La capa interfacial puede ser removida después usando, por ejemplo, succión. La centrifugación de esta capa a 1000 g produce finalmente una pella de MNC. Esta pella puede resuspenderse después en un regulador de pH adecuado para la selección de células mediante FACS. La MNC aislada puede ser cultivada in vitro para expandir las células inmunológicamente activas. Las células terapéuticamente • activas y expandidas se cargan después con péptido y se proveen al paciente para obtener un efecto terapéutico. 20 Las APCs también pueden ser células dendríticas, generadas de médula ósea o sangre periférica. Los fibroblastos pueden servir como APCs, y después pueden cultivarse a partir de tejidos tales como la piel.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Debe apreciarse por lo expertos en la técnica que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse como que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y obtener todavía un resultado igual o similar sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. 10 • EJEMPLO 1 La inmunización exitosa con PBMC pulsadas con pépticlos más rmlL-12 obvia la necesidad de usar células dendríticas Materiales y métodos Ratones Ratones DBA/2 se criaron y alojaron en una instalación libre de • patógenos. Se usaron ratones hembra de 8-10 semanas de edad para los estudios. 20 Líneas de células y transfectores Células de mastocitoma P815 se cultivaron en DMEM complementado con 10% de FCS y se incubaron a 37°C en una atmósfera de 8% de C02. Se usaron varios clones de P815 en este estudio: P1.HTR, una variante altamente transfectable de P815; P1 , un clon tumorigénico de P815; P198, un clon tum" de P815; P511 , una variante resistente a azaguanina de P815 y P1204, una variante P815AB-negativa que porta una deleción del gen P1A (Uyttenhove eí al., 1983). Se obtuvieron células P815.B7-1 y P198.B7-1 mediante electroporación respectivamente de células P1 y P198 con el ADNc de B7-1 clonado mediante PCR™ en plásmido pcDSRa y con el plásmido pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA) que confiere resistencia a neomicina. L1210 es una línea de células de leucemia derivada de un ratón DBA/2, la cual se cultivó bajo las mismas condiciones que las células P815. Los transfectores L1210 que expresan el antígeno P815AB (L1210.P1A) fueron generados mediante co-electroporación del cósmido C1A.3.1 (Gajewski eí al., 1995) con el plásmido pSVtkneob que confiere resistencia a neomicina. Las células L1210.P1A.B71 se obtuvieron mediante transfección de células L1210.P1A con el ADNc B7-1 de murino clonado en el plásmido pEFBOS (Gajewski eí al., 1995) (que contiene un gen de resistencia a puromicína) mediante electroporación, y la selección con puromicina y clonación por dilución limitativa. Todos los transfectores se mantuvieron en fármaco de selección por lo menos cada segundo pasaje; para inyecciones in vivo las células se cultivaron siempre en ausencia del fármaco de selección.

Clones CTL CTL P1 :5, un clon específico para el antígeno P815A, y el clon CTL P198.3 específico para P198, fueron cultivados en cultivos de 1 ml que • contenían 5x106 células de bazo DBA 2 irradiadas y 105 células P1 irradiadas (10,000 rad) (para el clon P1 :5) o células P198 (para el clon P198.3) como estimuladores. Además, los cultivos contenían 50% de sobrenadante de cultivo de linfocitos mixtos secundario (MLC) como una fuente de citocinas.

Péptidos tumorales 10 Los péptidos fueron sintetizados y purificados mediante CLAR de • fase inversa y se caracterizaron mediante análisis con aminoácidos usando técnicas estándares. Las secuencias con código de una letra de los péptidos usadas son como sigue: P198 H-2Kd-restringido, KYQAVTTTL (SEQ ID NO:1 ) y P815AB H-2Ld-restringido, LPYLGWLVF (SEQ ID NO:2). 15 rmlL-12 Como la fuente de rmlL-12, se llevaron a cabo estudios iniciales ^ usando una proteína de fusión a IL-12 marcada con hexahistidina expresada en y purificada a partir de células de mamífero transfectadas, como se describe (Fallarino eí al., 1996). Todos los estudios principales se repitieron usando rmlL-12 altamente purificada.

Purificación y preparación de células que presentan antíqenos Esplenocitos obtenidos de ratones DBA/2 hembra no afectados se usaron como una fuente para preparar las siguientes células que presentan antígenos (APCs): Células dendríticas (DC) Se lavaron los esplenocitos dos veces en medio que contenía 0.5% de suero de ratón normal (NMS) y se dejaron adherir durante dos horas a 37°C (Steinman eí al., 1979). Las placas se lavaron tres veces con el mismo medio y se incubaron durante la noche a 37°C. Después de esta segunda incubación, las células no adherentes se agruparon como DC y el análisis FACS mostró entre 70% y 90% de DC determinado mediante tinción con mAb N418.

Esplenocitos no fraccionados Grupos de esplenocitos DBA/2 se lavaron dos veces en medio que contenía 0.5% de NMS y después se contaron e incubaron con el péptido tumoral específico y se usaron en estudios in vivo o in vitro.

Blastos LPS En este caso se cultivaron suspensiones de células de bazo (10 x 106/ml) durante 48 horas a 37°C en cajas de cultivo de tejido de 10 cm2 en medio que contenía 0.5% de NMS en presencia de LPS (25 µg/ml). Las células vivas se cosecharon después y se lavaron tres veces para remover el exceso de LPS. Los análisis FACS con un anti-B220 mAb y anti-lgM mostraron que aproximadamente 80% de las células eran células B activadas.

Células B en descanso Los esplenocitos se lavaron dos veces en medio que contenía 0.5% de NMS y se dejaron adherir durante dos horas a 37°C; las células no adherentes se removieron y se lavaron dos veces e incubaron durante 30 minutos a 4°C con mAb de anti-Thy-1 y anti-MAC-1 (M170). Después de lavar, las células unidas a anticuerpo se usaron mediante tratamiento con complemento de conejo a 37°C durante 30 minutos. Las células se lavaron de nuevo y las células restantes se recuperaron después de la sedimentación sobre Ficoll-Hypaque. Más de 98% de las células recuperadas eran células B con base en el análisis FACS con anticuerpos anti-B220 y anti-IgM.

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) Aproximadamente 1 ml de sangre se obtuvo retroorbitalmente de varios ratones DBA/2, se usaron glóbulos rojos con regulador de pH de lisis ACK y la fracción de células mononucleares se recuperó después de la purificación con gradiente Ficoll.

Análisis FACS 1 x 106 células en 100 µl de regulador de pH de FACS (PBS que contenía 3% de FCS y 0.02% de azida de sodio) fueron teñidas en placas de • microtitulación con fondo en V con mAbs conjugado a FITC específico para 5 MHC clase I (30-5-7S), l-Ad (MKD6), B7-1 (16-10A1 ), B7-2 (GL1 ), CD11c (N418) o B220 (RA3-6B2) a 4°C durante 30 minutos. Las células se lavaron después con regulador de pH de FACS y se analizaron en un citómetro de flujo en recipiente FACS (Becton Dickinson, San José, CA). Se recogieron 10,000 células para cada muestra y los datos se analizaron usando software 10 Lysis II. • Pulsación in vitro con péptido e inmunización con APC pulsada con péptido tumoral Todas las pulsaciones con péptidos se hicieron en ausencia de 15 FCS u otras proteínas, en DPBS solamente. Las APCs se lavaron dos veces en DPBS (GIBCO) y se resuspendieron en PBS a 5-10 x 106 células/ml en tubos de polipropileno de 50 ml (Falcon). Las células fueron incubadas con el péptido P198 o P1A (1 µM o 10 µM) en un volumen total de 5-10 ml a 37°C con agitación ocasional durante 1-2 horas. Las células se lavaron después, se 20 irradiaron (2000 rad) y se resuspendieron para que el número de células pulsadas indicadas para cada estudio pudiera ser provisto en 100 µl de DPBS. Los ratones DBA/2 fueron inmunizados semanalmente con el número de células indicado (o DPBS solo) en 100 ml en ambas plantas de las patas - ' -- — •" - traseras. En algunos estudios, las mismas células fueron co-administradas con rmlL-12 (10 ng en 50 µl por planta de la pata) seguidas por inyecciones adicionales de rmlL-12 en cada planta de la pata los días 1 y 2.

Cultivo mixto de linfocitos-tumor (MLTC) Se llevaron a cabo MLTCs usando células de bazo o PBMC como una fuente de linfocitos de respuesta. Células de bazo (5x106) fueron estimuladas con 2 x 105 células P198 o L1210.P1A irradiadas (10,000 rad), o las mismas células transfectadas con B7-1. Las células fueron incubadas a 2 ml por cavidad en placas de 24 cavidades, y la actividad de CTL se midió 6-7 # días después. La estimulación de linfocitos de sangre periférica se llevó a cabo mezclando 3 x 105 de PBMC purificado con Ficoll con 105 de células estimuladoras irradiadas (10,000 rad) y 2 x 106 de células de bazo singeneicas normales irradiadas (2000 rad), 1 ml por cavidad de placas de 24 cavidades. Se determinó la actividad de CTL después de 6-7 días.

Prueba de liberación de cromo • Células efectoras fueron diluidas por duplicado en placas de microtitulación con fondo en V y se mezclaron con 2000 células blanco 20 marcadas con 51Cr a un volumen final de 200 µl de medio completo. En algunos estudios, 105 células competidoras frías se mezclaron con las células blanco marcadas antes de la adición a las células efectoras. Los sobrenadantes se recogieron después de la incubación durante 4 horas a 37°C y se midió la radioactividad usando un contador de placa con 96 cavidades (Packard Instruments). El porcentaje de liberación 51Cr-específica se calculó como se describió. Pruebas de protección de tumor in vivo Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron estimulados mediante inyección s.c. en el costado izquierdo con 1 x 106 células tumorales P1.HTR en 100 µl de DPBS. El tamaño de los tumores se determinó dos veces a la semana midiendo los diámetros más grandes y más pequeños. Los datos se reportan como el promedio de los diámetros de tumor en cada punto de tiempo. Todos los estudios incluyeron cinco ratones por cohorte y se repitieron por lo menos dos veces. Resultados Las células dendríticas derivadas de bazo y pulsadas con péptido P198 son reconocidas por un clon CTL P198-específico pero no son capaces de cebar eficientemente una respuesta a célula T P198-específica in vivo en forma eficiente. Para trabajar hacia un enfoque de inmunización a base de péptidos de antígeno tumoral que pudiera aplicarse a pacientes humanos de cáncer, se exploraron estrategias de vacunación que emplean células dendríticas pulsadas con péptidos en el modelo de tumor de murino P815. Varios genes de antígeno tumoral han sido clonados de P815 y sus variantes "tum"", y se han caracterizado los péptidos antigénicos específicos reconocidos por CTL. Se estudiaron en detalle el antígeno P198 restringido por K" y el antígeno P1A restringido por Ld (Uyttenhove et al., 1980). Se purificaron células dendríticas de bazo DBA usando el método de adherencia/desadherencia descrito primero por Steinman (Steinman eí al., 1979). DCs aisladas de esta manera fueron >90% N418+ y expresaron altos niveles de B7-1 , B7-2 y moléculas MHC clase I y II (Fig. 1 ). También fueron • 5 muy efectivas para estimular una reacción de linfocito-mixta alogénica primaria. Para determinar la capacidad de sDC para presentar complejos péptido/MHC funcionales sobre la superficie de la célula, fueron pulsadas con varias dosis del péptido P198 y después cultivadas en presencia del clon CTL específico CTL P198.6. sDC pulsada con el péptido P198 específico estimuló la secreción de FNT por CTL P198.6 de forma dependiente de dosis, a • concentraciones tan bajas como de 0.1 nM (Fig. 2). La estimulación de planicie ocurrió aproximadamente a 100 nM de péptido. sDC incubada en ausencia de péptido P198 o en ausencia del clon CTL no dio como resultado producción de citocina específica (Fig. 2). 15 Después se usaron sDC pulsadas con péptido P198 para inmunizar ratones DBA singeneicos in vivo. Ratones DBA/2 no afectados fueron inoculados semanalmente durante tres semanas consecutivas con 5 x • 105 sDC que habían sido pulsadas in vitro con 1 µM de péptido P198. Esta concentración se eligió para asegurar que los niveles de estimulación de planicie observados con el clon CTL in vitro pudieran mantenerse in vivo, pero para evitar una concentración de péptidos muy alta que pudiera generar preferentemente células T con TCRs de baja afinidad. Las células pulsadas se inyectaron i.v., i.p. o en la planta de la pata (f.p.); los grupos de control fueron inyectados con PBS o con sDC incubadas sólo en PBS durante el periodo de pulsación con péptidos. Dos semanas después de la tercera inmunización, se cosecharon células de bazo y se estimularon in vitro en un MLTC de seis días. El esquema general para el programa de inmunización se ilustra en la figura 3. ¡ Ya que se había mostrado previamente que la presencia de la molécula coestimuladora B7-1 en las células estimuladoras puede mejorar la detección de respuestas CTL anti-tumorales (Gajewski eí al., 1996), se usaron dos condiciones de estimulación diferentes en el MLTC, ya sea células tumorales P198 de control o transfectadas con B7-1. Se probó la actividad lítica en P198 y en la línea de células de control negativo P511. Como se muestra en la # figura 4, la inducción de CTL específica se detectó únicamente en 10-20% de los ratones, usando las rutas de inmunización en la planta de la pata o i.v. no se detectaron CTL específicos cuando se administraron i.p. las sDC pulsadas con péptidos P198. La magnitud de actividad de CTL y el número de ratones con citotoxicidad específica fueron los mismos cuando se llevó a cabo la estimulación in vitro con o son células tumorales que expresaban la molécula coestimuladora B7-1 (Fig. 4). Estos resultados demuestran que las sDC • pulsadas con péptido P198 fueron capaces de presentar correctamente el péptido a un clon CTL diferenciado in vitro, pero fueron incapaces de cebar ratones en forma efectiva para generar actividad de CTL detectable en la mayoría de los ratones in vivo. Las respuestas CTL en ratones fueron inmunizadas con sDC pulsadas con P198 en combinación con rmlL-12. Debido a la importancia de IL-12 durante el rechazo de variantes tumorales P815 in vivo se demostró previamente (Fallarino eí al., 1996), y debido a la capacidad de esta citocina para promover un fenotipo Th1/Tc1 lítico, se administró rmlL-12 exógena junto con las sDC pulsadas con P198 durante el protocolo de inmunización. Todas • 5 las inmunizaciones subsecuentes se llevaron a cabo por medio de la ruta de planta de la pata. Ratones DBA/2 no afectados fueron inmunizados semanalmente durante tres semanas consecutivas con sDC pulsadas con 1 µM de péptido P198 como arriba. Además, se inyectó rmlL-12 (10 ng por planta de pata al día) en los mismos sitios el día de la inmunización y en los dos días subsecuentes (fig. 3). Los ratones de control recibieron sDC • incubadas sin péptidos, sDC más rmlL-12 o sólo PBS. Como se muestra en el cuadro 1 , la coadministración de rmlL-12 junto con las sDC pulsadas con péptidos generó actividad citolítica anti-P198 específica en 100% de los ratones, mientras que la inyección de sDC pulsadas con péptidos P198 no desarrolló actividad de CTL específica. Como se observó anteriormente, la capacidad de detectar CTL específico no fue mejorada usando células P198.B7-1 para estimular el MLTC. Además, en estos estudios se detectaron • niveles comparables de actividad lítica cuando se usaron bazo o PBMC como una fuente de células T cebadas (cuadro 1 ). El uso de PBMC como una fuente de células T para determinar la generación de CTL específico llevó al sistema más cerca de la aplicación clínica, y también permitió que los ratones vivieran para poder determinar la duración de inmunidad anti-tumoral y la capacidad de los ratones inmunizados para rechazar un ataque tumoral. Todas las determinaciones de CTL subsecuentes fueron determinadas usando PBMC. La razón para administrar una dosis baja de rmlL-12 los días 0, 1 y 2 más que una sola dosis grande el día 0 únicamente, fue para desviar el efecto de IL-12 hacia los nodulos linfáticos drenantes locales en lugar de intentar distribuirla • 5 sistémicamente, y para asegurar que la IL-12 estuviera bañando el nodulo o nodulos linfáticos locales en el momento en el que se esperaba que las células T hicieran contacto con APCs. De hecho, cuando se administró rmlL- 12 el día 0 de cada inmunización únicamente, se detectó actividad de CTL específica en una fracción más pequeña de ratones (cuadro 1 ). En otros 10 estudios, no se detectó actividad de CTL alguna cuando se administró IL-12 # sólo el día 0. En forma colectiva, estos resultados demuestran que la inmunización con sDC pulsadas con péptidos P198 fue mucho más efectiva para desarrollar respuestas de CTL cuando se coadministró también IL-12 exógena.

• Oft- ' CUADRO 1 Proporción de ratones DBA/2 con actividad de CTL específica después de la inmunización con DC cargada con péptido tumoral P198 más rmlL- 12 Fracción con CTL específica P198 detectada en: Inmunización* Bazo Sangr e periférica DC-P198 0/6 0/6 DC-P198 + rmlL-12 (día 0) 3/6 3/6 DC-P198 + rmlL-12 (días O, 1 y 2) 6/6 6/6 DC-IL-12 0/3 0/3 PBS 0/3 0/3 Se inmunizaron ratones *DBA/2 (6 por cohorte) con 5 x 105 sDC pulsadas con 1 µM de péptido P198 como se indica en la figura 3. Se inyectó rmlL-12 ya sea el día 0 únicamente, o los días 0, 1 y 2 de cada inmunización. La actividad citolítica se analizó dos semanas después de la tercera inmunización usando células de bazo (columna 1 ) o PBMC (columna 2) como una fuente de células responsoras. Se consideró que los ratones eran positivos si la lisis específica a una relación E:T de 100:1 era de más de 25 y si la diferencia entre la lisis de P198 y P511 era de más de 15. La inmunización con esplenocitos pulsados con péptido P198, células B, o PBMC induce actividad de CTL in vivo, siempre que se coadministre rmlL-12. La capacidad de IL-12 para aumentar la capacidad de sDC pulsadas para inmunizar in vivo aceleró el examen de otras fuentes de APC que pudieran ser más simples de obtener, siendo de esta manera más fácil de aplicar a protocolos de inmunización humana. También fue deseable • 5 examinar tipos de células que normalmente son APC deficientes o incluso tolerogénicas cuando se usan solas. El razonamiento de los inventores fue que la provisión de IL-12 podría hacer a cualquier clase de célula l+ capaz de iniciar una respuesta a CTL después de la reinyección in vivo. En este punto, esplenocitos no fraccionados, PBMC, células B en descanso o células B 10 activadas con LPS fueron preparadas a partir de ratones DEJA/2 no afectados. La figura 1 muestra el nivel de expresión de moléculas MHC clase I y clase II es estas poblaciones de células, así como los niveles de moléculas coestimuladoras B7-1 o B7-2. Los esplenocitos no fraccionados y PBMC se examinaron 15 primero, en comparación con sDC. En estos estudios, cada población de APC fue pulsada con una concentración igual del péptido P198 (1 µM), pero los ratones fueron inyectados con números variables de las APCs cargadas con péptidos. Los resultados de la figura 5 confirman que tres inmunizaciones semanales con sDC pulsadas únicamente no pudieron inducir CTL detectable, 20 mientras que la administración adicional de rmlL-12 dio como resultado actividad de CTL en 100% de los ratones. En forma interesante, la inmunización con esplenocitos o PBMC totales pulsados con péptido P198 también indujo actividad de CTL exitosamente, pero sólo cuando se incluyó y|<^gSájMS||^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ »^^^^^^^g^^iJ^^ rmlL-12 en el protocolo de inmunización (fig. 5). Sin embargo, se indujo actividad de CTL específica sólo cuando los ratones fueron inyectados con números más altos de esplenocitos o PBMC (1 - 20 x 106) pero sólo en pocos ratones inmunizados con un número equivalente de células al usado en el • 5 caso de sDC (5 x 105). Fue concebible que el grueso de los esplenocitos y PBMC fuera cuantitativamente menos efectivo que sDC porque unen péptidos menos bien o fueron de otra manera inferiores al interactuar con células T, o debido a que contenían entre ellos números pequeños de DC que ya estaban haciendo el cebado de células T. Para comenzar a tocar estos puntos, se examinó la • capacidad de estas varias APCs pulsadas con péptido P198 para estimular la liberación de citocina por el clon CTL anti-P198 específico in vitro. Además, se purificaron células B esplénicas para eliminar la mayoría de DC contaminantes, y también se compararon blastos LPS. El mismo número (1 x 104) de cada tipo de APC se pulsó con concentraciones cada vez más altas de péptido P198, se irradió y se lavó, y se cultivó con el clon CTL P198.6. se probó el contenido de IFN-? después de 48 horas en los sobrenadantes. Como • se muestra en la figura 6, cada tipo de APC fue capaz de estimular al clon CTL P198.6. Sin embargo, fue claro que se necesitó una concentración de péptidos más alta cuando se usaron esplenocitos, PBMC o células B en descanso, en comparación con sDC para obtener una respuesta comparable. Estos resultados muestran que sDC así como otros tipos de APC fueron capaces de presentar el péptido tumoral P198 al clon CTL P198.6 específico, pero que las APC no DC fueron menos efectivas en una base por células para interactuar las células T. Esta deficiencia podría ser superada usando una concentración de péptidos más alta con las APC no DC. ^^ El efecto de usar una concentración de péptidos más alta fue 9 5 explorado después durante la inmunización in vivo. Los ratones fueron inmunizados con varios números de células B, esplenocitos o PBMC pulsados con péptidos P198, junto con rmlL-12 los días 0, 1 y 2 como arriba. Sin embargo, las APC no DC fueron cargadas con 10 µM de péptidos, mientras que las sDC fueron cargadas con 1 µM de péptidos antes de la inmunización.

Como se muestra en la figura 7, se indujeron niveles comparables de • actividad de CTL en una base por células cuando se usó una concentración de péptidos 10 veces más grande para la pulsación de poblaciones de APC no DC. El hecho de que las células B purificadas hayan inmunizado efectivamente contradice la posibilidad de que DC contaminantes en las poblaciones de APC sean responsables del cebado real. De esta manera, la eficiencia relativa de no DC como APC para inmunizar m vivo podría ser superada ya sea incrementando el número de células pulsadas o • incrementando la concentración del péptido usado para la pulsación. La inmunización con PBMC pulsadas con un péptido P815-A e IL-12 induce protección contra el ataque tumoral vivo. La facilidad con la cual PBMC puede obtenerse de pacientes humanos hace a PBMC cargada con péptidos más IL-12 un enfoque atractivo para la aplicación clínica. Este potencial aceleró la investigación acerca de si la generación de CTL específica inducida por la administración de PBMC pulsada con un péptido tumoral más IL-12 se correlaciona también con la capacidad para rechazar el ataque con un tumor que expresa el epítope usado para la inmunización. Para analizar esta posibilidad, tuvo que usarse otro péptido asociado a P815 > porque la línea de células que expresan al epítope de P198 en la asociación de Kd es una línea de células tum-regresoras que es rechazada naturalmente in vivo. Se eligió el péptido P815A nonámero que corresponde a los residuos 35-43 de la proteína P1A presentada por Ld (Lehe eí al, 1992). De hecho, P1A es un antígeno modelo adecuado porque el gen P1A, al igual que la familia de genes MAGE en tumores humanos (De Plaen eí al., 1994), es expresado en varias líneas de células de mastocitoma de murino, pero es silente es tejidos adultos excepto por la teste y placenta (Uyttenhove eí al., 1997). En cuanto a P198, sDC, células de bazo totales, células B o PBMC cargadas in vitro con el péptido P815A fueron todos capaces de presentar correctamente este epítope a un CTL anti-P815 específico (desingando P1 :5) in vitro. Usando el mismo esquema de pulsación e inmunización que había sido efectivo para P198, PBMC se cargaron con péptido P815A (10 µM) y fueron administrados in vivo junto con rmlL-12- los ratones de control recibieron PBMC incubado sin péptidos más IL-12, PBMC más péptido pero sin IL-12, o sólo el vehículo PBS. Dos semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron probados para verificar la actividad de CTL de anti-P815A en la sangre periférica después de un MLTC de seis días. También en este caso las dos células estimuladoras diferentes fueron usadas para el MLTC in vitro. La primera fue L1210 tumoral singeneica transfectada para expresar al gen P1A (L1210.P1A), y la segunda fue la línea de células L1210.P1A.B71 , un transfector doble que expresaba P1A y B7-1. Se probó la actividad lítica contra P815, el cual expresa al antígeno P815A, y • 5 en la línea de células de control negativo P1204, una variante de P815 que había perdido la expresión del gen P1A (Uyttenhove eí al., 1983). Para eliminar la actividad lítica no específica, se llevaron a cabo pruebas en presencia de un exceso de 50 veces de células blanco competidoras frías (es decir, no radioactivas) P1204. Como se muestra en la figura 8, se obtuvo una inducción de CTL efectiva en 100% de los ratones sólo cuando los ratones • fueron inmunizados con PBMC cargado con péptidos junto con rmlL-12. En contraste con lo que había sido observado con el péptido P198, la expresión de B7-1 en las células estimuladoras incrementó de hecho la sensibilidad del MLTC, dando como resultado una actividad de CTL detectable más alta.

Además de PBMC, los esplenocitos pulsados con péptido PÍA o sDC también indujeron exitosamente actividad de CTL in vivo. Como se mencionó previamente, a medición de la actividad de • CTL de la sangre periférica permitió que el mismo número de ratones fuera estimulado con tumor vivo para determinar la protección. Diez días después de la prueba de CTL, los ratones tratados recibieron células tumorales P1.HTR (1 x 106) subcutáneamente sobre el costado. P1.HTR es una variante altamente transfectable de P815 que expresa al epítope P815A y crece como un tumor sólido in vivo, creciendo progresivamente en alrededor de 90% de ratones DBA/2 singeneicos no afectados (Gajewski eí al., 1996). Los resultados de la figura 9 muestran que los ratones inmunizados con PBMC pulsada con P815-A más rmlL-12 no sólo adquirieron CTL anti-P815A específica sino también fueron protegidos contra el ataque con un tumor que • 5 expresaba el mismo antígeno. En estudios paralelos, los ratones inmunizados no rechazaron la variante P1 A-negativa de P815, P1204, demostrando especificidad a antígeno. En contraste, los ratones inyectados con PBMC cargada con péptido P815A pero sin rmlL-12 administrada o con PBMNC vacía y rmlL-12 no fueron protegidos contra el ataque tumoral (fig. 9). De esta manera, fue evidente una adecuada correlación entre la capacidad de PBMC • pulsada con péptidos más IL-12 para inducir actividad de CTL y para proteger contra un ataque tumoral. De hecho, la inmunización con PBMC cargada con péptidos en ausencia de IL-12 no pudo inducir inmunidad protectora in vivo justo como fue incapaz de facilitar la generación de CTL anti-tumoral específica.

EJEMPLO 2 • Prueba sustituta para verificar la inmunización específica de antígeno tumoral efectiva para pacientes con melanoma mestastásico Técnicas de cultivo de tejidos Los métodos generales de Cerottini eí al., (1974) con algunas modificaciones (Glasebrook y Fitch, 1980) se usan para cultivar células linfoides de ratón. Todas las líneas de células se analizan periódicamente para micoplasma, y se toman precauciones para mantener un laboratorio libre de micoplasma. El medio de base usado para células de murino es DMEM, y para células humanas es RPMI. • 5 Aislamiento de subpoblaciones de APC Se extirpan quirúrgicamente los bazos de ratones que habían sido anestesiados y dislocados cérvicamente. Se preparan suspensiones de células mediante homogeneización con un moledor de tejidos de vidrio pulverizado, y los restos de tejido conectivo se retiran mediante centrifugación lenta durante 30 segundos. Se preparan células denclríticas cultivando esplenocitos frescos sobre placas de cultivo de tejido durante 1.5 horas, enjuagando las células no adherentes, y cultivando durante la noche a 37°C en medio de cultivo. Las células no adherentes se aislan mediante enjuague suave; éstas son predominantemente células dendríticas (Inaba eí al., 1987). Las células B se purifican mediante la remoción de células adherentes, reducción de células T con anti-Thy-1 mAb y complemento, y centrifugación con gradiente de Percoll (Stack eí al., 1994).

Estudios de tumor in vivo en ratones Para las inmunizaciones, 2-10 x 105 APC pulsadas con péptidos de varias clases se preparan en un volumen de 50 µl de DPBS. Se inyectan por medio de una jeringa de 1 ce a través de una aguja calibre 23. Los lugares para inyectar incluyen subcutáneamente en las plantas de las patas traseras o costados, o intravenosamente a través de la vena de la cola. La inoculación con células tumorales vivas se lleva a cabo usualmente en forma subcutánea sobre el costado. Para P1.HTR y las demás variantes de P815, se ha usado 5 • 5 x 105 de células para generar crecimiento de tumores en la mayoría de los ratones. El tamaño del tumor se mide en las dimensiones más grandes y más cortas, y se calcula una media para cada punto de datos. Cada esfuerzo se hace para reducir al máximo las molestias a los animales.

Prueba de citólisis La citólisis se mide usando un prueba de liberación de 51Cr. Se recogen células efectoras, se cuentan y se resuspenden a una concentración de 2 x 106/ml. Los blancos a ser probados se cargan con Na251CrO4, se lavan y se resuspenden a 2 x 105/ml. Se hacen diluciones en serie de células efectoras en placas de microtitulación de fondo en V a un volumen de 100 µl, y se añade un volumen igual de blancos marcados. Para la inhibición blanco fría, se añade un exceso de 20 a 50 veces de blancos no marcados por cavidad. La placa es centrifugada brevemente, incubada a 37°C durante 4-5 horas, y se mide la liberación de 51Cr de los sobrenadantes usando un contador gama con placa de 96 cavidades. Se mide la liberación espontánea de las células blanco solas, y la liberación máxima se mide de células blanco lisadas con Tritón X-100. Se calcula la liberación porcentual máxima de 51Cr como se describió por Lancki eí al., 1987.

Pruebas de citocina mediante ELISA Se prueban varias citocinas mediante técnicas ELISA estándares. Las citocinas principales examinadas son IFN-?, FNT-a, IL-2 e IL- ^^ 4. Brevemente, placas de 96 cavidades son recubiertas con la anti-citocina relevante mAb, lavadas y bloqueadas con un regulador de pH que contiene proteínas para evitar la unión no específica. Se lavan, y soluciones en serie de los sobrenadantes de prueba o un estándar (normalmente una versión recombinante de la citocina) se preparan por duplicado. Después de incubar y lavar de nuevo, se añade un segundo Ab anyi-citocina y las placas se 10 incuban. Después del lavado, las placas son reveladas usando un tercer Ab • acoplado a peroxidasa de rábano seguido por un substrato que genera un producto con color. Las placas se leen en un lector ELISA, y las diluciones máximas medias se comparan con el estándar y se convierten a pg/ml o U/ml.

PCR™ para expresión de genes MAGE-3 o Melan-A Análisis de PCR™ de muestras de tumores para verificar la expresión de los genes MAGE-3 o Melan-A se llevan a cabo como parte del # protocolo de inmunización clínica usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Brevemente, ARN mensajero (ARNm) de muestras de tumores congeladas o frescas se aisla usando el método de guanidina/cloruro de cesio. Se sintetiza ADNc usando oligo(dT)?5 como un cebador de acuerdo con métodos estándares.

El análisis de RT-PCR™ de muestras de tumor para verificar la expresión de los genes MAGE-3 y Melan-A se lleva a cabo usando los siguientes oligonucleótidos y programa. Los oligonucleótidos cebadores que g^ se usarán para la PCR™ de MAGE-3 son: 5 Sentido: 5'-TGGAGGACCAGAGGCCCCC-3' (SEQ ID N0:3). Antisentido: 5'-GGACGATTATCAGGAGGCCTGC-3' (SEQ ID N0:4) Los oligonucleótidos cebadores que se usarán para la PCR™ de Melan-A son: A 10 Sentido: 5'-CTGACCCTACAAGATGCCAAGAG-3' (SEQ ID N0:5). Antisentido: 5'-ATCATGCATTGCAACATTTATTGATGG-3* (SEQ ID NO:6) Los oligonucleótidos cebadores que se usarán para el control de 15 ß-actina son: Sentido: 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' (SEQ ID N0:7). Antisentido: 5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' (SEQ ID N0:8).

• La PCR™ se lleva a cabo durante 40 ciclos a una temperatura de fijación de 58°C. Los productos de PCR™ se visualizan usando geles de 20 agarosa teñidos con 1.5% de EtBr. El tamaño esperado de los productos de PCR™ es 725 pb para MAGE-3, 605 pb para Melan-A y 615 pb para ß-actina. No se hizo intento de cuantificación.

Para casos en los que estén disponibles cantidades muy pequeñas de tejido (por ejemplo, una biopsia central guiada por CT), se lleva a cabo una segunda ronda de PCR™ anidada con un conjunto de cebadores internos al primero como se describe en el ejemplo 6.

Tipificación HLA La tipificación HLA para MHC clase I sólo se lleva a cabo usando métodos estándares bien conocidos por el experto en la técnica.

Aislamiento de PBMC humanas Se recoge sangre periférica (aproximadamente 100-150 ce) con heparina de cada paciente antes de cada inmunización programada, y tres semanas después de la inmunización final. Las células son diluidas 2:1 en DPBS, colocadas sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque o Lymphoprep, y se centrifugan a 3000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares se recogen de la interfaz, se lavan con DPBS y se cuentan. Después se preparan para la vacuna o para criopreservación como se indica en el protocolo clínico.

Criopreservación de las células Se resuspenden aproximadamente 10 x 106 células en 1 ml de medio que consiste en 50% de suero de bovino fetal, 10% de DMSO y 45% de DMEM (para células de murino) o RPMI (para células humanas). Los frascos ^^^^^ «^^^^¿ marcados se colocan en una cámara aislada durante la noche a <70°C y se transfieren a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Para la medición de actividad CTL MAGE-3-específica de los pacientes de melanoma que están siendo tratados, se descongela un solo frasco de células • 5 almacenadas y las células se lavan y se cuentan. Después son estimuladas y expandidas in vitro como se indica en el protocolo.

Métodos estadísticos Se generan estadísticas descriptivas para describir la frecuencia 10 de toxicidades y cambios inmunológicos observados inducidos por el tratamiento dentro de cada uno de los grupos de dosis pequeña. Sin embargo, en la dosis de fase II determinada, deben ser posibles más interferencias estadísticas formales. Las respuestas inmunológicas observadas antes del tratamiento se comparan con aquéllas después de cada inmunización usando 15 pruebas í apareadas. Se esperan niveles de línea de base variables entre pacientes, por lo que se emplea una transformación logarítmica y se generan intervalos de confluencia de 95% para la relación promedio entre las respuestas post-tratamiento y de línea de base. Además, se analizan los datos de la línea de base y cada uno de los estudios de post-inmunización 20 usando análisis de variación de medidas repetidas para determinar el patrón en la respuesta sobre ciclos de tratamiento múltiples.

EJEMPLO 3 Inmunización de humanos con PBMC pulsadas con péptidos más IL-12 Métodos 5 Este ejemplo describe un protocolo general para un estudio de inmunización no aleatorio con PBMC autólogas pulsadas con péptidos Mage3 o MelanA más dosis cada vez más altas de rhlL-12 en pacientes seleccionados con melanoma metastásico. El protocolo consiste en la inmunización con una mezcla que contiene las propias células de la sangre del paciente con un péptido de Mage3 o MelanA, dependiendo de cuáles sean • las propias células cancerosas del paciente que se produzcan. También se administran dosis variables de interleucina-12 humana recombinante (rhlL-12). Mage3 y MelanA son proteínas producidas por la mayoria de tumores de melanoma observados. Las células cancerosas que producen una de estas proteínas, la degradan en fragmentos de péptido más pequeños que se adhieren a la superficie de la célula por medio de antígenos HLA. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) pueden reconocer después la combinación • péptido/HLA y matar las células tumorales que la expresan. Por lo tanto, el diseño del protocolo en este ejemplo es estimular al cuerpo para producir CTL que específicamente matarán células tumorales.

Tratamiento La terapia de los pacientes consiste inicialmente en 3 ciclos. Cada ciclo de tratamiento tiene 21 días de longitud, consistiendo de inmunización (PBMC pulsadas con péptidos) e inyección de rhlL-12 el primer día, inyección de rhlL-12 el tercero y quinto días y un periodo de descanso de 16 días. Un cohorte inicial de 3-6 pacientes recibe las PBMC pulsadas con MAGE-3 o Melan-A solas. No se da placebo alguno en lugar de rhlL-12. Si un paciente tiene una respuesta objetiva o enfermedad estable, la terapia puede continuar durante conjuntos adicionales de 3 ciclos.

Duración Los pacientes pueden permanecer en estudio durante hasta 1 año.

Número de pacientes Cohortes de 3-6 pacientes se tratan sin rhlL-12, y a los niveles de dosis de rhlL-12 de 30, 100 y 300 ng/kg/día. Hasta diez pacientes adicionales son tratados en la dosis de fase II recomendada de rhlL-12. Hasta 34 pacientes son enrolados en este estudio. El número de pacientes en cada nivel de dosis es totalizado (los que reciben MAGE-3 y los que reciben Melan-A), y los pacientes son enrolados secuencialmente sin importar si están recibiendo o no MAGE-3 o Melan-A.

Intensificación de dosis Las dosis de rhlL-12 son intensificadas en cohortes de >3 pacientes a menos que se encuentre toxicidad limitativa de dosis (DLT). Si -^ ocurre DLT en uno de los primero tres pacientes a un nivel de dosis, se tratan entonces tres pacientes adicionales a ese nivel de dosis para determinar si la dosis máxima tolerada (MTD) ha sido excedida. Si ninguno de los primeros tres pacientes a un nivel de dosis experimenta DLT después de dos ciclos, entonces la intensificación de dosis puede proceder al siguiente nivel. La MTD se define como el nivel de dosis al cual por lo menos 2 ó 3 de seis pacientes 10 experimentan DLT. La dosis de fase II recomendada es un nivel de dosis • debajo de la MTD, o la dosis que brinde inmunización óptima medida mediante respuestas de células T, cualesquiera que sea la más baja. En el poco probable escenario de que la DLT se observe únicamente con un péptido y no con el otro, entonces la inmunización con ese péptido se explora 15 más como un grupo independiente.

Elegibilidad de pacientes • Los criterios de inclusión comprenden: 1. Melanoma metastásico histológicamente confirmado. 20 2. Expectativa de vida de por lo menos 12 semanas. 3. índice de estado de rendimiento de Karnofsky >70. 4. Consentimiento informado por escrito.

. Función hematopoyética, renal y hepática adecuada, definida como: Conteo de neutrófilos absoluto >1500/µl Hemoglobina >9 g/dl Conteo de plaquetas >100,000/µl Creatinina <1.5 x ULN SGPT 2 x ULN Bilirrubina <1.5 x ULN Calcio 11 mg/dl 6. Tipificación HLA: el paciente debe expresar HLA-A2. 7. Expresión de MAGE-3 o Melan-A: el tumor debe expresar MAGE-3 o Melan-A mediante análisis de RT-PCR™.

Los criterios de exclusión comprenden: 1. Enfermedad cardiovascular significativa o arritmia cardiaca que requiera intervención. 2. Mujeres embarazadas o lactando. 3. Terapia biológica en la semana 4 antes del inicio de la dosificación. 4. Seropositivo para antígeno de superficie de hepatitis B. El paciente debe ser analizado si es clínicamente indicado. 5. Seropositivo para anticuerpo de VIH. El paciente debe ser analizado si se identifican factores de riesgo. 6. Infección concurrente seria. 7. Corticoesteroides sistémicos concurrentes (excepto dosis de reemplazo fisiológicas) u otros fármacos inmunosupresores (por ejemplo, ^b ciclosporina A). 5 8. Enfermedad psiquiátrica que pudiera hacer difícil de manejar la cooperación con el protocolo clínico o que pudiera comprometer la capacidad del paciente para dar consentimiento informado. 9. Enfermedad autoinmune clínicamente significativa. 10. Sangrado gastrointestinal activo o úlcera péptica no 10 controlada. • 11. Historial de enfermedad inflamatoria del intestino. 12. Metástasis cerebrales no tratadas. Los pacientes con metástasis cerebrales tratadas deben ser separados de corticoesteroides y estar clínicamente estables antes de enrolarse en este estudio. 15 Las excepciones a los criterios de elegibilidad se consideran en una base de caso por caso, si en opinión del médico que atienda tal excepción no incrementará indebidamente los riesgos para el paciente. Ya que la • toxicidad de las PBMC pulsadas con péptidos sin rhlL-12 se espera que sea mínima, se prefiere que dichos pacientes excepcionales sean tratados en el grupo que no reciba rhlL-12.

Programa de prueba 1 Puede hacerse hasta 28 días antes del registro. 2Los barridos de CT se harán según sea necesario para verificar las etapas del tumor y hasta que se documente PD. ^ aproximadamente 10 ml de sangre coagulada será recogida para el almacenamiento de suero. 4Una alícuota de PBMC preparada el día 1 de cada ciclo será criopreservada para la determinación posterior de CTL. 5EI seguimiento será de por vida. 6DTH para PPD y antígenos de recuperación se llevará a cabo 10 de nuevo cuando la terapia esté completa. • Información de fármacos/métodos de estudio Los péptidos MAGE-3 y Melan-A son producidos de acuerdo con estándares de GMP por Múltiple Peptide Systems, San Diego, CA. El siguiente péptido MAGE-3 (usando designaciones de aminoácido de una sola letra) se usa para pacientes que expresan HLA-A2 y con tumores MAGE-3+: FLWGPRALV (SEQ ID N0:9). Se usa el siguiente péptido Melan-A para • pacientes que expresan HLA-A2 y con tumores Melan-A+: AAGIGILTV (SEQ ID NO:10). 20 Cada péptido es provisto en frascos liofilizados que contienen 1 g cada uno. Un solo frasco de péptido MAGE-3 es reconstituido a una concentración de 20 µM en PBS de Dulbecco (DPBS; Gibco/BRL) y almacenado en alícuotas de 5 ml a -80°C. El péptido Melan-A es reconstituido en DMSO, y después diluido en DPBS. Este volumen es añadido a un volumen igual de PBMC autólogas para incubación (pulsación con péptidos) en el momento de preparar cada vacuna. La rhlL-12 se fabrica y provee por el Instituto de Genética • (Cambridge, MA). El producto de fármaco de rhlL-12 se suministra como un polvo liofilizado en frascos de 5 ml bajo vacío leve. Cada frasco contiene 50 µg de rhlL-12. Los frascos están diseñados para un solo uso únicamente. Se provee agua estéril para inyección (WFI) para reconstituir el producto. No debe usarse WFI bacteriostática. La rhlL-12 liofilizada debe ser almacenada en una instalación refrigerada asegurada a 2-8°C. la WFI puede almacenarse • a temperatura ambiente. Después de la reconstitución, las dosis son estables durante 2 horas a 2-8°C. Las dosis unitarias preparadas en una jeringa pueden mantenerse a temperatura ambiente y deben usarse dentro de las 4 horas siguientes a su preparación. La rhlL-12 liofilizada es reconstituida con 5 ó 1 ml de WFI estéril. La reconstitución es completada aproximadamente en un minuto. Una vez que concluyen todos los análisis y otras pruebas pre- • estudio, el paciente es admitido para la primera inmunización e inyección de rhlL-12. 20 La PBMC se prepara de acuerdo con métodos estándares. Se . recogen aproximadamente 100-150 ml de sangre periférica usando una técnica de flebotomía estándar, directamente en 2-3 jeringas de 60 ce que contienen 0.6 ce de heparina libre de conservadores. Una alícuota de la muestra de sangre periférica (por lo menos 10 x 106 células) es criopreservada para la determinación futura de estudios inmunológicos de línea de base. Las PBMC son aisladas mediante centrifugación sobre un gradiente Lymphoprep (Gibco/BRL), contadas, lavadas en DPBS y • 5 resuspendidas es DPBS a una concentración de 40 x 106 células/ml. Se añade un volumen igual de la solución de péptidos relevante (preparada a 20 µM en DPBS), y la suspensión se incuba durante 1 horas a 37°C con oscilación suave. Las células son irradiadas después letalmente (2000 cGy), lavadas una vez con DPBS y resuspendidas en DPBS a una concentración de 50 x 106 en 0.5 ml. La suspensión de PBMC cargadas con péptidos es • inyectada subcutáneamente usando una jeringa de 1 ce y aguja de 21 g, dividida uniformemente en 2 sitios. Los sitios de inyección que se prefieren son cerca de los lugares de nodulos linfáticos drenantes pero no cerca de una masa tumoral. Ejemplos de sitios adecuados serían el muslo proximal, la parte superior del brazo o la pared abdominal inferior. La rhlL-12 al nivel de dosis asignado al paciente es inyectada subcutáneamente usando una jeringa de 3 ce y aguja de 25 g lo más pronto • posible después de la inoculación de PBMC pulsadas, inmediatamente adyacente a 1 de los dos sitios de inmunización. Si el paciente va a recibir la vacuna sola sin rhlL-12, entonces no se da inyección de placebo alguna. La apariencia de cada sitio de inyección se registra justo antes, 1 hora después y 24 horas después de la inmunización. En algunos casos, se toman fotografías con una regla métrica para documentar la inflamación.

Se toman muestras de sangre (10 ce en un tubo Vaccutainer de tapa roja de 10 ce) justo antes, 12 horas, 24 horas y 6 días después de la inmunización. También se aisla y almacena suero a -20°C para la medición ^^ subsecuente de los niveles de citocina. 9 5 La rhlL-12 (si es asignada al paciente) es inyectada subcutáneamente aproximadamente en el mismo lugar que la primera inyección los días 3 y 5 como un paciente externo. El esquema de inmunización completo es repetido cada 21 días. Un curso consiste en 3 ciclos. Las inyecciones de PBMC pulsadas con 10 péptidos e IL-12 para ciclos subsecuentes deben hacerse aproximadamente • en los mismos lugares que para el primer ciclo, a menos que lo prohiban señales de inflamación local. Se llevarán a cabo pruebas para medir la actividad de CTL específica de péptido y los niveles de citocina una vez que se haya reunido un 15 número práctico de muestras.

Modificación del tratamiento con base en toxicidad • Se usa la escala de criterios de toxicidad común del instituto nacional de cáncer para graduar las toxicidades. Las toxicidades limitativas de 20 dosis se definen como grado 3 o más, con las siguientes modificaciones: • • • Se permiten dos interrupciones al tratamiento. Si un paciente requiere una tercera interrupción por toxícidad.o si cualquier toxicidad no regresa a criterios de elegibilidad dentro de tres semanas, entonces el paciente es retirado del estudio. Se permite la reducción de dosis para el primer nivel de dosis, y consiste en la inmunización con PBMC autólogas pulsadas con péptidos solas. • 5 Las toxicidades de más de grado 3 o que satislagan los números 6, 7 u 8 del cuadro anterior se reportan como experiencias adversas para la FDA y el Instituto de Genética. En la improbable circunstancia de que se observen toxicidades inusuales o limitativas de dosis sólo con el péptido MAGE-3 o Melan-A, ^fe 10 entonces se explora el tratamiento con ese péptido como un grupo independiente.

Tratamiento auxiliar Puede darse cuidado sintomático según se requiera con 15 medicamentos tales como antieméticos y analgésicos. Sin embargo, la administración de corticoesteroides requiere que el paciente sea retirado del estudio. # Monitoreo de toxicidad 20 Los pacientes son monitoreados y cuestionados en cada visita (véase programa de prueba) que se refiera a la ocurrencia y naturaleza de cualquier experiencia adversa. Un evento se define como cualquier cambio en el estado fisiológico o psicológico que no sea la condición primaria que califique al paciente para el estudio.

Evaluación del tratamiento *\fff 5 Los pacientes son evaluados por lo menos dos semanas (normalmente el día 1 y el día 7 de un ciclo) mientras reciben el tratamiento, cada semana ocho hasta que haya evidencia de progresión del tumor, después a intervalos de 8-12 semanas siempre y cuando el paciente sea capaz de regresar. Los pacientes son observados durante 1 hora después de 10 cada inyección de rhlL-12 para monitorear una toxicidad inmediata. La evaluación de la regresión del tumor es un punto final secundario en este estudio. Las masas tumorales se caracterizan cuidadosamente con mediciones bidimensionales. Criterios para una respuesta parcial (PR): 50% de reducción en 15 la suma del producto de los diámetros perpendiculares más grandes de las lesiones indicadoras identificadas antes de la terapia. Criterios para una respuesta completa (CR): desaparición total • de toda la evidencia de tumor sin la aparición de lesiones nuevas. Criterios para enfermedad progresiva (PD): aparición de lesiones nuevas; y/o incremento de cincuenta por ciento en la suma del producto de los diámetros perpendiculares más grandes de las lesiones indicadoras. Este corte ha sido elegido debido a que se han observado incrementos iniciales en tamaños de tumor seguidos por el encogimiento del tumor en la primera experiencia de inmunización con péptido MAGE-3; y/o reaparición de cualquier tumor. Criterios para enfermedad estable (SD): falla en satisfacer los criterios para una respuesta parcial, respuesta completa o enfermedad • progresiva Decisión de tratamiento/seguimiento en la evaluación del paciente Los pacientes que cumplan los criterios para una PR o SD 10 pueden volverse a tratar durante cursos adicionales de tres ciclos. Los • pacientes con una CR pueden ser tratados con un curso adicional de tres ciclos y después se detiene el tratamiento.

Estudios moleculares/inmunolóqicos 15 La tipificación HLA se lleva a cabo usando métodos estándares. Los niveles de IFN-? y FNT-a en suero se determinan mediante una técnica de ELISA estándar. • Se analiza la presencia de CTL MAGE-3- o Melan-A-específicos. Brevemente, se aislan CD8+ PBL usando esferas magnéticas. La población de 20 CD8" es pulsada con el péptido MAGE-3 o Melan-A relevante, irradiada (2000 cGy) y añadida como células estimuladoras junto con IL-2. Después de una semana las células que responden se restimulan de nuevo de la misma manera. Después de otras semana, se mide la actividad citolítica mediante liberación de cromo contra una línea de células B pulsadas con péptidos que expresa HLA-A2 (células T2). Los controles negativos incluyen células T2 no pulsadas y el blanco K562 sensible a NK. La competencia en frío puede llevarse a cabo con células K562 no marcadas para eliminar actividad NK no • 5 específica.

Consideraciones estadísticas Se generan estadísticas descriptivas para describir la frecuencia de toxicidades y cambios inmunológicos observados inducidos por cada uno de los grupos de dosis pequeña. En la dosis de fase II determinada, hay • suficientes números de pacientes (13-16) estudiados como para permitir hacer interferencias estadísticas más formales. Las respuestas inmunológicas antes del tratamiento se comparan con aquéllas después de cada inmunización usando pruebas t apareadas. Se esperan líneas de base variables entre pacientes, por lo que se emplea una transformación logarítmica y se generan intervalos de confluencia de 95% para la relación promedio entre las respuestas post-tratamiento y de línea de base. Además, se analizan los • datos de la línea de base y cada uno de los estudios de post-inmunización usando análisis de variación de medidas repetidas para determinar el patrón en la respuesta sobre ciclos de tratamiento múltiples.

Consideraciones de patología Los pacientes que entran en esta prueba ya tienen melanoma maligno confirmado histológicamente. La biopsia del tumor es una parte necesaria de este protocolo para examinar la expresión de los genes MAGE-3 o Melan-A mediante RT-PCR™. Se llevan a cabo histologías estándares para verificar el diagnóstico patológico del espécimen.

EJEMPLO 4 Perspectiva general de un estudio de vacunación humana Este ejemplo provee resultados para pacientes inmunizados con PBMC incubadas con péptido Mage3 o péptido MelanA más dosis asignadas de rhlL-12 que varían de 0-100 ng/kg. Los pacientes fueron tratados con PBMC pulsadas con péptidos solas, usando péptido Mage3 o MelanA como se indicó, o con rhlL-12 administrada subcutáneamente cerca del sitio de inmunización. Después de la inmunización, se llevaron a cabo pruebas para verificar la actividad de CTL específica de péptido y la producción de citocina, en particular IFN-?. También se presentan los datos para las respuestas clínicas. Las abreviaturas, definiciones y métodos se han descrito previamente en el ejemplo 3.

Elegibilidad de pacientes Los criterios de inclusión generales se han establecido en el ejemplo 3. Los criterios adicionales son como sigue: 1. KPS 0-1 , función de órganos intacta para recibir rhlL-12, HLA- A2-positivo; varias terapias previas permitidas, expectativa de vida de 12 semanas. 2. Tumor obtenido por biopsia o quirúrgicamente, y expresión de • 5 Mage3 y MelanA determinada por RT-PCR™. PCR™ anidada hecha para material de biopsia pequeño. Sólo se permiten pacientes que expresen antígeno. Se da prioridad a Mage3.

Preparación de vacuna fe 10 Para cada vacuna, se obtuvieron 100 ce de sangre heparinizada y se aislaron las PBMC mediante centrifugación Lymphoprep. Se apartó una porción de células y se separó en fracciones de CD8+ y CD8- para criopreservación. Las PBMC se incubaron con péptido Mage3 (10 µM) o péptido 15 MelanA (50 µM) en DPBS durante una hora a 37°C. Las concentraciones de péptidos se eligieron con base en la dosis óptima más baja para la estabilización de la expresión de HLA-A2 en células T2. Las PBMC pulsadas fueron irradiadas (2000 rad), centrifugadas y resuspendidas en 2 ce de DPBS para inyección. 20 La inyección de PBMC pulsadas se llevó a cabo subcutáneamente, dividida entre dos sitios, ya sea en la parte superior de los brazos o piernas proximales.

Se inyectó rhlL-12 al nivel de dosis asignado (ng/kg/) cerca de uno de los dos sitios de vacuna. El procedimiento completo se repitió cada tres semanas, con revaluación clínica cada tres ciclos. 5 Análisis Se llevó a cabo el análisis funcional de células T por lotes, con todas las muestras de cierto paciente descongeladas y restimuladas in vitro simultáneamente. 10 La expansión in vitro de células T CD8+ para pruebas se llevó a • cabo usando condiciones de activación mínimas: células CD8-negativas pulsadas con péptidos, sólo 10 U/ml de rlL-2 añadido el día 2 de cada estimulación, con una estimulación de seis días seguida por una segunda estimulación de 4-5 días. 15 Cuando fue posible para pacientes en progreso, se obtuvo una biopsia de seguimiento para investigar el crecimiento de células tumorales negativas a antígeno. F A continuación se presenta un resumen de la prueba con vacunas: Resumen de la prueba con vacunas de MAGE3/MelanA • • • Resultados La vacunación de pacientes de melanoma con enfermedad metastásica refractaria se demostró usando PBMC autólogas pulsadas con péptidos de antígeno tumoral más rhlL-12. Este enfoque es más rápido que la • 5 expansión de células dendríticas. La generación de células T CD8+ productoras de IFN-? específicas de péptidos fue detectada después de una a tres inmunizaciones como se muestra en las figuras 10, 11 y 12. Las respuestas específicas a Melan-A parecieron ser detectadas antes que las respuestas específicas a f 10 Mage-3. Las respuestas clínicas parciales y la selección documentada para variantes de tumor de pérdida de antígeno indican que las células T que cebaron contra cada uno de estos antígenos pueden ejercer un efecto antitumoral. 15 EJEMPLO 5 Fabricación de péptido MPS-38 grado GMP, No. de parte 600038. No. de lote 96020, en MPS Secuencia de péptidos FLWGPRALV (SEQ ID NO:9); peso molecular = 1058.3, en donde un grupo hidroxilo está unido a la valina en el extremo de carboxilo.

Síntesis del péptido en resina (MD-14 Rev. 5) El procedimiento usado para la síntesis es el procedimiento general descrito en el documento original de Merrifield (1963) con modificaciones menores. La síntesis se llevó a cabo en un recipiente de reacción de 1000 mL con un embudo fritado en el fondo para un lavado y filtración de solvente fáciles del soporte sólido. La síntesis fue iniciada con 30 gramos (tamaño de lote) de resina Merrifield de Boc-L-Valina, sustitución con 1.04 meq/g. Se usó química de Boc a lo largo del ensamble de la cadena de péptidos. El cálculo de todos los lavados de solvente, excepto para el paso de desprotección con TFA, estuvo basado en 10 mL/g de resina de partida. Para el paso de desprotección con TFA, los lavados se basaron en 15 mL/g de resina de partida, como una precaución para asegurar una completa remoción de Boc. Todos los aminoácidos fueron apareados usando DIC o DIC/HOBt como el agente de activación. Los cálculos de aminoácidos, diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidrobenzotriazol (HOBt) se basaron en un exceso de tres veces de la sustitución y cantidad de partida de la resina usada. Cada apareamiento fue monitoreado por prueba con ninhidrina. La mezcla de la resina y el solvente se logró burbujeando nitrógeno.

Reapareamiento de aminoácidos (MD-I.IA) El reapareamiento se llevó a cabo con tres equivalentes de aminoácidos y DIC para los pasos de apareamiento que indicaban un resultado positivo a la prueba con ninhidrina. Estos incluyen Phe1 y Leu2. Como una precaución debido al apareamiento en prolina, se reapareó Gly4. Después del ensamble completo de la cadena, se llevó a cabo la ^^ remoción de Boc final. El péptido resultante sobre la resina se secó con nitrógeno y se pesó. El rendimiento fue de aproximadamente 68.1 gramos, o 104% de ganancia de peso de resina teórica.

Remoción de formilo antes del corte (MD-19 Rev. 1 ) Se removió el grupo protector de formilo en el residuo de ? 10 triptófano usando una solución de piperidina/DMF al 20%. Como precaución, este paso se llevó a cabo dos veces para asegurar la remoción del grupo protector. El rendimiento final de la resina fue de 61.6 gramos, que corresponde a 92% de rendimiento teórico.

Corte de HF y desprotección de cadena lateral del péptido (MD-2 Rev. 4) Después de la conclusión de la remoción del grupo formilo, se cortaron cuarenta gramos del péptido sobre resina de la resina mientras se desprotegían las cadenas laterales de aminoácidos con una mezcla de HF/anisol condensada (175 mL/35 mL). La reacción fue conducida a 0°C durante 60 minutos, después de lo cual el HF y anisol fueron evaporados con nitrógeno en aproximadamente tres horas. El péptido cortado fue lavado con tres porciones de 200 mL de éter etílico para remover cualquier anisol restante. El péptido se extrajo de la resina con tres porciones de 200 mL de HOAc acuoso al 10%. Las soluciones de péptidos/HOAc al 10% fueron combinadas, colocadas en matraces de liofilización de 1200 mL y liofilizadas durante aproximadamente 17 horas hasta la sequedad en un liofilizador Virtis FM25EL. El rendimiento fue de 101 % del valor teórico, dando como resultado 20 gramos de péptido crudo. Los lavados adicionales de la resina de péptido cortada con solución de 50% de ACN/50% (10%HOAc/H2O) proveyó una cantidad insignificante de material adicional y pareció de calidad más baja. Se descartó el rendimiento de estos lavados. El péptido crudo fue analizado mediante CLAR y la pureza se determinó como de aproximadamente 63%. Bajo las condiciones descritas, el péptido eluyó a aproximadamente nueve minutos.

Análisis del péptido crudo Sistema de CLAR: Beckman Gold, Shimadzu CR4A Integrator Columna: Vydac C-iß 4.6 mm x 250 mm, 5 µ, 300A Solvente A: 0.1 % TFA / H20 Solvente B: 0.1 % TFA / ACN Gradiente: 30 - 60% B en 30 minutos Velocidad de flujo: 1.0 mL/min. Datos-Longitud de onda: 215 nm (Véase figura 2 para un cromatograma de CLAR representativo del producto crudo).

Purificación del péptido crudo • El péptido fue purificado usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (CLAR), con resina Cis como la fase estacionaria. Un solo paso de purificación usando TFA como el regulador de pH dio como resultado la pureza deseada. Esto dio como resultado la sal de TFA del péptido purificado. 10 • Purificación de TFA (MD-18 Rev. 3) Se disolvieron un total de 1-2 gramos en 50-100 mL de ácido acético al 10%. La solución fue cargada en una columna preparativa dedicada a 80 mL/min. 15 Parámetros de purificación Sistema de CLAR: Walters Delta Prep Columna: C?8 300 A, 15µ 7.5 x 39 cm (etiqueta #000308) 20 Solvente A: 0.1% TFA / H2O Solvente B: ACN Gradiente: 0-18% B en 10 minutos (0-20% B en 10 min.) Velocidad de flujo: 18-38% en 60 minutos (20-40% en 60 min.) 80 mL/min. Longitud de onda: 215 nm ^k Los parámetros de gradiente en paréntesis se usan para los bordes iniciales: G0304 y G0305. Más tarde se adoptó un gradiente más lento para incrementar la separación de péptidos de impurezas. (Véase figura 3 para un cromatograma de CLAR preparativa representativo y patrón de elución de péptido). Diez microlitros de cada fracción que se creía contenía péptido ^ 10 puro fueron mezclados y analizados mediante CLAR. Las fracciones fueron • eliminadas o añadidas hasta que el número máximo de fracciones mostrara un rastro con un solo pico de la pureza deseada.

Análisis de las fracciones recogidas mediante CLAR analítica 15 Columna: Vydac C?84.6 mm x 250 mm, 5 µ, 100 Á Solvente A: 0.1 % TFA / H20 Solvente B: 0.1 % TFA / ACN • Gradiente: 25 - 45% B en 20 minutos Velocidad de flujo: 1.0 mL/min. 20 Datos-Longitud de onda: 215 nm Criterios: colecciones agrupadas > 95% puras (Véase figura 4 para un cromatograma de CLAR preparativa representativo de sal de TFA de péptidos purificada).

Cada lote de sal de TFA de péptidos purificada se congeló en coraza individualmente en un matraz de liofilización Vitris de 1200 mL y se liofilizó hasta la sequedad en un liofilizador Vitris FM25EL. No se recogieron las fracciones laterales de la purificación. • Agrupación de péptido purificado, sal de TFA (MD-Srev. 2) Un total de 9.8 g de péptido puro, sal de TFA se obtuvo a partir de la purificación de 20 g de péptido crudo, un rendimiento de 49%. Todos los 13 lotes fueron preparados para intercambio a la sal de acetato. Como una 10 verificación en proceso, se agruparon juntas muestras de cada lote, 1 mg por cada 417 paños, se disolvieron en 90% de HOAc/agua Milli Q a 5 mg/mL y se analizaron mediante CLAR. La pureza de este "mini grupo" fue de aproximadamente 99%. Cada lote de purificación se disolvió individualmente en 10% de HOAc/WFI. 15 Intercambio de péptidos de sales de trifluoroacetato a acetato en Dowex (MD-21 Rev 0) Un total de 9.8 g de péptido se disolvieron en -500 mL de 10% de HOAc/WFI. Se usó un exceso de aproximadamente tres veces de Dowex 1 20 X 2-100 (1 -resina de intercambio iónico de cloruro) a equivalentes de sitios básicos en el péptido y la cantidad intercambiada se usó para lograr la conversión a la sal de acetato. Un total de 53 g de Dowex se usó para empacar la columna. El Dowex en la columna se lavó secuencialmente con WFl, 1 M de NaOH/WFI, WFl y 25% de ácido acético/WFI antes de cargar el péptido en la columna dedicada. El péptido fue eluido de la columna con tres volúmenes de columna de 10% de HOAc/WFl. La solución de péptido se congeló en coraza en matraces de liofilización Vitris de 1200 mL y se liofilizó • 5 hasta la sequedad en un liofilizador Vitris FM25EL durante aproximadamente 66 horas. El producto se pesó y dio como resultado un rendimiento de 8.2 gramos de sal de acetato de péptido, 91 % de valor teórico.

Empaque y marcado (MD-9 Rev. 2) 10 El producto fue empacado en contenedores de polietileno de # baja densidad con tapas de polipropileno, se cubrió con argón y se selló con película de parafina. Se marcaron dos contenedores de 1 g de acuerdo con RMS 300043 Rev. 0-a. (Véase anexo 2 para información de marcado).

Adecuabilidad del sistema de CLAR Una solución de 0.3 rag/ml, de MPS-38 en ácido acético al 10% se analizó mediante CLAR usando las siguientes condiciones: • Instrumento: Hitachi D-7000 Columna: Vydac Cíe 4.6 mm x 250 mm, 5 µ, 300 ? 20 Solvente A: 0.1 % TFA / H20 Solvente B: 0.1 % TFA / ACN Gradiente: 25 - 50% B en 30 minutos Velocidad de flujo: 1.0 mL/min.

Datos-Longitud de onda: 215 nm Inyección: 20 µL Seis inyecciones replicadas dieron como resultado un área pico A promediode 10267852 ± 8 1840, con un RSD < 1.0%. La pureza fue de 99.4% ± 0.1 %. El tiempo de retención del pico de péptidos fue de 16.7 ± 0.1 minutos. El análisis es lineal de 0.04 a 0.8 rag/mL. Los datos se muestran en el anexo Liberación y transportación del producto 10 El producto fue liberado para su distribución después de que los # registros de lote habían sido revisados y aprobados por QC, y el producto había sido probado y se había encontrado que cumplía con las especificaciones. El péptido fue transportado sobre hielo seco.

Materiales Aminoácidos y resinas Resina Merrifield de N-Boc-L-Valina, N-Boc-L -Arginina (tosilo), • N-Boc-L-Leucina H20, N-Boc-L-Alanina, N-Boc-Glicina, N-Boc-L-Triptófano (formilo), N-Boc-Fenilalanina y N-Boc-L-Prolina. 20 Reactivos y solventes Reactivo Abreviatura Reactivo Abreviatura Diclorometano DCM Anisol Dimetilformamida DMF Éter etílico ET20 Acido trifluoroacético TFA Acido acético HOAc 2-Propanol IPA Argón Ar Diisopropiletilamina DIEA Helio He Diisopropilcarbodiimida DIC Acetonitrilo ACN 1-Hidroxibenzotriazol HOBt Agua MilliQ H2Q Hidrato Nitrógeno N2 Agua para inyección WFl Fluoruro de hidrógeno HF Piperidina EJEMPLO 6 Preparación de PBMC humanas pulsadas con MAGE-3/A2 para inmunización Se ilumina luz UV en el recipiente de flujo durante 15 minutos y después se apaga. Se enciende el recipiente y se limpia el interior con Roccal y después con HTOH al 70%. Se reúnen los reactivos y se colocan en el recipiente (Lymphoprep, DPBS, tubos de 50 ml, tubo de 250 ml, jeringa de 3cc, aguja de 16 g, tubos para conteo de células, azul de tripano, frascos de congelación, heparina, bolsa de desecho roja). Los tubos se marcan (un tubo de 50 ml por 15 ml de sangre; típicamente 6-8 total), frascos de congelación (2) y una jeringa de 3cc con ID del paciente y fecha. Se lavan las manos; se colocan la bata y guantes estériles. Se forman alícuotas de 10 ml de Lymphoprep en cada tubo de 5 50 ml. Se obtiene la muestra de sangre periférica heparinizada que había sido aislada del paciente, y se calcula el volumen. Se añade 1 volumen de sangre a un tubo de 250 ml, y se añade un volumen de 1/100 de heparina estéril (10,000 U/ml de existencia). Se transfiere la sangre periférica heparinizada al tubo que contiene DPBS y se mezcla suavemente. Se coloca en capas 30-35 de sangre heparinizada diluida sobre el Lymphoprep en cada tubo de 50 ml.

• Se centrifuga durante 20 minutos a 1000 rpm, 20°C. Se remueven aproximadamente 80% de la fase superior y se descartan (para eliminar las plaquetas). Se centrifuga durante 20 minutos a 2500 rpm, 20°C (ajuste #5 en Sorvall RT600B). Se remueven las células de la ¡nterfaz, transfiriéndolas a dos tubos de 50 ml nuevos. El volumen se lleva a 45 ml con DPBS en cada tubo, y se resuspenden con pipeta. Se centrifuga 5 minutos a 2000 rpm. Se aspira el • sobrenadante; se resuspenden las pellas en 5 ml de DPBS total, agrupando en un tubo. Las células se cuentan con azul tripano (dilución 40:1 ). El rendimiento epserado es 1-2 x 106 células por ml de sangre. Se apartan 20 x 106 células para la separación de las células CD8 y la congelación, manteniendo 80-100 x 106 células para la vacuna.

Se descongela un tubo de péptidos MAGE-3 o Melan-A (5 ml a 20 µM en DPBS) calentando en incubadora a 37°C. Las células se transfieren a un tubo que contiene péptidos y se mezclan con una pipeta. Se colocan en • una incubadora a 37°C durante una hora; se mezcla mediante inversión a 30 5 minutos. Durante la incubación, se prepara el fraccionado de CD8 y la congelación del alícuota de células guardado. Se remueven las células de la incubadora, y la muestra se irradia con 2000 rads (12.8 minutos). Se mezcla mediante inversión y se centrifuga 5 minutos a 2000 rpm. Se aspira el 10 sobrenadante; se resuspenden la pella en 1 ml de DPBS. Las células se • cuentan con azul tripano y se registra la viabilidad. Se remueven 50µl de suspensión de células finales y de solución de péptidos/DPBS para prueba de esterilidad y prueba de endotoxina. Se toman también 1 ml cada uno del DPBS y el Lymphoprep usados y se 15 trasfieren a tubos de cultivo individuales. Se presentan con la ID del paciente al laboratorio de microbiología para determinar la contaminación. Se lleva a cabo la prueba de endotoxinas y los resultados se registran. • Las células se resuspenden mediante inclinación. Se extrae la muestra en la jeringa de 3cc usando una aguja de 16g; se retira la aguja y se tapa la jeringa. La jeringa se coloca en una bolsa Ziploc marcada con la ID del paciente. La vacuna está lista para inyección subcutánea, usando una aguja de 23g y 5/8 pulgadas.

EJEMPLO 7 Análisis de antígenos de melanoma de muestras de tumor sólido ^^ Obtención de muestras de tumores 5 Se obtienen muestras de tumor en la sala de operaciones, cuarto de radiología o clínica, y se colocan en solución isotónica estéril (PBS o solución salina isotónica) sobre hielo y se llevan directamente al laboratorio. Toda la información acerca de los pacientes (nombre, MR#, sitio del tumor) se escribe en el libro de registro de tumor. 10 • Procesamiento de las muestras de tumor Dependiendo de la cantidad de tumor disponible los inventores intentan hacer: homogenato de guanidina para extraer ARN; se congelan algunos frascos en nitrógeno líquido y se mantiene un registro de éstos en el libro de registro del congelador; se homogeneizan algunos en una solución de hialuronidasa (85 U/ml) y colagenasa (1 U/ml) en DMEM para cultivar líneas de células y posiblemente clones. El tumor se deja en la • hialuronidasa/colagenasa hasta que se separe tanto como sea posible del tumor en una suspensión de células (normalmente se requieren pocas horas).

Si el tumor es demasiado grande se corta en piezas más pequeñas usando instrumentos y técnicas estériles, siempre manteniendo la muestra de tumor en hielo.

Brevemente, para preparar homogenato de guanidina (úsense reactivos libres de ARNasa y manténganse las muestras sobre hielo lo más posible), se pesa el tejido que será homogeneizado en guanidina. Se añade la ^^ solución de guanidina directamente a la muestra. Si la muestra pesa más de 5 50 mg, se añaden 0.5 ce de guanidina. Si la muestra pesa menos de 50 mg, se añaden 3.2 ce de guanidina. La muestra se homogeneiza sobre hielo usando el homogeneizador eléctrico (powergen 125; Fisher). Se usan generadores estériles para cada muestra de tumor separada. Siempre se limpia el homogeneizador con SDS al 1 % y etanol al 70% para cada muestra.

Se homogeneizan las muestras hasta que se haya homogeneizado tanto tumor sólido como sea posible. El homogenato se centrifuga a 3,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se aspira y puede ser almacenado ahora a -70°C para almacenamiento a largo plazo. Brevemente, para la extracción de ARN con cloruro de cesio, se carga cuidadosamente el lisado de guanidina sobre la parte superior de la solución de CsCl. Si la muestra original pesa más de 50 mg, se usan tubos centrífugos ultraclaros de 0.8 ce (Beckman). Nótese que hay 0.5 ce de lisado de guanidina/.17 ce de CsCl. Si la muestra original pesa menos de 50 mg, se usan tubos centrífugos ultraclaros de 5 ml (Beckman) y se usan 3.2 ce de guanidina/1.1 ce de CsCl. Se ultracentrif uga a 35,000 rpm durante 18 horas a 20°C en un rotor SW 50.1 (durante la noche) - aceleración máxima y sin freno. Después de la ultracentrifugación se remueve la mayoría del sobrenadante con pipeta de mano (pellas de ARN en el fondo del tubo y comúnmente no es visible). Se colocan los tubos boca abajo en un soporte adecuado para drenar cualquier líquido restante. Se cortan los tubos ultracentrífugos aproximadamente 0.5-1 cm ^^ desde el fondo dependiendo del tamaño del tubo (se corta el tubo centrífugo 9 5 más pequeño para acortarlo y se voltea el tubo boca arriba. La pella de ARN se disuelve pipeteando agua libre de ARNasa (100 µl) en la copa y transfiriendo a un tubo Eppendorf en hielo, marcado adecuadamente. La copa se enjuaga con 100 µl adicionales de agua libre de ARNasa y se añade al tubo Eppendorf. 10 Se añaden 20 µl de acetato de sodio 3M (NaAc) y 250 µl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se vortexea. Las muestras se mantienen en hielo tantoo como sea posible durante esta parte del procedimiento. El tubo se centrifuga usando un rotor de ángulo fijo (12,000 rpm) durante 5 minutos a 4°C. La fase acuosa se transfiere a un tubo Eppendorf nuevo y se añaden 250 µl de cloroformo. Se mezcla mediante vortexeo. Se centrifuga de nuevo y se remueve la fase acuosa superior a un tubo Eppendorf nuevo. Se añaden 600 µl de etanol absoluto y se mezcla suavemente mediante inversión. Se dejan a -20°C durante 30 minutos. Después se centrifuga durante 15 minutos usando un rotor de ángulo fijo (12,000 rpm) a 4°C. Se descarta el sobrenadante y se añaden 150 µl de etanol al 70%. Se mezcla mediante vortexeo. Se centrifuga de nuevo durante 5 minutos usando un rotor de ángulo fijo (12,000 rpm) a 4"C. Se descarta el sobrenadante y se deja que el ARN se seque dejando al tubo abierto en el recipiente. El ARN se disuelve en 7 µl de agua libre de ARNasa mediante ^t pipeteo cuidadoso. Se cuantifica el rendimiento usando el método de varilla de 5 inmersión en ADN de Invitrogen. Se añade 1 µl de ARNasin a cada muestra. La muestra puede almacenarse a -70°C en esta etapa. Para la remoción del ADN contaminante de la preparación de ARN (usando ADNasa grado amplificación Gibco), se añade lo siguiente a un tubo microcentrífugo pequeño sobre hielo: hasta 1 µg de ARN por µg de 10 ADNasa para depurar la reacción; 1 µl de regulador de pH 10X ADNasa (Gibco); 1 µl de ADNasa grado amplificación (Gibco) y agua libre de ARNasa para llevar el volumen hasta 10 µl. La muestra se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añade 1 µl de EDTA 25mM (Gibco) y se calienta a 65°C en baño 15 de agua durante 10 minutos. La muestra está lista para la síntesis de ADNc.

Síntesis de ADNc Se usa hasta 1 µg de ARN por 20 µl de reacción, si es posible. Se forma una mezcla maestra en un tubo Eppendorf para reacciones de 20 transcriptasa inversa que comprenden: a. 1 µl de dNTP (10 mM; Gibco) por 20 µl de reacción b. 4 µl de 5 x 1er regulador de pH de cadena (Gibco) por 20 µl de reacción c. 2 µl de DTT (0.1 M; Gibco) por 20 µl de reacción d. 1 µl de ARNasin (40U/µl; Promega) por 20 µl de reacción e. 1 µl de transcriptasa inversa (200U/µl; Gibco) por 20 µl de ^^ reacción. 5 En tubos Eppendorf marcados por separado se añade 1 µl de cebador Oligo dT (0.5 µg/µl) y se añaden 10 µl de cada muestra de ARN al tubo marcado adecuadamente. Se añaden 9 µl de mezcla maestra (de arriba) a cada muestra. Se vortexea y se colocan en baño de agua a 37°C durante 1 hora. Se añaden 30 µl de agua estéril a cada muestra después de la 10 incubación y se colocan en un congelador a -20°C en una caja marcada adecuadamente.

Condiciones de PCR™ para determinar la presencia de antíqenos de melanoma (MAGE 1 , MAGE 3, tirosinasa y Melan-A) 15 Se hace una mezcla maestra en un tubo Eppendorf para reacciones de 50 µl añadiendo: a. 1 µl de dNTP (10 mM; Gibco) por reacción b. 5 µl de 10x regulador de pH de PCR (Gibco) por reacción c. 1.5 µl de MgCI2 (50 mM; Gibco) por reacción 20 d. 0.3 µl de Taq ADN polimerasa (Gibco) por reacción Se mezclan las muestras de ADNc, cebadores y mezcla maestra como sigue: a. 7.8 µl de mezcla maestra b. 3 µl de muestra de ADNc c. 2 µl de cada cebador (5' y 3'); total de 4 µl d. 35.2 µl de agua estéril ^^ Se añade una gota de aceite mineral al final. Se corre la PCR™ para todos los cebadores antigénicos usando las mismas condiciones siguientes y 40 ciclos: a. Pre-reposar a 94°C durante 4 minutos. b. Después a 94°C durante 1 minuto. c. Después a 58°C durante 2 minutos. 10 d. Después a 72°C durante 3 minutos. e. Extender a 72°C durante 5 minutos. Las reacciones de PCR™ anidada se hacen usando las mismas condiciones de PCR™ anteriores y durante 40 ciclos. El producto de la reacción de PCR™ primaria se diluye 1 :10 añadiendo 2 µl del producto de 15 PCR™ primaria a 18 µl de agua estéril. Dos µl de esta dilución se usan después para la reacción anidada. Los cebadores son todos reconstituidos en 1 ml de agua estéril a su llegada y después se diluyen a una concentración de aproximadamente 100 µg/ml antes de usar. Los moldes de cebador primarios son como sigue: 20 B-actina (cebador 5') GGCATCGTGATGGACTCCG (SEQ ID NO:11 ); B-actina (cebador 3') GCTGGAAGGTGGACAGCGA (SEQ ID NO:12); MAGE-1 (cebador 5') CGGCCGAAGGAACCTGACCCAG (SEQ ID NO:13); MAGE-1 (cebador 3') GCTCCGACCCTCACTGGGTTGCC (SEQ ^ ID NO:14); 5 MAGE-3 (cebador 5') TGGAGGACCAGAGGCCCCC (SEQ ID NO:15); MAGE-3 (cebador 3') GGACGATTATCAGGAGGCCTGC (SEQ ID NO:16); Tirosinasa (cebador 5') GGATAGCGGATGCCTCTCAAAG (SEQ 10 ID NO:17); Tirosinasa (cebador 3') CCCAAGGAGCCATGACCAGAT (SEQ ID NO:18); Melan-A (cebador 5*) CTGACCCTACAAGATGCCAAGAG (SEQ ID NO:19) y 15 Melan-A (cebador 3') ATCATGCATTGCAACATTTATTGA TGG AG (SEQ ID NO:20). Los moldes de cebador anidados son como sigue: MAGE-1 (cebador 5') CTTCAGGTTTTCAGGGGACAGGCC (SEQ ID NO:21 ); 20 MAGE-1 (cebador 3') CTGTCGAGTGAAGTTGATGGTAGTGG (SEQ ID NO:22); MAGE-3 (cebador 5') TCACATGCTCCCTCTCTCCCAGGCC (SEQ ID NO:23); MAGE-3 (cebador 3') ATCTGATTGTCACCCAGCAGGCCATC (SEQ ID NO:24); Tirosinasa (cebador 5') GCATGCACAATGCCTTGCACATCTATA (SEQ ID NO:25); Tirosinasa (cebador 3') TGTAGTCTTGAAAAGAGTCTGGGTCTG (SEQ ID NO:26); Melan-A (cebador 5') TCTTACACCACGGCTGAAGAGGCC (SEQ ID NO:27) y Melan-A (cebador 3') CCTCACATGATTAGTGCTAGCGGA (SEQ ID NO:28). Todos los productos de PCR™ se corren sobre 1.5% de geles de agarosa con bromuro de etidio. Los tamaños de las bandas de antígenos de tumor para la PCR™ primaria se muestran abajo: Antígeno de tumor ADNc amplificado ADN contaminante B-actina 615 pb 615 pb y 830 pb (débil) Mage-1 421 pb ninguno Mage-3 725 pb 805 pb Tirosinasa 383 pb Melan-A 605 pb Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente pueden ser hechos y ejecutados sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será aparente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de los pasos del método descrito en la presente sin alejarse del concepto, espíritu y • 5 alcance de la invención. En forma más específica, será aparente que los agentes descritos en la presente pueden ser sustiuidos por ciertos agentes que estén relacionados tanto química como fisiológicamente obteniendo los mismos o similares resultados. Todos esos sustitutos y modificaciones similares aparentes para los expertos en la técnica se consideran dentro del 10 espíritu, alcance y concepto de la invención definidos en las reivindicaciones • anexas.

• REFERENCIAS Las siguientes referencias, al grado en el que provean ^ procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a los descritos en la presente, se incorporan específicamente en la presente a manera de referencia. Balch, Houghton, Peters, "Cutaneous Melanoma", en: Cáncer: Principáis and Practice of Oncology", 4ta edición, V.T. DeVita, S. Hellman y S.A. Rosenberg, eds. J.B. Lippincott, Filadelfia, 1612, 1993. 10 Berd, Maguire, McCue, Mastrangelo, "Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumer-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients", J. Clin. Oncol., 8:1858, 1990. Boon, Cerottini, Van den Eynde, Van der Bruggen, Van Peí, "Tumor antigens recognized by T lymphocytes", Ann. Rev. Immunol., 12:337, 15 1994. Boon, Gajewski, Coulie, "From defined human tumor antigens to effective immunization?", Immunol. Today, 16:334, 1995. Brichard, Warnier, Van Peí, Morlighem, Lucas, Boon, "Individual differences in the orientation of the cytolytic T cell responses against mouse 20 tumor P815", Eur. J. Immunol., 25:664, 1995. Brunda, Luistro, Warrier, Wright, Hubbard, Murphy, Wolf, Gately, "Antitumor and antimetastatic activity of interleukin 12 against murine tumors", J. Exp. Med., 178:1223, 1993.

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LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: • (i) SOLICITANTE: Gajewski, Thomas F. Fallarino, Francesca (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMBINACIÓN DE CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTIGENOS PULSADAS CON ANTIGENOS E 10 INTERLEUCINA 12 PARA TERAPIA CONTRA TUMORES Y VIRUS • (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 28 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: 15 (A) DESTINATARIO: Arnold, White & Durkee (B) CALLE: P.O. Box 4433 (C) CIUDAD: Houston • (D) ESTADO: Texas (E) PAÍS: EUA 20 (F) CÓDIGO POSTAL: 77210-4433 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Desconocido en EUA (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Concurrentemente con la presente (C) CLASIFICACIÓN: Desconocida (vii j DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 09/064,964 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Abril 23 de 1998 (v¡¡¡) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: 15 (A) NOMBRE: Wilson, Mark B. (B) NUMERO DE REGISTRO: 37,259 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: ARCD:301 • (ix) INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIONES: 20 (A) TELEFONO: (512)418-3000 (B) TELEFAX: (512)474-7577 »'« ' «¿¿ Omiá* c^eu ,-. (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1 : 10 • Lys Tyr Gln Ala Val Thr Thr Thr Leu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ^ (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: 20 (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2: Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3: TGGAGGACCA GAGGCCCCC 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:4: GGACGATTAT CAGGAGGCCT GC 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico A 10 (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5: CTGACCCTAC AAGATGCCAA GAG 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: • (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6: ATCATGCATT GCAACATTTA TTGATGG 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 10 (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7: GGCATCGTGA TGGACTCCG 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8: GCTGGAAGGT GGACAGCGA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9: Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10: Ala Ala Gly lie Gly He Leu Thr Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11 : GGCATCGTGA TGGACTCCG 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: GCTGGAAGGT GGACAGCGA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13: • CGGCCGAAGG AACCTGACCC AG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14: GCTCCGACCC TCACTGGGTT GCC 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15: • (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 15 (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15: TGGAGGACCA GAGGCCCCC 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16: GGACGATTAT CAGGAGGCCT GC 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17: GGATAGCGGA TGCCTCTCAA AG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18: CCCAAGGAGC CATGACCAGA T 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19: CTGACCCTAC AAGATGCCAA GAG 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ^ (A) LONGITUD: 29 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20: • 1 0 ATCATGCATT GCAACATTTA TTGATGGAG 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases ^ (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21 : CTTCAGGTTT TCAGGGGACA GGCC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A (A) LONGITUD: 26 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22: CTGTCGAGTG AAGTTGATGG TAGTGG 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23: TCACATGCTC CCTCTCTCCC CAGGCC 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: ^ (A) LONGITUD: 26 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24: 10 ATCTGATTGT CACCCAGCAG GCCATC 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25: GCATGCACAA TGCCTTGCAC ATCTATA 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26: TGTAGTCTTG AAAAGAGTCT GGGTCTG 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27: TCTTACACCA CGGCTGAAGA GGCC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28: CCTCACATGA TTAGTGCTAG CGGA 24

Claims (45)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. REIVINDICACIONES • 5 1.- El uso de: a) una composición que comprende IL-12; y b) una composición que comprende células que presentan antígenos pulsadas con péptidos en la fabricación de un primer o segundo medicamento respectivamente, para inducir respuesta inmune en un 10 mamífero. 2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dichas células que presentan antígenos son autólogas.
3. 3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en el que dichas células que presentan antígenos se seleccionan del grupo que 15 consiste en células B activadas por lipopolisacáridos, células de bazo enteras, células dendríticas, fibroblastos y células mononucleares de sangre periférica no fraccionadas.
4. 4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en el que dichas células que presentan antígenos son células mononucleares de 20 sangre periférica no fraccionadas.
5. 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dicho péptido se deriva de un antígeno que se une a moléculas MHC clase I o moléculas MHC clase II.
6. 6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en el que dicho antígeno es antígeno de melanoma.
7. 7.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en el f que dicho antígeno es antígeno de virus. 5
8. 8.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma se selecciona del grupo que consiste en MAGE-1 , MAGE-3, Melan-A, P198, P1A, gp100 y tirosinasa.
9. 9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es MAGE-1. 10
10. 10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es MAGE-3.
11. 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es Melan-A.
12. 12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el 15 que dicho antígeno de melanoma es P198.
13. 13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es P1A.
14. 14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es gp100. 20
15. 15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es tirosinasa.
16. 16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que dicho antígeno de melanoma es una combinación ele antígenos que comprende por lo menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste en MAGE-1 , MAGE-3, Melan-A, P198, P1A, gp100 y tirosinasa.
17. 17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dichas células que presentan antígenos son pulsadas con péptidos en 5 una cantidad de 0.1 µM - 1 mM.
18. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en el que dicha cantidad es 10-50 µM.
19. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dicha respuesta inmune comprende la producción de linfocitos T citolíticos 10 dirigidos contra antígenos que se unen a moléculas MHC clase I o moléculas MHC clase II por dicho mamífero.
20. 20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dicho primer medicamento que comprende la composición de IL-12 se administra al mamífero en una o más dosis y el segundo medicamento que 15 comprende la composición de células que presentan antígenos pulsadas con péptidos se administra al mamífero en una sola dosis.
21. 21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en el que dicha dosis de células que presentan antígenos se provee en una cantidad de 1x106-1x109 0
22. 22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en el que dicha dosis de células que presentan antígenos es de aproximadamente 1x108
23. 23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en el que dicha dosis de IL-12 se administra en una cantidad de 1 ng/kg de peso del cuerpo del mamífero-1000 ng/kg de peso del cuerpo del mamífero.
24. 24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en el que dicha dosis de IL-12 es 30-500 ng/kg de peso del cuerpo del mamífero.
25. 25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero es un humano.
26. 26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero tiene una enfermedad.
27. 27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en el que dicha enfermedad es melanoma.
28. 28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en el que dicha enfermedad es un virus.
29. 29.- El uso de: a) una composición que comprende IL-12,- y b) una composición que comprende células que presentan antígenos pulsadas con péptidos en la fabricación de un primer o segundo medicamento respectivamente, para tratar a un animal con una enfermedad proliferativa o infecciosa.
30. 30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que dicha enfermedad es un melanoma.
31. 31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que dicha enfermedad es una infección viral.
32. 32.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que dichas células que presentan antígenos son autólogas.
33. 33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, en el 0 que dichas células que presentan antígenos se seleccionan del grupo que 5 consiste en células B activadas por lipopolisacáridos, células de bazo enteras, células dendríticas, fibroblastos y células mononucleares de sangre periférica no fraccionadas.
34. 34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 33, en el que dichas células que presentan antígenos son células mononucleares de 10 sangre periférica no fraccionadas.
35. 35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que dicho péptido se deriva de un antígeno que se une a moléculas MHC clase I o moléculas MHC clase II.
36. 36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en el 15 que dicho antígeno es un virus.
37. 37.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en el "^ que dicho antígeno es antígeno de melanoma.
38. 38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en el que dicho antígeno de melanoma se selecciona del grupo que consiste en 20 MAGE-1 , MAGE-3, Melan-A, P198, P1 A, gp100 y tirosinasa.
39. 39.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que dichas células que presentan antígenos son pulsadas con péptidos en una cantidad de 0.1 µM - 1 mM.
40. 40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en el que dicha cantidad es 10-50 µM.
41. 41.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en el que el primer medicamento que comprende la composición de I L-12 y el segundo medicamento que comprende la composición de células que presentan antígenos pulsadas con péptidos se combinan y administran al mamífero en una sola dosis, seguida por dosis múltiples de composición de Ill .
42. 42.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en el que dicha dosis de células que presentan antígenos se provee en una cantidad de 1x106-1x109
43. 43.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 42, en el que dicha dosis de células que presentan antígenos es de aproximadamente 1x108
44. 44.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en el que dicha dosis de IL-12 se administra en una cantidad de 1 ng/kg de peso del cuerpo-1000 ng/kg de peso del cuerpo del mamífero.
45. 45.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 44, en el que dicha dosis de IL-12 es 30-500 ng/kg de peso del cuerpo del mamífero.