JPH11514340A - Ｈａ−２抗原性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、いわゆる副組織適合性抗原と呼ばれているペプチドのアミノ酸配列を初めて開示する。副組織適合性抗原は移植片対宿主病と関連する抗原である。本発明のペプチド及びその誘導体は骨髄移植、臓器移植及び白血病の治療に用いることができる。更に、本発明のペプチド及びその誘導体は、ワクチンや医薬組成物、また、診断試験用のキットに用いることができる。本発明のペプチドは副組織適合性抗原ＨＡ−２より得られ、アミノ酸配列ＹＸＧＥＶＸＶＳＶ（但しＸはロイシン又はイソロイシン残基）を有する。骨髄移植においては、ドナー及びレシピアントのいずれもこのペプチドによる処置を受けることが可能であり、その際、必要に応じてその他のぺプチドと共に用いたり、担体と結合したり、適切な賦形剤および／又は助薬と共に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＡ−２抗原性ペプチド 本発明は、免疫、特に、細胞性免疫の分野に関する。詳細には、臓器、組織、 又は細胞（特に骨髄）の移植の分野、及び移植によって起こる可能性のある免疫 反応に関する。 骨髄移植（bone marrow transplantation，ＢＭＴ）は、例えば、重症の再生 不良性貧血症、白血病、及び免疫不全症の治療において、臨床的に行われている 。 骨髄移植の実施が開始されてまもない頃の症例においては、移植の結果として 、移植片に対する拒絶反応または移植片対宿主病（Graft versus Host Disease ，ＧｖＨＤ）の発症が認められた。現在では、このような効果は主要Ｈ抗原（主 要組織適合性抗原）の存在に起因し、その存在は移植に際して多大な障壁となる ことが明らかとなっている。その後、骨髄提供者（donor、ドナー）と骨髄受容 者（recipient、レシピアント）との間のＨＬＡ（human leukocyte antigen、ヒ ト白血球抗原）抗原の適合を考慮することにより、骨髄移植の成功率を改善でき るとの報告がなされた。現在では、主としてＨＬＡが同一である兄弟または姉妹 、又は血縁者ではないがＨＬＡが適合する人物をドナーとして選択している。し かし、移植前の化学療法及び／又は放射線療法の改良や、プロフィラクシーとし ての強力な免疫抑制剤の使用、並びにより 有効な抗生物質やより高度な骨髄の摘出技術等の技術の改善とともに、ＨＬＡ適 合性の高いドナーを選択しているにもかかわらず、レシピアント（年齢によって も異なる）の約２０〜７０％が、今なお、ＧｖＨＤに罹患しているのが現状であ る。ＧｖＨＤにおいては、ドナーの免疫応答性Ｔ細胞は宿主の組織に対して反応 する。よって、成熟したＴ細胞を除去した骨髄を移植する手法が現行法として屡 々用いられている。しかし、この手法を用いても、移植片に対する拒絶反応、即 ち、移植の失敗を招くと共に、特に白血病において、元来罹患していた疾患の再 発が顕著である。 ドナーとレシピアントの選択は慣例としてＨＬＡの一致に基づいて行われるの で、今日の（特に）ヒト臓器、細胞等の移植における現存する問題点を、主要Ｈ 抗原に起因するとすることは難しい。よって、ＧｖＨＤは、いわゆる‘副’組織 適合性抗原系（ｍＨａｇ）の産物、即ち、主要組織適合性遺伝子複合体（major histocompatibility complex，ＭＨＣ）がコードする以外の組織適合性抗原、の 不均衡によって起こると考えられる。 ｍＨａｇ抗原は、共通遺伝子型系統(congeneic strain)のマウスにおける腫瘍 と皮膚の拒絶反応に関する研究において初めて発見された。４０を越えるｍＨａ ｇ遺伝子座が確認され、ゲノム（genome）に分散して存在することが認められて いるが、数百の遺伝子座の存在が推定される。広く知られて いる副組織適合性抗原の１つはＨＹ抗原である。 数件の報告によると、同一ＨＬＡ遺伝子型に基づくＢＭＴの後にＧｖＨＤを発 症した患者において、抗宿主ｍＨａｇ特異的ＣＴＬ（cytotoxic T lymphocyte、 細胞障害Ｔ細胞）が存在することが証明された（文献１〜７）。本発明者らは、 （僅かながらも）いくつかの抗宿主ｍＨａｇ特異的ＣＴＬの更なる特定を行うべ く、鋭意研究を行った。その結果、重症のＧｖＨＤ患者の末梢血液から宿主ｍＨ ａｇに特異的なＣＴＬクローンが単離された（文献８）。 その後の免疫遺伝学的解析によって、上記のＣＴＬクローンは、５種類の非伴 性ｍＨａｇ抗原（ＨＡ−１、ＨＡ−２、ＨＡ−３、ＨＡ−４、ＨＡ−５）を認識 し、これらの抗原は、通常のＭＨＣ拘束型の認識がなされることが判明した（文 献８）。ｍＨａｇ ＨＡ−３はＨＬＡ−Ａ１の存在下で認識され、また、ｍＨａ ｇ ＨＡ−１、ＨＡ−２、ＨＡ−４及びＨＡ−５の認識にはＨＬＡ−Ａ２の存在 が必要である。遺伝学的分離の研究によって、ｍＨａｇ ＨＡ−１〜ＨＡ−５の ５種類の抗原のそれぞれが、メンデルの法則に従って分離する単一の遺伝子の発 現産物であること、及び、ＨＡ−１とＨＡ−２はＨＬＡ領域によってコードされ ていないこと、が判明した（文献９）。ｍＨａｇ抗原は表現型頻度が互いに異な り、ｍＨａｇ ＨＡ−２は、ＨＬＡ−Ａ２に陽性な健常者の非常に多く（９５％ ）に見うけられる（文献１０）。 組織の違いとｍＨａｇの発現の関係については、本発明者らは、あらゆる組識 に分布するｍＨａｇと、限られた組織にのみ分布するｍＨａｇがあることを知見 した（文献１１）。ｍＨａｇ ＨＡ−２の発現は、胸腺細胞、末梢血リンパ球、 Ｂ細胞及び／又は単球などの造血細胞系の細胞に限られる。更に、骨髄由来の抗 原提示専門細胞（professional antigen presenting cell）、樹状細胞、表皮ラ ンゲルハンス細胞も、ｍＨａｇ ＨＡ−２を発現する（文献１１と１２）。なお 、ｍＨａｇ ＨＡ−２は造血幹細胞でも発現され（文献１３）、 また、クローン原生白血病前駆細胞でも発現され（文献１４）、更に、単離して 間もない骨髄性やリンパ性白血病細胞でも発現される（文献１５）。 ヒトｍＨ抗原系の重要性を実証するために、本発明者らは、ｍＨａｇがヒトと ヒト以外の霊長類の間を結ぶ進化の過程で保存されているかどうかを調べた。具 体的には、ヒト以外の霊長類の細胞にヒトＨＬＡ−Ａ2.1 遺伝子を形質転換した 。それから、ヒト同種ＨＬＡ−Ａ2.1 抗原と４つのｍＨａｇ ＨＬＡ−2.1 拘束 性ＣＴＬクローンを用いて分析を行ったところ、類人猿とサルの標的細胞表面に おいて、類人猿とサルの同種ペプチドとｍＨａｇ ＨＹ、ＨＡ−１及びＨＡ−２ ペプチドが、導入されたヒトＨＬＡ−Ａ2.1 分子の存在下に提示されていること が分かった。更に、これらのペプチドを、形質転換した類人猿の細胞表面に発現 されたＨＬＡ−Ａ2.1 分子から溶離した。その結果、逆相ＨＰＬＣにおいてヒト ＥＢＶ−ＬＣＬ由来のＨＡ−２画分と同じ挙動を示す、ＨＡ−２に陽性の画分が 得られた。このことは、ＨＡ−２ペプチドは、少なくとも３５００万年の間保存 されていることを示している（文献１６）。 ＨＬＡ遺伝子型が同一の骨髄移植（ＢＭＴ）において、ｍＨａｇが急性（グレ ード≧２）ＧｖＨＤの発症率に与える影響を調べるために、観察研究を行った。 十分に特徴付けのなされた５種類のｍＨａｇ抗原ＨＡ−１〜ＨＡ−５に特異的な それぞれのＣＴＬクローンを用いてｍＨａｇ型の検査を行った結果、ｍＨａｇＨ Ａ−１〜ＨＡ−５の不適合とＧｖＨＤの間に有為な相関関係があることが示され た（文献１７）。 本発明者らはヒトｍH抗原を生化学的に特徴づけることを試みた。具体的には 、Rammenseeらが使用に成功した免疫精製法及び生化学的手法を用いてマウスｍH ペプチドをMHC分子より抽出した。実際、酸を用いて処理したMHCクラスI HLA-A2 .1 分子から相対分子量の低い分子（＜ｋD）をHPLCを用いて分離することに成功 した。非伴性のｍＨ抗原HA-2に特異的なCTLクローンに対する感作作用を示す画 分が単離された(文献20)。ｍHag HA-２のペプチドとしての性質を分析するため に2種類の実験を行った。始めに、上記の方法で得られたｍHag含有画分による感 作作用は、プロテアーゼ処理に対して感受性を有することが明らかとなった。即 ち、mHagを含有するHPLC画分をプロナーゼ又はプロティナーゼKと共にインキュ ベートした場合、画分の感作作用は失われた(文献21)。次に、MHCによりコード されるTAP1とTAP２の遺伝子産物は、ｍHagペプチドの細胞表面における提示に必 須であることが判明した。抗原の提示に関連するペプチド輸送遺伝子であるTAP1 とTAP2は、小胞体と共に、細胞質からペプチドを輸送する際に必要である(文献 ２２)。輸送とプロテアソームに関する遺伝子のサブユニットをいずれも欠如し たヒト細胞系の“T2”細胞を用いることにより、ヒトｍH抗原のプロセシング及 び提 示に関する研究が可能となった。本願発明者らは（ラットの）輸送遺伝子の産物 であるTAP１とTAP2はインフルエンザウイルス及び細胞内ｍHタンパク質であるHA -2のそれぞれに由来する抗原ペプチドのプロセッシング及び提示に必要であるこ とを明らかにした（文献２３）。 しかし、本発明以前には、ｍHag系に相当する抗原ペプチドのアミノ酸配列は 同定されておらず、また、このようなペプチドが由来するタンパク質も同定され ていない。本発明者らは、今回始めてｍHag HA-2の一部に相当するペプチドの確 定に成功した。 従って、本発明は副組織適合性抗原ＨＡ−２より得られるアミノ酸配列ＹＸＧ ＥＶＸＶＳＶ（但しＸはロイシン又はイソロイシン残基）を包含するペプチド又 は該ペプチドと同様の免疫学的特性を有する該ペプチドの誘導体であることを特 徴とする、Ｔ細胞のエピトープを構成するペプチドを提供する。 これらのアミノ酸配列を得る方法については、本願実施例に記載している。本 発明に用いられた新規な方法において、最も重要となる工程は精製方法および出 発物質の選択である。従って、このアミノ酸配列を得るための新規な方法も本発 明の一部である。しかしながら、アミノ酸配列が既に同定された以上、当然のこ とながらこの方法を実施しなくとも、当業者にはよく知られているペプチド合成 法を用いて本願ペプチ ドを合成することは容易である。合成ペプチドを得るための方法には慣例の手法 が存在するので、明示された本発明のペプチド以外にも、このペプチドのアナロ グや誘導体も本発明の技術範囲に含まれる。ここで言うアナログ及び／又は誘導 体とは、本発明のペプチドと同じか又は少なくとも類似した特性及び／又は活性 を有する物質を指す。一方、本発明のペプチドアナログのうち、明示された本発 明のペプチドの活性を阻害するアナログもまた、本発明の技術範囲に含まれてお り、本発明の教示を元に完成することができる。従って、上記した誘導体及びア ナログは、本発明のペプチドと長さが等しいか否か、またアゴニストであるかア ンタゴニストであるかに拘わらず、ペプチド様の物質であっても、ペプチドの擬 似物質であっても、本発明の範囲に含まれる。 本発明の好ましい態様の一つは、アミノ酸配列YIGEVLVSVからなるペプチドで あり、細胞中のペプチド含有量が極めて低濃度な状態において、細胞の溶解を融 解を誘発するペプチドである。細胞の融解を誘発する際に高濃度が必要とされる ペプチドは適当ではないという意味ではない。どのようなペプチドが好ましいペ プチドであるかは、ペプチドの使用目的及びペプチドの有するその他の特性に基 づくものであるが、本発明の範囲内ですべての特性を分析することは不可能であ る。 本発明のペプチドとその他の分子は、HA-２陰性のドナー の有する免疫系における寛容状態の誘導に使用され、その結果、移植された臓器 又は骨髄に最終的に残存する抹消血リンパ球は、HA-2陽性のレシピアントの宿主 HA-2物質と反応しなくなる。この方法を用いることにより、GvHDを予防すること ができる。また、HA-２陰性のレシピアントにおいても、基本的には同じ方法で 、寛容状態を誘導することが可能である。この場合、HA-２陽性のドナーから提 供された臓器や骨髄を移植されても、HA-2関連物質に基づく拒絶反応は起こらな い。HA-2ペプチドの機能は、対立遺伝子による拘束を受けないと考えられる。従 って、寛容な状態の誘発はHA-2陰性の個体に限定されるものではない。 寛容誘導のためには、例えば静脈注射により、ごく微量を繰り返し投与するこ とができる。但し、他の投与方法もまた適していることがある。更に他の可能性 は、多量のペプチドを経口投与してもよい。ペプチドは、単独で又は他のペプチ ドと組み合わせて、或いはより大きな分子の一部として、又はいずれか適当な賦 形剤中の担体（carrier）物質と共に投与することができる。 又、本願のペプチド又はその誘導体は、移植を行った患者におけるＧｖＨＤの 予防投与に用いることができる。これはアゴニスト、あるいは原因細胞をブロッ クする拮抗薬として、アジュバントと組み合わせて用いることができる。これは 、サイトカインの投与に付随して、又は付随せずに行われる。 更に、本発明のペプチドは、細胞サブセット、特に造血細胞由来の細胞群の排 除が直接又は間接的に可能な治療薬の調製に用いることができる。これを、白血 病の治療薬について以下の例で具体的に示す。 ａ） ＨＡ−２陽性の骨髄移植レシピアントに、骨髄移植前の調節のための付加 的な処置をする。この処置は、造血細胞上に提示された本発明のペプチド（ＨＡ −２ペプチド）を特異的に認識する薬剤であって、このペプチドを提示している 細胞の排除を誘発する薬剤を、移植の前にレシピアントに投与することを意味す る。この薬剤は、造血細胞由来のすべての残留細胞（白血病細胞）を排除する。 この薬剤は、Ｔ細胞（好ましくは、自己不活性化遺伝子と共に供給される）及び ／又は毒性部分に結合した抗体を含むが、これに限定されるものではない。 ｂ）ＨＡ−２陰性の骨髄移植ドナーは、本発明のペプチド（ＨＡ−２ペプチド） の予防接種を受ける。ＨＡ−２陽性のレシピアントへの骨髄移植をすると、ドナ ーの免疫系は、白血病のレシピアントの、ＨＡ−２ペプチドを提示している残留 または再発性細胞を排除することができる。 ｃ）ＨＡ−２陰性の骨髄を（ＨＡ−２陽性の骨髄を用いても同様である）の移植 を受けた後、再び疾患（即ち、ＨＡ−２陽性の白血病細胞の再発症）にかかって いるＨＡ−２陽性のレシピアントは、再び、造血細胞上に提示されている本発明 のペプチド（ＨＡ−２ペプチド）を特異的に認識して、該ペプチドを提示してい る細胞の排除を誘発する治療薬で治療することができる。ＨＡ−２陽性の骨髄が ＨＡ−２陽性のレシピアントに移植される場合、再発性疾患である時には、それ によって移植された骨髄中のＨＡ−２陽性の細胞まで除去されるとしても全ての ＨＡ−２陽性の細胞を排除することが必須である。なぜならば、そうしなければ 、ＨＡ−２陽性の白血病細胞がレシピアントを死に至らしめるからである。後者 の場合には、もし必要であれば、患者は再移植を受けることができる。 診断への応用は、明らかに本発明の範囲内である。診断への応用としては、Ｈ Ａ−２のタイピング、遺伝子異常等の検出等が挙げられるがこれらに限定される ものではない。 本発明のペプチドの他の治療法への応用としては、たとえばリューマチ性関節 炎のようなＨＡ−２が関連する自己免疫疾患における、ＨＡ−２タンパク質に対 する寛容状態の誘導が含まれる。また、ＨＡ−２が関連する自己免疫疾患に対す るワクチンとして本発明のペプチドを用いることも可能である。 ここに記載したペプチドを用いることにより、ＨＡ−２タンパク質をコードす る遺伝子のスクリーニングに用いられる遺伝子のプローブを調製することができ る。また、このようなプローブは、検出キットに用いることもできる。ここに記 載したペプチドを用いることにより、抗イディオタイプのＢ−細胞及び／又はＴ 細胞、並びに抗体を調製することができる。これらの具体例は全て本開示によっ て実施可能となったものであり、従って、本発明の一部を構成する。 これらの具体例を調製するための技法は全て公知の技術に基づくものである。 前述の治療法への応用として用いられる本発明のペプチド、抗体、及び／又は 分子の投与量の範囲は、通常投与量を増加しながら検討し（dose rising studie s）、その結果に基づいて臨床的に設定する。ペプチドの服用量は、体重１ｋｇ 当 り約 ０．１〜１０００μｇであり、好ましくは体重１ｋｇ当り約 １〜１０μｇ の範囲内で用いられる。 本発明を、以下の実施例においてより詳細に説明する。 実施例 ｍＨａｇに特異的なＣＴＬクローンを試験管内（生体外条件）の実験用のツー ルとして用いることにより、酸を用いた溶出によってＭＨＣ分子から単離された マウスとヒトのｍＨａｇのうちのいくつかは、ＭＨＣ分子によって提示されたペ プチド（文献１３，１４）であることが明らかとなった。さらに、ｍＨａｇの特 徴、即ち、ｍＨａｇペプチドの実際のアミノ酸配列及びこれらのｍＨａｇの起源 となるタンパク質の同定に関しては、これまで報告されたことはなかった。少数 の「特定の明確に定義された」マウスのｍＨａｇ、たとえばＨ−３がコードする β２ミクログロブリン対立遺伝子（文献 １５）及びＨｍｔにより拘束される、 ミトコンドリアがコードする抗原であって、母体から伝達される抗原（文献 １ ６）が特徴付けられているにすぎない。本願では、タンデム質量分析法（tandem mass spectrometry）によるＨＬＡ−Ａ2.1 によって拘束されたｍＨａｇ ＨＡ −２エピトープの同定に関して報告する。 mHag HA−２を単離するために、HA−２を発現するBリンパ球であって、HLA−A 2.1 に陽性のエプスタイン−バール ウイルス（EBV）により形質転換されたBリ ンパ球（EBV−BLCL）から、アフィニティークロマトグラフィーによってHLA−A2 .1 分子を精製した。HLA−A2.1 が結合したペプチドを、酸処理及び１０ｋDろ過 により単離した（文献１４）。得られた 低分子量の分子を逆相高速液体クロマトグラフィー（reverse phase HPLC）にて 分画し、得られたフラクションそれぞれに関して、mHag HA−２感作作用を⁵¹Cr 放出アッセイ（⁵¹Cr release assay）により分析した。⁵¹Cr 放出アッセイは、m Hag HA−２に陰性で且つHLA−A2.1 に陽性であるリンパ芽球様セルラインのT２ 細胞と共に各フラクションをインキュベートすることにより行った。その結果、 画分の１つ（フラクション３３）に関しては、HA−２特異的CTLクローン５H１７ によるT２の細胞融解が確認され、T２を感作していることが分かった（文献１７ ）（図１a）。このフラクション３３をより緩やかなグラジエントを用いて再ク ロマトグラフィーに付した。その結果、フラクション３７及び３８においてHA− ２感作作用が確認された（図１ｂ）。しかし、マイクロキャピラリーHPLC／エレ クトロスプレー イオン化 タンデム 質量分析法(microcapillary HPLC/electros pray ionization tandem mass spectrometry)で調べた結果、フラクション３８ は１００以上の異なったHLA−A2結合性ペプチド（文献１８）を含んでいた。こ れらのペプチドのうちどれがHA−２感作作用を有するのか決定するために、フラ クション３７をオンライン スプリッター（on-line splitter）を用いて分析し （文献１９）、この機能分析によって得られた結果を質量分析データと比較した 。図２ａから、４つの互いに隣接したウェルにおけるフラクションがHA−２感作 作用の単一ピークを示 していることがわかる。これらウェルに存在する多くのペプチドのうち、４つの ペプチド［質量／電荷比（ｍ／ｚ）：６５１、８６９、９７９、１０００］の相 対イオン存在量プロファイル（relative ion abundance profile）が、HA−２特 異的CTL活性の活性プロファイルと対応するものであった。更に、ｍ／ｚが９７ ９のものに関して、衝突活性化解離［collision activated dissociation（ＣＡ Ｄ）］分析を行った結果、２種類の異なったペプチドＹＸＧＥＶＸＶＳＶ及びＳ ＸＤＦＧＴＸＱＶの存在が確認された（図３ａ及び図３ｂ）。式中のXはロイシ ン又はイソロイシン残基であり、本発明に用いた質量分析の条件では、Xを確定 することはできなかった。上記２種のペプチドの合成をそれぞれ行い（但しXと してLとIとの等モル混合物を用いた）各ペプチドの合成ペプチド混合物を得、得 られた混合物に関してHA−２特異的感作CTL活性の分析を行った。ＹＸＧＥＶＸ ＶＳＶのペプチド混合物のみにおいてT２細胞の融解が確認された（文献２０） 。 更にHA−２特異的感作CTL活性を有する天然のペプチドをより詳細に定義する ために、ＹＸＧＥＶＸＶＳＶにおいてXとしてのI及びLの組み合わせが異なる４ つのペプチドＹIＧＥＶIＶＳＶ、ＹIＧＥＶLＶＳＶ、ＹLＧＥＶLＶＳＶ及びＹL ＧＥＶIＶＳＶを合成し、合成したペプチドを上記のBリンパ球より単離された２ 種の画分と共にマイクロキャピラリーHPLCに付して、これらのペプチド及び単離 された画分の共溶出 状態を調べた。ペプチドYIGEVIVSVは単離されたペプチドと共溶出しなかったの で、天然に存在するエピトープではない。それに対し、他の３つのペプチド、YI GEVLVSV、YLGEVLVSV及びYLGEVIVSVは天然より得られたペプチドと共溶出した（ 文献２１）。この３種のペプチドはいずれもT２細胞系を感作し、クローン５H17 によるた細胞融解を引き起こした（図４a）。ペプチドYLGEVLVSV及びYLGEVIVSV は共に実質的に高い濃度（１．５ ｎＭ及び２．２５ ｎＭ）で細胞の５０％を融 解したのに対し、ペプチドYIGEVLVSVは５０％の細胞を融解するために４０ pM必 要だった。いずれの濃度も他の天然に存在するエピトープに対して決定された濃 度（即ち１０ｐM−５０ｎM）の範囲内である（文献１９、２２）。クローン５H1 3は単独に誘導されたCTLであり、パネルセルを用いた分析によると、５H17と同 様にHA-2も認識するが、厳密な抗原認識の特異性においては僅かながら５H17と は異なる（文献１０、２３）。クローン５H13も又、３種のペプチドの変異体を もすべて認識した（図 ４ｂ）。クローン５Ｈ13においては半数の細胞がエピト ープを再構成するために必要なペプチドYIGEVLVSVの濃度は５H17の５倍から１０ 倍であったが、このペプチドは他の２種のペプチドの１００分の１の濃度で感作 作用を有した。このような結果から、厳密な特異性の相違（文献１０、２３）が 存在するにもかかわらず、いずれのHA-2特異的CTLも同一のペプチドよりなるエ ピトープを認識すると いうことが立証される。 これら３つのペプチドの結合性に関する研究の結果、ペプチドYIGEVLVSVがHLA −A2.1 に対して最も高い結合性を示すことが明らかとなった。標準として用い るペプチドをヨード化し、精製したHLA-A2.1 との結合性を見た場合、上記ペプ チドが５０％の結合を阻害する濃度は５．６ ｎMであるのに対し、YLGEVIVSV及 びYLGEVLVSVではそれぞれ、９．５ ｎM及び１５ ｎMであった（図５）。この数 値から、上記３種のペプチドは、現在知られている天然に存在するペプチドとし ては最も高い親和性を有するペプチドであることが明らかである（文献２４）。 しかし、上記３種のペプチド間の結合の親和性の差は高々３倍にすぎない。YIGE VLVSVが、他の２つのペプチドより５０−１００倍低い濃度でクローン ５H17及 び５H13を感作するという事実は、このペプチドがTCRによって最も高い親和性と 共に認識されるので、真のHA-２エピトープである可能性が高い。 DNA及びタンパク質の配列に関するデータベースを検索した結果、YIGEVLVSVの ９個のアミノ酸残基の内、７個と一致するヒト由来の配列が２つ見出された。ペ プチドYYGEVCVSは乏枝神経細胞のミエリン糖タンパク質（文献２５）から誘導さ れ、ペプチド YIGSVLISVは非定型ミオシン IC（文献２６）より誘導される。両 方のヒトペプチドを合成し、その感作作用を試験した。 ミオシンから誘導されたペプチドYIGSVLISVのみがＴ２細胞を感作し、クロー ン５H17及び５Ｈ13により細胞融解を引き起こした。５０％の細胞を融解するた めに必要なペプチド濃度は５〜５０ｎＭであった（文献２７）。ヒト非定型ミオ シンICは、異なるクラスから構成されたミオシン遺伝子の大きなファミリーに属 し（文献２８，２９）、細胞運動・細胞小器官の運搬（文献２８、２９）に関与 することが知られている（文献２８，２９）。 おそらく、すべての細胞は同時にそれぞれのクラスのミオシンを発現しうる。 ある種のミオシンについては、限られた組織にのみ分布していると報告されてい る（文献２６、２９）。データベース検索を行った結果、Acantamoeba castella nii からヒトに及ぶ種々の起源から得られた別個のクラスＩミオシンにおいて、 このペプチドのアミノ酸配列の第１、２、３、５および９番目に位置するＹ、Ｉ 、Ｇ、ＶおよびＶが保存されていることがわかった。とりわけ、ＨＡ−２ペプチ ドの配列は、ミオシンＩＣペプチドの非保存アミノ酸部位において、ミオシンと 異なっている。ヒトクラスＩミオシン遺伝子のうち、クローン化が行われたもの はヒト非定形ミオシンＩＣのみで、このほかに少なくとも２種のクラスＩミオシ ンがヒト由来細胞中に存在するという証拠が挙げられている。従って、人体中に ＹＩＧＥＶＬＶＳＶという配列を含む未知のクラスＩミオシン蛋白が存在する可 能性がある。興味深い ことに、進化の過程において、ＨＡ−２を含むいくつかのｍＨａｇのアミノ酸配 列がヒトとヒト以外の霊長類の間で保存されていることが、現在進行中の研究に 示されている（文献３０）。ｍＨａｇ ＨＡ−２は造血細胞中にのみ生ずるので 、この未知のクラスＩミオシンは、造血細胞に限局して存在するか、あるいは組 織特異的なプロセッシングにより造血細胞中にのみ生ずる。 ｍＨａｇ ＨＡ−２に多型がみられることは興味深い問題である。ＨＬＡ−Ａ2 .1 に陽性の白血球の９５％は、ＨＡ−２を発現する。従って、ドナーとレシピ アントの間でｍＨａｇ ＨＡ−２の型が本質的に違っている場合には、生体内に おいてＨＡ−２特異的ＣＴＬが生ずる。ＨＡ−２の多型は、ＨＡ−２遺伝子内、 或いはこれに隣接した遺伝子内領域での突然変異、或いは抗原プロセッシング系 の多型に基づくものであると説明されうる。 今日までに得られているｍＨａｇに関する情報は極めて乏しい。ｍＨａｇの生 理学的機能についてはいまだ不明であるが、臓器移植一般、特に骨髄移植におけ る重要な役割については否定し難い。ここに本発明者等は、本発明者等の知る限 り始めて、ＧｖＨＤにより生じたＣＴＬにおいて定義されたｍＨａｇのアミノ酸 配列を報告する。ｍＨａｇのアミノ酸配列の利用により、ＧｖＨＤに関連した生 体内におけるＴ−細胞の反応を調節することができる。更に、ｍＨａｇ ＨＡ− ２は、白血病細胞を含む造血系において発現されるので、骨髄移植前に行われれ 白血病の免疫療法に有用と考えられる。 図５．精製ＨＬＡ−Ａ2.1 に対する合成ペプチドの結合ＨＰＬＣにより精製した ペプチドについて、ヨード化したＢ型肝炎コア抗原ペプチドＦＬＰＳＤＹＦＰＳ Ｖと、既報（文献２３）の精製ＨＬＡ−Ａ2.1 との結合阻害能を測定した。図中 、（○）ＹＩＧＥＶＬＶＳＶ；（△）ＹＬＧＥＶＬＶＳＶ；（□）ＹＬＧＥＶＩ ＶＳＶ；（◇）インフルエンザＭ１蛋白抗原 ＧＩＬＧＦＶＦＴＬである。すべ てのデータポイントは、少なくとも２回の独立した実験に基づく結果の平均値で ある。文献 1． Goulmy E，Gratama JW，Blokland E，Zwaan FE，van Rood JJ（1983）A Minor transplantation antiqen detected by MHCrestricted cytotoxic T lymP hocytes during graft-versus-host-disease．Nature 302: 159-161． （移植片対宿主病においてＭＨＣ拘束性細胞障害性Ｔリンパ球によって 検出される副移植抗原） 2． Tsoi M-S，Storb R，Dobbs S，Medill I，Thomas ED(1980)．cell media ted immunity to non-HLA antigens of the host by donor lymphocytes in pat ients with chronic graft-vs-host disease．J．Immunol．125: 2258-2262． （慢性移植片対宿主病患者におけるドナーリンパ球による宿主の非ＨＬ Ａ抗原に対する細胞媒介性免疫） 3． Tsoi M-S，Storb R，Santos E，Thomas ED（1983）Anti-host cytotoxic cells in patients with acute graft-versus-host disease after HLA identi cal marrow grafting．Transplant Proc．15: 1484-1486． （ＨＬＡ適合骨髄移植後の急性移植片対宿主病患者の抗宿主細胞障害性 細胞） （1985）Alloreactive T cell responses between HLA identical siblings．Tr ansplantation 40: 329-333． （ＨＬＡ適合血緑者間の同種反応性Ｔ細胞反応） 5． van Els C，Bakker A，Zwinderman AH，Zwaan FE，van Rood JJ，Goulmy E（1990）Effector mechanisms in GvHD in response to minor Histocompatib ility antigens．I．Absence of correlation with CTLs．Transplantation 50: 62-66． （ＧｖＨＤにおける副組織適合性抗原に対するエフェクターの機構。 Ｉ．ＣＴＬとの相互関係の不在） 6． Irscheck E，Hladik T，Niederwieser D et al（1992）Studies on the mechanism of tolerance or Graft-versus-Host Disease in allogeneic bone m arrow recipients at the level of cytotoxic T cell precursor frequencies ．Blood 79: 1622-1628． （同種異系骨髄移植レシピアントにおける細胞障害性Ｔ細胞前駆体の出 現頻度に基づく寛容状態及び移植片対宿主病に関する研究） S，Ritter M and Huber C（1993）Correlation of minor histocompatibility a ntigen specific cytotoxic T lymphocytes with Graft-versus-Host Disease s tatus and analyses of tissue distribution of their target antigens．Bloo d，81: 2200-2208． （副組織適合性抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球と移植片対宿主病の病態 の相互関係及びその標的抗原の組織分布の分析） 8． Goulmy E．Class-I restricted human cytotoxic T lymphocytes direct ed against transplantation antigens and their possible role in organ tra nsplantation(1985)．Prog，in allergy，vol，36: 44-72． （移植抗原を標的とするクラスＩ抗原拘束性ヒト細胞障害性Ｔリンパ球、 及びその推定される臓器移植における役割） 9． Schreuder GMTH.，Pool J，Blookland E，Van Els C，Bakker A，Van Ro od JJ and Goulmy E．Genetic analysis of human minor Histocompatibility a ntigens demonstrates Mendelian segregation independent from HLA(1993)．I mmunogenetics 38: 98-105． （ヒト副組織適合性抗原の遺伝的分析により、この抗原はＨＬＡとは独立 にメンデル遺伝的分離を行うことが明らかになった。） 10． Van Els C，D'Amaro J，Pool J，Bakker A，van den Elsen PJ，Van Roo d JJ and Goulmy E（1992）Immunogenetics of human minor Histocompatibilit y antigens: their polymorphism and immunodominance．Immunogenetics 35: 1 61-165． （ヒト副組織適合性抗原の免疫遺伝学：その多系現象及び免疫優性） 11． De Bueger M，Bakker A，Van Rood JJ，Van der Woude F and Goulmy E ．(1992).Tissue distribution of human minor Histocompatibility antigen． Ubiquitous versus restricted tissue distribution indicates heterogeneity among human CTLs defined non-MHC antigens．J．Immunology 1992，149: 178 8-1794． （ヒト副組織適合性抗原の組織分布。偏在的な組織分布に対して限定的な 組織分布はヒトＣＴＬによって定義される非ＭＨＣ抗原の不均一性を示す。） 12． Van Lochem EG，Van de Keur M，Mommaas M，de Gast G and Goulmy E ．(1994)．Expression of cytotoxic T cell defined minor Histocompatibili ty antigens on human peripheral blood dendritic cells and skin derived L angerhans cells，manuscript submitted for publication． （細胞障害性Ｔ細胞によって定義される副組織適合性抗原の、ヒト抹消血 液樹枝細胞及び表皮由来ランゲルハンス細胞における発現；刊行物は準備中） 13． Marijt WAF，Veenhof WFJ，Goulmy E，Willemze R，Van Rood JJ and Fa lkenburg JHF(1993).Minor histocompatibility antigen HA-1，-2，-4 and HY specific cytotoxic T cell clones inhibit human hematopoietic progenitor cell growth by a mechanism that is dependent on direct cell-cell contact ．Blood 82: 3778-3785． （副組織適合性抗原ＨＡ−１，−２、−４及びＨＹ特異的細胞障害性Ｔ細 胞クローンによるヒト造血細胞始原細胞の増殖阻害は、直接的な細胞間の接触に 基づくメカニズムによって生じる。） 14． Falkenburg F，Goselink H，van der Harst D，Van Luxemburg-Heijs SA P，Kooy-Winkelaar YMC，Faber LM，de Kroon J，Brand A，Fibbe WE，Willemze R and Goulmy E(1991).Growth inhibition of clonogenic leukemic precursor cells by minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocy tes．J．Exp．Med．174: 27-33． （副組織適合性抗原特異的な細胞障害性Ｔリンパ球によるクローン産生性 白血病細胞前駆体の増殖阻害） 15． van der Harst D，Goulmy E，Falkenburg JHF et al(1994)．Recognitio n of minor histocompatibility antigens on lymphocytic and myeloid leukem ic cells by cytotoxic T-cell clones．Blood 83: 1060-1066． （細胞障害性Ｔ細胞クローンによるリンパ球及び骨髄性白血病細胞上に提 示された副組織適合性抗原の認識） 16． Den Haan J，Pool J，Blokland E，Bontrop R and Goulmy E(1994)．Min or Histocompatibility antigens are conversed between primates．Manuscrip t in preparation． （副組織適合性抗原の霊長類における保存；刊行物は準備中） 17． Goulmy E，Schipper R，Pool J(1994)．Minor histocompatibility anti gen mismatches influence the development of GvHD after HLA genotypically identical bone marrow transplantation．Manuscript subm．for publication ． （同一ＨＬＡ遺伝子型に基づく骨髄移植後のＧｖＨＤ発現に対し、副組織 適合性抗原の不適合が影響を及ぼす。出版のために論文は提出済） G(1990)．Science 249: 283． 248． 20． De Bueger M，Verreck F，Blokland E，Drijfhout J-W，Amons R，Konin g F and Goulmy E(1993)．Isolation of a HLA-A2.1 extracted human minor hi stocompatibility peptide(1993)．Eur．J．Immunol.23: 614-618． （抽出されたヒト副組織適合性ペプチド中からのＨＬＡ−Ａ2.1の単離） 21． Den Haan JJM，Blokland E，Koning F，Drijfhout J-W and Goulmy E(19 94)．Structure analysis of human minor histocompatibility antigens HA-1 and HA-2．Abstract NWO retraite． （ヒト副組織適合性抗原ＨＡ−１及びＨＡ−２の構造解析） 22． Powis SJ，Twonsend RM，Deverson EV et al．(1991)Nature 354: 528． 23． Momburg F，Ortiz-Navarrete V，Neefjes J，Goulmy E，v.d．Wal Y，Sp its H，Powis SJ，Butcher GW，Howard JC，Walden P by the major histocompatibility complex are not essential for antigen pr esentation．Nature 360: 174-177． （主要組織適合性遺伝子複合体によりコードされたプロテアソームのサブ ユニットは抗原の提示に不可欠のものではない。） 24． H.J．Wallny and H-G Rammensee，Nature 343，275(1990)．O. Science 249，283(1990)．M．Sekimata，P．Griem，K．Egawa，H-G．Rammensee ，M．Takiguchi，Int．Immunol．4，301(1992)．L．Franksson，M．Petersson， R．Kiessling，K．Karre，Eur.J．Immunol.，23，2606(1993); 25． M．De Bueger et al．Eur.J.Immunol.23，614(1993); 26． M.E．Kurtz，R.J．Graff，A．Adelman，D．Martin-Morgan，R.E．Click ，J．Immunol．135，2847(1985).H-G Rammensee，P.J．Robinson，A．Grisanti ，M.J．Bevan，Nature 319，502(1986)．B．Perarnau et al.，Nature 346，751 (1990); 27． B．Loveland，C-R．Wang，H．Yonekawa，E．Hermel，K．Fischer Lindah l，Cell，60，971(1990); 28． The HA-2 specific CTL clone 5H17 originate from a female patient who underwent bone marrow transplantation for severe aplastic anaemia．T he pre-transplant conditioning regime consisted of total lymphoid irradiation and cyclophosphamide．The patient was grafted with non-T-cell-depleted bone marrow from her HLA i dentical father．The patient suffered from severe acute GvHD grade III f ollowed by extensive chronic GvHD．The HA-2 specific CTL clone was gener ated from post BMT PBL according to the protocol described earlier．E．G oulmy，in Transplant，Rev.J.Morris and N.L．Tilney，Eds．(Saunders Compa ny 2，29，1988); （ＨＡ−２特異的ＣＴＬクローン５Ｈ１７は、重度の再生不良性貧血の治 療のため骨髄移植を受けた女性患者から得られた細胞である。移植前の処置とし て、全リンパ球に対する放射線照射とシクロホスファミドの投与を行った。ＨＬ Ａの型が一致する彼女の父親から、Ｔ−細胞の除去を行っていない骨髄を患者に 移植した。患者は重度の急性ＧｖＨＤ（グレード：第III度）と共に、それに続 く拡張性の慢性ＧｖＨＤに罹患した。ＨＡ−２特異的なＣＴＬクローンが、既報 のプロトコールに従いＢＭＴ前のＰＢＬから産生された。） 29． Data not Shown;（データは記載されていない。） 30． A.L．Cox et al.，Science 264，716 (1994)； 31． Peptide mixtures YSGEVXVSV and SXDFGTXQV were tested in several c oncentrations against clone 5H17 and clone 5H13.In addition to T2，an HA -2 negative HLA-A2.1 positive EBV-BLCL was used to present the peptid em ixture; （複数の濃度の、ＹＳＧＥＶＸＶＳＶとＳＸＤＦＧＴＸＱＶからなるペプ チド混合物を、クローン５Ｈ１７及びクローン５Ｈ１３に対して試験した。Ｔ２ の他に、ＨＡ−２陰性であるＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＥＢＶ−ＢＬＣＬがペプチド 混合物の提示に用いられた。） 32． Data not shown;（データは記載されていない。） 33． K．Udake，T.J．Tsomides，H.N．Eisen，cell 69，989(1992).R.A．Hend erson et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，90，10275(1993)．O．Mandelboim et al.，Nature，369，67(1994)，A．Uenaka et al.，J．Exp．Med.，180，1599(19 94); 34． 5H13 and 5H17 demonstrated identical patterns when analyzed aqain st 100 healthy unrelated HLA-A2.1 positive individuals．Adiscriminatory reaction pattern between the clones was noted when a target cell was ana lyzed expressing a natural HLA-A2 variant molecule; （５Ｈ１３及び５Ｈ１７を、１００人の健康な血縁関係のないＨＬＡ−Ａ ２陽性の被験者に対して分析したところ、５Ｈ１３と５Ｈ１７は同一のパターン を示した。５Ｈ１３と５Ｈ１７において異なる反応パターンは、自然に変異した ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞をターゲットとして用いた場合に見られた。) 35． Y．Chen et al.，J．Immunol.，152，2874(1994)．J．Ruppert et al.， Cell，74，829 (1993); 36． 37． W.M．Bement，T．Hasson，J.A．Wirth，R.E．Cheney，M.S．Mooseker，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，91，6549(1994); 38． Peptide YYGEVCVSV was tested in a concentration rang of 50 nM to 0.5 pM against 5H17 as well as 5H13．No activity was found; （ペプチドＹＹＧＥＶＣＶＳＶを５０ｎＭから０．５ｐＭの範囲内で５Ｈ １７及び５Ｈ１３に対して試験したところ、活性は検出されなかった。） 39． M.A．Titus，Curr．Opin．Cell Biol.，5，77(1993)．E．Coudrier，A． Durrbach，D．Louvard，FEBS，307，87(1992); 40． M．Mooseker，Curr．Biol.，3，245(1993); 41． J.M.M．den Haan，J．Pool，E．Blokland，R．Bontrop，E．Goulmy，man uscript in preparation．（刊行物は準備中）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/725 14/725 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ホウルメイ，エルス アー．イェー．エ ム. オランダ国、エヌエル−2343 ベーセー ウーフストヘースト、ブリードルプラーン ２ (72)発明者 ハント，ドナルド エフ. アメリカ合衆国、バージニア州 22901、 シャーロッツビル、オールド バラード ロード 970 (72)発明者 エンジェルハード，ビクター エイチ. アメリカ合衆国、バージニア州 22901、 シャーロッツビル、オールド バラード ロード 1401

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．副組織適合性抗原ＨＡ−２より得られるアミノ酸配列ＹＸＧＥＶＸＶＳＶ（ 但しＸはロイシン又はイソロイシン残基）を包含するペプチド又は該ペプチドと 同様の免疫学的特性を有する該ペプチドの誘導体であることを特徴とする、Ｔ細 胞のエピトープを構成するペプチド。 ２．副組織適合性抗原ＨＡ−２より得られるアミノ酸配列ＹＸＧＥＶＸＶＳＶ（ 但しＸはロイシン又はイソロイシン残基）を包含するペプチド又は該ペプチドの 誘導体であることを特徴とする、免疫原であるポリペプチド。 ３．アミノ酸配列ＹＩＧＥＶＬＶＳＶを包含することを特徴とする、請求項１又 は２に記載のペプチド又はポリペプチド。 ４．アミノ酸配列ＹＩＧＥＶＬＶＳＶ又はＹＬＧＥＶＩＶＳＶを包含することを 特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド又はポリペプチド。 ５．請求項１〜４のいずれかに記載のエピトープ又はポリペプチドを包含するこ とを特徴とするワクチン。 ５．請求項１〜４のいずれかに記載のエピトープ又はポリペプチドを包含するこ とを特徴とする医薬組成物。 ６．医薬として使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の エピトープ又はポリペプチド。 ７．拒絶反応及び／又は移植片対宿主病の予防を目的として、移植に対して寛容 な状態を誘発するための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の エピトープ又はポリペプチドの使用。 ８．請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを、HLAクラスI抗原の存在下に提 示している一群の（腫瘍性）造血細胞を排除するための方法であって、ＨＬＡク ラスＩ抗原の存在下に該ペプチドを特異的に認識することによって該排除を直接 的又は間接的に誘発することを特徴とする、造血細胞を排除するための方法。 ９．該ペプチドを認識するT細胞の活性に対するアンタゴニストであることを特 徴とする、請求項１に記載のペプチドのアナログ。 １０．請求項１又は２に記載のペプチド又はポリペプチドを用いて哺乳類を免疫 することを包含する、抗体、Ｔ細胞受容体、抗イディオタイプ のB−細胞又はＴ 細胞を誘発するための方法。 １１．請求項９に記載の方法によって得られる抗体、Ｔ細胞受容体、B−細胞又 はＴ細胞。