DE69635856T2

DE69635856T2 - Antigenische ha-2 peptide

Info

Publication number: DE69635856T2
Application number: DE69635856T
Authority: DE
Inventors: A. Els GOULMY; F. Donald Charlottesville HUNT; H. Victor Charlottesville ENGELHARD
Original assignee: Universiteit Leiden; University of Virginia UVA; University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: Universiteit Leiden; University of Virginia UVA; University of Virginia Patent Foundation
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-04-25
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2016-04-26
Also published as: EP0840750B1; DK0840750T3; AU716907B2; EP0840750A1; PT840750E; DE69635856D1; ES2259181T3; ATE318842T1; WO1997005169A1; AU5409996A; JPH11514340A; CA2224909A1; NZ305959A

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere der Zellimmunologie. Sie betrifft insbesondere den Bereich der Transplantation von Organen, Geweben oder Zellen (insbesondere Knochenmark) und mögliche Immunreaktionen, die durch Transplantationen verursacht werden.
Die Knochenmarktransplantation (BMT) findet ihre klinische Anwendung bei der Behandlung z.B. von schwerer aplastischer Anämie, Leukämie und Immundefiziterkrankung.
Anfangs führten viele dieser Transplantationen zur Abstoßung des Transplantats oder zur Transplantat-Wirt-Reaktion (Graft versus Host Disease; GvHD). Es ist heutzutage klar, dass diese Wirkungen größtenteils auf Grund der Gegenwart von Haupt-H-Antigenen vorliegen, die als Haupttransplantationsschranke wirken. Demzufolge wurde über einen verbesserten Erfolg bei einer Knochenmarktransplantation berichtet, wenn die Übereinstimmung der HLA-Antigene berücksichtigt wurde. Heutzutage werden hauptsächlich HLA-identische Geschwister oder in HLA übereinstimmende nicht verwandte Individuen als Quelle für das Spendermaterial verwendet. Trotz der Verbesserungen in der HLA-Übereinstimmung sowie Verbesserungen in der Vortransplantationschemotherapie und/oder – strahlentherapie und der Verwendung von leistungsstarken immunsuppressiven Arzneimitteln als Prophylaxe sowie besseren Antibiotika und besseren Isolationstechniken für das Spendermaterial leiden immer noch etwa 20-70% (je nach deren Alter) der Empfänger an GvHD. Bei GvHD reagieren immunkompetente Spender-T-Zellen gegen das Wirtsgewebe. deshalb wurde die Spende von Knochenmarkszellen, von welchen die reifen T-Zellen entfernt worden waren, zu einer häufig verwendeten Kur. Jedoch führt dies häufig zu einer Transplantatabstoßung oder einem Transplantatversagen sowie zum erneuten Auftreten der ursprünglichen Erkrankung, was besonders bei Leukämie dramatisch ist.
Die Probleme, die immer noch (insbesondere) mit Humantransplantation verbunden sind, können kaum den Haupt-H-Antigenen zugeschrieben werden, da der Spender und der Empfänger routinemäßig auf HLA-Identität überprüft werden. Deshalb kann GvHD durch das Missverhältnis der Produkte der so genannten „Neben"-H-Systeme (mHag), d.h. anderen Histokompatibilitätsantigenen, als diejenigen, die durch den MHC kodiert werden, verursacht werden.
mHags wurden ursprünglich in Untersuchungen der Tumor- und Hautabstoßung zwischen gleichartigen Mäusestämmen entdeckt. Über 40 mHag-Orte wurden verteilt über das Genom definiert, jedoch sagen Bestimmungen die Gegenwart von mehreren Hundert Orten voraus. Eines der besser bekannten Neben-H-Antigene ist das HY-Antigen.
Etliche Berichte zeigten die Gegenwart von Anti-Wirt-mHag-spezifischem CTL in Patienten, die nach HLA-genotypisch identischem BMT an GvHD leiden (1-7). In unserem Labor wurde der Hauptteil der Bemühungen auf die weitere Charakterisierung einer (kleinen) Anzahl an Anti-Wirt-mHag-spezifischen CTLs verwandt. Bisher wurden für Wirt-mHag spezifische CTL-Klone vom peripheren Blut (PBL) von an schwerer GvHD leidenden Patienten isoliert (8).
Anschließende immunogetische Analysen zeigten, dass die CTL-Klone (wie vorstehend beschrieben) fünf nicht geschlechtsverbundene mHags, bezeichnet als HA-1-, -2, -3, -4, -5, identifizierten, die in klassischer MHC-beschränkter Weise erkannt werden (8). mHag HA-3 wird in Gegenwart von HLA-A1 erkannt, und mHag HA-1, -2, -4 und -5 erfordern die Gegenwart von HLA-A2. Segregations untersuchungen zeigten, dass jedes von mHag HA-1 bis HA-5 das Produkt einer einzelnen Gensegregation in Mendel'scher Weise ist und dass HA-1 und HA-2 in der HLA-Region nicht kodiert sind (9). Die mHags unterscheiden sich voneinander in Phenotyphäufigkeiten; mHag HA2 kam in der HLA-A2-positiven gesunden Bevölkerung sehr häufig (d.h. zu 95%) vor (10).
Im Hinblick auf die auf verschiedenen Geweben exprimierten mHags beobachteten wir allgegenwärtige gegen beschränkte Gewebeverteilung der analysierten mHags (11). Die Expression des mHag HA-2 ist auf die Zellen der hämatopoietischen Zellabstammungslinie wie Thymozyten, peripheren Blutlymphozyten, B-Zellen und/oder Monozyten beschränkt. Auch exprimieren die von Knochenmarkzellen abgeleiteten professionellen Antigen-darreichenden Zellen; die dendritischen Zellen und die epidermalen Langerhans-Zellen das mHag HA-2 (11, 12). Das mHag HA-2 wird auch auf hämatopoietischen Stammzellen (13), auf klonogenen leukämischen Vorläuferzellen (14) sowie auf frisch isolierten myeloiden und lymphoiden leukämischen Zellen (15) exprimiert.
Zum Bekräftigen der Wichtigkeit der Human-mH-antigenen Systeme untersuchten wir, ob die mHags in der Evolution zwischen menschlichen oder nicht menschlichen Primaten bewahrt werden. Deshalb wurden Zellen von nicht menschlichen Primaten mit dem humanen HLA-A2.1-Gen transfiziert. Anschließende Analysen mit unserem menschlichen Allo-HLA-A2.1 und vier auf mHags HLA-2.1 beschränkten CTL-Klonen zeigten die Darbietung von Menschenaffen- und Affen-Allo und MHag-HY-, -HA-1- und -HA-2-Peptiden im Zusammenhang mit dem transfizierten Human-HLA-A2.1-Molekül durch Menschenaffen- und Affen-Zielzellen. Weiterhin wurden Peptide von HLA-A2.1-Molekülen, die auf den transfizierten Affenzellen exprimiert wurden, eluiert. Eine HA-2-positive Fraktion wurde identifiziert, die dasselbe Verhalten auf Umkehrphasen-HPLC zeigte, wie die HA-2-Fraktion, die von Human-EBV-LCL abgeleitet wurde. Dies legt nahe, dass das HA-2-Peptid für eine Dauer von mindestens 35 Millionen Jahren bewahrt wird (16).
Eine vorausblickende Studie wurde durchgeführt, um die Wirkung von mHag- genotypisch identischer BMT auf das Vorkommen von akuter (Grad ≥ 2) GvHD zu dokumentieren. Die Ergebnisse des mHag-Typisierens unter Verwendung der CTL-Klone, die für fünf gut definierte MHags HA-1 bis HA-5 spezifisch sind zeigte einen deutlichen Zusammenhang zwischen mHag HA-1-, -2-, -4- und -5-Fehlübereinstimmung und GvHD (17).
Wir planten die biochemische Charakterisierung von Human-mH-Antigenen. Dazu verwendeten wir die Immunreinigung und biochemischen Techniken, die von Rammensee und seinen Kollegen erfolgreich angewandt wurden (18, 19), um Mäuse-mH-Peptide von MHC-Molekülen zu extrahieren. Tatsächlich erschien die HPLC-Abtrennung von kleinen Mr-Molekülen (< kD), die von mit Säure behandelten MHC-Klasse-1-HLA-A2.1-Molekülen erhalten wurden, erfolgreich. Fraktionen mit einer sensibilisierenden Aktivität für die nicht geschlechtsverwandten mH-Antigen-HA-2-spezifischen CTL-Klone wurden isoliert (20). Zum Analysieren der peptidischen natur des mHag HA-2 wurden zwei Versuchssätze durchgeführt. Erstens ist die sensibilisierende Aktivität der wie vorstehend erhaltenen mHag-haltigen Fraktionen für eine Proteasebehandlung empfindlich, d.h. eine Inkubation dieser mHag-haltigen HPLC-Fraktionen mit Pronase oder Proteinase K beseitigte die sensibilisierende Aktivität (21). Zweitens sind die MHC-kodierten TAP1- und TAP2-Genprodukte für die mHag-Peptiddarreichung auf der Zelloberfläche erforderlich. Die Transportergene Tap1 und TAP2, die mit der Antigen-Darreichung verbunden sind, sind zur Abgabe von Peptiden von dem Cytosol mit dem endoplasmatischen Retikulum (22) erforderlich. Die Verfügbarkeit einer menschlichen Zelllinie („T2"), welcher es sowohl an Transport- als auch an Proteasomuntereinheitsgenen mangelt, ermöglichte es uns, die Verarbeitung und Darreichung von Human-mH-Antigenen zu untersuchen. Wir zeigten, dass die (Ratten-) Transportgenprodukte TAP1 und TAP2 zum Verarbeiten und Darreichen von antigenen Peptiden vom Grippevirus und vom intrazellulären mH-Protein HA-2 erforderlich waren (23).
Jedoch gelang bis zur vorliegenden Erfindung niemandem die Identifizierung von Aminosäuresequenzen von (10) antigenen Peptiden, noch gelang jemandem die Identifizierung der Proteine, von welchen sie abgeleitet werden. Wir identifizierten nun erstmals ein Peptid, das ein relevanter Teil von mHag HA-2 ist.
Folglich stellt diese Erfindung ein (Poly)Peptid bereit, umfassend ein T-Zellepitop, das aus dem Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-2 erhältlich ist und die Sequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Der Weg, auf welchem die Sequenzen erhalten werden, ist im Experimentalteil beschrieben. Ein wichtiger Teil dieses neuen Verfahrens zum Gelangen zu diesen Sequenzen ist die Reinigung und die Auswahl des Ausgangsmaterials. Das neue Verfahren ist deshalb ebenfalls Teil des Umfangs dieser Erfindung. Da jedoch die Sequenz nun bekannt ist, ist es natürlich nicht mehr nötig, diesem Verfahren zu folgen, da die Peptide wie auf dem Fachgebiet bekannt leicht synthetisch hergestellt werden können. Da Routinetechniken zum Herstellen von synthetischen Peptiden verfügbar sind, liegt es auch im Fachwissen, zu Analoga oder Derivaten der explizit beschriebenen Peptide zu gelangen, wobei die Analoga und/oder Derivate dieselbe/n oder zumindest ähnliche Eigenschaften und/oder Aktivität aufweisen können. Andererseits liegen auch Analoga, die der Aktivität der explizit beschriebenen Peptide entgegenwirken, im Fachwissen, das durch die Lehren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid mit der Sequenz YIGEVLVSV, das die Lyse der Zelle induziert, indem sie es mit sehr geringer Konzentration des vorliegenden Peptids darreicht. Dies setzt nicht voraus, dass Peptide, die die Lyse mit höheren Konzentrationen induzieren, nicht geeignet sind. Dies hängt größtenteils von der Anwendung und anderen Eigenschaften der Peptide ab, die im Umfang der vorliegenden Erfindung nicht alle getestet werden konnten.
Die erfindungsgemäßen Peptide und anderen Moleküle finden ihre Nützlichkeit darin, dass sie zum Induzieren der Toleranz des Spenderimmunsystems in HA-2-negativen Spendern verwendet werden können, sodass restliche periphere Blutlymphozyten im letztendlich transplantierten Organ oder Knochenmark, wie es vorkommen kann, auf das Wirt-HA-2-Material in einem HA-2-positiven Empfänger nicht anspricht. Auf diese Weise kann GvHD vermieden werden. Andererseits kann die Toleranz in HA-2-negativen Empfängern grundsätzlich in derselben Weise induziert werden, sodass nach dem Empfang eines Organs oder von Knochenmark von einem HA-2-positiven Spender keine Abstoßung auf der Basis des HA-2-Materials stattfindet. Es kann der Fall sein, dass das HA-2-Peptid in einer nicht-allelischen beschränkten Weise wirkt. In diesem Fall ist die Toleranzinduktion auf HA-2-negative Individuen nicht beschränkt.
Für die Toleranzinduktion können wiederholt sehr kleine Dosen, z.B. intravenös verabreicht werden, jedoch können auch andere Verabreichungswege sehr gut geeignet sein. Eine andere Möglichkeit ist die wiederholte orale Verabreichung von hohen Dosen der Peptide. Die Peptide können allein oder in Kombination mit anderen Peptiden oder als Teil von größeren Molekülen oder gekoppelt an Trägermaterialien in beliebigen geeigneten Exzipienten verabreicht werden.
Weitere Anwendungen des Peptids oder der Derivate davon liegen in der prophylaktischen Verabreichung derartiges an transplantierte Individuen zum Verhindern von GvHD. Dies kann entweder mit Agonisten, möglicherweise in Kombination mit einem Hilfsstoff, oder mit Antagonisten, die die verantwortlichen Zellen blockieren können, durchgeführt werden. Dies kann mit oder ohne die gleichzeitige Verabreichung von Cytokinen durchgeführt werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide zum herstellen von therapeutischen Mitteln verwendet werden, die eine Teilmenge an Zellen, insbesondere Zellen hämatopoietischen Ursprungs direkt oder indirekt eliminieren können. Dies kann durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die mit Leukämie verbundene therapeutische Mittel betreffen.

a) Ein HA-2-positiver Empfänger (in einer Knochenmarktransplantation) kann einer zusätzlichen Vor-Knochenmarktransplantat-Konditionierungskur unterzogen werden. Dies bedeutet, dass ein Mittel, das ein erfindungsgemäßes Peptid (ein HA-2-Peptid), wie auf hämatopoietischen Zellen dargereicht, spezifisch erkennt, wobei das Mittel die Eliminierung der das Peptid darreichenden Zellen induziert, dem Empfänger vor der Transplantation verabreicht wird. Dieses Mittel eliminiert alle restlichen Zellen (leukämische Zellen) hämatopoietischen Ursprungs. Ein derartiges Mittel schließt T-Zellen (vorzugsweise versehen mit einem Suizid-Gen) und/oder an toxische Einheiten gekoppelte Antikörper ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
b) Ein HA-2-negativer Spender für eine Knochenmarktransplantation kann mit einem erfindungsgemäßen Peptid, einem HA-2-Peptid beimpft werden. Nach der Transplantation in einen HA-2-positiven Patienten kann das Immunsystem des Spenders jegliche restliche oder erneut auftretende das HA-2-Peptid darreichende Zellen im Empfänger, die natürlich leukämisch sind, eliminieren.
c) Ein transplantierter HA-2-positiver Empfänger, welchem ein HA-2-negatives (oder für diese Sache HA-2-positiven) Knochenmark transplantiert wurde und der an einer erneut auftretenden Erkrankung (Rückfall), d.h. HA-2-positiven leukämischen Zellen leidet, kann (nochmals) mit einem Mittel, das ein erfindungsgemäßes Peptid (ein HA-2-Peptid), wie auf hämatopoietischen Zellen dargereicht, behandelt werden, wobei das Mittel die Eliminierung der das Peptid darreichenden Zellen induziert. In dem Falle, in welchem HA-2-positives Knochenmark in einen HA-2-positiven Empfänger transplantiert wird, ist es auch dann immer noch wichtig (im Falle einer erneut auftretenden Erkrankung), alle HA-2-positiven Zellen zu eliminieren, wenn dies das transplantierte Material einschließt, da die HA-2-positive Leukämie den Empfänger sonst tötet. Im letzteren Fall kann der Patient gegebenenfalls erneut transplantiert werden.

Diagnostische Anwendungen liegen deutlich im Fachkönnen. Sie schließen das HA-2-Typisieren, den Nachweis von genetischen Anomalien und dergleichen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Andere therapeutische Anwendungen des Peptids schließen die Induktion von Toleranz für HA-2-Proteine in mit HA-2 verbundenen (Auto)Immunerkrankungen wie möglicherweise bei rheumatoider Arthritis ein. Andererseits können sie in Impfstoffen bei mit HA-2 verbundenen (Auto)Immunerkrankungen verwendet werden.
Auf der Basis des hier beschriebenen Peptids können genetische Sonden hergestellt werden, die zum Durchmustern auf das das Protein kodierende Gen verwendet werden können. Andererseits können derartige Sonden auch in Nachweiskits nützlich sein. Auf der Basis des hier beschriebenen Peptids können antiidiotypische B-Zellen und/oder T-Zellen und Antikörper hergestellt werden. Alle diese Ausführungsformen wurden durch die vorliegende Offenbarung ermöglicht und sind deshalb Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Techniken zur Herstellung dieser Ausführungsformen liegen alle im Fachkönnen.
Dosisbereiche der Peptide und Antikörper und/oder anderer Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, die in den wie hier vorstehend beschriebenen therapeutischen Anwendungen zu verwenden sind, werden gewöhnlich auf der Basis von klinischen Erhöhungsstudien entwickelt. Die Dosen für Peptide können zwischen etwa 0,1 und 1000 μg pro kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 10 μg pro kg Körpergewicht liegen.
Die Erfindung wird nun in stärker erläuterndem Detail im folgenden Experimentalteil beschrieben.
EXPERIMENTALTEIL
Unter Verwendung von mHag-spezifischen CTL-Klonen wie in-vitro-Hilfsmitteln wurden einige Mäuse- und Human-mHags von MHC-Molekülen durch Säureelution isoliert und wurden als Peptide gezeigt, die durch MHC-Moleküle dargereicht werden (13, 14). Über eine weitere Charakterisierung, d.h. die exakte Aminosäuresequenz der mHag-Peptide und die Identifikation der Proteine, von welchen diese mHags stammen, wurde bisher nicht berichtet. Nur eine kleine Anzahl an „nicht konventionell definierten" Mäuse-mHags, wie dieH-3-kodierten β2-Mikroglobulin-Allele (15) und das Hmt-beschränkte Mitochondrien-kodierte von der Mutterseite her übertragene Antigen (16) wurden charakterisiert. Hier berichten wir über die Identifikation durch Tandem-Massenspektrometrie des HLA-A2.1-bewschränkten mHag-HA-2-Epitops.
Zum Isolieren des mHag-HA-2 wurden HLA-A2.1-Moleküle durch Affinitätschromatographie von durch den HLA-A2.1-positiven Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierten B-Lymphozyten (EBV-BLCL), die HA-2 exprimieren, gereinigt. Die an HLA-A2.1 gebundenen Peptide wurden durch Säurebehandlung, gefolgt von 10kD-Infiltration (14) isoliert. Diese Moleküle mit niedriger Molekülmasse wurden durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert, und einzelne Fraktionen wurden auf mHag-HA-2-sensibilisierende Aktivität durch Inkubation mit der mHag-HA-2-negativen, HLA-A2.1-positiven Lymphoblastoid-Zelllinie T2 in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest analysiert. Eine Fraktion (Fraktion 33) sensibilisierte T2 für Lyse durch den HA-2-spezifischen Klon 5H17 (17) (1a). Als diese Fraktion unter Verwendung eines flacheren Gradienten erneut chromatografiert wurde, wurde eine HA-2-sensibilisierende Aktivität in den Fraktionen 37 und 38 beobachtet (1b). Als jedoch unter Verwendung von Mikrokapillar-HPLC/Elektrosprühionisierungs-Tandem-Massenspektrometrie getestet wurde, enthielten die letzteren Fraktionen immer noch über 100 verschiedene HLA-A2-Bindungspeptide (18). Zum Bestimmen, welches der Peptide für die HLA-2-sensibilisierende Aktivität verantwortlich war, wurde Fraktion 37 unter Verwendung einer betriebsinternen Spaltvorrichtung (19) analysier, wodurch der Vergleich der massenspektrometrischen Daten mit Ergebnissen des funktionellen Tests ermöglicht wurde. 2a zeigt einen einzelnen Peak von HA-2 sensibilisierender Aktivität in vier benachbarten Mulden. Unter den vielen in diesen Mulden vorliegenden Peptiden stimmte das relative Ionenhäufigkeitsprofil von vier Peptiden (mit Masse-zu-Ladungs-Verhältnissen (m/z von 651, 869, 979, 1000) mit dem Aktivitätsprofil der HA-2-spezifischen CTL-Aktivität überein. Eine stoßaktivierte Dissoziations(CAD)-Analyse, die für die Spezies mit einem m/z von 979 durchgeführt wurde, zeigte die Gegenwart von 2 verschiedenen Peptiden, YXGEVXVSV und SXDFGTXQV (3a und 3b). X steht für L oder I, die durch Massenspektrometrie unter diesen Bedingungen nicht unterschieden werden konnten. Synthetische Peptidgemische wurden mit einem äquimolaren Gemisch von L und I anstellen von X hergestellt und auf HA-2-spezifische sensibilisierende CTL-Aktivität getestet. Nur eine Inkubation mit dem Peptidgemisch YXGEVXVSV führte zu einer Lyse von T2 (20).
Zum weiteren Definieren des natürlichen verarbeiteten Peptids wurden vier einzelne Peptide mit I oder L an den Positionen zwei und sechs synthetisiert, und Mikrokapillar-HPLC-Coelutionsstrudien dieser synthetischen Peptide und der isolierten Fraktion wurden durchgeführt. Das Peptid YIGEVIVSV coeluierte nicht mit dem natürlich verarbeiteten Peptid und kann deshalb als das natürlich verarbeitete Epitop ausgeschlossen werden, wohingegen die anderen drei Peptide, YIGEVLVSV, YLGEVLVSV und YLGEVIVSV coeluierten (21). Diese drei Peptide sensibilisierten alle die T2-Zellinie für die Lyse durch Klon 5H17 ( 4a). peptid YIGEVLVSV induzierte eine 50%ige Lyse bei einer Konzentration von 40 pM, wohingegen diese Konzentrationen für die Peptide YLGEVLVSV und YLGEVIVSV deutlich höher waren (1,5 nM und 2,25 nM). Alle drei Konzentrationen liegen im Bereich von 10 pM – 50 nM, der für andere natürlich verarbeitete Epitope etabliert ist (19, 22). Klon 5H13 ist ein unabhängig abgeleitetes CTL, das auf der Basis von Plattenanalyse auch HA-2 erkennt, sich jedoch in seiner feinen Spezifität der Antigenerkennung von 5H17 leicht unterscheidet (10, 23). Klon 5H13 erkannte auch alle 3 Peptidvarianten (4b). Während die Konzentration der Peptide, die zum Erhalt einer halbmaximalen Epitop-Neubildung nötig ist, um das 5-10-Fache höher als für 5H17 waren, sensibilisierte Peptid YIGEVLVSV immer noch mit um das 100-Fache niedrigeren Konzentrationen als die anderen beiden. Diese Ergebnisse ermitteln, dass trotz ihrer feinen Spezifitätsunterschiede (10, 23) beide HA-2-spezifische CTLs dasselbe Peptidepitop erkennen.
Bindungsstudien mit diesen drei Peptiden zeigten, dass Peptid YIGEVLVSV der höchste Binder an HLA-A2.1 war. Die Konzentration, die zu einer 50%igen Hemmung der Bindung des iodinierten Standardpeptids an gereinigtes HLA-A2.1 führte, betrug 5,6 nM, während diejenigen für YLGEVIVSV und YLGEVLVSV 9,5 bzw. 15 nM betrugen (5). Diese Werte platzieren diese Peptide unter die natürlich verarbeiteten Peptide mit höchster Affinität, die bisher identifiziert wurden (24). Jedoch handelt es sich bei den Unterschieden in den Bindungsaffinitäten für diese drei Peptide lediglich um einen Faktor von 3. Die Tatsache, dass YIGEVLVSV für eine Erkennung durch die Klone 5H17 und 5H13 mit um das 50-100-Fache niedrigeren Konzentrationen sensibilisiert als die anderen Peptide, weist darauf hin, dass dieses Peptid mit der höchsten Affinität durch das TCR erkannt wird und folglich das tatsächliche HA-2-Epitop ist.
Eine Durchsuchung von DNA- und Proteinsequenzdatenbanken führte zu zwei Humansequenzen, die beiden an 7 aus 9 Resten mit Peptid YIGEVLVSV übereinstimmten. Peptid YYGEVCVSV ist von Oligodendrocytmyelinglycoprotein abgeleitet (25) und Peptid YIGSVLISV stammte von unkonventionellem Myosin-IC (26). Beide Humanpeptide wurden synthetisiert und auf sensibilisierende Aktivität getestet. Nur das von Myosin-IC abgeleitete Peptid YIGSVLISV konnte T2-Zellen für eine Lyse durch 5H17 und 5H13 mit einer 50%igen Lyseinduzierenden Konzentration von 5-50 nM sensibilisieren (27). Unkonventionelles Humanmyosin-IC gehört zu einer großen Familie an Myosingenen (28, 29), die aus unterschiedlichen Klassen bestehen und von welchen angegeben wird, dass sie bei der Zelllokomotion und beim Organellentransport beteiligt sind (28, 29). Alle Zelltypen exprimieren wahrscheinlich mehrere Myosine von jeder Klasse gleichzeitig. Über eine auf Gewebe beschränkte Verteilung von einigen Myosinen wurde berichtet (26, 29). Datenbankdurchsuchungen zeigten, dass in verschiede nen Myosinen der Klasse I verschiedenen Ursprungs im Bereich von Acanthamoeba castellanii bis Human diese Peptidsequenz eine Bewahrung von Y, I, G, V und V an Position 1, 2, 3, 5 und 9 zeigten. Vornehmlich unterscheidet sich die HA-2-Peptidsequenz in den nicht bewahrten Aminosäurepositionen von der Myosin-IC-Peptidsequenz. Menschliches unkenventionelles Myosin-IC-Peptid ist das einzige klonierte menschliche Myosingen der Klasse I, jedoch gibt es ein Indiz für die Gegenwart von mindestens 2 anderen Myosinen der Klasse I in menschlichen Zellen. Deshalb ist es nicht unwahrscheinlich, dass ein noch unbekanntes Myosinprotein der Klasse I, das YIGEVLVSV enthält, in Menschen vorliegt. Interessanterweise zeigen aktuelle Studien die evolutionäre Bewahrung von etlichen HA-2 einschließenden mHags zwischen menschlichen und nicht menschlichen Primaten (30) Das mHag nur von hämatopoietischen Zellen dargereicht wird, ist dieses unbekannte Myosin der Klasse I entweder nur auf hämatopoietische Zellen beschränkt oder wird auf Grund der gewebespezifischen Verarbeitung nur von hämatopoietischen Zellen dargereicht.
Der Polymorphismus von mHag-HA-2 ist ein fesselndes Merkmal. 95% der HLA-A2.1-positiven Bevölkerung exprimieren das HA-2. Demzufolge wurden die HA-2-spezifischen CTLs in vivo zwischen einer mHag-HA-2-ungleichartigen Knochenmarkspender/-empfänger-Kombination gebildet. Der HA-2-Polymorphismus kann entweder durch Mutationen in oder neben dem HA-2-Gen oder durch den Polymorphismus des Antigen-Verarbeitungssystems erklärt werden.
Bis jetzt waren Informationen über mHag äußerst spärlich. Obwohl die physiologische Funktion von mHag immer noch unbekannt ist, ist ihre zentrale Rolle bei der Organtransplantation im Allgemeinen und bei der Knochenmarktransplantation insbesondere unbestreitbar. Wir berichten hiermit unseres Wissens nach erstmalig über die Aminosäuresequenz von mHag, die durch das von GvHD abgeleitet CTL definiert ist. Die Verfügbarkeit der mHag-Peptidsequenz kann eine in-vivo-Modifikation der mit GvHD verbundenen T-Zellantworten ermöglichen.
Weiterhin ist es, da mHag HA2 auf Zellen der hämatopoietischen Abstammungslinie, einschließlich leukämischen Zellen exprimiert wird, ein Kandidat für eine Immuntherapie von Leukämie vor der Knochenmarktransplantation.
5. Bindung von synthetischen Peptiden an gereinigtem HLA-A2.1. Durch HPLC gereinigte Peptide wurden auf die Fähigkeit, die Bindung von iodiniertem Hepatitis-B-Kernantigenpeptid zu hemmen, getestet. FLPSDYFPSV, an wie vorstehend beschriebenen gereinigten HLA-A2.1-Molekülen (23). (Geschlossene Kreise), YIGEVLVSV; (geschlossene Dreiecke), YLGEVLVSV; (geschlossene Quadrate), YLGEVIVSV; (geschlossene Rauten), das Grippe-M1-Protein-Antigen GILGEVFTL. Alle Datenpunkte sind der Mittelwert von mindestens zwei unabhängigen Versuchen.
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23. Momburg F, Ortiz-Navarrete V, Neefjes J, Goulmy E, v.d. Wal Y, Spits H, Powis SJ, Butcher GW, Howard JC, Walden P und Hämmerling GJ (1992). The proteasome subunits encoded by the major histocompatibility complex are not essential for antigen presentation. Nature 360: 174-177.
24. H.J. Wallny and H-G Rammensee, Nature 343, 275 (1990). O. Rötzschke, K. Falk, H.J. Wallny, S. Faath, H-G. Rammensee, Science 249, 283 (1990). M. Sekimata, P. Griem, K. Egawa, H-G. Rammensee, M. Takigu chi, Int. Immunol. 4, 301 (1992). L. Franksson, M. Petersson, R. Kiessling, K. Karre, Eur.J. Immunol., 23, 2606 (1993);
25. M. De Bueger et al. Eur.J.Immunol.23, 614 (1993);
26. M.E. Kurtz, R.J. Graff, A. Adelman, D. Martin-Morgan, R.E. Click, J. Immunol. 135, 2847 (1985). H-G Rammensee, P.J. Robinson, A. Grisanti, M.J. Bevan, Nature 319, 502 (1986). B. Perarnau et al., Nature 346, 751 (1990);
27. B. Loveland, C-R. Wang, H. Yonekawa, E. Hermel, K. Fischer Lindahl, Cell, 60, 971 (1990);
28. Das HA-2-spezifische CTL-Klon 5H17 stammte von einer weiblichen Patientin, die sich einer Knochenmarktransplantation für schwere aplastischer Anämie unterzog. Die Vortransplantatkonditionierungskur bestand aus einer Gesamtlymphoidbestrahlung und Cyclophosphamide. Der Patientin wurde nicht-T-cell-armes Knochenmark von ihrem HLA identischen Vater transplantiert. Die Patientin litt an schwerer akuter GvHD, Grad III, gefolgt von extensiver chronischer GvHD. Der HA-2-spezifische CTL-Klon wurde durch Post-BMT-PBL gemäß dem früher beschriebenen Protokoll agebildet. E. Goulmy, in Transplant, Rev.J.Morris und N.L. Tilney, Eds. (Saunders Company 2, 29, 1988);
29. Daten nicht dargestellt;
30. A.L. Cox et al., Science 264, 716 (1994);
31. Die Peptidgemische YSGEVXVSV und SXDFGTXQV wurden in etlichen Konzentrationen gegen Klon 5H17 und Klon 5H13 getestet. Zusätzlich zu T2 wurde ein HA-2-negatives, HLA-A2.1-positives EBVBLCL zum Darreichen des Peptidgemischs verwendet;
32. Daten nicht dargestellt;
33. K. Udake, T.J. Tsomides, H.N. Eisen, cell 69, 989 (1992). R.A. Henderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 10275 (1993). O. Mandelboim et al., Na ture, 369, 67 (1994), A. Uenaka et al., J. Exp. Med., 180, 1599 (1994);
34. 5H13 und 5H17 zeigten identische Muster beim Analysieren gegen 100 gesunde nicht verwandte HLA-A2.1-positive Individuen. Ein charakteristisches Reaktionsmuster zwischen den Klonen wurde bemerkt, als eine Zielzelle analysiert wurde, die ein natürliches HLA-A2-Variantenmolekül exprimiert;
35. Y. Chen et al., J. Immunol., 152,2874 (1994).J. Ruppert et al., Cell, 74, 829 (1993);
36.
37. W.M. Bement, T. Hasson, J.A. Wirth, R.E. Cheney, M.S. Mooseker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6549 (1994);
38. Das Peptid YYGEVCVSV wurde in einem Konzentrationsbereich von 50 nM bis 0.5 pM gegen 5H17 sowie 5H13 getestet. Es wurde keine Aktivität gefunden;
39. M.A. Titus, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 77 (1993). E. Coudrier, A. Durrbach, D. Louvard, FEBS, 307, 87 (1992);
40. M. Mooseker, Curr. Biol., 3, 245 (1993);
41. J.M.M. den Haan, J.Pool, E. Blokland, R. Bontrop, E. Boulmy, Manuskript in Vorbereitung.

Claims

Peptid, das ein T-Zellepitop bildet erhältlich aus dem Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-2, umfassend die Sequenz YIGEVLVSV, YLGEVLVSV oder YLGEVIVSV.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Sequenz VIGEVLVSV.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Sequenz YLGEVLVSV oder YLGEVIVSV.
Impfstoff, umfassend ein Epitop nach einem der Ansprüche 1-3.
Arzneimittel, umfassend ein Epitop nach einem der Ansprüche 1-3.
Peptid nach den Ansprüchen 1-3 zur Verwendung als Medizin.
Verwendung eines Peptids nach den Ansprüchen 1-3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Toleranzinduktion für Transplantate zur Verhinderung von Abstoßung und/oder Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1-3 bei der Herstellung eines Medikaments zur Eliminierung einer Gruppe von (neoplastischen) hämatopoietischen Zellen unter Darreichung eines Peptids in Zusammenhang mit der HLA-Klasse 1 nach einem der Ansprüche 1-3, wodurch die Elimination durch spezifische Erkennung des Peptids in dem Zusammenhang direkt oder indirekt induziert wird.
Verfahren zur Bildung von Antikörpern, T-Zellrezeptoren, antiidiotypischen B-Zellen oder T-Zellen, umfassend den Schritt der Immunisierung eines nicht menschlichen Säugers mit einem Peptid nach Anspruch 1.
Isolierte T-Zelle, die spezifisch die Sequenz YIGEVLVSV, YLGEVLVSV oder YLGEVIVSV erkennt.
Isolierter Antikörper, der spezifisch die Sequenz YIGEVLVSV, YLGEVLVSV oder YLGEVIVSV erkennt.