DE69835766T2 - Neues peptid, apoep1.b, zusammensetzungen und verwendungen davon - Google Patents

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Verfahren und Zubereitungen zur Immun-Modulation.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Immunsystem ist ein komplexes, multifaktorielles Verteidigungssystem, das den Körper vor einer großen Vielzahl infektiöser Krankheiten schützt, einschließlich Viren, Bakterien, Parasiten und Pilze. Obwohl es kritisch für unser Überleben ist, kann in bestimmten Beispielen, wie beispielsweise Autoimmun-Krankeiten, Transplantat-Abstoßung, Allergien und Entzündungen, das Immunsystem der Anlass für Krankheit sein. In solchen Beispielen ist es wünschenswert, die Immun-Antwort bzw. Immun-Response zu unterdrücken oder abzuschalten.
  • Das Immunsystem besteht aus einer großen Vielzahl von Zellen, die von undifferenzierten, hematopoietischen Stammzellen abgeleitet sind, und schließt Phagozyten (wie neutrophile polymorphe Zellen, Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen) sowie Lymphozyten (wie beispielsweise T-Zellen und B-Zellen und natürliche Killer-Zellen) ein.
  • Dendritische Zellen sind interessante Immunzellen, da sie in Abhängigkeit von den Umständen eine Immun-Antwort entweder aktivieren oder unterdrücken können. Im Hinblick auf eine Immun-Aktivierung sind dendritische Zellen (DCs) potente Lymphozyten-Stimulatoren und sind extrem wirksame, Antigen-präsentierende Zellen. Kürzlich entstand erhebliches Interesse an einer potentiellen Verwendung von dendritischen Zellen zur Therapie von Krebs und infektiösen Krankheiten. DCs, die mit Tumor-Peptiden gepulst sind, lösen eine schützende und gegen Tumore gerichtete Immunität bei Mäusen aus (Mayordame et al., 1995). Patienten mit B-Zell-Lymphomen wurden erfolgreich geimpft mit autologen, Antigen-gepulsten DC, die direkt aus dem Blut isoliert worden waren (Hsu et al., 1996). Flt3-Ligand, der eine DC-Reifung induziert, führte zu einer Tumor-Regression und einer Anti-Tumor-Immun-Antwort in Mäusen (Lynch et al., 1997). Unglücklicherweise waren Fortschritte in der Behandlung von Tumoren mit DCs durch ihre Spuren-Konzentration in vivo beschränkt. Bemühungen in diesem Bereich sind gerichtet auf eine Erhöhung der Zahl von DCs und den Aktivierungsgrad. In Bezug auf eine Toleranz wurde kürzlich gezeigt, dass dendritische Zellen in die Induktion von zentraler sowie peripherer Toleranz involviert sind und nützlich sein können bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten, Allergien und Transplantat-Abstoßung.
  • Hunt et al. (Science (1992) 256 (50650, 1817-1820)) offenbaren ein Verfahren des Sequenzierens verschiedener Peptid-Fragmente, die mit MHC-Klasse II-Molekül I-Ad assoziiert sind. Die Sequenzen der Peptide wurden bestimmt durch Umkehrphasen-HPLC in Kombination mit Mikrokapillar-HPLC-Elektrospray-Ionisierungs-Tandem-Massen-Spektrometrie.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegenden Erfinder haben ein Peptid hergestellt, das von Apolipoprotein E abgeleitet ist und apoEp1.B genannt wird, das die Aminosäuren 239 bis 252 des Apolipoproteins E einschließt. Die Erfinder haben gefunden, dass überraschenderweise apoEp1.B ein potenter Immun-Modulator ist, der auf eine Vielzahl von Immunzellen wirkt. Interessanterweise ist apoEp1.B ein dualer Modulator, der in der Lage ist, sowohl eine Immun-Antwort zu induzieren als auch eine solche zu unterdrücken. Insbesondere wurde gezeigt, dass apoEp1.B eine Differenzierung von unreifen Zellen in dendritische Zellen induziert, eine Tumor-Zellen-Differenzierung und -Aktivierung induziert, Entzündungen inhibiert und Autoimmun-Krankheiten inhibiert.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung bereit, ein isoliertes apoEp1.B-Peptid, das die Aminosäuren 239 bis 252 eines Apolipoproteins E-Proteins umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung bereit ein isoliertes apoEp1.B-Peptid, das die folgende Aminosäure-Sequenz aufweist: TQQIRLQAEIFQAR (bei der Maus) oder AQQIRLQAEAFQAR (beim Menschen). Die Erfindung schließt auch Analoge, Fragmente, Verlängerungen und Derivate eines Peptids gemäß der Erfindung ein. Analoge und Derivate der Peptide schließen Peptide mit den folgenden Sequenzen ein: TAQIRLQAEIFQAR; TQAIRLQAEIFQAR; TQQARLQAEIFQAR und TQQIALQAEIFQAR. Fragmente und Verlängerungen der Peptide schließen Peptide ein, die die folgenden Sequenzen aufweisen: QTQQIRLQAEIFQAR und QQIRLQAEIFQAR. Die vorliegende Erfindung stellt auch bereit ein Nukleinsäure-Molekül, das für das apoEp1.B-Peptide kodiert, oder ein Analog, Fragment oder Derivat davon.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter bereit ein Verfahren zur Immun-Modulation, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer für ein apoEp1.B-Peptid kodierenden Nucleinsäure an eine Zelle oder ein Lebewesen umfasst, das Bedarf hierfür hat.
  • Entsprechend einer Ausführungsform kann das Peptid Immun-Toleranz induzieren. Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid Monozyten dazu aktivieren kann, sich in tolerogene dendritische Zellen zu differenzieren. Die Induktion tolerogener dendritischer Zellen kann eine große Vielzahl therapeutischer Anwendungen aufweisen, einschließlich einer Anwendung bei Entzündungen, Autoimmun-Krankheiten und Transplantationen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das apoEp1.B-Peptid nützlich in der Inhibierung von Entzündungen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Peptid eine atherosklerotische Plaque-Bildung in vivo inhibieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das apoEp1.B-Peptid zum Verhindern oder Behandeln einer Autoimmun-Reaktion oder Krankheit verwendet werden. Die vorliegenden Erfinder haben auch demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid NOD-Mäuse davor schützen kann, Diabetes zu entwickeln. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Autoimmun-Krankheit Diabetes.
  • In einem weiteren Aspekt kann das apoEp1.B-Peptid verwendet werden zum Induzieren einer Immun-Antwort durch Aktivieren von Immunzellen. In einer Ausführungsform kann das Peptid in Kombination mit anderen Zytokinen, wie beispielsweise IL-4, GM-CSF, TNF-α und Flt3-Ligand induzieren, dass sich unreife dendritische Zellen in reife immunogene dendritische Zellen differenzieren. Reife dendritische Zellen können in einer großen Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich einer Tumor-Immunotherapie.
  • In einem anderen Aspekt kann das apoEp1.B-Peptid verwendet werden zur Behandlung von Tumoren mit Immun-Ursprung durch Induzieren von deren Differenzierung. Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid die Differenzierung und Aktivierung von monozytischen, monoblastischen Leukämie- und Lymphom-Tumor-Zellen induzieren kann.
  • Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung offenbar. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele zwar bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, jedoch nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der Erfindung Fachleuten in diesem technischen Bereich aus der detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die Erfindung wird nun in Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen:
  • 1A und B Photographien von Milz-Zellen sind, die für 48 h mit apoEp1.B (B) oder einem Kontroll-Peptid (A) inkubiert wurden;
  • 1C und D Photographien von PU5-1.8-Zellen sind, die für 48 h mit apoEp1.B (D) oder einem Kontroll-Peptid (C) inkubiert wurden;
  • 2(A-D) eine FACS-Analyse von J77A-Zellen ist, die für 48 h mit apoEp1.B (B und D) oder mit einem Kontroll-Peptid (A und C) inkubiert wurden;
  • 3 eine FACS-Analyse von PU5-1.8-Zellen ist, die mit apoEp1.B oder apoEp1.D induziert wurden und mit verschiedenen Markern gefärbt wurden;
  • 4 eine FACS-Analyse von BALB/c-Splenozyten zeigt, die mit apoEp1.B oder apoEp1.D inkubiert wurden;
  • 5 eine FACS-Analyse zeigt, die veranschaulicht, dass eine durch apoEp1.B induzierte DC-Oberflächen-Molekül-Expression Dosis-abhängig ist;
  • 6 eine FACS-Analyse zeigt, die demonstriert, dass apoEp1.B nicht Spezies-spezifisch ist;
  • 7 Balken-Graphiken sind, die eine Chemokin-Produktion von PU5-1.8-Zellen demonstrieren, die inkubiert wurden mit apoEp1.B, apoEp1 und einer Kontrolle;
  • 8A eine FACS-Analyse ist, die SCC- und FSC-Profile von mit apoEp1.D und apoEp1.B geprimten PEC-Zellen zeigt;
  • 8B eine FACS-Analyse ist, die eine Oberflächen-Marker-Expression von mit apoEp1.D (unmarkierter Peak) und mit apoEp1.B (markierter Peak) geprimten PEC-Zellen zeigt;
  • 9 eine Balken-Graphik ist, die eine Aktivierung von Milz-Zellen in Gegenwart von apoEp1.B und/oder ConA zeigt;
  • 10 einen Schnitt von iliofemoralen Arterien zeigt: (A) unbehandelt, keine Operation; (B) unbehandelt, Operation; und (C) mit apoEp1.B behandelt und Operation (Arterien-Schnitt gezeigt);
  • 11 Histogramme zeigt, die die Induktion von Th2-artigen Zellen durch apoEp1.B Immunisierung veranschaulichen;
  • 12 ein Histogramm zeigt, das allostiumulatorische Fähigkeiten von mit apoEp1.B behandelten Zellen veranschaulicht;
  • 13A eine Graphik ist, die einen Schutz von NOD-Mäusen vor spontanem Diabetes durch apoEp1.B veranschaulicht;
  • 13B eine Graphik ist, die einen Schutz von NOD-Mäusen vor adoptiv übertragenem Diabetes durch apoEp1.D veranschaulicht;
  • 14 eine Graphik ist, die die Prozentzahl Mäuse, die vor Diabetes geschützt wurden, gegen die Zeit in Gegenwart und Abwesenheit von apoEp1.B zeigt;
  • 15A-D die Wirkung von verschiedenen Konzentrationenen apoEp1.B auf eine Proliferation von U-937-Zellen veranschaulichen;
  • 16 eine FACS-Analyse zeigt, die veranschaulicht, dass einzelne Aminosaüre-Streichungen oder -Verlängerungen die Aktivität von apoEp1.B senken.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wie oben erwähnt, haben die vorliegenden Erfinder ein Peptid von menschlichem und von Mäusen stammenden Apolipoprotein E hergestellt, das mit „apoEp1.B" (239 bis 252) bezeichnet wird, das ein potenter Immun-Modulator ist und in einer großen Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.
  • I. Peptide gemäß der Erfindung
  • Breit gesagt, stellt die vorliegende Erfindung bereit ein isoliertes apoEp1.B-Peptid, das die Aminosaüren 239 bis 252 eines Apolipoprotein E-Proteins umfasst, oder ein Analog, ein Fragment, eine Verlängerung oder ein Derivat davon.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung bereit ein isoliertes apoEp1.B-Peptid, das die folgende Aminosaüre-Sequenz aufweist: TQQIRLQAEIFQAR (von der Maus) (Seq.-ID-Nr. 1) oder AQQIRLQAEAFQAR (vom Mensch) (Seq.-ID-Nr. 2) oder ein Analog, ein Fragment, eine Verlängerung oder ein Derivat des Peptids. Die Erfindung schließt auch ein ein Nukleinsäure-Molekül, das für das apoEp1.B-Peptid kodiert, oder ein Analog, ein Fragment, eine Verlängerung oder ein Derivat davon.
  • Der Begriff „Analog" schließt jedes beliebige Peptid mit einer Aminosäure-Rest-Sequenz ein, die im wesentlichen identisch mit der Human- oder Maus-apoEp1.B- Sequenz ist, die spezifisch in der vorliegenden Anmeldung angegeben ist, worin ein Rest oder mehrere Reste konservativ substituiert wurden durch einen funktionell ähnlichen Rest, und das das Vermögen zeigt, apoEp1.B zu imitieren, wie dies in der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist. Beispiele von konservativen Substitutionen schließen die Substitution eines nicht-polaren (hydrophoben) Restes wie beispielsweise Alanin, Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, die Substitution eines polaren (hydrophilen) Restes durch einen anderen, wie beispielsweise einen Austausch zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin, die Substitution eines basischen Restes wie beispielsweise Lysin, Arginin oder Histidin durch einen anderen oder die Substitution eines sauren Restes wie beispielsweise Asparaginsäure oder Glutaminsäure durch einen anderen ein. Der Begriff „konservative Substitution" schließt auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht-derivatisierten Restes ein, mit der Maßgabe, dass ein solches Polypeptid die erforderliche Aktivität zeigt.
  • Analoge der Peptide schließen Peptide ein, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
    TAQIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 4),
    TQQARLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 5) und TQQIALQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 6).
  • Der Begriff „Derivat" bezieht sich auf ein Peptid, das einen Rest oder mehrere Reste aufweist, die chemisch durch eine Reaktion einer funktionellen Seiten-Gruppe derivatisiert wurden. Solche derivatisierten Moleküle schließen beispielsweise solche Moleküle ein, in denen freie Amino-Gruppen derivatisiert wurden unter Bildung von Amin-Hydrochloriden, p-Toluolsulfonyl-Gruppen, Carbobenzoxy-Gruppen, t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, Chloracetyl-Gruppen oder Formyl-Gruppen. Freie Carboxyl-Gruppen können derivatisiert werden unter Bildung von Salzen, Methyl und Ethyl-Estern und anderen Arten von Estern oder Hydraziden. Freie Hydroxyl-Gruppen können derivatisiert werden unter Bildung von O-Acyl-Derivaten oder O-Alkyl-Derivaten. Der Imidazol-Stickstoff von Histidin kann derivatisiert werden unter Bildung von N-im-Benzylhistidin. Auch eingeschlossen als Derivate sind solche Peptide, die ein oder mehrere, natürlich vorkommende Aminosäure-Derivat(e) der zwanzig Standard Aminosäu ren enthalten. Beispielsweise kann 4-Hydroxyprolin anstelle von Prolin gesetzt werden, kann 5-Hydroxylysin anstelle von Lysin gesetzt werden, kann 3-Methylhistidin anstelle von Histidin gesetzt werden, kann Homoserin anstelle von Serin gesetzt werden, kann Ornithin anstelle von Lysin gesetzt werden. Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung schließen auch jedes beliebige Polypeptid ein, das einen oder mehrere zusätzliche Reste und/oder gestrichene Reste oder Reste in Bezug auf die Sequenz eines Polypeptids aufweisen, dessen Sequenz in der vorliegenden Beschreibung gezeigt ist, solange die erforderliche Aktivität aufrechterhalten bleibt.
  • Der Begriff „Fragment" bezieht sich auf irgendein gegenständliches Peptid, das eine Aminosäure-Rest-Sequenz aufweist, die kürzer ist als diejenige eines Peptids, dessen Aminosäure-Rest-Sequenz in der vorliegenden Beschreibung gezeigt ist.
  • Der Begriff „Verlängerung" bezieht sich auf irgendein gegenständliches Peptid, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die um eine Aminosäure oder zwei Aminosäuren (entweder am Carboxy-terminalen Ende oder am Amino-terminalen Ende) länger ist als diejenige eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise tritt die Verlängerung am Amino-terminalen Ende auf.
  • Fragmente und Verlängerungen der Peptide schließen Peptide ein, die die folgenden Sequenzen aufweisen: QTQQIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 8).
  • Der Begriff „apoEp1.B-Peptid" oder der Begriff „Peptid gemäß der Erfindung", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, schließt ein Peptid ein, das die Aminosäure-Reste 239 bis 252 eines Apolipoprotein E-Proteins umfasst und schließt alle Analoge, Fragmente, Verlängerungen oder Derivate des apoEp1.B-Peptids ein, einschließlich der Sequenzen, die oben unter den Seq.-ID-Nrn. 1 bis 8 angegeben wurden. Vorzugsweise ist das apoEp1.B die von Mäusen stammende apoEp1.B-Sequenz TQQIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 1) oder die vom Mensch stammende apoEp1.B-Sequenz AQQIRLQAEAFQAR (Seq.-ID-Nr. 2).
  • Das apoEp1.B-Peptid kann modifiziert werden, um es noch mehr therapeutisch wirksam oder geeignet zu machen. Beispielsweise kann es zyklisiert werden, da eine Zyklisierung ermöglicht, dass ein Peptid eine noch vorteilhaftere Konformation annimmt. Eine Zyklisierung des apoEp1.B-Peptids kann erreicht werden unter Anwendung von Verfahrensweisen, die in diesem technischen Bereich bekannt sind. Insbesondere können Disulfid-Bindungen gebildet werden zwischen zwei passend beabstandeten Komponenten, die freie Sulfhydryl-Gruppen aufweisen. Die Bindungen können gebildet werden zwischen Seitenketten von Aminosäuren, nicht-Aminosäure-Komponenten oder einer Kombination der beiden. Darüber hinaus kann das apoEp1.B-Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung in pharmazeutische Salze umgewandelt werden, indem man es mit anorganischen Säuren einschließlich Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure usw. oder organischen Säuren einschließlich Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztrauben-Säure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Benzolsulfonsäure und Toluolsulfonsäure umsetzt.
  • Die apoEp1.B-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung können auch hergestellt werden durch herkömmliche Verfahrensweisen. Beispielsweise können die Peptide synthetisiert werden durch chemische Synthese unter Anwendung von in der Chemie von Proteinen wohlbekannten Verfahrensweisen wie beispielsweise Festphasen-Synthese oder Lösungsphasen-Synthese (siehe beispielsweise „J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford ILL (1984)" und „G. Barany und R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Syntethesis, Biology; Herausgeber: E. Gross und J. Meienhofer, Band 2, Academic Press, New York (1980), Seiten 3 bis 254" für die Festphasen-Synthese-Verfahrensweisen; und „M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1984)" und „E. Gross und J. Meienhofer (Hrsg.) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, a.a.O., Band 1" für eine klassischse Lösungs-Synthese; sowie „Merrifield (1964), J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149 bis 2154)" oder durch Synthese in homogener Lösung („Houben-Weyl (198, Methods of Organic Chemistry; Herausgeber: E. Wansch, Band 15 (I) und (II), Thieme Verlag, Stuttgart").
  • Die apoEp1.B-Peptide gemäß der Erfindung können auch hergestellt werden durch rekombinante DNS-Verfahrensweisen. Zur Herstellung der Peptide gemäß der Erfindung durch rekombinante DNS-Verfahrensweisen muss eine DNS-Sequenz hergestellt werden, die für das apoEp1.B-Peptid kodiert. Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch gereinigte und isolierte Nukleinsäure mit einer Nukleotid-Sequenz bereit, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz TQQIRLQAEIFQAR (Seq.-ID-Nr. 1) oder eine Aminosäure-Sequenz AQQIRLQAEAFQAR (Seq.-ID-Nr. 2) umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressions-Vektor bereit, der ein DNS-Molekül umfasst, das für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, das für eine Transfektion oder Transformation einer Wirts-Zelle angepasst ist.
  • Dementsprechend können die Nukleinsäure-Moleküle gemäß der vorliegenden Erfin- dung in einer bekannten Weise in einen passenden Expressions-Vektor eingearbeitet werden, der eine Expression des Proteins sicherstellt. Mögliche Expressions-Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. Replikations-defekte Retro-Viren, Adeno-Viren und Adeno-assoziierte Viren). Der Vektor sollte mit der verwendeten Wirts-Zelle kompatibel sein. Die Expressions-Vektoren sind „geeignet für eine Transformation einer Wirts-Zelle", was bedeutet, dass der Expressions-Vektor ein Nukleinsäure-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung und Regulations-Sequenzen enthält, die auf der Basis der Wirts-Zellen, die für eine Expression verwendet werden sollen, ausgewählt sind, die operativ an das Nukleinsäure-Molekül gebunden sind. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „operativ verbunden" bedeutet, dass die Nukleinsäure an Regulations-Sequenzen in einer Weise gebunden ist, die eine Expression der Nukleinsäure erlaubt.
  • Die Erfindung zieht daher in Betracht einen rekombinanten Expressions-Vektor gemäß der Erfindung, der ein Nukleinsäure-Molekül gemäß der Erfindung oder ein Fragment davon sowie die notwendigen regulatorischen Sequenzen für die Transkription und Translation der eingebauten Protein-Sequenz enthält.
  • Geeignete regulatorische Sequenzen können von einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden, einschließlich bakterieller, mit Pilzen in Verbindung stehender, viraler, Säuger- oder Insekten-Genen. (Siehe beispielsweise die regulatorischen Sequenzen, die beschrieben sind in „Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)"). Die Selektion passender regulatorischer Sequenzen ist abhängig von der gewählten Wirts-Zelle, wie dies oben diskutiert wurde, und kann von einem mit üblichen Sachverstand in diesem technischen Bereich ausgestatteten Fachmann einfach durchgeführt werden. Beispiele solcher regulatorischer Sequenzen schließen ein: einen Transkriptions-Promoter und -Verstärker oder eine RNS-Polymerase-Bindungs-Sequenz, eine Ribosomen-Bindungs-Sequenz einschließlich eines Translations-Initiierungs-Signals. Zusätzlich können in Abhängigkeit von der gewählten Wirts-Zelle und dem verwendeten Vektor andere Sequenzen wie beispielsweise ein Replikations-Ursprung (origin of replication), zusätzliche DNS-Restriktions-Stellen, Verstärker und Sequenzen in den Expressions-Vektor eingearbeitet werden, die eine Induzierbarkeit von Transkription verleihen.
  • Die rekombinanten Expressions-Vektoren gemäß der Erfindung können auch ein auswählbares Marker-Gen enthalten, das die Selektion von Wirts-Zellen erleichtert, die mit einem rekombinanten Molekül gemäß der Erfindung transformiert oder transfektiert wurden. Beispiele auswählbarer Marker-Gene sind Gene, die für ein Protein wie beispielsweise G418 und Hygromycin kodieren, die Widerstand gegenüber bestimmten Drogen bzw. Arzneistoffen, β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Leuchtkäfer-Luciferase oder ein Immun-Globulin oder einen Teil davon wie beispielsweise den Fc-Teil eines Immun-Globulins, vorzugsweise IgG, verleihen.
  • Rekombinante Expressions-Vektoren können in Wirts-Zellen unter Herstellung einer transformanten Wirts-Zelle eingeführt werden. Der Begriff „Transformanten-Wirts-Zelle" schließt – so wird beabsichtigt – Prokaryonten- und Eukaryonten-Zellen ein, die mit einem rekombinanten Expressions-Vektor gemäß der Erfindung transformiert oder transfektiert wurden. Die Begriffe „transformiert mit", „transfektiert mit", „Transformation" und „Transfektion" sollen der Absicht gemäß das Einführen einer Nukleinsäure (z. B. eines Vektors) in eine Zelle durch eine von vielen möglichen Verfahrensweisen umfassen, die in diesem technischen Bereich bekannt sind. Prokaryonten-Zellen können transformiert werden mit Nukleinsäuren beispielsweise durch Elektroporation oder Calciumchlorid-vermittelte Transformation. Nukleinsäure können in Säuger-Zellen über herkömmliche Verfahrensweisen wie beispielsweise Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Coprezipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofectin, Elektroporation oder Mikroinjektion eingeführt werden. Geeignete Verfahrensweisen zum Transformieren und Transfektieren von Wirts-Zellen können gefunden werden in der Druckschrift „ Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)") oder in anderen, für die Arbeit im Labor geeigneten Lehrbüchern.
  • Geeignete Wirts-Zellen schließen eine große Vielzahl von Prokaryonten- und Eukaryonten-Wirts-Zellen ein. Beispielsweise können die Proteine gemäß der Erfindung exprimiert werden in Bakterien-Zellen, wie beispielsweise E. coli, Insekten-Zellen (unter Verwendung von Baculovirus,) Hefe-Zellen oder Säuger-Zellen. Hefe- und Pilz-Wirts-Zellen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Saccharomyces cerevisae, die Arten Pichia oder Kluyveromyces und verschiedene Spezies der Art Aspergillus. Säuger-Zellen, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen neben anderen ein: COS (z. B. ATCC Nr. CRL 1650 oder 1651), BHK (z. B. ATCC Nr. CRL 6281), CHO (ATCC Nr. CCL 61), HeLa (z. B. ATCC Nr. CCL 2), 293 (ATCC Nr. 1573) und NS-1-Zellen. Andere geeignete Wirts-Zellen können gefunden werden in der Druckschrift „Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)".
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Nukleotid-Sequenz bereit, die unter Hochstringenz-Bedingungen in eine Nukleinsäure-Sequenz hybridisiert, die für ein apoEp1.B-Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert. Geeignete Stringenz-Bedingungen, die eine DNS-Hybridisierung fördern, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt oder können gefunden werden in der Druckschrift „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), Kapitel 6.3.1 bis 6.3.6.". Beispielsweise kann angewendet werden: 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45° C, gefolgt von einem Waschen mit 2,0 × SSC bei 50° C. Die Stringenz kann gewählt werden auf der Basis von Bedingungen, die in dem Wasch-Schritt angewendet werden. Beispielsweise kann die Salz-Konzentration in dem Wasch-Schritt gewählt werden von einer hohen Stringenz von 0,2 × SSC bei 50° C. Darüber hinaus kann die Temperatur in dem Wasch-Schritt eine bei Hoch-Stringenz-Bedingungen bei etwa 65° C sein.
  • II. Brauchbarkeit der Peptide
  • A. Therapeutische Verfahren
  • Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass das apoEp1.B-Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung ein potenter Immun-Modulator ist, der auf eine Vielzahl von Immun-Zellen wirkt. Interessanterweise ist apoEp1.B ein dualer Modulator, der in der Lage ist, eine Immun-Antwort sowohl zu induzieren als auch zu unterdrücken. Wie vorher erwähnt wurde, umfasst das apoEp1.B-Peptid die Aminosäuren 239 bis 252 des Apolipoprotein E-Proteins (apoE) voller Länge, einschließlich von Fragmenten, Verlängerungen, Analogen und Derivaten des Peptids. Die Erfinder haben gezeigt, dass apoEp1.B, nicht jedoch apoE oder ein Peptid, das die Aminosäuren 237 bis 250 von apoE umfasst, die Aktivierung und Differenzierung von Immunzellen induzieren kann.
  • Sinngemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren der Immun-Modulation bereit, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an eine Zelle oder ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf.
  • Das apoEp1.B-Peptid kann verwendet werden zum Induzieren von Immun-Toleranz. Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid unreife Zellen dazu aktivieren kann, in tolerogene dendritische Zellen zu differenzieren. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren von Immun-Toleranz bereit, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an eine Zelle oder ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf. Das Induzieren tolerogener dendritischer Zellen kann eine große Vielzahl therapeutischer Anwendungen haben, einschließlich in den Bereichen Entzündungen, Autoimmun-Krankheiten und Transplantationen. Die tolerogenen dendritischen Zellen können in vitro induziert und dann in einen Rezipienten übertragen werden, der solcher Zellen bedarf. Alternativ können die tolerogenen Zellen direkt in vivo induziert werden.
  • Die Erfinder haben gezeigt, dass das apoEp1.B-Peptid nützlich beim Inhibieren von Entzündungen ist. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung bereit ein Verfahren zum Inhibieren von Entzündungen, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an eine Zelle oder ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Peptid die arterosklerotische Plaque-Bildung in vivo inhibieren. Andere entzündliche Erkrankungen, die unter Verwendung des apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure behandelt werden können, die für das apoEp1.B-Peptid kodiert, schließen ein: Arthritis, entzündliche Darm-Erkrankung (inflammatory bowel disease; IBD), Sjogren's Syndrom, Atherosklerose, Restenose, Transplantat Abstoßung, Transplantat-Vaskulopathie, Asthma, akutes Atemnot-Syndrom (acute respiratory distress syndrome), Allergien, Psoriasis, Multiple Sklerose, systemischer Lupus, akute Glomerulonephritis, Rückenmark-Trauma und andere.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das apoEp1.B-Peptid verwendet werden zur Vorbeugung einer Autoimmun-Reaktion oder -Krankheit. Die vorliegenden Erfinder haben demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid NOD-Mäuse davor schützen kann, Diabetes zu entwickeln. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmun-Erkrankung bereit, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Autoimmun-Krankheit Diabetes. Andere Autoimmun-Krankheiten, die unter Verwendung des apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure behandelt werden können, die für das apoEp1.B-Peptid kodiert, schließen ein: Multiple Sklerose, EAE, das das Maus-Modell von Multiple Sklerose ist, Rheumatoide Arthritis, Sjogren's Syndrom, Lupus (SLE), Autoimmun-Schilddrüsen-Erkrankung und andere.
  • In einem weiteren Aspekt kann das apoEp1.B-Peptid verwendet werden zum Induzieren einer Immun-Antwort durch Aktivieren von Immun-Zellen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung bereit ein Verfahren zum Induzieren einer Immun-Antwort, das ein Verabreichen einer wirksamen Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf. In einer Ausführungsform induziert das Peptid in Kombination mit anderen Zytokinen wie beispielsweise IL-4, GM-CSF, TNF-α und dem Flt3-Liganden unreife dendritische Zellen zum Differenzieren in reife, immunogene dendritische Zellen. Reife dendritische Zellen können in einer großen Vielzahl von Anwendungen einschließlich einer Tumor-Immunotherapie verwendet werden.
  • In einem weiteren Aspekt kann das apoEp1.B-Peptid verwendet werden zur Behandlung von Tumoren mit Immun-Ursprung durch Induzierung ihrer Differenzierung. Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder demonstriert, dass das apoEp1.B-Peptid die Differenzierung und Aktivierung von monozytischen, monoblastischen Leukämie- und – Lymphom-Tumor-Zellen induzieren kann. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung bereit ein Verfahren zum Behandeln eines Tumors, das ein Verabreichen einer wirksa men Menge eines apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure, die für ein apoEp1.B-Peptid kodiert, an ein Lebewesen umfasst, das dessen bedarf.
  • Das apoEp1.B-Peptid oder die Nukleinsäure, die für das apoEp1.B-Peptid kodiert kann auch verwendet werden zum Behandeln oder Vorbeugen anderer Krankheiten oder Zustände, die eine Immun-Aktivierung erfordern (einschließlich infektiöser Krankheiten wie beispielsweise viraler Infektionen) und eine Immun-Toleranz erfordern (einschließlich Gewebe- oder Organ-Transplantation, Allergien und die oben genannten entzündlichen und Autoimmun-Erkrankungen).
  • Eine Verabreichung einer „wirksamen Menge" des apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist definiert als eine Menge, die bei Dosierungen und für Zeiträume, die notwendig sind, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, wirksam ist. Die wirksame Menge einer Verbindung gemäß der Erfindung kann entsprechend Faktoren wie beispielsweise dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des Lebewesens schwanken. Dosierungs-Zeitpläne können eingestellt werden, um die optimale therapeutische Antwort zu liefern. Beispielsweise können mehrere geteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt wird. Der Begriff „Lebewesen", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, schließt alle Mitglieder der Tierwelt einschließlich Menschen ein.
  • In allen oben beschriebenen therapeutischen Verfahrensweisen kann das apoEp1.B-Peptid in vivo oder ex vivo verabreicht werden. Bei ex vivo-Anwendungen kann das apoEp1.B-Peptid an Zellen verabreicht werden, die von dem Patienten entfernt wurden, und zwar in einer in vitro-Kultur. Nach Inkubieren der Zellen mit dem Peptid für eine Zeitdauer, die für die gewünschte Wirkung ausreichend ist, können die Zellen wieder in den Körper des Patienten eingeführt werden. In einem Beispiel können Monozyten von einem Patienten entfernt und mit apoEp1.B kultiviert werden, um zu ermöglichen, dass sie reifen. Darüber hinaus können Tumor-Antigene und Auto-Antigene zugesetzt wer den, wenn man Krebs- oder Autoimmun-Erkrankungen behandelt. Die Antigen exprimierenden reifen Monozyten können wieder in den Patienten zurück überführt werden und induzieren eine Immun-Antwort gegen den Tumor oder ein Auto-Antigen.
  • B. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung schließt pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die das apoEp1.B-Peptid oder eine Nukleinsäure oder Substanzen enthalten, die die Wirkungen von apoEp1.B modulieren, zur Verwendung in den beschriebenen Verfahren zum Modulieren der Immun-Antwort.
  • Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können Zusammensetzungen für eine intralesionale, intravenöse, topische, rektale, parenterale, lokale, Inhalations- oder subkutane, intradermale, intramuskuläre, intrathekale, transperitoneale, orale und intrazerebrale Verwendung sein. Die Zusammensetzung kann in flüssiger, fester oder halbfester Form vorliegen, beispielsweise in Form von Pillen, Tabletten, Cremes, Gelatine-Kapseln, Kapseln, Zäpfchen, Weichgelatine-Kapseln, Gels, Membranen, Röhrchen, Lösungen oder Suspensionen. Das apoEp1.B-Peptid wird vorzugsweise in einer Kochsalz-Lösung entweder intravenös, intraperitoneal oder subkutan injiziert. Mehrere Arten der Verabreichung sind zugänglich, wenn man eine Zusammensetzung verwendet, die ein Nukleinsaüre-Molekül enthält, das für ein apoEp1.B-Protein kodiert. Rekombinante Moleküle, die eine Nukleinsaüre-Sequenz umfassen, die für ein apoEp1.B-Protein oder ein Fragment davon kodiert, können direkt in Zellen oder Gewebe in vivo eingeführt werden unter Anwendung von Zufuhr-Vehikeln, wie beispielsweise Retro-Virus-Vektoren, Adeno-Virus-Vektoren und DNS-Virus-Vektoren. Sie können auch in Zellen in vivo oder in vitro unter Anwendung physikalischer Verfahrensweisen eingeführt werden wie Mikroinjektion und Elektroporation, oder durch chemische Verfahrensweisen wie beispielsweise Coprezipitation oder Einarbeitung von DNS in Liposome. Rekombinante Moleküle können auch zugeführt werden in Form eines Aerosols oder durch eine Spülung. Die Nukleinsäue-Moleküle gemäß der Erfindung können auch extrazellulär angewendet werden, beispielsweise durch direkte Injektion in Zellen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können vorgesehen werden für eine Verabreichung an Menschen oder Tiere. Zu verabreichende Dosierungen hängen von individuellen Bedürfnissen, von der gewünschten Wirkung oder von dem gewählten Verabreichungs-Weg ab.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch per se bekannte Verfahrensweisen zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Zusammensetzungen hergestellt werden, die an Patienten verabreicht werden können, und zwar derart, dass eine wirksame Menge der aktiven Substanz in einer Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel bzw. Träger kombiniert wird. Geeignete Vehikel bzw. Träger sind beispielsweise beschrieben in der Druckschrift „Remington's Pharmaceutical Sciences; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA (1985)".
  • Auf dieser Basis schließen die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein (auch wenn sie nicht exklusiv daraus bestehen) die aktive Verbindung oder Substanz in Assoziation mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln bzw. Trägern oder Verdünnungsmitteln und sind enthalten in gepufferten Lösungen mit einem geeigneten pH-Wert und sind iso-osmotisch mit den physiologischen Fluids. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzlich andere Mittel zur Erhöhung der Wirksamkeit des apoEp1.B-Peptids oder einer Nukleinsäure enthalten.
  • C. Das Peptid imitierende Substanzen (Peptide-Mimetics)
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch das Peptid imitierende Substanzen (Peptide-Mimetics) der apoEp1.B-Peptide gemäß der Erfindung ein.
  • Beispielsweise wird ein Peptid, das von einer Bindungs-Domain von apoEp1.B abgeleitet ist, direkt oder indirekt mit einem assoziierten Molekül in einer solchen Weise in Wechselwirkung, dass es die native Bindungs-Domain imitiert. Solche Peptide können kompetitive Inhibitoren, Verstärker, das Peptid imitierende Substanzen (Peptide Mimetics) und dergleichen einschließen. Alle diese Peptide sowie Moleküle, die im wesentlichen homolog, komplementär oder in anderer Weise funktionell oder strukturell äquivalent mit diesen Peptiden sind, können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • „Das Peptid imitierende Substanzen (Peptide Mimetics)" sind Strukturen, die als Substitute für Peptide in Wechselwirkungen zwischen Molekülen dienen (siehe: „Morgan et al. (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: 243 bis 252" für eine Übersicht). Das Peptid imitierende Substanzen (Peptide Mimetics) schließen synthetische Strukturen ein, die Aminosaüren und/oder Peptid-Bindungen enthalten können oder nicht enthalten können, jedoch die strukturellen und funktionellen Merkmale eines Peptids erhalten, sowie Verstärker oder Inhibitoren gemäß der Erfindung. Peptide Mimetics schließen auch Peptoide, Oligopeptoide („Simon et al. (1972), Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89: 9367") und Peptid-Bibliotheken ein, die Peptide einer vorgesehenen Länge enthalten, die alle möglichen Sequenzen von Aminosäuren wiedergeben, die einem Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechen.
  • Peptide Mimetics können entworfen werden auf der Basis von Information, die durch systematisches Ersetzen von L-Aminosaüren durch D-Aminosaüren, durch Ersetzen von Seitenketten durch Gruppen mit unterschiedlichen elektronischen Eigenschaften und durch systematisches Ersetzen von Peptid-Bindungen durch Amid-Bindungs-Ersatz erhalten werden. Lokale Konformations-Zwänge können auch eingeführt werden, um Konformations-Erfordernisse für die Aktivität eines als Kandidat vorgesehene Peptide Mimetics zu bestimmen. Die Mimetics können isosterische Amid-Bindungen oder D-Aminosaüren zum Stabilisieren oder Fördern von Umkehr-Strang-Konformationen und zur Unterstützung zum Stabilisieren des Moleküls einschließen. Zyklische Aminosäure-Analoge können verwendet werden, um Aminosaüre-Reste auf spezielle Konformations-Zustände einzuschränken. Die Mimetics können auch Mimetics von Inhibitor-Peptid-Sekundärstrukturen einschließen. Diese Strukturen können die dreidimensionale Orientierung von Aminosäure-Resten in die bekannten Sekundär-Konformationen von Proteinen modelieren. Peptoide können auch verwendet werden, die Oligomere von N-substituierten Aminosäuren sind, und sie können als Motive für die Erzeugung chemisch diversifizierter Bibliotheken neuer Moleküle verwendet werden.
  • Peptide gemäß der Erfindung können auch verwendet werden zum Identifizieren von Leitverbindungen zur Arzneimittel-Entwicklung. Die Struktur der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Peptide kann in einfacher Weise bestimmt werden durch eine Anzahl von Verfahrensweisen wie beispielsweise NMR und Röntgenstrahl-Kristallographie. Ein Vergleich der Strukturen von Peptiden, die hinsichtlich ihrer Sequenz ähnlich sind, sich jedoch hinsichtlich ihrer biologischen Aktivitäten unterscheiden, die sie in Ziel-Molekülen auslösen, kann Informationen über die Struktur-Aktivitäts-Beziehung des Ziel-Moleküls liefern. Informationen, die durch die Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen erhalten werden, können verwendet werden, um entweder modifizierte Peptide oder andere kleine Moleküle oder Leit-Verbindungen zu entwerfen, die hinsichtlich vorausgesagter Eigenschaften getestet werden können, wie sie mit dem Ziel-Molekül in Bezug stehen. Die Aktivität der Leit-Verbindungen kann unter Verwendung von Assays bewertet werden, die ähnlich denjenigen sind, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind. Informationen über Struktur-Aktivitäts-Beziehungen können auch erhalten werden aus Co-Kristallisations-Untersuchungen. In diesen Untersuchungen wird ein Peptid mit einer gewünschten Aktivität zusammen mit einem Ziel-Molekül kristallisiert, und die Röntgenstrahl-Struktur des Komplexes wird bestimmt. Die Struktur kann dann mit der Struktur des Ziel-Moleküls in seinem nativen Zustand verglichen werden, und Informationen aus einem derartigen Vergleich können verwendet werden, um Verbindungen zu entwerfen, von denen erwartet wird, dass sie die gewünschten Aktivitäten besitzen.
  • Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele sind veranschaulichend für die vorliegende Erfindung:
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • apoEp1.B induziert dendritische Zellen und eine Differenzierung von Tumor-Zellen
  • Materialien und Verfahrensweisen
  • Reagenzien
  • Phorbol 12-myristat-l3-acetat (PMA) (Firma Calbiochem, La Jolla CA) wurde in Ethanol gelöst und bei –80° C gelagert.
  • Mäuse
  • C57BL/6J (B6)-(H2b)-, apoE-knockout-(H2b)- und BALB/c (H2d)-Mäuse im Alter zwischen 8 und 18 Wochen wie sie in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden von der Firma Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME gekauft. Die Mäuse wurden mit einem regulären Mäuse-Futter (#5012) gefüttert, das einen niedrigen Fettgehalt aufwies (4,5 % (Gewicht/Gewicht)) und einen niedrigen Cholesterin-Gehalt aufwies (0,022 % (Gewicht/Gewicht)) (Firma Ralston, Purina, St. Louis, MO.).
  • Zellen und Kulturmedium
  • Transformierte Mause-Monozyten-PU5-1.8- und -J77A1.4-Zell-Linien, menschliche monoblasten Leukämie-THP-1- und -U-937-Zellen und Mause-B-Zellen-Lymphom-A20-Zellen wurden in einem RPMI 1640-Medium kultiviert (Firma Gibco Laboratories, Grand Island, NY das 5 × 105 M 2ME, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 5,0 IU/ml Penicillin Streptomycin (Gibco) und 10 % durch Hitze inaktiviertes fetales Kälberserum (Fetal Bovine Serum; FBS) (Firma Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) (cRPMI) enthielt.
  • Peptid-Synthese und Reinigung und Proteine
  • Peptide wurden auf einem Beckman 990C Peptid-Synthesizer synthetisiert, wie dies früher beschrieben worden war (MacNeil et al., 1993). Die Peptide wurden dann durch HPLC auf einer Umkehr-Phasen-C18-Säule mit einem Wasser-Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die Peptide wurden in einer Konzentration von 2 mg/ml in destillierten H2O gelöst und durch ein 0,22 μm Filter filtersterilisiert und weiter entweder in cRPMI 1640 zur Verwendung in Proliferations-Assays gelöst oder in CFA oder IFA für eine Immunisierung von Mäusen emulgiert. Human-Plasma-VLDL-gereinigtes apoE (Firma Calbiochem) wurde als natives apoE verwendet.
  • Herstellung einer Ein-Zellen-Suspension
  • Mäuse wurden in einer CO2-Kammer euthanisiert, und entweder die Milz oder Lymphknoten wurden aseptisch entfernt und in eiskalte PBS (Phosphat gepufferte Kochsalz-Lösung) eingetaucht. Zellen wurden separiert durch Zerteilen der Gewebe durch ein feinmaschiges Sieb. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 1.500 Upm für die Zeit von 5 min pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. Erythrozyten in Milz-Zubereitungen wurden unter Verwendung von ACK-Lyse-Puffer (0,15 M NH4Cl; 1,0 mM KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,3) für 2 min bei Raumtemperatur lysiert und dann in PBS erneut suspendiert und zwei weitere Male pelletiert, um die Zellen zu waschen.
  • T-Zellen-Proliferations-Assay
  • BALB/c-Mäusen wurde unter leichter Anästhesie 50 μl-Volumenmengen injiziert, die 0, 1, 10 oder 100 μg/ml apoE-Peptid enthielten, das in IFA oder CFA emulgiert war, und zwar in die Hinterpfote. Nach 10 Tagen des Entwässerns wurden die (Kniekehlen-) Lymphknoten entfernt, und die T-Zellen wurden gereinigt durch Durchleiten durch Nylonwolle. 5 × 105 gereinigte T-Zellen und 2 × 105 Gamma-bestrahlte (60Co, 2.500 rad) (Atomic Energy, Canada) autologe Milz-APCs wurden mit 0, 1, 10 oder 100 μg/ml apoE-Peptid in 96 Loch-Flachboden-Mikrotiter-Platten bei 5 % CO2 und 37° C drei Tage lang inkubiert. PPD (20 μg/ml) diente als positive Kontrolle in den Fällen, in denen CFA verwendet wurde. Entweder APCs oder T-Zellen allein, inkubiert mit einem der beiden stimulierenden Peptide dienten als Negativ-Kontrolle. 50 μl [3H]-TdR (0,5 μCi/Vertiefung) wurden für einen Zeitraum von weiteren 18 h zugesetzt, und danach wurden die Zellen gewonnen (Firma Tomtec, Orange, CONN). Der Einbau von [3H]-TdR wurde gemessen auf einem Mikrobeta Liquid Scintillation Counter (Firma Wallac, Turku, Finnland).
  • Proliferations-Assays
  • Ungeprimte Milz-Zellen oder Peritoneal-Exudat-Zellen (PECs) wurden mit 0, 1, 10 oder 100 μg/ml apoEp1.B oder einer negativen Kontrolle in 96 Vertiefungen aufweisenden Flachboden-Mikrotiter-Platten bei 5 % CO2 und 37° C 2 Tage lang inkubiert. 50 μl [3H]-TdR (0,5 μCi/Vertiefung) wurden für weitere 18 h zugesetzt, und die Zellen wurden dann gewonnen (Firma Tomtec, Orange, CONN). Die [3H]-TdR-Einbindung wurde auf einem Mikrobeta Liquid Scintillation Counter (Firma Wallac, Turku, Finnland) gemessen. PU5-1.8-, J77A1.4-, A20- und U-937-Zell-Linien wurden in ähnlicher Weise behandelt, wurden jedoch mit Peptid 12 h vor einer Zugabe von [3H]-TdR für einen weiteren Zeitraum von 18 h inkubiert. Die Ergebnisse von den U-937-Zell-Linien sind in 15 gezeigt. Zell-Überstände wurden von den meisten Zell-Kulturen vor einer Radioisotyp-Zugabe gewonnen und auf ihren Zytokin-Gehalt getestet.
  • Gemischte Leukozyten-Reaktions-Assays
  • Ein Primär-Allogen-MLR wurde mit NOD-Splenozyten als Stimulatoren und durch Nylon-Wolle angereicherten naiven T-Zellen von BALB/c-Mäusen als Respondern angesetzt. Die Stimulator-Zellen wurden 3 Tage lang mit verschiedenen Kombinationen von apoEp1.B, GM-CSF und PU5-1.8-Überstand, der TNF enthielt, vor-inkubiert. Die Stimulator-Zellen wurden dann mit Mitomycin C behandelt (50 μg/ml, 20 min bei 37° C; Firma Sigma) und wurden mit 4 × 104 Responder 3 Tage lang gemeinsam kultiviert.
  • Danach wurden die Zellen mit 50 μl [3H]-TdR (0,5 μCi/Vertiefung) 24 h lang gepulst. Die Zellen wurden gewonnen (Tomtec) und der Einbau von [3H]-TdR wurde auf einem Microbeta Liquid Scintillation Counter (Firma Wallac) gemessen. Jeder Balken steht für den mittleren cpm-Wert aus drei Kulturen.
  • Zytokin-Analyse
  • Kultur-Überstände wurden auf die Konzentration von IL-2, IL-4 und IFNγ unter Verwendung von Sandwick-ELISA-Assays getestet. Man folgte den Vorschriften des Herstellers (Firma Pharmingen). 96 Vertiefungen aufweisende Mikrotiter-ELISA-Platten wurden überzogen mit 50 μl, 1 μg/ml α-IL-2, α-IL-4 oder α-IFNγ-mAB in Überzugs-Puffer (0,1 M NaHCO3, pH-Wert 8,2), und zwar über Nacht bei 4° C. Die Platten wurden zweimal mit PBS-T gewaschen (PBS, Tween-20 (Firma Sigma, St. Louis, MO)), und die Platten wurden 2 h lang bei Raumtemperatur mit 100 μl Blockierpuffer blockiert (PBS, 5 % BSA). Die Platten wurden zweimal gewaschen, und 50 μl umfassende Proben wurden dreifach für eine Inkubation über Nacht bei 4° C zugesetzt. Die Platten wurden dann 5 Mal gewaschen und wurden im Anschluss an eine zweistündige, bei Raumtemperatur stattfindende Inkubations-Periode mit 50 μl, 1 mg/ml biotinylierten α-IL-2, α-IL-4 oder α-IFNγ-mAB (Firma Pharmingen) 8 Mal gewaschen. 50 μl, 1 μg/ml Streptavidin-alkalische Phosphatase (Firma Pharmingen) wurde dann für 1 h bei Raumtemperatur zugesetzt. Im Anschluss an 8 Waschungen wurden 50 μl p-Nitrophenylphosphat-Substrat (pNPP (Firma Sigma)) zugesetzt, und die Absorbtion bei O.D. 405 nm wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Ablesers (Firma Biorad, Hercules, CA) bestimmt, nachdem sich Farbe entwickelt hatte.
  • Immunofluoreszenz und Fließ-Zytometrie
  • 1 × 106 Zellen wurden mit eiskalter PBS gewaschen und in 25 μl PBS resuspendiert und mit 10 μl normalem Mause-Serum und Fluorochrom-konjugiertem Anti-Maus-CD11a-, CD11b-, CD14-, MHC-Klasse II-, CD95-, CD62L-, CD62E-, B7-1-, B7-2- und ICAM-1-Monoklonal-Antikörpern (mAb's) (Firma Pharmingen, Mississauga, Kanada) 45 min lang auf Eis inkubiert. Dendritsche Zell-Marker DEC-205, 33D1, CD11c (N418) unkonjugierte Antikörper wurden in ähnlicher Weise behandelt, jedoch wurden im Anschluss an eine primäre Antikörper-Inkubation die Zellen dreimal gewaschen, und ein Sekundär-Ziegen-Anti-Ratten- (für 33D1- und DEC-205 Ab's) und Ziegen-Anti-Hamster-(für CD11c Ab)-Fluorochrom-konjugierter Antikörper wurde dann für 45 min auf Eis zugegeben. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen. Alle Proben wurden in 300 μl PBS resuspendiert, und die Fluoreszenz der gefärbten Rattenzellen wurde analysiert auf einem FACScan-Fließ-Zytometer (Firma Becton Dickinson, Mountain View, CA), und die gesammelten Daten wurden unter Verwendung der Lysis II-Software der Firma Becton-Dickinson analysiert.
  • Zell-Zyklus-Analyse
  • 1 × 106 Zellen wurden gewaschen und erneut in hypotonischer Propidiumiodid-(PI-) Färbelösung suspendiert (0,1 % [w/v] Natriumcitrat; 0,1 % [v/v] Triton X-100; 0,05 μg/ml Propidiumiodid), und man ließ sie zum Färben in der Dunkelheit über Nacht bei 4° C stehen. Die Zellen wurden auf einen FACScan-Fließ-Zytometer analysiert, und die Prozentmenge an Zellen in jeder Phase des Zell-Zyklus wurde quantitativ unter Verwendung der ModFit-Software (Firma Becton Dickinson) erfasst. Aggregate wurden von der Analyse durch die Verwendung des Doublett-Diskriminierungs-Moduls und anschließendes Ausblenden auf dem linearen roten (FL2) Fluoreszenz-Bereich und unter Verwendung von Breiten-Parametern ausgeschlossen.
  • Intraperitoneale Injektion
  • BALB/c-Mäusen wurden i. p. 300 μg apoE-Peptid injiziert, und 48 Stunden später wurden PECs post-mortem gewonnen durch peritoneale Spülung unter Verwendung von eiskalter Kochsalz-Lösung.
  • Adoptive Transfer-Untersuchungen
  • An RBC-verarmte diabetogene Splenozyten von 17 bis 20 Wochen alten weiblichen NOD-Mäusen wurden in Kochsalzlösung resuspendiert. 8 bis 10 Wochen alten NOD. SCID-Mäusen wurden 0,2 μl Kochsalzlösung i. p. injiziert, die 107 diabetogene Splenozyten enthielt. Dieselben Mäuse wurden dann über die Pfote immunisiert, und zwar entweder mit 200 μg/ml apoEp1.B oder mit 200 μg/ml apoEp2. Die Urin-Glucose-Werte wurden zweiwöchentlich unter Verwendung von enzymatischen Glycose-Test-Streifen überwacht (Firma Eli Lilly, Toronto, Ont.). Sobald Urin positiv getestet wurde, wurden die Blut-Glucose-Werte (BGL) untersucht unter Verwendung eines Glucometers der Firma Encore (Miles/Bayer). Mäuse, die einen BGL-Wert > 11,1 mMol/L (200 mg/dl) für 2 aufeinander folgende Wochen zeigten, wurden als an Diabetes erkrankt angesehen.
  • Ergebgnisse
  • ApoEp1.B-Peptid induziert eine Dendrit-ähnliche Zell-Morphologie
  • Ungeprimte Splenozyten, angereicherte Milz-Monozyten und monozytische PU5-1.8- und J77A4.1-Zell-Linien von BALB/c-Mäusen wurden inkubiert mit 0, 1, 10 oder 100 μg/ml apoEp1.B (239 bis 252)- oder negativen Kontroll-apoEp1.D-(236 bis 249)-Peptid, um die Aktivität abzuschätzen. Nach nur 2 h begannen apoEp1.B-inkubierte Zellen, nicht jedoch apoEp1.D-inkubierte Zellen, sich von Kunststoff-Platten zu lösen und aggregierten in Suspension optimal bei 100 μg/ml. Nach 24 h erschienen diese Zellen morphologisch weniger gerundet, mehr kornförmig. Photographien wurden nach 24 h aufgenommen, und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt (Vergrößerung: 400 X). Nach 48 h zeigten sie dendrit-ähnliche Prozesse. Eine FACS-Analyse bestätigte eine Erhöhung der Zell-Größe und -Granularität (2).
  • ApoEp1.B-Peptid induziert DC-ähnliche Marker-Expression
  • Morphologisch erschienen apoEp1.B-behandelte Zellen DC-artig. Dies wurde durch FACS-Analyse bestätigt. Ungeprimte BALB/c-Splenozyten und PU5-1.8-Zellen wurden 24 h lang mit 100 μg/ml apoEp1.B oder dem Kontroll-Peptid apoEp1.-D inkubiert und dann für eine FACS-Analyse gefärbt. Eine Oberflächen-Expression von CD14, CD11a, CD11b, CD11c, B7-1, B7-2, DEC-205, 33D1, MHC-Klasse II, fas, CD40, CD62L (L-Selectin) und CD43 (Leukosialin) war über den Hintergrund hinaus erhöht bei apoEp1.B-inkubierten PU5-1.8-Zellen, und zwar nach 24 h Inkubation (3 und 4). Bei Wiederholung der Experimente wurde gefunden, dass die Expression von Mac-3 und CD54 (ICAM-1) relativ schwankend ist.
  • Um abzuschätzen, ob durch apoEp1.B-induzierte Phenotyp Änderungen Dosis-abhängig sind, wurden 105 PU5-1.8-Zellen 20 h lang mit 0 (nur Medium) 1, 10 oder 100 μg/ml apoEp1.B- in 24 Vertiefungen aufweisenden Platten inkubiert und wurden dann für eine FACS-Analyse gefärbt. 10.000 Ereignisse wurden gewonnen. B7-1-Marker wird gezeigt. Die Ergebnisse, wie sie in 5 gezeigt sind, veranschaulichen, dass – wie gefunden wurde – 100 μg/ml apoEp1.B optimal ist, jedoch führte 1 μg/ml zu leichten Phenotyp-Änderungen.
  • Eine Oberflächen-Expression von B7-1, B7-2, MHC-Klasse II, CD28, CD11a, CD11c und 33D1 waren über den Hintergrund-Wert hinaus bei apoEp1.B-inkubierten Splenozyten nach 24 h Inkubation erhöht (siehe 4). Es gab auch eine Erhöhung bei CD40 und eine Senkung bei L-Selectin (Daten nicht gezeigt) bei mit apoEp1-behandelten Splenozyten. Es gab keine Änderungen bei der Expression von CD16/32 zu irgendeiner Zeit.
  • ApoEp1.B-Peptid-induzierte Differenzierung und Aktivierung ist nicht Stamm- oder Spezies-spezifisch
  • Ungeprimte B6- und NOD-Splenozyten wurden inkubiert mit 100 μg/ml apoEp1.B oder apoEp1.D, um zu bestimmen, ob apoEp1.B Stamm-spezifisch ist. Nach 48 h in Kultur wurden die Zellen für eine FACS-Analyse gefärbt. B6- und NOD-Splenozyten antworteten auf apoEp1.B mit einer ähnlichen Marker-Expressions-Erhöhung im Vergleich zu derjenigen von BALB/c-Splenozyten (Daten nicht gezeigt). Naive Milz-Zellen von apoE-defizienten (apoE-K.O.-) Mäusen wurden auch getestet, um zu bestimmen, ob eine in-vivo-Produktion von apoE irgendeinen Einfluss auf diesen Effekt hat. apoE-K.O-Splenozyten antworteten auch mit einer ähnlichen Marker-Expressions-Erhöhung im Vergleich zu derjenigen von BALB/c-Splenozyten (Daten nicht gezeigt). Da menschliches apoEp1.B-(HapoEp1.B) (239 bis 252) Peptid einen hohen Grad von Homologie zu von Mäusen stammendem apoEp1.B-Peptid aufweist (239T zu 239A und 248I zu 248A), wurde die Spezies-Kreuz-Reaktivität getestet. Die humane monozyten Zell-Linie U-937 antwortete innerhalb 24 h auf 100 μg/ml apoEp1.B mit ähnlichen, jedoch weniger tiefgreifenden morphologischen und phenotypischen Änderungen im Vergleich zu denjenigen von PU5-1.8-Zellen (15). Um zu bestimmen, ob das HapoEp1.B einen ähnlichen Einfluss auf Mäuse-Zellen hat, wurden 105 PU5-1.8-Zellen mit 100 μg/ml HapoEp1.B oder Mause-apoEp1.B 24 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann für eine FACS-Analyse gefärbt. HapoEp1.B induzierte ein Zell-Clustern und eine Erhöhung bei ähnlichen Markern wie denjenigen von Mäuse-apoEp1.B, jedoch zu einem geringeren Grad (die B7-1-Marker-Expression ist in 6 gezeigt).
  • ApoEp1.B induziert DC-artige Zellen, wenn es intraperitoneal injiziert wird
  • Um zu beurteilen, ob apoEp1.B DC-artige Zellen in vivo induzieren kann, wurde BALB/c-Mäusen i. p. 300 μg/ml apoEp1.B oder apoEp1.D injiziert. Nach 48 h wurden die PECs für eine FACS-Analyse gefärbt. apoEp1.B induzierte eine Erhöhung der Zellgröße und -Granularität (8A) und eine Erhöhung der Oberflächen-Expression von DEC-205, 33D1, CD11c, B7-1 und B7-2 (8B). Unmarkierte Peaks entsprechen apoEp1.D. Die mittlere Fluoreszenz-Intensität ist in Klammern gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass apoEp1.B eine Differenzierung und Aktivierung von PECs in vivo induziert, ähnlich zu dem in vitro-System.
  • Um die funktionelle Aktivierung von apoEp1.B-behandelten Zellen abzuschätzen, wurden ungeprimte BALB/c-Splenozyten inkubiert mit oder ohne apoEp1.B (100 μg/ml) in vitro für 24 h. Die Zellen (gewaschen und ungewaschen) wurden 12 h lang mit ConA stimuliert, und 3H wurde dann für weitere 12 h zugesetzt. Die Zellen wurden dann gewonnen, und die Radioaktivität-Aufnahme wurde mittels eines Counters ermittelt. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwert von Dreifach-Experiment-Vertiefungen (cpm+/–SEM). Wie in 9 gezeigt ist, antworten mit apoEp1.B behandelte Zellen auf das Mitogen um das 3-Fache stärker als unbehandelte Zellen.
  • Nach einer apoEp1.B-Immunisierung-produzierte Zytokine
  • apoEp1.B- oder apoEp1.D-immunisierte NOD-Lymphknoten-Zellen wurden 48 h lang in Abwesenheit eines Challenge-Antigens oder eines exogenen Zytokins kultiviert. Die Zell-Überstände wurden gewonnen und auf ihren Zytokin-Gehalt getestet, um zu beurteilen, ob apoEp1.B eine Th1- oder Th2-Response induzierte. apoEp1.B-geprimte Zellen schieden höhere Werte an IL-4 und niedrigere Werte an IL-2 ab als mit apoEp1.D geprimte Zellen (11). Es gab keine Änderung bei IFNγ.
  • T-Zell-Allostimulations-Aktivität von mit apoEp1.B-induzierten DC
  • Um das T-Zell-Allostimulator- oder -Inhibitor-Vermögen dieser DCs zu messen, wurden 4 × 104 angereicherte BALB/c-naiv-T-Zellen co-kultiviert mit 40, 400, 4.000 und 40.000 Mitomycin C behandelten NOD-Splenozyten, die inkubiert worden waren mit verschiedenen Stimulantien für die Zeit von 3 Tagen. Die T-Zell-Proliferation wurde gemessen im Anschluss an 3 Tage einer gemeinsamen Kultivierung durch [3H]-TdR-Einbau. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Balken geben den Mittelwert von Dreifach-Experimenten in den Vertiefungen wieder (cpm+/–S.D.). Die Bezeichnungen „*" und „**" stehen für p < 0,05 bzw. p < 0,001 in Zwei-Weg-ANOVA's, im Vergleich zu Kontrollen mit Medium allein (Null-Wert). Eine apoEp1.B-behandelte APC-Allostimulation war ähnlich derjenigen von unbehandelten APCs bei einer Konzentration von 4 × 104 APCs pro Vertiefung, jedoch gab es einen geringfügig höheren Wert, der apoEp1.B-behandelten-APC-T-Zellen-Stimulation gegenüber unbehandelten APCs bei 4 × 103 und 4 × 102 APCs. Es gab eine dramatische Erhöhung der Allostimulation, wenn APCs vor-inkubiert wurden mit GM-CSF, insbesondere bei 4 × 103 APCs pro Vertiefung. Diese Erhöhung war geringfügig, jedoch signifikant reduziert, wenn die APCs vor-inkubiert waren mit GM-CSF plus apoEp1.B. APCs (4 × 103) bei allen Balken (mit Ausnahme von „T allein") waren entweder unbehandelt (Null-Wert) oder vor-inkubiert mit 100 μg/ml apoEp1.B, apoEp1.B + GM-CSF oder GM-CSF allein, und zwar für 3 Tage vor einer Co-Kultur. Bei Kombinieren von Responder-T-Zellen mit APC wurden verschiedene exogene Faktoren zugegeben, einschließlich 20 μg/ml ConA und 5 μg/ml apoEp1.B. Sehr wenig Proliferation wurde nachgewiesen in Vertiefungen, die T-Zellen allein oder APC allein enthielten. T-Zellen proliferierten gut in Response auf ConA, jedoch war dann, wenn apoEp1.B zugesetzt wurde, die T-Zellen-Albstimulation vollständig aufgehoben.
  • Diskussion
  • Es ist bekannt, dass Monozyten-Zellen in DCs differenzieren können, jedoch war lange angenommen worden, dass GM-CSF für diesen Effekt essentiell ist (Scheicher et al., 1992). Es wurde hier gezeigt, dass ein neues eigenes Peptid, apoEp1.B, allein DCs in vitro sowohl von naiven Monozyten-Zellen als auch einer Mause-Zell-Linie induziert. Diese DCs besitzen die Morphologie und die Zell-Oberflächen-Marker klassischer DCs. apoEp1.B induziert auch DCs in vivo bei Immunisierung mit apoEp1.B. Diese DCs können eine Th2-Response bevorzugen, wie dies gezeigt wird durch eine Erhöhung der IL-4-Produktion und eine Absenkung der IL-2-Produktion, und können daher in eine gespaltene Toleranz involviert sein.
  • apoEp1.B induzierte eine DC-Morphologie in naiven BALB/c-Splenozyten, angereicherten Milz-Monozyten (Daten nicht gezeigt), Monozyten-Zell-Linien PU5-1.8 (1) und J77A4.1 in vitro (Daten nicht gezeigt). Im Anschluss an eine nur 2 stündige Inkubation begannen apoEp1.B-behandelte Zellen, sich von Kunststoff-Platten zu lösen und aggregierten in Suspension, ein Prozess, wie er für DCs charakteristisch ist. Da erhöhter Zell-Tod auftrat, zeigten Proliferations-Assays keine Gesamt-Erhöhung der Zell-Zahl (Daten nicht gezeigt). Dies ist konsistent mit dem Verlust von Proliferation, wie er für eine Zell-Differenzierung charakteristisch ist.
  • Eine apoEp1.B-Behandlung von PU5-1.8-Zellen induzierte eine Erhöhung in DC-spezifischen Markern DEC-205, 33D1 und CD11c. Andere Marker, die konsistenter Weise erhöht waren, waren CD11a, B7-1, B7-2, MHC-Klasse II, fas, CD40 und L-Selectin.
  • Eine apoEp1.B-Stimulierung von Splenozyten induzierte eine Erhöhung der Expression von CD40, CD11a, CD11c, 33D1, B7-1, B7-2, MHC-Klasse II, fas und fast bei 24 h. Ein ähnliches Profil wurde aufgezeichnet im Anschluss an eine 72 h dauernde post-apoEp1.B-Behandlung (Daten nicht gezeigt). Diese Änderungen waren nicht so dramatisch wie die Änderungen bei den durch apoEp1.B induzierten PU5-1.8-Oberflächen-Markern. Dies lenkt nicht ab von den Ergebnissen, die mit PU5-1.8-Zellen erhalten wurden, da diese Zellen transformiert werden und für schnelles Wachstum, Zell-Teilung und Protein-Synthese befähigt sind.
  • Änderungen bei B7-Costimulator-Molekülen würden unvermeidlich T-Zellen-Antworten ändern. Weiter ermöglicht eine Erhöhung von MHC-Klasse II, das DCs Peptide in einer höheren Dichte präsentieren, was sie effizienter entweder bei der T-Zell-Aktivierung oder -Toleranz macht. Eine Erhöhung der Expression von Haft-Molekülen wie beispielsweise LFA-1 kann ermöglichen, dass DCs von verschiedenen Geweben zu Lymphoid-Organen wandern, wo sie eingefangenes Ag präsentieren.
  • Im Gegensatz zu Splenozyten erhöht sich eine L-Selectin-Expression bei PU5-1.8-Zellen bei Inkubation mit apoEp1.B (Daten nicht gezeigt). L-Selectin wird schnell an aktivierten Zellen abwärts reguliert, und so legen die Milz-Zell-Daten nahe, dass apoEp1.B diese Zellen aktiviert.
  • Diese in Konflikt miteinander stehenden Ergebnisse sind nicht außergewöhnlich, wenn man betrachtet, dass PU5-1.8-Zellen genauso gut wie eine homogene Population transformiert werden. Heterogene Zell-Zell-Wechselwirkungen sowie parakrine Stimulator- und Inhibitor-Faktoren, die Immun-Antworten beeinflussen, können einige der Unterschiede zwischen Milz-Zellen und PU5-1.8-Zellen erklären. Weiter können transformierten PU5-1.8-Zellen Mechanismen fehlen, die für eine L-Selectin-abwärts-Regulierung nötig sind, wie beispielsweise spezielle Proteasen für eine L-Selectin-Spaltung. Die CD28-Expression an Splenozyten ist auch leicht bei apoEp1.B-Behandlung erhöht.
  • Eine leichte Erhöhung der makrophagen Differenzierungs-Marker CD14 und Mac-3 gibt an, dass eine Reifung von Makrophagen in apoEp1.B-behandelten Kulturen ebenfalls auftreten kann. Ob sich diese Zellen dann zu DCs entwickeln, eine Apoptose eintritt oder diese als Makrophagen bestehen bleiben, ist unbekannt.
  • Im Anschluss an eine i. p. Injektion induzierte apoEp1.B eine Erhöhung der PEC-Größe und -Granularität und eine Erhöhung der für DC-spezifischen Marker, nämlich DEC-205, 33D1 und CD11c sowie B7-1 und B7-2. Daher induziert eine Injektion von apoEp1.B auf i. p. Weg, das PEC einen ähnlichen, DC-artigen Phenotyp exprimieren, verglichen mit in vitro-Experimenten. Diese Erhöhung der DC-Marker-Expression ist nicht so ausgeprägt wie sie in vitro war, und zwar wahrscheinlich aufgrund der Verdünnung und/oder des Verschwindens von apoEp1.B-Peptid in vivo. Da jedoch DCs effizient in der T-Zellen-Stimulation oder -Inhibierung sind, kann selbst eine bescheidene Erhöhung der Zahl einen durchschlagenden Effekt auf eine Immun-Antwort haben.
  • Die Behandlung von NOD-Mäusen mit apoEp1.B stimulierte eine Erhöhung der IL-4-Sekretion, vermutlich durch Th2-artige Zellen, und eine Absenkung der IL-2-Sekretion. Die Immunisierung von Mäusen mit apoEp1.B induzierte auch eine Erhöhung der DC-Konzentration.
  • Ob apoEp1.B ein natürlich abgespaltenes Produkt von apoE ist, ist unklar, jedoch zweifelhaft. apoEp1.B bindet I-Ad mit einer ähnlichen Affinität wie derjenigen des originalen apoEp1-Peptids (das DCs nicht induziert), wird jedoch in Elutions-Experimenten nicht eluiert. Es wird daher wahrscheinlich nicht natürlich in hohen Konzentrationen abgespalten.
  • Wir zeigen hier, dass apoEp1.B eine mo/ma-Aktivierung stimuliert. Darüber hinaus induziert apoEp1.B DCs, die eine Th2-artige Response begünstigen. Diese DCs können partiell aktiviert werden oder nicht vollständig reifen, vollständig aktiviert werden oder zu voller Reife induziert werden durch inflammatorische Signale.
  • Beispiel 2
  • apoEp1.B inhibiert eine atherosklerotische Plaque-Entwicklung
  • Um die Rolle von apoEp1.B-Peptid bei Entzündungen zu untersuchen, speziell in Response auf eine Arterien-Verletzung, wurde ein Ballon-Angioplastie-Verletzungs-Modell verwendet, das gut charakterisiert wurde durch Dr. Alex Lucas (Lucas et al., 1996, Circ. 94: 2898-2900). 300 μg/ml apoEp1 oder apoEp1.B-Peptid wurden intraarteriell unmittelbar vor einer Angioplastie an der Stelle einer Verletzung der iliofemoralen Arterie der Ratte infundiert. Positive Kontrolle in Form von SERP-1 und negative Kontrolle in Form von Kochsalzlösung allein wurden ebenfalls verwendet. Die Ratten wurden sorgfältig überwacht und 6 Wochen nach der Behandlung euthanisiert, und die iliofemoralen Arterien wurden auf eine Plaque-Entwicklung durch Histochemie untersucht. Eine sorgfältige Messung der Arterien-Dicke und der Lumen-Größe zeigte eine durch apoEp1.B-Peptid (500 μg) verringerte Lesions-Größe in diesem Modell. Tatsächlich wurde in vielen der mit apoEp1.B behandelten Ratten kein Plaque festgestellt. Keine nachteiligen Wirkungen wurden bei apoEp1.B-behandelten Ratten beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 10 präsentiert.
  • Beispiel 3
  • Eine apoEp1.B-Immunisierung schützt Mäuse vor Diabetes
  • 8 weibliche 8 Wochen alte NOD-Mäuse wurden mit 250 μg apoEp1.B-Peptid in einer Pfote immunisiert, das in IFA emulgiert war. 6 Mäuse für die negative Kontrolle wurden mit Kochsalzlösung in IFA immunisiert. Die Mäuse wurden für die folgenden 4 Monate überwacht, und ihr Urin-Glukose-Wert wurde getestet, um eine Diabetes-Entwicklung abzuschätzen. Am Ende der 8 Monate blieben alle 8 mit apoEp1.B immunisierten Mäuse noch Diabetes-frei. 4 der 6 mit Kochsalz in IFA behandelten Mäuse waren aufgrund von Diabetes verstorben. Die Ergebnisse, die in 14 gezeigt sind, demonstrieren, dass eine Immunisierung mit apoEp1.B zur Diabetes neigende Mäuse schützt.
  • Beispiel 4
  • Eine Immunisierung mit apoEp1.B induziert Th2-artige Zellen
  • NOD-Mäuse wurden über die Pfote mit 200 μg/ml apoEp1.B- oder apoEp1.D-Peptid in IFA immunisiert. Im Anschluss an den Ablauf von 7 Tagen wurden die ablassenden Lymphknoten entfernt, und Zellen wurden in 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiter-Platten in Abwesenheit einer weiteren Stimulierung kultiviert. Die Zell-Kultur-Überstände wurden nach 48 h gewonnen und auf ihren Zytokin-Gehalt getestet. Die Ergebnisse, die in 11 gezeigt sind, demonstrieren, dass eine apoEp1.B-Immunisierung Th2-artige Zellen induziert. (Die Ergebnisse von IL-2, IL-4 und IFNγ werden präsentiert als der Mittelwert von Dreifach-Tests in den Vertiefungen (O.D. +/–SEM). * gibt einen Wert von p < 0,001 in 2-Weg ANOVAs wieder, verglichen mit Kontrollwerten bei Behandlung mit apoEp1.D).
  • Um zu bestimmen, ob die Th2-Response, die durch eine apoEp1.B-Immunisierung induziert worden war, die IDDM-Incidenz beeinflusste, wurden 10 weibliche, 8 Wochen alte NOD-Mäuse mit 200 μg/ml apoEp1.B immunisiert, und 10 Mäuse wurden mit negativen Kontrollen von apoEp2, emulgiert in IFA, immunisiert, und zwar in einer Pfote. Die Mäuse wurden für die folgenden 8 Monate überwacht, und ihr Urin und ihr Blut wurde auf Glycose getestet, um ein Anspringen der Krankheit zu erfassen. Zum Zeitpunkt von 10 Monaten waren 7 von 10 mit apoEp1.B immunisierten Mäusen Diabetesfrei geblieben, während eine von 10 mit apoEp2 behandelten Mäusen krankheitsfrei geblieben war (13A).
  • Beispiel 5
  • Eine Immunisierung mit apoEp1.B schützt NOD.SCID-Mäuse vor einer adoptiv übertragenen Diabetes
  • Um die Schutz-Wirkung von apoEp1.B in einem Alternativ-Modell von IDDM zu testen, wurden 107 diabetogenes Splenozyten adoptiv in 20 NOD.SCID-Mäuse übertragen. 10 dieser Mäuse wurden mit 200 μg/ml apoEp1.B immunisiert, die anderen wurden mit 200 μg/ml apoEp2 immunisiert, die anderen mit 200 μg/ml apoEp2. Alle 10 negativen Kontroll-Tiere erlagen der Krankheit nach 5 Wochen. 5 der 10 mit apoEp1.B behandelten Mäuse blieben zum Zeitpunkt von 9 Wochen Diabetes-frei (13B).
  • Diskussion der Ergebnisse der Beispiele 3, 4 und 5
  • Da eine Th2-Response schützend im NOD-Modell von IDDM sein kann und da eine apoEp1.B-Immunisierung von NOD-Mäusen eine Antwort des Th2-Typs begünstigt (siehe 11), wurde apoEp1.B auf einen Krankheits-Schutz in diesen Mäusen getestet. Eine Immunisierung mit apoEp1.B/IFA verzögerte signifikant das Anspringen der Krankheit bei NOD-Mäusen und bei NOD.SCID-Mäusen, denen die Krankheit adoptiv übertragen worden war. Durch apoEp1.B geschützte Mäuse hatten eine leicht geringere Insel-Infiltration, verglichen mit ungeschützten Mäusen (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass ein apoEp1.B-Schutz die Induktion von regulatorischen Zellen und weniger die Streichung von destruktiven Effektor-Zellen involvieren kann.
  • APCs von NOD-Mäusen haben – wie angenommen wird – funktionelle und/oder Differenzierungs-Defekte (Serreze et al., 1988; Serreze et al., 1993). Da NOD-Th2-Zellen mehr abhängig von einer B7-Costimulation sind als Th1-Zellen (Rulifson et al., 1997), kann eine proinflammatorische Th1-Response in diesen Mäusen aufgrund eines Fehlers vorherrschen. Konsistent mit dieser Annahme sind Untersuchungen, die demonstrieren, dass eine Th2-Zell-Hypenesponsivität, die NOD-Mäusen eigen ist (Zipris 1991 a und 1991b), entweder durch IL-4 (Rapoport et al., 1993, Mueller et al., 1996; Cameron et al., 1997) oder durch CD28-(Arreaza et al., 1997) Verabreichung in vivo reversibel ist. Eine Anti-CD28-Behandlung fördert – wie angenommen wird – ein Th2-Überleben bzw. eine Expansion. Weiter zeigen Mäuse mit Costimulations-Mangel (CD28–/–) schwerere IDDM (Rulifson et al., 1997).
  • Es ist unklar, welche Rolle DCs bei IDDM spielen. Jedoch wird die Wirkung von DCs bei der Krankheit betont durch die DC K.O.-Maus (ReIB–/–). Diese Mäuse zeigen eine aggressive Multi-Organ-Infiltration und -Entzündung. Eine andere Gruppe berichtete, dass Pankreas-DCs einen Krankheitsschutz bei Übertragung induzieren können (Clare-Salzler et al., 1992). Diese Ergebnisse legen nahe, dass DCs eine Schutz-Rolle bei IDDM spielen können. Weiter zeigten Voorbij et al. (1989), dass DCs die ersten Zellen waren, die sich um Pankreas-Inseln in den spontanen Diabetes-BB-Ratten-Modell akkumulieren, gefolgt von Lymphozyten.
  • Ob die Induktion von DCs bei apoEp1.B-Injektion eine direkte Wirkung auf den Krankheitsschutz hat, ist unbekannt, jedoch kann die resultierende Th2-Response einen Schutz vermitteln. Es wird vorgeschlagen, dass eine apoEp1.B-Immunisierung eine DC-Differenzierung stimuliert, bei einer Erhöhung der Zahl an B7-Costimulator-Molekülen. Diese noch wirksameren APCs, die zu einer stärkeren Costimulation in der Lage sind, retten die IL-4 produzierende Th2-Zell-Responsivität bei zu Diabetes neigenden Mäusen. Dies reduziert seinerseits das Auftreten der Krankheit. Alternativ oder zusätzlich kann apoEp1.B direkt auf T-Zellen wirken, indem es die CD28-Expression erhöht und/oder die Schwelle für eine Stimulation senkt. Da Th1-Zellen bereits in NOD-Mäusen stimuliert werden, kann eine schützende Th2- oder Th3-Zell-Stimulierung vorzugsweise wieder hergestellt werden. Konsistent mit dieser Feststellung sind die Daten, die keine Änderung der IFN-Produktion zeigen, jedoch eine Erhöhung bezüglich IL-4.
  • Da das Fehlen einer Th2-Zell-Responsivität, das NOD-Mäusen eigen ist (Zipris 1991a und 1991b), reversibel ist, wird vorgeschlagen, dass eine apoEp1.B-Immunisierung eine Th2-Responsivität in zu Diabetes neigenden Mäusen rettet, was seinerseits das Auftreten der Krankheit reduziert. Da Th-Zellen APCs zur Stimulierung benötigen, spekulieren wir, dass apoEp1.B einen Th2-induzierenden APC stimuliert, und zwar möglicherweise des DC-Phenotyps. Unabhängig vom Mechanismus kann apoEp1.B eine mögliche Selbst-Peptid-Therapie für Diabetes wie andere, durch Th1-vermittelte Autoimmun-Krankheiten eröffnen.
  • Beispiel 6
  • Modifikationen der apoEp1.B-Sequenz
  • Verschiedene Aminosäure-Substitutionen und -Verlängerungen wurden an dem apoEp1.B-Peptid durchgeführt, wie dies in den Tabellen 1 und 2 veranschaulicht wird. Die modifizierten Peptide wurden in einer Konzentration von 100 μg/ml mit 105 PU5-1.8-Zellen 20 h lang inkubiert. Die Zellen wurden mit B7-1 für eine FACS-Analyse gefärbt. Die Ergebnisse zeigen, dass einige, jedoch nicht alle einzelnen Aminosäure-Substitutionen, Verlängerungen oder Streichungen die Wirkungen von apoEp1.B senken oder aufheben können (siehe Tabelle 1 und 2 sowie 16). Dies stützt die Auffassung, dass es einen Rezeptor gibt, an den sich apoEp1.B bindet, und dass bestimmte Aminosäure-Änderungen die Peptid-Rezeptor-Affinität senken. Die Deletion bzw. Streichung von 239T führt zu einer stark verringerten Wirkung auf die Oberflächen-Marker-Änderungen. Jedoch hat die Substitution dieser selben Aminosäure durch einen Alanin-Rest (wie in der Sequenz von HapoEp1.B) nur eine leicht verringerte Auswirkung, verglichen mit apoEp1.B. Daher ist die Länge von apoEp1.B wahrscheinlich un wichtig für die Rezeptor-Bindung. Es scheint auch, dass die strukturelle Integrität in dem Carboxy-terminalen Bereich des apoEp1.B-Peptids liegt, da leichte Änderungen in diesem Bereich die Aktivität des Peptids senken oder aufheben.
  • Zwar wurde die vorliegende Erfindung beschrieben unter Bezugnahme auf das, was derzeit als die bevorzugten Beispiele angesehen wird; es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht auf die offenbarten Beispiele beschränkt ist. Im Gegenteil: Es ist beabsichtigt, dass die Erfindung verschiedene Modifikationen und äquivalente Anordnungen abdeckt, die in den Geist und Umfang der beigefügten Patentansprüche eingeschlossen sind.
  • Vollständige Literaturzitate, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird
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  • Tabelle 1 ApoEp.1 B-Verlängerungen und -Trunkierungen
    Figure 00460001
  • Tabelle 2 ApoEP1.B-Aminosäure-Substitutuionen
    Figure 00470001
  • Tabelle 3
    Figure 00480001
  • Sequenzliste
    Figure 00490001
  • Figure 00500001

Claims (39)

  1. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Auslösung einer Zelldifferenzierung, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  2. Eine Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Differenzierung die Differenzierung zwischen einem Monozyten und einer dendritischen Zelle ist.
  3. Eine Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist und das Medikament für die Behandlung des Tumors vorgesehen ist.
  4. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Auslösung einer Immuntoleranz, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  5. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition oder Prävention einer Entzündung, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosaüresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  6. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition einer atherosklerotischen Plaqueentwicklung, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  7. Eine Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Medikament zur Inhibition einer atherosklerotischen Plaquebildung bestimmt ist.
  8. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention einer Autoimmunkrankheit, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  9. Eine Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Autoimmunkrankheit Diabetes ist.
  10. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren von tolerogenen dendritischen Zellen, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  11. Eine Verwendung eines apoEp1.B Peptids oder einer Nucleinsäure, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Tumors, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  12. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1) hat.
  13. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2) hat.
  14. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3) hat.
  15. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4) hat.
  16. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5) hat.
  17. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6) hat.
  18. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) hat.
  19. Eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das apoEp1.B Peptid die Aminosäuresequenz QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8) hat.
  20. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Pharmazeutikum, das ein apoEp1.B Peptid oder eine Nucleinsäure umfasst, die ein apoEp1.B Peptid kodiert, in Beimischung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  21. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit vorgesehen ist.
  22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Autoimmunkrankheit Diabetes ist
  23. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Entzündung bestimmt ist.
  24. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Atherosklerose bestimmt ist.
  25. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Tumors vorgesehen ist.
  26. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminosäuresequenz AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2).
  27. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminosäuresequenz TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3).
  28. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminosaüresequenz TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4).
  29. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminasäuresequenz TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5).
  30. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminasäuresequenz TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6).
  31. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminosäuresequenz QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7).
  32. Ein apoEp1.B Peptid mit der Aminosäuresequenz QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  33. Ein apoEp1.B Peptid oder eine Nucleinsäure, die ein apoEp1.Peptid kodiert, zur Verwendung als Pharmazeutikum, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr, 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  34. Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes zur Auslösung einer Zelldifferenzierung, das das Formulieren eines apoEp1.B Peptids in ein solches Medikament beinhaltet, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  35. Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes zur Auslösung einer Immuntoleranz, das das Formulieren eines apoEp1.B Peptids in ein solches Medikament beinhaltet, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  36. Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition oder Prävention einer Entzündung, das das Formulieren eines apoEp1.B Peptids in ein solches Medikament beinhaltet, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  37. Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition einer atherosklerotischen Plaqueentwicklung, das das Formulieren eines apoEp1.B Peptids in ein solches Medikament beinhaltet, wobei das apaEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  38. Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention einer Autoimmunkrankheit, das das Formulieren eines apoEp1.B Peptids in ein solches Medikament beinhaltet, wobei das apoEp1.B Peptid eine Aminosäuresequenz hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: TQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 1), AQQIRLQAEAFQAR (SEQ ID Nr. 2), TAQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 3), TQAIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 4), TQQARLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 5), TQQIALQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 6), QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 7) und QQIRLQAEIFQAR (SEQ ID Nr. 8).
  39. Ein Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Autoimmunkrankheit Diabetes ist.
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