KR20070058463A

KR20070058463A - 분획 장치

Info

Publication number: KR20070058463A
Application number: KR20077004631A
Authority: KR
Inventors: 가쯔히로 다나하시; 히로시 다까하시; 히로유끼 수가야; 시게히사 와다
Original assignee: 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2005-08-30
Publication date: 2007-06-08
Also published as: CA2578202C; CN101010334A; WO2006025352A1; CA2578202A1; JP4910700B2; EP1785431A1; US20110009503A1; EP1785431B1; EP1785431A4; JPWO2006025352A1; CN101010334B; US20090191105A1

Abstract

본 발명에서는, 1) 단백질 등이 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 소 혈청 알부민 용액을 접촉시켰을 때 상기 기재 표면에 대한 소 혈청 알부민의 흡착량이 50 ng/㎠ 이하인 것, 2) 단백질 등이 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 상기 기재 표면에 인간 β2-마이크로글로블린과 소 혈청 알부민으로 이루어지는 단백질 수용액에 접촉시켰을 때, 상기 기재에 대한 인간 β2-마이크로글로블린의 흡착량이 3 ng/㎠ 이하인 것, 3) 단백질 등을 함유하는 용액을 공급하는 공급 수단, 용액으로부터 단백질 등을 분리하는 수단, 및 용액 중의 단백질 등을 농축하는 수단을 갖고, 분획 장치에서의 단백질 등이 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 친수성 고분자에 의해서 그래프팅되어 있는 것 중 어느 하나의 특징을 갖는 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치를 개시한다. 상기 구성의 장치에 의해, 기재에 대한 단백질의 비특이 흡착이 적고, 고분자량의 단백질이 제거된 분석에 유리한 시료가 용이하게 얻어진다.

분획 장치, 소 혈청 알부민 용액, 인간 β2-마이크로글로블린, 단백질 수용액

Description

분획 장치{FRACTIONATION APPARATUS}

본 발명은 단백질 및/또는 펩티드를 함유하는 용액, 특히 혈액, 소변 등의 체액으로부터 단백질 및/또는 펩티드 등의 생체 성분을 분리하여 분석용 용액을 제조하기 위한 분획 장치에 관한 것이다.

최근 포스트 게놈 연구로서, 프로테옴 해석 연구(프로테오믹스)가 주목받기 시작하였다. 유전자 산물인 단백질은 유전자보다도 질환의 용태에 직접 관련이 있다고 생각되기 때문에, 단백질을 망라적으로 조사하는 프로테옴 해석의 연구 성과는 진단과 치료에 널리 응용할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 게다가, 게놈 해석에서는 발견할 수 없던 병의 원인 단백질이나 질환 관련 인자를 많이 발견할 수 있을 가능성이 높다.

프로테옴 해석이 급속히 진전되기 시작한 것은, 기술적으로는 질량 분석 장치(mass spectrometer:MS)에 의한 고속 구조 분석이 가능해진 것이 크고, MALDI-TOF-MS(매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량분석법, matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) 등의 실용화에 의해서 높은 작업 처리량으로 폴리펩티드의 초미량 분석이 가능해지고, 종래 검출할 수 없었던 미량 단백질까지 동정할 수 있게 되어 질환 관련 인자의 탐 색에 강력한 도구가 되고 있다.

프로테옴 해석의 임상 응용의 제1 목적은, 질환에 의해서 유도 또는 소실되는 바이오마커 단백질의 발견이다. 바이오마커는 병의 용태와 관련하여 거동하기 때문에, 진단의 표지가 될 수 있을 뿐만 아니라, 창약의 목표가 될 가능성도 높다. 즉, 프로테옴 해석의 성과는 특정 유전자보다도 진단의 표지나 창약의 목표 달성에 이용될 가능성이 높기 때문에, 포스트 게놈 시대의 진단과 치료의 근거 기술이 되고, 동정된 바이오마커는 환자의 약제 응답성 평가나 부작용 발현 예측이라는 직접적으로 환자가 누릴 수 있는 이익에 연결되기 때문에, 소위 테일러 메이드 의료(오더 메이드 의료)의 추진에 큰 역할을 한다고 할 수 있다.

임상 연구에 프로테옴 해석(임상 프로테오믹스)을 도입하는 경우에는, 다량의 검체를 신속, 확실하게 해석하는 것이 요구되고, 게다가 임상 검체는 미량으로도 귀중하기 때문에 고분해능·고감도·고기능 측정을 신속히 행할 필요가 있다. 질량 분석(mass spectrometry)은 해석을 매우 촉진하였으며, 질량 분석 장치의 특성, 즉 초고감도 및 높은 작업 처리량은 해석에 큰 기여를 하였다. 그러나, 그 수법이나 기기가 급속히 개량되고는 있지만, 프로테옴 해석을 임상 현장에서 간편하고 신속히 실시할 수 있는 상황은 아직 아니다.

인간·단백질은 10만종 이상으로도 추정되고 있지만, 혈청 중에 포함되는 단백질만도 약 1만종에 이르고, 혈청 중 단백질의 총 농도는 약 60 내지 80 mg/㎖이다. 혈청 중의 고함량의 단백질은 알부민(분자량 66 kDa), 면역 글로블린(150 내지 1000 kDa), 트랜스페린(80 kDa), 헵토글로빈(>85 kDa), 리포단백질(수 100 kDa) 등이고, 모두 다량(>mg/㎖)으로 존재한다. 한편, 병의 용태의 바이오마커나 병의 원인 인자라 생각되고 있는 펩티드 호르몬, 인터루킨, 사이토카인 등의 생리 활성 단백질의 대부분은 극미량(<ng/㎖)밖에 존재하지 않는다． 그 함량은 고분자의 고함량 성분에 비해, 실제로 나노 내지 피코 수준이다. 단백질의 크기에 있어서, 단백질 전체 종류의 70 ％ 이상은 분자량 60 kDa 이하이고, 상기한 극미량인 바이오마커 단백질은 모두 이 영역에 포함되는 경우가 대부분이다(예를 들면, 비특허 문헌 1). 이들 단백질은 신장을 통해 소변으로 일부 배설되기 때문에, 혈액뿐만 아니라 소변을 검체로서 측정하는 것도 가능하다.

일반적인 혈청 중 단백질의 프로테옴 해석에서, 병에 관련된 미량 성분의 검출에 방해가 되는 분자량 6만 이상의 고분자량 성분을 제거하는 것이 우선 필수가 된다. 또한, 분자량 6만 미만의 병에 관련된 미량 성분은 가능한 한 많이 회수하는 것이 필수가 된다.

고분자량 단백질의 분리 및 제거 수단으로서, 고속 액체 크로마토그래피(liquid chromatography:LC)나 이차원 전기 영동(2 dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis:2D-PAGE)이 있다. 또한, 알부민을 주된 대상 물질로서, 이미 실용화되고 있는 제품, 또는 개시되어 있는 기술로는, 블루 색소 등의 친화 리간드를 고정화한 담체(예를 들면, 닛본 밀리포어사: "몽타쥬 알부민 디플리트 키트 (Montage Albumin Deplete Kit)", 닛본바이오 래드사: "어피겔 블루 (AffiGel Blue)" 겔), 고분자량 성분을 원심 분리 여과에 의해서 분획하는 원심관 형식의 장치(예를 들면, 닛본 밀리포어사: "아미콘 울트라"), 일본 특허 공표 제2002-542163 호 공보(특허 문헌 1)에 개시되어 있는 전기 영동 원리에 의해서 분획하는 방법(예를 들면, 그래디포어사의 "그래디플로어" 시스템), 콘 (Cohn)의 에탄올 침전 등의 전통적인 침전법이나 크로마토그래피에 의해서 분획하는 방법(예를 들면, 비특허 문헌 2) 등이 있다. 일반적으로 이들 기술이 질량 분석의 전처리 조작으로서 행해져 왔다.

단백질을 취급하는 경우, 기재 표면상에 단백질의 비특이 흡착이 항상 문제가 된다. 기재 표면상 비특이 흡착은 단백질의 감소에 의한 분석 결과의 편차를 야기시킬 뿐만 아니라, 분석 대상 단백질의 손실이라는 중대한 문제를 야기하기 때문에, 비특이 흡착을 방지할 필요가 있다. 일반적으로 단백질의 비특이 흡착에 의한 단백질의 감소율은 용액 중의 단백질의 총 농도에 따라 다르고, 단백질의 총 농도가 낮을수록 단백질의 감소율이 커진다. 특히 상술한 바와 같이 프로테옴 해석에서 병에 관련된 미량 성분을 질량 분석으로 분석하는 경우, 기존의 전처리 장치에는 비특이 흡착을 억제하는 처리가 실시된 경우가 없기 때문에, 검출을 저해하는 성분을 제외하여 얻어지는 분획액의 단백질의 총 농도는 매우 낮아, 미량 바이오마커 단백질의 비특이 흡착에 의한 감소·손실이 문제가 되고 있다.

이러한 단백질이나 펩티드의 부착에 의한 손실의 문제에 대하여, 크게 두가지의 대책이 제안되었다. 하나는 흡착을 억제하는 화합물을 생체 성분 용액에 첨가하는 방법, 다른 하나는 기재 표면의 생체 성분 비흡착 처리이다. 전자의 대표적인 방법으로서 블로킹제를 첨가하는 방법이 있다. 블로킹제는 알부민이나 카제인의 용액이고 경쟁 흡착에 의해 유용 생체 성분의 흡착을 억제하는 방법이다. 경 쟁 흡착이기 때문에 블로킹제 농도는 유용 생체 성분의 농도보다 높게 하는 것이 일반적이다. 따라서, 분석 용도에서는 블로킹제가 분석을 저해하거나, 소량의 첨가로도 생체 성분의 구조 변화를 초래할 위험성이 있다. 블록킹 이외에 계면활성제나 유기용매를 첨가하는 방법도 있지만, 이것도 블로킹제와 마찬가지로 분석계의 저해나 생체 성분의 구조 변화에 따른 변성이 문제가 된다.

기재 표면의 비흡착 처리로서 일반적인 것은 기재 표면의 친수화 처리이다. 친수화 처리로는 몇가지 방법이 있다. 예를 들면 기재에 친수성 화합물, 예를 들면 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 공중합체(이하 MPC라 약기함)를 코팅 처리에 의해 도입하는 방법이 특허 문헌 2에 기재되어 있다. 친수성 화합물을 그래프트 처리에 의해 도입하는 방법이 특허 문헌 3, 특허 문헌 4에 기재되어 있다. 반응성 이온 에칭 처리, 플라즈마 처리나 이온 클러스터 빔 처리와 같이, 기재 표면에 친수성의 관능기를 직접 생성하는 방법이 있다.

그러나 종래의 기재 표면 처리 방법으로 처리한 기재는, 고농도의 단백질이나 펩티드의 용액과 접촉한 경우에는 생체 성분의 흡착 억제 효과는 인정되지만, 저농도의 생체 성분을 함유하는 용액과 접촉한 경우에는 여전히 흡착에 의한 생체 성분의 감소나 손실이 발생하고, 과제 해결로는 아직 충분하다고 할만한 수준은 아니었다.

또한 친수성 고분자를 사용한 코팅 처리에 의한 수법은 친수성 고분자 용액에 사용한 용매가 추가로 처리된 기재에 접촉한 경우, 코팅 박리 등에 의해 친수성이 저하되는 것이 염려된다. 또한, 분석이나 분리 등의 처리 장치에서는, 용리된 친수성 고분자가 후속 분석의 저해 인자가 될 수 있다는 것이 염려된다.

친수성 고분자 그래프트에 의한 친수화는 그래프트량에 비례하여 친수성을 향상시키지만, 처리하는 친수성 고분자 용액의 농도가 높아지면 친수성 고분자끼리 삼차원적으로 가교되기 때문에 친수성 고분자의 운동성이 저하되고, 생체 성분의 부착 억제 효과가 낮아진다는 문제가 있다.

또한, 반응성 이온 에칭 처리, 플라즈마 처리나 이온 클러스터 빔 처리는 기재의 외표면이나 판상 기재의 한쪽면 등에는 간편히 친수화를 행할 수 있지만, 플라즈마나 이온 클러스터 빔 등에 대해 음영부를 형성하는 부분을 친수화하는 것이 어렵기 때문에, 판상의 기재의 양면이나 중공 형상의 기재의 내외 표면 등의 다면을 1회의 처리로 친수화하는 데에는 부적합하다. 또한, 기재상에 생체 성분의 흡착 특성은, 생체 성분과 접촉하는 부분의 표면 상태에 따라 다르고, 일반적으로는 표면의 친수성이 높을수록, 또한 표면에 고정화된 친수성 분자의 운동성이 높을수록 기재 표면에 생체 성분의 흡착은 억제된다. 운동성이 높은 친수성 분자는, 그 분자 운동에 의해서 단백질이나 혈소판 등의 생체 성분을 배제하고 있다고 생각되고 있다. 반응성 이온 에칭 처리, 플라즈마 처리나 이온 클러스터 빔 처리에 의한 친수화는 기재 표면에 수산기 등의 친수성 관능기의 생성에 달려있다. 따라서, 기재 표면에 친수성 고분자의 도입에 의한 친수화와 비교하여 친수성 분자의 운동성이 낮기 때문에, 생체 성분의 부착 억제 효과는 낮아 바람직하지 않다. 또한, 처리 중에 고온이 되는 경우가 있기 때문에 기재가 변성되는 경향도 있어서 바람직하지 않다.

이와 같이, 흡착 억제 처리의 기술이 확립되어 있지 않기 때문에, 단백질 및/또는 펩티드를 분획하는 장치 중에서 적절한 흡착 억제 처리가 실시되고 있는 장치는 없다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 공표 제2002-542163호 공보

[특허 문헌 2] 일본 특허 공개 제2003-130882호 공보

[특허 문헌 3] 일본 특허 공개 (소)58-40323호 공보

[특허 문헌 4] 일본 특허 제3297707호 공보

[비특허 문헌 1] 앤더슨·NL(Anderson NL), 앤더슨·NG(Anderson,NG)저, "더 휴먼 플라즈마 프로테옴: 히스토리, 캐릭터, 그리고 다이아그노스틱 프로스펙스(The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)", v몰레큘러 ＆ 셀룰러 프로테오믹스(Molecular ＆ Cellular Proteomics), (미국), 더·아메리칸 소사이어티 포 바이오캐미스트리 앤드 몰레큘러 바이올러지 인코포레이티드(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2002년, 제1권, p845-867.

[비특허 문헌 2] 닛본 세이까가꾸 학회편 "신생화학 실험 강좌(제1권) 단백질 (1) 분리·정제·성질", 도쿄 가가꾸 도진, 1990년

상술한 바와 같이 임상 프로테옴 해석을 할 때에, 질량 분석을 방해하는 고분자량 단백질을 제거하는 전처리 조작이 필요하다. 프로테옴 해석에서 분석 대상이 될 수 있는 단백질은 미량이고, 전처리에 의해 총 단백질 농도가 저하되기 때문에, 기재에 대한 비특이 흡착에 의해서 분석 대상 단백질이 손실되고, 안정적인 프로테옴 해석이 불가능하다는 문제가 있다. 안정적인 프로테옴 해석을 행하기 위해서, 상술한 전처리에서 단백질의 비특이 흡착을 억제하는 것이 중요하고, 기재에 단백질의 비특이 흡착이 적으며, 고분자량의 단백질이 제거된 유리한 분석용 용액을 용이하게 제조할 수 있는 장치를 제공하는 것이 과제이다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에서는 이하의 수단을 채용한다.

1) 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치이며, 단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부에 1000 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민 용액을 접촉시켰을 때 상기 기재 표면에 소 혈청 알부민의 흡착량이 50 ng/㎠ 이하인 분획 장치.

2) 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치이며, 단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부에 농도 200 ng/㎖의 인간 β2-마이크로글로블린과 농도 10 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민으로 이루어지는 단백질 수용액을 접촉시켰을 때, 상기 기재에 인간 β2-마이크로글로블린 흡착량이 3 ng/㎠ 이하인 분획 장치.

3) 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치이며, 단백질 및/또는 펩티드를 함유하는 용액을 공급하는 공급 수단, 용액으로부터 단백질 및/또는 펩티드를 분리하는 수단, 및 용액 중 단백질 및/또는 펩티드를 농축하는 수단을 갖고, 분획 장치에서의 단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 친수성 고분자에 의해서 그래프트되어 있는 분획 장치.

이상의 구성을 취함으로써, 분획 조작에 의해서도 분석을 목적으로 하는 단백질을 적은 손실로 회수할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 A1에서 이용한 분획 장치의 개략도이다. 또한 도면에서의 부호의 의미는 이하와 같다.

<도면의 주요 부분을 설명하기 위한 부호의 간단한 설명>

100: 주입 펌프

101, 201, 301, 401: 3방향 밸브

102: 1단계 용액 순환 회로(튜브 회로)

103: 1단계 펌프

104: 1단계의 막 분리 유닛의 처리액 회수구

105: 제1 분리막 모듈

202: 2단계 용액 순환 회로(튜브 회로)

203: 2단계 펌프

204: 2단계의 막 분리 유닛의 처리액 회수구

205: 제2 분리막 모듈

302: 3단계 용액 순환 회로(튜브 회로)

303: 3단계 펌프

304: 3단계의 막 분리 유닛의 처리액 회수구

305: 제3 분리막 모듈

402: 4단계 용액 순환 회로(튜브 회로)

403: 4단계 펌프

404: 농축막 유닛의 처리액 회수구

405: 농축막 모듈

406: 회수용 3방향 밸브

407: 회수 용기

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명에서 말하는 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치란, 분자량별 또는 단백질 또는 펩티드가 갖는 특성별로 이들을 분리하는 장치이다. 그 수법으로는, 분자량, 이온 상호 작용, 소수성 상호 작용, 항체로 대표되는 생물학적 상호 작용 등을 사용할 수 있다. 일반적으로는, 단백질 또는 펩티드 시료를 공급하는 공급 수단과 분리를 행하는 분리 수단을 구비하는 장치이다. 혈청, 혈장, 소변 등으로 대표되는 체액이나, 인위적으로 제조한 단백질 또는 펩티드를 포함하는 용액이나, 세포 배양에 의해서 생긴 배양 상청액 등의 검체를 그대로의 농도로, 또는 pH 완충 용액 등으로 희석하여 공급 수단에 투입하면, 검체가 이동상에 의해서 전달되어 이동상의 유로에 설치된 막, 겔, 흡착체를 구비한 분리 수단으로 분리된다. 본 발명의 분획 장치에 의해서 분리된 목적으로 하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 용액은 필요에 따라서 자외선 흡수, 형광, 비색 등에 의해서 정량되거나, 단백질 또는 펩티드와 함께 포함되는 수분이 제거됨으로써 농축되거나, 일정량씩 분취 또는 회수된다. 정량, 농축, 분취, 회수의 공정을 위한 수단은 분리 공정의 수단과 일체화될 필요는 없지만, 분리 수단과 정량, 농축, 분취, 회수 중 하나 이상의 수단이 추가로 연결되어 있는 장치가 바람직하다. 단백질 또는 펩티드를 분리하고, 추가 로 회수한 후 행해지는 분석 장치의 요구에 의해 높은 농도의 단백질 또는 펩티드 용액을 제조할 필요가 있는 경우에는, 후속 농축 수단이 분리 수단에 연속으로 연결된 장치가 바람직하다. 이동상을 이용하여 단백질 또는 펩티드를 전달하는 수단은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 튜브, 파이프, 홈 등으로 이루어지고 튜브 펌프, 기어 펌프, 다이아프램 펌프, 실린지 펌프 등에 연결된 유로이다.

특히 프로테옴 해석의 전처리용 시료를 얻기 위한 장치로서 이용하는 경우에는, 분석에 필요한 미량 성분을 많이 포함하는 용액이 생체 유래의 용액으로부터 제조된다. 그 기능은 분자량이 높은(예를 들면, 분자량 6만 이상) 단백질을 제거하고, 또한 프로테옴 해석의 대상이 될 수 있는 분자량이 낮은(예를 들면, 분자량 1.5만 미만) 단백질을 회수하는 것이다. 또한, 상기와 같은 목적의 장치는, 단백질을 분리하는 수단, 단백질을 농축하는 수단, 및 분획에 의해 얻어진 단백질을 회수하는 수단으로부터 선택되는 수단을 가지며, 단백질 용액을 송액하는 수단을 갖는 것이 바람직하다.

여기서 말하는 분자량 6만 이상의 단백질이란, 혈액의 경우 알부민이나 면역 글로블린, 트랜스페린 등이 해당된다. 혈액의 경우에 이러한 단백질은 단백질 성분 전체에 대하여 고함량으로 존재한다. 본 발명의 분획 장치의 기능 평가를 위해 여기서는 분자량이 6만에 가까운 소 혈청 알부민을 지표로 하였다. 또한, 분자량 1만5천 미만의 단백질은 단백질 중에서도 비교적 분자량이 작은 단백질이고, 혈액의 경우 총 단백질에 대하여 존재 비율이 낮지만, 종류는 매우 많다.

본 발명의 분획 장치가 분리 수단을 갖는 경우, 단백질 또는 펩티드를 포함 하는 용액은 분리 공정시에 희석되는 경우가 있다. 예를 들면, 검체를 막에 의해서 분리한 경우, 통상은 용매도 감소된다. 단백질 또는 펩티드의 농도가 높아지면 막 표면에 퇴적물이 적층하여 막 구멍의 클로깅을 일으켜 분리 효율이 저하된다. 이를 회피하기 위해서 희석액을 첨가하여 단백질 농도가 증가하지 않도록 하는 경우가 있다.

그러나 분석시 장해가 되는 단백질을 제거하여도 목적으로 하는 단백질의 농도가 낮은 경우, 농도가 분석 장치의 검출 한계 이하가 될 우려가 있다. 따라서, 분리 후 목적 성분을 포함하는 용액의 농도가 낮은 경우는, 분리 수단 이후에 농축 수단을 설치하여, 농축 조작을 하는 것이 바람직하다. 또한, 용매만을 제거하면, 용액 중의 염의 농도가 지나치게 증가하여 단백질이 변성될 우려가 있기 때문에, 용매와 동시에 염도 제거하는 것이 바람직하다. 주된 농축 조작으로서, 가열이나 감압에 의한 용매의 증발이나 동결 건조에 의한 방법, 용매 분자를 우선적으로 투과하는 분리막을 이용하여 여과나 투석에 의해 용매를 제거하는 방법, 흡수 겔 등을 사용하여 용매를 흡수 제거하는 방법, 분자체 효과, 이온 상호 작용, 소수성 상호 작용, 수소 결합, 친화성에 의한 특이적 결합 등을 이용한 크로마토그래피에 의해 농축하는 방법, 전기 영동, 원심 분리 등을 들 수 있고, 이들 조작을 조합할 수도 있다. 본 발명의 분획 장치는 이들 조작 중 어느 하나를 행할 수 있는 수단을 갖고 있는 것이 바람직하다.

단백질 또는 펩티드가 접촉하는 본 발명의 기재로는, 단백질 또는 펩티드를 함유하는 시료를 공급하는 수단, 및 분리, 흡착, 정량, 농축, 분취, 회수 중 어느 하나의 처리를 행하는 수단 중 어느 하나에서 단백질 또는 펩티드를 함유하는 용액이 접촉하는 구성 소재가 예시된다. 본 발명의 장치에서는, 검체가 접촉하는 기재 표면 중 적어도 일부가 친수화 처리되어 있는 것이 바람직하고, 되도록이면 모든 기재 표면이 친수화 처리되어 있는 것이 가장 바람직하다.

기재를 구성하는 소재는 특별히 한정되지 않지만, 화학적인 가공이나 표면 개질이 용이하고, 압출 성형이나 사출 성형 등을 통해 저렴하게 대량 생산이 가능한 고분자 재료가 바람직하다. 고분자 재료의 예로는, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리염화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 셀룰로오스트리아세테이트, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 비닐알코올·에틸렌 공중합체, 실리콘 고무, 에폭시 수지, 페놀 수지 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 분획 장치에서는, 단백질 또는 펩티드가 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부에 단백질 또는 펩티드가 흡착하기 어려운 표면을 형성함으로써, 흡착 손실을 억제할 뿐만 아니라, 추가적인 작용으로서 단백질 또는 펩티드의 흡착·퇴적·클로깅에 의한 분리 성능의 저하를 억제할 수 있다는 점이 중요하다. 그 결과, 높은 회수율을 달성하였다. 이를 달성하기 위해서 표면 특성은, 기재 표면의 0.01 ㎠ 이상 10 ㎠ 이하의 범위로 1000 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민 용액을 접촉시켰을 때 상기 기재 표면에 대한 소 혈청 알부민의 흡착량이 50 ng/㎠ 이하이도록 설정된다. 또한, 농도 200 ng/㎖의 인간 β2-마이크로글로블린과 농도 10 ㎍/㎖의 소 혈청 알 부민으로 이루어지는 단백질 수용액을 기재 표면에 접촉시켰을 때, 상기 기재에 대한 인간 β2-마이크로글로블린 흡착량이 3 ng/㎠ 이하이도록 표면이 설정된다. 이러한 표면 특성은 이하의 방법으로 평가된다.

기재 표면에 대한 단백질의 흡착 평가에 대해서, 비교적 저렴하고 범용적인 단백질인 소 혈청 알부민(이하 BSA라 약기함)의 용액으로 행하는 경우에 대해서 설명한다. BSA 용액은 불순물 등에 의한 흡착의 변동을 억제하기 위해서 BSA(시그마사(SIGMA)의 소 알부민(A-7906))를 인산 완충 생리 식염수(닛스이 세이야꾸(주)의 PBS(-) 분말(162-21112) 9.6 g을 오쯔카 세이야꾸사에서 시판중인 주사용 물(2069)에 용해시켜 1 ℓ가 되도록 제조한 용액, 이하 PBS라 약기함)에 1000 ㎍/㎖가 되도록 용해시킨 것을 사용한다. 또한 기재에 대해 BSA 용액을 접촉시키는 면적은 지나치게 작으면 정확한 분석이 불가능해질 우려가 있고, 반대로 지나치게 크면 사용하는 단백질량이 많아지게 되어 효율이 악화되기 때문에 0.01 ㎠ 이상 10 ㎠ 이하의 범위로 설정하는 것이 바람직하다. 0.1 ㎠ 이상 5 ㎠ 이하의 범위로 설정하는 것이 보다 바람직하다.

BSA 용액과 접촉시키는 면은 실제로 단백질의 전처리에서 단백질 용액과 접촉하는 면이고, 예를 들면 기재의 단편 등을 포함하는 경우는 단면 등에 BSA의 흡착은 평가하지 않도록 한다. 표면적에 대해서 기재가 분리막 또는 농축막이 아닌 경우, 기재 표면의 중심선 평균 조도가 0.1 ㎛ 미만일 때는 표면의 요철에 의한 면적의 증가는 감안하지 않지만, 기재 표면의 중심선 평균 조도가 0.1 ㎛ 이상일 때는 표면의 요철에 의한 면적의 증가를 감안하도록 한다. 중심선 평균 조도의 측정 은 JIS-B0601 부속서 2에 기재된 방법으로 행하도록 한다. 표면의 요철을 감안한 표면적은 B.E.T.법 등의 가스 흡착법이나 기엔스사의 초심도 현미경 "VK9500" 등에 의한 삼차원 형상 측정 현미경에 의해 측정하는 것이 가능하다.

한편, 기재가 중공사 분리막 또는 중공사 농축막의 경우 막 면적은 이하와 같이 산출된다. 37 ℃, pH 7.2로 조정한 5 중량％의 BSA 수용액으로 용액 유량 200 ㎖/분, 여과 유량 15 ㎖/분의 사용 조건으로 대상이 되는 막 1.5 ㎡를 충전한 모듈을 이용하여 여과하고, 여과 개시로부터 30 분 후 BSA의 체 계수가 0.1 이상일 때, BSA는 막의 내표면에 접하고, 막을 투과한 후에 막의 외표면에도 접촉하면서 이동하기 때문에, 막의 세공 내표면 및 외표면도 표면적으로 한다. 한편, BSA의 체 계수가 0.1 미만일 때는 BSA는 거의 막을 투과할 수 없고, 막의 내표면에만 접촉하기 때문에, 막의 내표면을 표면적으로 한다.

BSA의 체 계수는 이하의 수학식 1로 산출된다.

(a)=2×(b)/((c)+(d))

여기서 (a)는 BSA의 체 계수, (b)는 여과액의 BSA 농도이고, (c)는 막 분리 전의 원액측 BSA 농도, (d)는 막 분리 후의 원액측 BSA 농도이다.

접촉시키는 시간은, 지나치게 짧으면 흡착 평형에 도달하기 전에 조작이 끝날 우려가 있고, 한편 지나치게 길면 단백질이 변성될 위험성이 있기 때문에 2 시간으로 설정된다. 또한, BSA 용액량은 지나치게 적으면 단백질의 절대량이 적어지기 때문에 막 면적 1 ㎠당 50 ㎕ 이상으로 설정된다. 또한, 흡착량은 온도의 영향 을 크게 받기 때문에, BSA 용액과 기재와 접촉시킬 때에는 25 ℃에서 행할 필요가 있다.

BSA의 흡착량 정량 방법으로서 이하의 방법이 예시된다. 기재를 50 ㎖의 PBS에 10 초간 2회 침적하여 세정한 후, 1 ㎖ 이상 30 ㎖ 이하의 범위의 50 부피％의 아세트산 수용액에 실온에서 12 시간 동안 침적하고, 아세트산 수용액을 동결 건조시킨다. 건조 BSA가 재차 벽에 흡착하지 않도록 블로킹제를 포함하는 수용액에 건조 BSA를 용해시키고, 상기 용액을 정량에 이용하도록 한다. 용액 중의 BSA의 정량은 베틸(BETHYL)사의 소 알부민 엘리사 정량 키트 (Bovine Albumin ELISA Quantitation Kit) (E10-113) 또는 그의 동등품으로 행할 수 있다.

단백질이 물에 용해되어 있을 때에는, 친수성의 도메인이 단백질 분자의 표면에 존재하고, 소수성 도메인은 단백질의 내부에 존재한다. 단백질이 소수성의 기재에 접촉하면 내부의 소수성 도메인이 표면에 노출하여 소수성 상호 작용에 의해 기재에 흡착된다고 생각된다. 따라서, 단백질의 흡착을 억제하기 위해서는 기재 표면의 친수화가 유효하다. 특히, 친수성 고분자를 기재 표면에 그래프트하면 친수성 고분자에 의한 친수화의 효과에 추가로, 단백질 용액 중에 연장된 친수성 고분자 사슬의 마이크로 브라운 운동으로 인해 배제된 부피 효과에 의한 단백질 흡착 억제 효과도 기대할 수 있기 때문에 바람직하다.

친수화 처리란 기재 표면에 친수성을 부여하는 처리이고, 기재의 원료에 친수성의 화합물을 혼입시키는 방법, 화학 반응이나 방사선 조사 등으로 기재 표면에 친수성의 관능기를 생성시키는 방법, 화학 반응이나 방사선 조사에 의해 친수성 고 분자를 그래프트하는 방법 등이 있고, 그 중에서도 친수성 고분자를 그래프트하는 방법이 바람직하다. 그 중에서도 친수성 고분자를 방사선 조사에 의해 그래프트하는 방법은 친수성 고분자의 종류나 분자량 등을 선택함으로써 친수성을 조절하는 것이 용이하며, 부생성물도 적고 멸균도 동시에 가능하기 때문에 바람직하다.

친수성의 관능기란 정전기적 상호 작용이나 수소 결합 등에 의해서 수분자와 약한 결합을 생성하는 관능기이다. 예를 들면 수산기, 카르복실기, 아미노기, 니트로기, 알데히드기, 티올기, 술폰산기, 황산기, 아미노황산기 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이 중, 수산기는 비이온성의 관능기이고 강한 표면 전하를 갖는 단백질과의 상호 작용 및 산화 환원력이 적어서 단백질의 변성도 적기 때문에 바람직하다.

친수성 고분자란 물에 가용성인 고분자 및 물에 불용성이어도 정전기적 상호 작용이나 수소 결합으로 물분자와 약한 상호 작용을 할 수 있는 고분자를 가리킨다. 예를 들면, 폴리비닐알코올, 폴리알릴알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 폴리비닐아민, 폴리아세트산비닐, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아미드, 당 화합물 등이나 이들과 다른 단량체의 공중합체나, 그래프트 중합체 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그 중에서도 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올 공중합체가 효과가 높아 특히 바람직하다. 폴리비닐알코올의 공중합체로는, 중합체를 구성하는 분자 중의 단량체 반복 단위로서 비닐알코올 단위수를 전체 단량체 반복 단위수에 대하여 10 ％ 이상 100 ％ 미만 함유하는 중합체인 것이 바람직하다.

폴리비닐알코올 공중합체로는, 분자 중에 화학식 1의 화학 구조식으로 표시되는 단량체 반복 단위와 화학식 2의 화학 구조식으로 표시되는 단량체 반복 단위를 갖는 공중합체가 바람직하게 사용된다. 또한 그 밖의 공중합 성분을 함유하고 있을 수도 있다. 또한 비누화도란 수학식 2로부터 구해지는 수치이다. 비누화도가 낮으면 친수성이 낮아져 물에 대한 용해성이 저하되는 경향이 있으므로, 수용액으로서 기재를 표면 처리하는 것이 곤란해지기 때문에 바람직하게는 0.70 이상, 보다 바람직하게는 0.74 이상, 더욱 바람직하게는 0.78 이상 1 미만이다. 비누화도가 1인 경우는 폴리비닐알코올이 되지만, 상술한 바와 같이 이것도 바람직한 양태이다.

(k)=(m)/((n)+(m))

수학식 2 중의 기호는 이하와 같다.

(k): 비누화도

(m): 폴리비닐알코올 공중합체 중 화학식 1로 표시되는 단량체 반복 단위수

(n): 폴리비닐알코올 공중합체 중 화학식 2로 표시되는 단량체 반복 단위수

또한 공중합체는 무작위 공중합체, 교대 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 중 어느 하나일 수도 있고, 이들의 조합일 수도 있다.

친수성 고분자의 분자량은 작으면 친수성 고분자의 분자 운동성이 작아지기 때문에, 중량 평균 분자량이 바람직하게는 1000 이상, 보다 바람직하게는 5000 이상, 더욱 바람직하게는 10000 이상일 수 있다.

친수성 고분자를 기재에 도입하는 방법으로는 표면에 코팅도 사용할 수 있지만, 기재에 그래프트 방법이 용리가 적어 바람직하다. 특히 방사선을 이용한 그래프트 방법은 부생성물이 적어 바람직하다. 또한, 기재를 수산기를 갖는 친수성 고분자 용액, 바람직하게는 수용액에 접촉시켜서 방사선에 의해서 그래프트하는 것이 바람직하다. 방사선은 α선, β선, γ선, X선, 자외선, 전자선 등이 이용된다. 분획 장치를 장기간 보존하는 경우, 균이 발생하여 성능 저하를 야기할 우려가 있다. 특히 분리 또는 농축 수단을 갖는 분획 장치에서는, 이들 수단 중에 물을 이미 포함할 수 있지만, 함수 상태에서는 균이 증식하는 위험이 커지기 때문에 멸균하는 것이 바람직하다. 최근에는 간편하다는 점에서, 방사선 멸균법이 다수의 경우에 이용되고 있고, 특히 γ선 등의 전자파선이나 전자선이 바람직하게 이용되고 있다. 즉, 방사선에 의한 방법을 이용함으로써, 멸균과 친수화 처리를 동시에 달성할 수 있기 때문에 바람직하다. 선량은 멸균이 필요한 경우는 15 kGy 이상으로 설정하는 것이 바람직하지만, 멸균이 필요없는 경우는 친수화 처리의 효율과 기재 의 열화 방지의 관점에서 0.5 kGy 이상 200 kGy 이하의 범위로 설정하는 것이 바람직하고, 1 kGy 이상 100 kGy 이하의 범위로 설정하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 분획 장치에서, 막을 이용하여 분리 또는 농축을 행하는 경우에는, 평면 필터, 카트리지식 필터 등의 평막형 분리막(이하 "평막"이라 함), 중공사 등의 중공 유형 분리막(중공사막)을 모두 사용할 수 있지만, 일반적으로 중공사는 처리 액량당 막 표면적이 크고, 압력 손실도 줄일 수 있기 때문에 가장 효율적으로 사용할 수 있다. 처리 액량당 막 표면적을 크게 하기 위해서는, 중공사 내경은 작은 것이 바람직하고, 1000 ㎛ 이하가 바람직하며, 500 ㎛ 이하가 보다 바람직하다. 또한, 평면 필터는 제막이 용이하고 저렴하게 제조할 수 있다는 이점이 있다. 막 소재로는, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 소재를 예시할 수 있다. 이 중에서도 최근 투석기 등에 자주 이용되고 있는 폴리술폰은 분획 특성이 우수하기 때문에 바람직한 소재이다.

이하 실시예에서 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

<<실시예 A>>

<회수 용기의 BSA 흡착량 측정>

시그마사의 소 알부민(A-7906, 로트 41k1270) 100 mg을 PBS 100 ㎖에 용해시켜서 1000 ㎍/㎖의 BSA 용액을 제조하였다. 상기 BSA 용액을 회수 용기에 2 ㎖ 첨가하고, 용액이 증발하지 않도록 캡핑을 하여 25 ℃, 4 시간 동안 정치시켰다. 이 때, BSA 용액은 회수 용기 내부 표면의 4.0 ㎠의 면적으로 접촉하고, 이 면적을 이용하여 BSA 흡착량을 계산하도록 한다. 회수 용기 중의 BSA 용액을 아스피레이터로 흡인하여 제거하고, PBS 3 ㎖로 5회 세정하였다. 회수 용기에 50 부피％의 아세트산 수용액 3 ㎖를 첨가하여 25 ℃에서 12 시간 동안 정치하고, 회수 용기와 함께 동결 건조하였다. 회수하고자 하는 BSA가 회수 용기 표면에 흡착하는 것을 억제하기 위해서, 회수 용기에 다이닛본 세이야꾸사의 블록 에이스 분말(UK-B40, lot. STK084206) 40 g을 물 1 ℓ에 용해시킨 액을 1 ㎖ 첨가하고, 보르텍스 믹서에 넣고 회수 용기 내벽에 부착되어 있던 BSA를 용해시켜 BSA 정량 분석 샘플로 하였다. BSA의 정량은 베틸사의 소 알부민 엘리사 정량 키트 (E10-113, 로트 E10-113-11)를 이용하고, 키트 부속의 설명서에 따라서 분석을 하였다. 흡착량은 수학식 3으로 계산하였다.

A=B/C

수학식 3 중 기호는 다음과 같다.

A: BSA 흡착량(ng/㎠)

B: BSA 정량 분석으로 얻어진 BSA 양(ng)

C: BSA 용액과 회수 용기의 접촉 면적(㎠)

<중공사막의 BSA 흡착량 측정>

미니 모듈에 사용한 중공사막을 30개 묶고, 중공사막 중공부를 폐색하지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈케이스에 고정시켜 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈의 내부 직경은 약 5 mm, 길이는 약 12 cm이며, 일반적인 중공사막형 투석기와 마찬가지로 중공사막의 내측에 연결되는 포트(혈액 포트) 2개와, 외측에 연결되는 포트(투석액 포트) 2개를 갖고 있다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다. 그 후, 투석액 포트를 통해 PBS를 주입한 후 캡핑을 하여, 중공사의 외측을 PBS로 채웠다. 혈액 포트 중 하나를 실리콘 튜브에 연결하고 튜브 중앙에 페리-스트래트 펌프를 설치하였다. 다른 한쪽의 혈액 포트에도 실리콘 튜브를 연결하였다. 이들 2개의 실리콘 튜브의 개방 말단을 그라이너 바이오-원사(Greiner Bio-One)의 PP 튜브(188261)에 삽입하였다. 상기 PP 튜브에 시그마사의 소 알부민(A-7906, 로트 41k1270) 100 mg을 PBS 100 ㎖에 용해시켜 제조한 1000 ㎍/㎖의 BSA 용액을 10 ㎖ 넣고, 페리-스트래트 펌프로 1 ㎖/분의 유속으로 25 ℃, 4 시간 동안 순환시켰다. 그 후 빠르게 300 ㎖의 PBS를 페리-스트래트 펌프로 10 ㎖/분의 유속으로 송액하였다. 이 때, 실리콘 튜브로부터 배출된 PBS는 폐기하고, 순환시키지 않았다.

그 후, 미니 모듈 내의 PBS를 제거하였다. 미니 모듈을 해체하여 중공사를 취출하였다. 취출한 중공사의 길이는 15 cm였다. 상기 중공사를 1 cm의 길이로 절단하고 전체량을 그라이너 바이오-원사의 PP 튜브(188261)에 넣고, 50 부피％의 아세트산 수용액 5 ㎖를 첨가하여 25 ℃에서 12 시간 동안 정치하였다. 그 후, 중 공사를 여과 분별하고, 아세트산 용액을 회수 용기와 함께 동결 건조하였다. 회수 용기에 다이닛본 세이야꾸사의 블록 에이스 분말(UK-B40, 로트 STK084206) 40 g을 물 1 ℓ에 용해시킨 액을 2 ㎖ 첨가하고, 보르텍스 믹서에 넣고 회수 용기 내벽에 부착되어 있던 BSA를 용해시켜 BSA 정량 분석 샘플로 하였다. BSA의 정량은 베틸사의 소 알부민 엘리사 정량 키트(E10-113, 로트 E10-113-11)를 이용하고, 키트 부속의 설명서에 따라서 분석을 하였다. 흡착량은 수학식 4로 계산하였다. 또 중공사내 표면적은 수학식 5로 계산하였다.

D=E/F

수학식 4 중 기호는 이하와 같다.

D: BSA 흡착량(ng/㎠)

E: BSA 정량 분석으로 얻어진 BSA 양(ng)

F: 중공사내 표면적(㎠)

F=(G/2)²P·H·I

수학식 5 중 기호는 이하와 같다.

F: 중공사내 표면적(㎠)

G: 중공사 내경

P: 원주율

H: 모듈로부터 취출한 중공사 1개당 길이(cm)

I: 중공사 개수

<액 중에 존재하는 β2마이크로글로블린의 측정>

와코 쥰야꾸 고교사에서 시판중인 그라자임 β2-마이크로글로블린-EIA TEST(코드 305-11011)를 이용하여 키트 부속의 설명서에 따라서 분석을 하였다.

<혈청 및 회수액의 알부민의 측정>

베틸사 인간 알부민 엘리사 정량 키트(E80-129, 로트 E80-129-9)를 이용하여 키트 부속의 설명서에 따라서 분석을 하였다.

<회수 용기 (1)의 제조>

초순수에 나카라이 테스크사 제조 폴리비닐알코올(28311-25, (사실상 비닐알코올-아세트산비닐의 공중합체, 비누화도 86.5 내지 89.0 ％), 로트 번호 M2B1968)을 용해시켜 농도 1000 ppm의 폴리비닐알코올 공중합체 수용액을 제조하였다. 세이산 닛본사의 척(chuck)이 부착된 주머니(유니팩 E-4)에 상기 폴리비닐알코올 수용액 50 ㎖를 첨가하고, 거기에 벡톤 딕킨손사 (BECTON DICKINSON)의 5 ㎖ 폴리스티렌 라운드 튜브(352054)를 침적하고, γ선을 조사하였다. 이 때 γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. γ선 조사 후 폴리스티렌 라운드 튜브를 초순수 1 ℓ로 세정하고, 오븐으로 50 ℃에서 3 시간 동안 건조하여 회수 용기 (1)을 얻었다.

<회수 용기 (2)의 준비>

벡톤 딕킨손사의 5 ㎖ 폴리스티렌 라운드 튜브(352054)를 회수 용기 (2)로서 그대로 사용하였다.

<미니 모듈 (1)의 제조>

도레이사의 투석기 BS1.8L (Lot. 20440312)의 모듈의 양 말단의 수지 접착 부분을 절단하여 중공사막을 얻었다. 얻어진 중공사막의 치수는 내부 직경 200 ㎛ 막 두께 40 ㎛였다. 상기 중공사막을 100개 묶고, 중공사막의 중공부를 폐색하지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈케이스에 고정시켜서 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈의 내부 직경은 약 5 mm, 길이는 약 17 cm이고, 일반적인 중공사막형 투석기와 마찬가지로 중공사막의 내측에 연결되는 포트(혈액 포트) 2개와 외측에 연결되는 포트(투석액 포트) 2개를 갖고 있다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다. 그 후, PBS를 주입하여 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (1)이라 약기함)을 얻었다.

<미니 모듈 (2)의 제조>

동일하게 도레이사의 투석기 BS1.8L로부터 전달된 중공사막을 40개 묶고, 중공사막 중공부를 폐색하지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈케이스에 고정시켜서 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈의 내부 직경은 약 5 mm, 길이는 약 17 cm이고, 일반적인 중공사막형 투석기와 마찬가지로 중공사막의 내측에 연결되는 포트(혈액 포트) 2개와 외측에 연결되는 포트(투석액 포트) 2개를 갖고 있다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다. 그 후, PBS를 주입하여 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (2)라 약기함)을 얻었다.

<미니 모듈 (3)의 제조>

폴리술폰(솔베이사 제조 유델(등록상표) P-3500) 18 중량부 및 폴리비닐피롤 리돈(바스프사(BASF)의 K30) 9 중량부를 N,N'-디메틸아세트아미드 72 중량부 및 물 1 중량부의 혼합 용매에 첨가하고, 90 ℃에서 14 시간 동안 가열하여 용해시켜서 제막 원액을 얻었다. 이 제막 원액을 외경 0.3 mm, 내경 0.2 mm의 오리피스형 이중 원통상 구금의 외측의 관으로부터 토출하였다. 심액으로서 N,N'-디메틸아세트아미드 58 중량부 및 물 42 중량부로 이루어지는 용액을 내측의 관으로부터 토출하였다.

토출된 제막 원액은, 구금으로부터 응고욕 액면까지의 거리 350 mm를 통과한 후, 물 100 ％의 응고욕으로 유도되어 중공사막이 얻어졌다. 얻어진 중공사막의 구조를 전자 현미경(히타치사 제조 S800)으로 확인한 바 비대칭 구조를 갖고 있었다. 얻어진 중공사막을 10000개, 일반적인 투석기와 마찬가지로 투석액 입구 및 투석액 출구를 갖는 원통상의 플라스틱 케이스에 삽입하고, 양단부를 수지로 밀봉하여 유효 막 표면적 1.6 ㎡의 중공사막 모듈을 제조하였다. 이 중공사막 모듈을 물로 세정한 후, 상기 모듈로부터 중공사막을 절단하여 100개 준비하였다. 50 ℃, 상대 습도 13 ％의 분위기하에서 24 시간 동안 건조시켰다. 이 중공사막을 실시예 A4와 마찬가지로 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈케이스에 고정시켜서 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다. 그 후, PBS를 주입하여 농축용 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (3)이라 약기함)을 얻었다.

<미니 모듈 (4)의 제조>

미니 모듈 (1)과 마찬가지로 미니 모듈을 제조하였다. 단, 미니 모듈의 중 공사막 및 모듈 내부의 증류수 세정은 행하였지만, BPS의 주입은 행하지 않았다.

초순수에 나카라이 테스크사의 폴리비닐알코올(28311-25, 로트 번호 M2B1968) 용해시켜 농도 1000 ppm의 폴리비닐알코올 수용액을 제조하고, 페리-스트래트 펌프로 1 ㎖/분의 유속으로 10 ㎖를 상기 미니 모듈 중공사막의 내측 중 한쪽의 혈액 포트로 주입하고 중공사 내를 경유하여 다른 한쪽의 혈액 포트로부터 방출시켜 튜브를 통하여 상기 혈액 포트측의 투석액 포트에 주입하고 다른 한쪽의 투석액 포트로부터 방출시켰다.

그 후, 미니 모듈의 중공사 내측과 외측에 상기 폴리비닐알코올을 충전시킨 상태에서, 4개소의 포트를 밀전한 상태에서 γ선을 조사하였다. 이 때 γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 40 ℃의 증류수 3 ℓ로 세정하였다.

그 후, PBS를 주입하여 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (4)라 약기함)을 얻었다.

<미니 모듈 (5)의 제조>

미니 모듈 (2)과 마찬가지로 미니 모듈을 제조하였다. 단, 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부의 증류수 세정은 행했지만, BPS의 주입은 행하지 않았다.

초순수에 나카라이 테스크사의 폴리비닐알코올(28311-25, 로트 번호 M2B1968) 용해시켜 농도 1000 ppm의 폴리비닐알코올 수용액을 제조하고, 페리-스트래트 펌프로 1 ㎖/분의 유속으로 10 ㎖를 상기 미니 모듈 중공사막의 내측 중 한쪽의 혈액 포트에 주입하고 중공사 내를 경유하여 다른 한쪽의 혈액 포트로부터 방출 시켜 튜브를 통하여 상기 혈액 포트측의 투석액 포트에 주입하고 다른 한쪽의 투석액 포트로부터 방출하였다.

그 후, 미니 모듈의 중공사내측과 외측에 상기 폴리비닐알코올을 충전시킨 상태에서, 4개소의 포트를 밀전한 상태에서 γ선을 조사하였다. 이 때 γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 40 ℃의 증류수3 ℓ에서 세정하였다.

그 후, PBS를 주입하여 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (5)라 약기함)을 얻었다.

<미니 모듈 (6)의 제조>

미니 모듈 (3)과 마찬가지로 미니 모듈을 제조하였다. 단, 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부의 증류수 세정은 행했지만, BPS의 주입은 행하지 않았다.

초순수에 나카라이 테스크사의 폴리비닐알코올(28311-25, 로트 번호 M2B1968) 용해시켜 농도 1000 ppm의 폴리비닐알코올 수용액을 제조하고, 페리-스트래트 펌프로 1 ㎖/분의 유속으로 10 ㎖를 상기 미니 모듈 중공사막의 내측 중 한쪽의 혈액 포트에 주입하고 중공사 내를 경유하여 다른 한쪽의 혈액 포트로부터 방출시켜 튜브를 통하여 상기 혈액 포트측의 투석액 포트에 주입하고 다른 한쪽의 투석액 포트로부터 방출하였다. 그 후, 미니 모듈의 중공사 내측과 외측에 상기 폴리비닐알코올 수용액을 충전한 상태에서, 4개소의 포트를 밀전한 상태에서 γ선을 조사하였다, 이 때 γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 상기 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 40 ℃의 증류수 3 ℓ에서 세정하였다. 그 후, PBS를 주입하여 농축용 중공사막 미니 모듈(이후, 미니 모듈 (6)이라 약기함)을 얻었다.

<실시예 A1>

우선, 하나의 미니 모듈 (1)을 준비하고, 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 실리콘 튜브를 연결하였다. 중공사막 내측의 액에 대해서는, 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 해당 회로에 페리-스트래트 펌프를 설치하여 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 상기 용액 순환 회로의 중앙에 3방향 밸브를 설치하고, 3방향 밸브의 한 방향으로는 주입 펌프를 부착하였다. 이것을 1단계의 막 분리 유닛으로 하였다. 또한, 미니 모듈 (2) 중 하나의 미니 모듈에 대해서 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 실리콘 튜브에 연결하였다. 미니 모듈 (2)의 중공사막 내측의 액에 대해서도, 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 해당 회로에 페리-스트래트 펌프를 설치하여 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 상기 용액 순환 회로의 중앙에 3방향 밸브를 설치하였다. 이것을 2단계의 막 분리 유닛으로 하였다. 또한, 다른 하나의 미니 모듈 (2)의 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 나머지 하나는 실리콘 튜브에 연결하였다. 2번째의 미니 모듈 (2)의 중공사막 내측의 액에 대해서도, 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고 회로의 중앙에 피리스타 펌프를 설치하여 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 상기 용액 순환 회로의 중앙에 3방향 밸브를 설치하였다. 이것을 3단계의 막 분리 유닛으로 하였다.

미니 모듈 (3)의 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 여과액 출구 로 하였다. 이 미니 모듈 (3)의 중공사막 내측의 액도 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 페리-스트래트 펌프를 이용하여 원액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 용액 순환 회로의 중앙에 3방향 밸브를 2개 설치하였다. 이것을 농축막 유닛으로 하였다.

3단계의 분리막 유닛 미니 모듈의 처리액 회수구와 농축막 유닛의 3방향 밸브를 실리콘 튜브로 접합하였다. 또한 농축막 유닛의 용액 순환 회로의 중앙에, 3방향 밸브로 이루어지는 농축 유닛의 처리액 회수구가 설치되어 있고, 농축 조작 중에는 용액 순환 회로만이 개통하도록 되어 있다. 상기 처리액 회수구의 끝에는 회수 용기 (1)이 설치되어 있다. 시스템 전체에 PBS를 충전하고, 알부민 이상의 분자량을 갖는 단백질을 분자체에 의해 분획하는 막 분리 유닛과 단백질을 농축하는 유닛이 직결된 복합 시스템을 제조하였다.

도 1은, 실시예 A1에서 이용한 분리 시스템의 개략도이다. 액의 흐름을 화살표로 나타내었다. 혈청 및 희석액(PBS)은 주입 펌프 (100), 3방향 밸브 (101)을 거쳐서 1단계 용액 순환 회로 (102) 중에 주입되었다. 또한 액은 1단계 펌프 (103)에 의해서 송액되고, 제1 분리막 모듈 (105)(미니 모듈 (1))에 주입되어, 1단계 용액 순환 회로 (102)를 순환하였다. 제1 막 분리 유닛에서 처리된 용액은, 막 분리 유닛의 1단계에서 막 분리 유닛의 처리액 회수구 (104)를 통해 얻어졌다. 이어서, 이 용액은 2단계에서 막 분리 유닛의 3방향 밸브 (201)을 거쳐서, 2단계 용액 순환 회로 (202) 중에 주입되고 추가로 2단계 펌프 (203)에 의해서 송액되고, 제2 분리막 모듈 (205)(제1 미니 모듈 (2))에 주입되어, 2단계 용액 순환 회로 (202)를 순환하였다. 제2 막 분리 유닛에서 처리된 용액은, 2단계 막 분리 유닛의 처리액 회수구의 2단계에서 막 분리 유닛의 처리액 회수구 (204)를 통해 얻어졌다. 또한, 이 용액은 3단계에서 막 분리 유닛의 3방향 밸브 (301)을 거쳐서, 3단계 용액 순환 회로 (302) 중에 주입되고 추가로 3단계 펌프 (303)에 의해서 송액되고, 제3 분리막 모듈 (305)(제2 미니 모듈 (2))에 주입되어, 용액 순환 회로 (302)를 순환하였다. 제3 막 분리 유닛에서 처리된 액은 3단계에서 막 분리막 유닛의 처리액 회수구 (304)를 통해 얻어졌다. 또한, 이 처리액은 농축막 유닛의 3방향 밸브 (401)을 거쳐서, 4단계에서 용액 순환 회로 (402) 중에 주입되고 추가로 4단계 펌프 (403)에 의해서 송액되고, 농축 막 모듈 (405)(미니 모듈 (3))에 주입되어, 4단계에서 용액 순환 회로 (402)를 순환하였다. 이 때, 농축 막 모듈 (405)를 통해 여과된 액은 농축막 유닛의 여과액 출구 (404)로부터 취출되어 폐기된다. 여과, 농축 조작 종료 후, 미니 모듈 (3)의 4단계에서 용액 순환 회로 (402)에 남아 있는 용액은 농축 유닛의 3방향 밸브 (406)을 개방함으로써 회수 용기 (407)(회수 용기 (1))에 취출된다.

구체적 조건은 이하와 같다. 1 ㎖의 인간 혈청(시그마사 제조, H1388(Lot 073K445))을 0.2 ㎖/분으로 1단계의 막 분리 유닛에 첨가한 후, 1단계의 막 분리 유닛, 2단계의 막 분리 유닛, 3단계의 막 분리 유닛 모두 유량 5.0 ㎖/분의 조건으로 각 용액 순환 회로를 순환시키고, 각 모듈에서 모두 여과액 유량 0.2 ㎖/분의 유속으로 20 ℃, 4 시간 동안 여과를 실시하였다. 이 때, 여과된 용량분의 PBS를 0.2 ㎖/분으로 주입 펌프 (100)에 의해 첨가하여, 각 분리 유닛 및 농축 유닛을 순 환하는 액량을 일정하게 유지하였다.

4 시간의 운전 후, 회수 용기 (407)(회수 용기 (1))에 얻어진 액 중의 알부민량은 0.336 ㎍, β2 마이크로글로블린량은 0.853 ㎍이며, 원액으로서 이용한 인간 혈청 중 알부민량은 31200 ㎍, β2-마이크로글로블린량은 1.19 ㎍이고, β2-마이크로글로블린량을 유지하면서 알부민을 대폭 제거할 수 있었다.

별도로 BSA의 흡착량을 특정한 바, 회수 용기 (1)이 16.6 ng/㎠, 미니 모듈 (1)의 중공사가 397.9 ng/㎠, 미니 모듈 (2)의 중공사가 378.4 ng/㎠, 미니 모듈 (3)의 중공사가 429.3 ng/㎠였다.

<실시예 A2>

우선 1개의 미니 모듈 (4)를 준비하고, 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 실리콘 튜브를 연결하였다. 중공사막 내측의 액에 대해서는, 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 해당 회로에 페리-스트래트 펌프를 설치하여, 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 상기 용액 순환 회로의 도중에 3방향 밸브를 설치하고, 3방향 밸브의 한 방향으로는 주입 펌프를 부착하였다. 이것을 1단계의 막 분리 유닛으로 하였다. 또한, 미니 모듈 (5) 중 하나의 미니 모듈에 대해서 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 실리콘 튜브에 연결하였다. 미니 모듈 (5)의 중공사막 내측의 액에 대해서도, 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 해당 회로에 페리-스트래트 펌프를 설치하여 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 상기 용액 순환 회로의 도중에 3방향 밸브를 설치하였다. 이것을 2단계의 막 분리 유닛으로 하였다. 또한, 다른 하나의 미니 모듈 (5)의 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 나머지 하나는 실리콘 튜브에 연결하였다. 2개의 미니 모듈 (5)의 중공사막 내측의 액에 대해서도, 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 회로의 도중에 페리-스트래트 펌프를 설치하여 용액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 상기 용액 순환 회로의 도중에 3방향 밸브를 설치하였다. 이것을 3단계의 막 분리 유닛으로 하였다.

미니 모듈 (6)의 외측의 포트 중 하나를 캡핑하고, 다른 하나는 여과액 출구로 하였다. 이 미니 모듈 (6)의 중공사막 내측의 액도, 모듈의 원액 입구와 출구를 실리콘 튜브로 연결하여 용액 순환 회로를 형성하고, 페리-스트래트 펌프를 이용하여 원액을 순환할 수 있도록 하였다. 또한 용액 순환 회로의 도중에는 3방향 밸브를 2개 설치하였다. 이것을 농축막 유닛으로 하였다.

분리막 유닛 3단계의 미니 모듈의 처리액 회수구와 농축막 유닛의 3방향 밸브를 실리콘 튜브로 접합하였다. 또한 농축막 유닛의 용액 순환 회로의 도중에는, 3방향 밸브로 이루어지는 농축 유닛의 처리액 회수구가 설치되어 있고, 농축 조작 중에는 용액 순환 회로만이 개통하도록 되어 있다. 상기 처리액 회수구의 끝에는 회수 용기 (1)이 설치되어 있다. 시스템 전체에 PBS를 충전하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 알부민 이상의 분자량을 갖는 단백질을 분자체에 의해 분획하는 막 분리 유닛과 단백질을 농축하는 유닛이 직결된 복합 시스템을 제조하였다.

실시예 1과 동일하게 주입, 분리, 농축 및 회수 조작을 행하였다. 구체적 조건은 이하와 같다. 1 ㎖의 혈청을 0.2 ㎖/분으로 1단계의 막 분리 유닛에 첨가 한 후, 1단계의 막 분리 유닛, 2단계의 막 분리 유닛, 3단계의 막 분리 유닛 모두 유량 5.0 ㎖/분의 조건으로 각 용액 순환 회로를 순환하고, 각 모듈에서 모두 여과액 유량 0.2 ㎖/분의 유속으로 20 ℃, 4 시간 동안 여과를 실시하였다. 이 때, 여과된 용량분의 PBS를 0.2 ㎖/분으로 주입 펌프에 의해 첨가하여 각 분리 유닛 및 농축 유닛을 순환하는 액량을 일정하게 유지하였다.

4 시간의 운전 후, 회수 용기 (1)에 얻어진 액 중의 알부민량은 0.251 ㎍, β2마이크로글로블린량은 0.981 ㎍이고, 원액으로서 이용한 인간 혈청 중의 알부민량은 31200 ㎍, β2-마이크로글로블린량은 1.19 ㎍이고, β2-마이크로글로블린량을 유지하면서 알부민을 대폭 제거할 수 있었다.

별도로 BSA의 흡착량을 특정한 바, 회수 용기 (1)이 17.6 ng/㎠, 미니 모듈 (4)의 중공사가 35.6 ng/㎠, 미니 모듈 (5)의 중공사가 39.2 ng/㎠, 미니 모듈 (6)의 중공사가 42.8 ng/㎠였다.

<비교예 A1>

실시예 A1의 회수 용기 (1) 대신에 회수 용기 (2)를 사용한 것 이외에는, 실시예 A1과 마찬가지로 4 시간 동안 여과를 행하였다. 회수 용기 (2)에 얻어진 액 중의 알부민량은 0.490 ㎍, β2마이크로글로블린량은 0.202 ㎍이고, 원액으로서 이용한 인간 혈청 중의 알부민량은 31200 ㎍, β2-마이크로글로블린량은 1.19 ㎍이며, 알부민을 제거할 수 있었지만, β2-마이크로글로블린의 회수율이 낮았다.

별도로 BSA의 흡착량을 특정한 바, 회수 용기 (2)가 236.4 ng/㎠, 미니 모듈 (1)의 중공사가 377.1 ng/㎠, 미니 모듈 (2)의 중공사가 394.5 ng/㎠, 미니 모듈 (3)의 중공사가 429.3 ng/㎠였다.

이상의 결과를 하기 표 1, 2에 통합하였다. 표 1은 BSA의 흡착량을, 표 2에는 β2-마이크로글로블린의 회수량을 나타낸다. 흡착량이 50 ng/㎠ 이하인 회수 용기 또는 중공사를 사용한 실시예 A1, A2에서는 β2-마이크로글로블린의 회수량이 높았던 것에 반해, 흡착량이 50 ng/㎠ 이상인 회수 용기와 중공사막을 사용한 비교예 A1에서는 β2-마이크로글로블린의 회수량이 낮았다. 이와 같이 저흡착의 표면을 일부에 도입한 장치에서는 β2-마이크로글로블린의 높은 회수율이 달성되었다. 막 표면에서의 알부민의 퇴적·클로깅이 억제되고, β2-마이크로글로블린이 양호하게 막을 투과할 수 있었을 뿐만 아니라, 여과된 β2마이크로글로블린의 흡착 손실도 억제되어 높은 비율로 회수된 것을 나타내고 있다.

<<실시예 B>>

본 발명의 분획 장치에서, 분획된 미량 단백질을 포함하는 용액을 회수하기 위해서 이용하는 폴리스티렌 시험관(벡톤 딕킨손제 "5 ㎖ 폴리스티렌 둥근-바닥 튜브") 및 폴리프로필렌 시험관(벡톤 딕킨손제 "5 ㎖ 폴리프로필렌 둥근-바닥 튜브")에 대해서 흡착 및 회수 성능을 비교하였다.

<인간 β2-마이크로글로블린의 흡착 시험>

기재 표면에 대한 단백질의 흡착 평가에 대해서, 인간 β2-마이크로글로블린의 용액으로 행하는 경우에 대해서 설명한다. 실시예에서 사용한 인간 β2-마이크로글로블린(이하 β2-MG라 약기함)이란, 오리엔탈이스트사 (ORIENTALYEAST CO., LTD)의 재조합 인간 β2-마이크로글리블린, 카탈로그 코드 47194000 또는 그의 동 등품이다. 또한, 본 발명 중 소 혈청 알부민은 시그마사의 소 알부민 분말, 제품 번호 A7906 또는 그의 동등품이다.

β2-MG(오리엔탈이스트사의 재조합 인간 β2-마이크로글로블린, 카탈로그 코드 47194000)를 200 ng/㎖, 소 혈청 알부민(시그마사의 소 알부민 분말, 제품 번호 A7906) (이하 BSA라 약기함)을 10 ㎍/㎖로 함유하도록 조정한 PBS(닛스이 세이야꾸사의 둘베코 PBS) 수용액(이하, PBS 수용액이라 약기함)을 단백질 용액(이하, 단백질 용액 A라 함)으로서 이용하였다. 단백질 용액 A 중의 단백질은 제조에 사용한 용기에도 흡착하기 때문에 제조 후 5 분 이내에 흡착 실험을 개시해야만 한다. 상기한 바와 같이 제조한 단백질 용액 A를 이하와 같이 흡착 실험에 이용하였다. 즉, 대조군 샘플로서 블로킹제(다이닛본 세이야꾸사에서 시판중인 블록 에이스 카탈로그 번호 UK-B25)를 100 ㎕ 첨가한 용기(에펜도르프사 제조 안전 잠금 튜브 (safe lock tube) 상품 번호 0030 120,086)에 단백질 용액 A를 500 ㎕ 첨가하고, β2-MG 농도 측정 직전까지 -70 ℃에서 동결 보관하였다. 흡착 평가 샘플로서, 평가하는 기재에 접촉하고 25 ℃에서 1 시간 동안 정치한 후에, 블로킹제(다이닛본 세이야꾸사에서 시판중인 블록 에이스 카탈로그 코드 UK-B25)를 100 ㎕ 첨가한 용기(에펜도르프사의 안전 잠금 튜브 상품 No.0030 120,086)에 단백질 용액 A 500 ㎕를 첨가하고, β2-MG 농도 측정 직전까지 -70 ℃에서 동결 보관한다. 또한, 평가하는 기재 표면적에 대한 단백질 용액 A의 첨가량은 2 ㎖/㎠ 이상 8 ㎖/㎠ 이하로 하였다.

β2-MG 농도의 측정은 β2-MG 측정 키트(와코 쥰야꾸 고교사에서 시판중인 그라자임 β2-마이크로글로블린 EIA 시험, 코드 305-11011)로, 키트 첨부의 메뉴얼 에 따라서 행하였다. 단백질의 흡착량은 수학식 5에 의해 산출하였다.

(a)=((b)-(c))/(d)

수학식 6 중의 기호는 이하와 같다.

(a): 플라스틱 시험관의 단백질 흡착량(ng/㎠)

(b): 대조군 샘플 중 β2-MG량(ng)

(c): 흡착 평가 샘플 중 β2-MG량(ng)

(d): 플라스틱 시험관과 단백질 용액 A의 접촉 면적(㎠)

<실시예 B1>

폴리스티렌제 시험관(벡톤 딕킨손사의 "5 ㎖ 폴리스티렌 둥근-바닥 튜브")을 비닐알코올-아세트산 비닐 공중합체(중량 평균 분자량 10000, 비누화도 80 ％, 알드리치사(Aldrich)의 카탈로그 번호 360627) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

<실시예 B2>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌제 시험관을 실시예 B1 폴리비닐알코올아세트산비닐 공중합체 10 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수 용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

<실시예 B3>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌제 시험관을 폴리비닐알코올(분자량 22000, 나카라이 테스크사의 코드번호 28311-25) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<실시예 B4>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 실시예 B3과 동일한 폴리비닐알코올의 10 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 27 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<실시예 B5>

폴리프로필렌 시험관(벡톤 딕킨손사의 "5 ㎖ 폴리프로필렌 둥근-바닥 튜브")을 폴리비닐알코올(분자량 10000, 알드리치사의 카탈로그 번호 360627) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<실시예 B6>

실시예 B5에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리프로필렌 시험관을 실시예 B5와 동일한 폴리비닐알코올의 10 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<실시예 B7>

실시예 B5에서 최초로 준비한 폴리프로필렌 시험관을 폴리비닐알코올(분자량 22000, 나카라이 테스크제 코드 번호 28311-25) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<실시예 B8>

실시예 B5에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리프로필렌 시험관을 실시예 B7 과 동일한 폴리비닐알코올의 10 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 27 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B1>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B2>

실시예 B5에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리프로필렌 시험관을 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B3>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐피롤리돈(분자량 50000, 바스프사의 콜리돈(Kollidon) 25) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐피롤리돈 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B4>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐피롤리돈(분자량 3000, 바스프사의 콜리돈 12PF) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 27 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B5>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 폴리에틸렌글리콜(분자량 20000, 가타야마 가가꾸 고교사의 폴리에틸렌글리콜 20000) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 25 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B6>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 폴리에틸렌글리콜(분자량 2000, 와코 쥰야꾸 고교사의 폴리에틸렌글리콜 2000) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블 린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B7>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관을 폴리에틸렌이민(분자량 25000, 알드리치사의 카탈로그 코드 40872-7) 1000 ppm 수용액 100 ㎖에 침지하여 γ선 조사하였다. γ선의 흡수선량은 26 kGy였다. 폴리스티렌 시험관을 폴리비닐알코올 수용액으로부터 취출하여 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예 B8>

실시예 B1에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리스티렌 시험관의 내벽을 15 ㎖의 메탄올로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 상기의 시험관에 MPC와 부틸메타크릴레이트 공중합체 25000 ppm 메탄올 용액 100 ㎖에 1 분간 침지하였다. 상기 시험관을 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 용액으로부터 취출하여 시험관 내의 액을 배출하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 상기 시험관을 유수 500 ㎖로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

<비교예9>

실시예 B5에서 최초로 준비한 것과 동일한 폴리프로필렌 시험관의 내벽을 15 ㎖의 메탄올로 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관에 MPC와 부틸메타크릴레이트 공중합체 25000 ppm 메탄올 용액 100 ㎖에 1 분간 침지하였다. 상기 시험관을 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 용액으로부터 취출하여 시험관내의 액을 배출하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 상기 시험관을 유수 500 ㎖에서 세정하고, 70 ℃의 오븐으로 1 시간 동안 건조하였다. 이 시험관을 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험에 제공하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3로부터 명백한 바와 같이, 인간 β2-마이크로글로블린 흡착 시험(농도 200 ng/㎖의 인간 β2-마이크로글로블린과 농도 10 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민으로 이루어지는 단백질 수용액을 사용)의 결과, 본 발명의 경우(실시예 1 내지 9)는 비교예 1 내지 9에 비해 β2-MG 흡착량(인간 β2-마이크로글로블린 흡착량)이 적고, 미량 생체 성분의 흡착 억제, 고효율 회수에 효과적이다.

본 발명의 분획 장치는 프로테옴 해석을 행할 때의 시료의 제조에서 매우 유용한 것이고, 의학, 특히 인간의 병의 발견에 적용된다.

Claims

단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 표면을 갖는 기재를 포함하며, 기재 표면의 적어도 일부를 1000 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민 용액과 접촉시켰을 때 상기 기재 표면에 대한 소 혈청 알부민의 흡착량이 50 ng/㎠ 이하인 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치.
제1항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드와 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 친수화 처리되어 이루어지는 분획 장치.
제2항에 있어서, 친수성 고분자가 기재 표면에 부여되어 친수화된 분획 장치.
제3항에 있어서, 친수성 고분자가 수산기를 함유하는 것인 분획 장치.
제4항에 있어서, 친수성 고분자의 적어도 일부가 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올의 공중합체인 분획 장치.
제5항에 있어서, 폴리비닐알코올의 공중합체가 폴리비닐알코올-폴리아세트산비닐 공중합체인 분획 장치.
제6항에 있어서, 폴리비닐알코올-폴리아세트산비닐 공중합체의 비누화도가 0.70 이상 1 미만인 분획 장치.
제3항에 있어서, 친수성 고분자를 기재 표면에 그래프팅함으로써 기재 표면이 친수화된 분획 장치.
제8항에 있어서, 친수성 고분자의 그래프팅이 방사선 조사에 의한 것인 분획 장치.
제9항에 있어서, 소 혈청 알부민의 흡착량이 50 ng/㎠ 이하인 기재가 막인 분획 장치.
제10항에 있어서, 상기 막의 형상이 중공사인 분획 장치.
제11항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드를 함유하는 용액을 공급하는 수단, 용액으로부터 단백질 및/또는 펩티드를 분리하는 수단, 및 용액 중의 단백질 및/또는 펩티드를 농축하는 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 분획 장치.
제12항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드의 질량 분석을 위한 시료를 제조하 는 전처리 장치인 분획 장치.
제13항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드가 혈액, 혈청, 혈장 등의 혈액 유래물, 소변, 복수, 타액, 눈물, 방수(aqueous humor), 뇌척수액, 양수, 흉수 또는 세포 추출액에 함유된 유체인 분획 장치.
단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 표면을 갖는 기재를 포함하며, 기재 표면의 적어도 일부를 농도 200 ng/㎖의 인간 β2-마이크로글로블린과 농도 10 ㎍/㎖의 소 혈청 알부민으로 이루어지는 단백질 수용액과 접촉시켰을 때, 상기 기재 표면에 대한 인간 β2-마이크로글로블린의 흡착량이 3 ng/㎠ 이하인 단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치.
제15항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드와 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 친수화 처리되어 이루어지는 분획 장치.
제16항에 있어서, 친수성 고분자가 기재 표면에 부여되어 친수화된 분획 장치.
제17항에 있어서, 친수성 고분자가 수산기를 함유하는 것인 분획 장치.
제18항에 있어서, 친수성 고분자의 적어도 일부가 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올의 공중합체인 분획 장치.
제19항에 있어서, 폴리비닐알코올의 공중합체가 폴리비닐알코올-폴리아세트산비닐 공중합체인 분획 장치.
제20항에 있어서, 폴리비닐알코올-폴리아세트산비닐 공중합체의 비누화도가 0.70 이상 1 미만인 분획 장치.
제17항에 있어서, 친수성 고분자를 기재 표면에 그래프팅함으로써 기재 표면이 친수화된 분획 장치.
제22항에 있어서, 친수성 고분자의 그래프팅이 방사선 조사에 의한 것인 분획 장치.
제22항에 있어서, 인간 β2-마이크로글로블린의 흡착량이 3 ng/㎠ 이하인 기재가 막을 포함하는 것인 분획 장치.
제24항에 있어서, 상기 막의 형상이 중공사인 분획 장치.
제24항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드를 함유하는 용액을 공급하는 수단, 용액으로부터 단백질 및/또는 펩티드를 분리하는 수단, 및 용액 중의 단백질 및/또는 펩티드를 농축하는 수단을 갖는 분획 장치.
제26항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드의 질량 분석을 위한 시료를 제조하는 전처리 장치인 분획 장치.
제27항에 있어서, 단백질 및/또는 펩티드가 혈액, 혈청, 혈장 등의 혈액 유래물, 소변, 복수, 타액, 눈물, 방수, 뇌척수액, 양수, 흉수 또는 세포 추출액에 함유된 유체인 분획 장치.
단백질 및/또는 펩티드의 분획 장치이며, 단백질 및/또는 펩티드를 함유하는 용액을 공급하는 공급 수단, 용액으로부터 단백질 및/또는 펩티드를 분리하는 수단, 및 용액 중의 단백질 및/또는 펩티드를 농축하는 수단을 갖고, 분획 장치에서의 단백질 및/또는 펩티드가 접촉하는 기재 표면의 적어도 일부가 친수성 고분자에 의해서 그래프팅되어 있는 분획 장치.
제29항에 있어서, 친수성 고분자가 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올 공중합체이며, 그래프팅이 방사선에 의한 것인 분획 장치.