JP2020063957A - 試料前処理器具及び該器具を用いた試料前処理方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このBOPs法は、疎水性ビーズ表面を目的タンパク質でコーティングせずに効率よくトリプシン消化を達成できる。さらに、この方法は、上記したような希薄試料又は変性剤混入試料からでもロスなく試料調製することが可能となる。実際、線虫 (C. elegans) の1個体に発現する1000種以上のタンパク質を一回の分析で同定できる性能をもっている。
内部に貯留部を有し、一端に前記分注器と装着するための装着口が形成され、他端に前記被験物質を注入及び排出する吸排出口とが形成される容器本体と、
前記貯留部内で移動可能に内包され、被験物質を吸着する吸着材料と、
を備えることを特徴とする、試料前処理器具である。
前記分注器のピペッティング操作によりタンパク質を被験物質として含有した溶液の吸排出を所定数繰り返し行って、前記被験物質を前記吸着材料に吸着させるステップを含むことを特徴とする、試料前処理方法である。
以下の説明では、被験物質としてタンパク質を使用し、タンパク質を含有する試料溶液に各種処理(タンパク質の濃縮、洗浄、消化処理)を施して質量分析法で使用可能な分析用試料を調製する実施形態を例示する。
図1に示すように、本実施形態の試料前処理器具1は、容器本体2と、フィルタ3と、吸着材料4とで構成され、分注器Dの先端に取り付けてピペットチップのように使用される。
なお、本実施形態では、被験物質がタンパク質であるため、一般的に知られているタンパク質の試料調製工程(濃縮処理→洗浄処理→消化処理)と同様の工程を経るが、本発明の試料前処理器具1を用いた場合、前処理〜消化処理の前段階までのハンドリング操作が全て分注器Dのピペッティング操作のみで行える点が、従来の方法と大きく異なる。
被験物質の濃縮処理は、マイクロチューブに収容された試料溶液をピペッティング操作により懸濁操作を所定回数行う。この処理により、貯留部2a内への試料溶液の流入/流出が繰り返し行われることで、被験物質が吸着材料4の表面に吸着して濃縮される。濃縮処理におけるピペッティング回数は、試料溶液の液量に依存するが、概ね20μlの試料では15〜20回、100μlでは30〜40回程度行う。
なお、濃縮処理後の吸着材料4を容器本体2に収容する場合は、例えば吸着材料4を装着口2cから入れた後に試料前処理器具1を分注器Dの先端に装着すればよい。
被験物質の洗浄処理は、洗浄液としてマイクロチューブに収容された水系緩衝液を用いて数回(2、3回程度)ピペッティング操作する処理が基本となり、貯留部2a内への洗浄液の流入/流出が繰り返し行われることで洗浄される。る。また、吸着材料4に吸着されてしまう混入物(例えば界面活性剤)が試料溶液内に混和している場合は、タンパク質とともにこれらの混入物も吸着材料4に吸着してMS分析を妨害する虞があるため、洗浄液としてアセトンや酢酸エチルなどの有機溶媒を用いたピペッティング操作(2、3回程度)による洗浄を、水系緩衝液を用いる洗浄操作に前に行う。これにより、混入物の除去が可能となる。
被験物質の消化処理において、トリプシン消化の溶媒として少量の有機溶媒―水系緩衝液を用いる。有機溶媒と緩衝液の組み合わせは種々考え得るが、例えばアセトニトリルと100mM(最終濃度)とTris−HCl緩衝液(pH8)との組み合わせの場合、概ね60:40〜80:20(V/V)間で調整するのが好ましい。
なお、下記に示す実施例は本発明を限定するものではなく、前・後記の趣旨に照らし合わせて本発明の構成及び特徴要件を逸脱しない範囲で適宜設計変更することは、何れも本発明の技術的範囲に含まれるものとする。
実施例1は、本発明の試料前処理器具1を用いて溶液内消化法により調製した分析用試料と、従来の溶液内消化法により調整した分析用試料における分析感度を比較した。
・容器本体2:ピペットチップ(QSPピペットチップ1−200μl クリアー:ThermoFisherScientific社製)
・フィルタ3:PTFEメンブレン(オムニポアメンブレンフィルター:細孔サイズ10. 0μm,Merck社製)
・吸着材料4:R2ビーズ (POROS R2マイクロビーズ:平均粒子径50μm,PerSeptive Biosystems社製)
次に、濃縮処理として、平衡化した前記器具1を用い、100μlのトリス−塩酸緩衝液(100mM Tris−HCl(pH8)に0. 15μMのウシ血清アルブミン(BSA(Bovine Serum Albumin),富士フイルム和光純薬株式会社製)を含有させた溶液を40回ピペッティング操作し、吸着材料4にBSAを吸着させ濃縮した。
次に、洗浄処理として、100μlのトリス−塩酸緩衝液(100mM Tris−HCl(pH8),富士フイルム和光純薬株式会社製)を洗浄液として用いて3回のピペッティング操作により吸着材料4を洗浄した。
その後、60%のアセトニトリル(LCグレード,Millipore社製)と40%のトリス−塩酸緩衝液(100mM Tris−HCl(pH8)を最終濃度とした混合溶媒20μlに0.5μgのトリプシン(MSグレード:Promega社製)を含有させた溶液を前記器具1内に吸引し、37℃でオーバーナイトインキュベートしてトリプシン消化による分析用試料の調製をした。
実施例2は、作業者によるデータのばらつきの程度を検討するため、試料調製の習熟度が異なる5人の作業者(作業者1〜5)に試料調製処理を実施させた。
2…容器本体(2a…貯留部、2b…吸排出口、2c…装着口、2d…蓋)
3…フィルタ
4…吸着材料
D…分注器
一端に前記分注器を装着するための装着口が形成され、他端に前記被験物質を注入及び排出する吸排出口が形成され、前記装着口と前記吸排出口の間の内部が前記吸排出口から前記被験物質の流入と流出が繰り返されることにより被験物質の吸着が行なわれる貯留部とされた容器本体と、
前記吸排出口から流出しないように、かつ前記貯留部内で移動可能に内包され、前記貯留部内に流入した被験物質を吸着する吸着材料と、
を備えることを特徴とする、試料前処理器具である。
前記分注器のピペッティング操作によりタンパク質を被験物質として含有した溶液の吸排出を、前記吸排出口を介して所定数繰り返し行って、前記貯留部内で前記被験物質を前記吸着材料に吸着させるステップを含むことを特徴とする、試料前処理方法である。
Claims (5)
- 分注器の先端に装着して溶液内の被験物質を吸着分離する試料前処理器具であって、
内部に貯留部を有し、一端に前記分注器と装着するための装着口が形成され、他端に前記被験物質を注入及び排出する吸排出口とが形成される容器本体と、
前記貯留部内で移動可能に内包され、被験物質を吸着する吸着材料と、
を備えることを特徴とする試料前処理器具。 - 前記容器本体の前記吸排出口に、前記吸着材料の流出を防止しつつ前記被験物質が通過可能なフィルタが設けられていることを特徴とする請求項1記載の試料前処理器具。
- 請求項1又は2記載の試料前処理器具を先端に装着した分注器による試料前処理方法であって、
前記分注器のピペッティング操作によりタンパク質を被験物質として含有した溶液の吸排出を所定数繰り返し行って、前記被験物質を前記吸着材料に吸着させるステップを含むことを特徴とする試料前処理方法。 - さらに、前記分注器のピペッティング操作により洗浄液の吸排出を所定数繰り返し行って、前記被験物質が吸着された吸着材料を洗浄するステップを含むことを特徴とする請求項3記載の試料前処理方法。
- さらに、前記分注器のピペッティング操作により、トリプシンを添加した溶媒の吸排出を所定数繰り返し行った後、前記溶媒を吸入した状態でインキュベートして前記被験物質をトリプシン消化させるステップを含むことを特徴とする請求項4記載の試料前処理方法。
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