JP2004004078A - 閉塞防止装置及びそのゲル内消化への適用方法 - Google Patents

閉塞防止装置及びそのゲル内消化への適用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ウエルのドレインが閉塞することを防止することを課題とする。
【解決手段】入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路であって試料担体の最小寸法よりも小さい最大寸法を有する通路とを有する少なくとも１つのウエルを用意し、前記ウエルのドレインを真空源に接続し、前記試料担体を前記底部表面に支持させたとき、前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持するようにした試料調製装置である。
【選択図】　　　　図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分析のためにタンパク質を含有する試料の調製する方法及びそのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マトリックス補助レーザ脱着・イオン化分析は生化学、免疫学、遺伝学、及び生物学における構造上の問題に対処する有用な手段である。この分析法では、試料がイオン化され、そして飛行時間（ＴＯＦ）分析がイオン質量を測定するのに使用される。飛行時間分析は、イオンが形成されそしてイオンがドリフト領域に入るように一定のエネルギーまで加速されたときに開始される。イオンはそれらの質量の平方根に比例した飛行時間に従って検出器に到着する。質量スペクトルが形成されるのは異なった質量のイオンが異なった時間に検出器に到着するためである。
【０００３】
質量スペクトル分析器は特に薬剤の研究開発、遺伝子型決定、及びタンパク質研究における特に強力な手段である。現在の研究動向はより大きく且つより多数の試料を自動処理装置またはロボットを使用して分析することに向けられている。それぞれの試料の量はナノモルからフェムトモルのレベルまで広範囲である。その結果計測は益々感度が高くなり、小型で、高濃度で、使い捨て処理できる試料処理形式が必要である。
【０００４】
タンパク質のゲル内消化は試料分析（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　ＭＳ）に先立つ多くの試料調製工程を有するプロテオミクス法である。簡単に述べると、電気泳動ゲルの分離に際して試料中のタンパク質は検出のために染色され、目的のタンパク質を含有するゲルの部分が削り出される。染色は次のこれらの部分から除去され、次いでタンパク質試料を消化してゲル部分から酵素溶液に移行するペプチドを選択的に形成するために酵素溶液が使用される。ペプチドを精製した後にこの試料の分析が行われる。
【０００５】
多数の試料の同時調製及び分析はしばしば望まれるところである。多ウエルプレートが同時分析の目的で開発されており、典型的なものは１個のプレートにつき９６個、３８４個または１５３９個の反応容器またはウエルを含む。試料の取り扱い及び調製、例えば所望されたい塩や生化学物質の除去により質量分析の分解能と選択性を向上するためにも多ウエルプレートを使用することが望ましい。
【０００６】
これに関して、ＥＰ１１５１７９３号は疎液製の多孔質底部を有するマイクロタイタープレートを記載している。タンパク質を含有するゲル片が雨プレートのウエル内に置かれ、酵素で消化される。酵素は次に遠心分離によりゲル片から除去され、次いでＭＡＬＤＩ用試料担持プレートに載せられて分析に掛けられる。
【０００７】
しかし、遠心分離を使用して結合、洗浄、溶出は時間がかかる工程である。加えて、こうした作業を自動制御またはロボット作業に適合することが難しい。酵素による消化及びタンパク質の捕捉に遠心分離作用を要せず、容易に自動化できるマイクロタータプレートを使用することが望まれる。
【０００８】
他の困難はゲルプラグが変形する可能性を有し、またゲルプラグがプレートの円錐形ドレインと同様な直径を有することである。真空濾過の際に、ゲルプラグは出口を塞いでウエルの排出をできなくするか、或いは多重の溶液添加によりオーバーフローを起こすことにより隣接ウエルを汚染する。
【０００９】
【特許文献１】
ＥＰ１１５１７９３号明細書
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、マトリックス補助レーザ脱着飛行時間法（ＭＡＬＤＩＴＯＦ法）、電気噴霧イオン化法（ＥＳＩ法）質量分析、又は他の方法の実施に先立って、試料の脱塩及び精製を行い、又タンパク質の消化特にゲル内消化に使用できる試料調製法を提供することにある。
本発明の他の目的は高密度多ウエル装置であって、装置内に各種配列体が同一または異なった薬剤を含有するクロマトグラフ媒体を含み、タンパク質のゲル内消化が駆動力として真空を利用して実行されるような多ウエル装置を提供することにある。
本発明の更なる目的は自動化ロボットによる液体処理装置に適した試料調製システム及び方法を提供することにある。
これら及び他の目的は以下の説明から明らかであろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の従来技術の問題は、本発明により解決される。本発明の第１の形態では、マトリックス補助レーザ脱着飛行時間法（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ法）又は電気噴霧イオン化法（ＥＳＩ法）質量分析に先立って、タンパク質の脱塩及び濃縮を行う集積プロテオミクス試料の調製装置及び方法を提供する。本発明の装置及び方法は、脱着飛行時間法（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ法）分析に先立って試料の消化、脱塩及び濃縮を行うことが可能である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
より具体的には、本発明の装置は各々がそれぞれの出口又はドレインに連通し、場合により多孔質重合体マトリックスに捕捉された複数の収着性粒子を含む３次元構造体を収容している複数のウエルを有することにより、固相抽出を実行できる装置を構成する。好ましい実施例では、ウエルは、ウエルに挿入されるゲル片のようなサンプル支持体が真空駆動力を加えたときに出口を閉塞しないような形状に形成される。装置は又出口が詰まった場合にウエル間の相互汚染を減少又は解消する。
【００１３】
本発明は、分析のためにタンパク質を含有する試料の調製する方法において、前記試料を含有する担体を用意し、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路であって前記担体の最小寸法よりも大きい寸法を有する通路とを有する少なくとも１つのウエルを用意し、前記担体を前記底部表面に支持させ、同時に前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持し、酵素を添加することにより前記担体中の前記試料中に含有されたタンパク質を消化させ、溶液を前記ウエルに加えて前記担体からペプチドを抽出し、前記ウエルに真空を印加し、次いで前記抽出されたペプチドを前記少なくとも１つの通路を経由して前記ドレインに流す工程よりなる、試料調製方法であるを提供する。
【００１４】
本発明はまた、分析のためにタンパク質を含有する試料の調製する方法において、前記試料を含有する複数の担体を用意し、各々が、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路であって前記担体の最小寸法よりも小さい寸法を有する通路とを有する複数のウエルを用意し、前記複数の担体の各一つを対応した各ウエルの前記底部表面に支持させ、前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持し、酵素溶液を添加することにより前記担体中の前記試料中に含有されたタンパク質を消化させ、溶液を前記ウエルに加えて前記担体からペプチドを抽出し、前記ウエルに同時に真空を印加し、次いで前記抽出されたペプチドを各ウエルの前記少なくとも１つの通路を経由して前記各ドレインに流す工程よりなる試料調製方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路とを有し、試料担体を受容する少なくとも１つのウエル、及び前記ウエルに連通した真空源より構成され、前記少なくとも１つの通路は、前記試料担体の最小寸法よりも小さい寸法を有することにより、前記試料担体が前記ウエル内に装入されているときに前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持するようにされている、試料調製装置を提供する。
【００１６】
本発明はまた、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路とを有し、試料担体を受容する少なくとも１つのウエル、前記ドレインに配置した複合構造体、及び前記ウエルに連通した真空源より構成され、前記複合構造体は、前記ドレインから前記ウエル内に延びて前記ウエルから前記ドレインへの流路を形成する部分を有し、前記ウエル内に前記試料担体が前記ウエル内に配置されたときに前記部分を介して前記底部表面と前記ドレインとの間の流体流通を確保するように構成された、試料調製装置を提供する。
【００１７】
本発明はまた、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインを１つ以上の小ドレイン開口に分割するリブとを有する少なくとも１つのウエル、及び前記ウエルに連通した真空源よりなり、前記少なくとも１つのウエルは試料を受容するように適合し、前記小ドレイン開口は前記試料担体の最小寸法よりも小さい寸法を有している試料調製装置を提供する。
【００１８】
ある実施の形態では、前記通路は前記ドレインの周りに好ましくは対称に３個配置されている。
ある形態ではペプチドはドレイン中に配置されている吸着構造体により前記ドレイン中で吸着される。
ある形態では、吸着構造体は多孔質基質に捕捉された複数の吸着剤粒子である。
ある形態では、試料担体はゲルを含む。
ある形態では、担体は膜を含む。
ある形態では、前記少なくとも１つの通路は１．０ｍｍ以下の寸法を有する。
ある形態では、ウエルは複数個のウエルである。
ある形態では、複数のウエルは凹入部により取り囲まれている。
【００１９】
【実施例】
本発明の試料調製装置に適した基材は特に限定されず、プラスチック（ポリエチレン及びポリプロピレン）、ガラス、及びステンレス鋼が使用できる。基材は装置の動作に干渉したり、使用される薬剤に干渉することがないものとする。ポリオレフィン、及び特にポリプロピレンが好ましい材料である。
【００２０】
図１及び図２には単一又は複数のウエル装置１０を有するウエル試料調製装置に適した単一ウエル１２が示されている。ウエル１２は垂直に延びる流体に不透過な側壁と傾斜して底部を有する。ウエル１２の中間部及び上部はほぼ円筒形をなすが、本発明の範囲内で他の形状を有しても良い。ウエル１２の下部は底部中央に向けて下方に傾斜して円錐台形をなしている。底部１３はドレイン１５を有し、好ましくはウエル１２の中央部にある。
【００２１】
ウエル１０の底部１３は少なくとも１つの流体通路１８を有する。流体通路１８は底部１３の比較的平滑な又は平坦な表面を修正して、ウエル１２内で底部１３に指示されたゲル片のような試料担体２０（図２）とドレイン１５との間にギャップ又は空所を形成する。試料担体は液体でも良いが好ましくはゲル、被覆ビーズ、又はメンブレインのような固体である。試料担体２０が存在するときに流体をウエル１２とドレイン１５の間に確実に流すために、各通路１８の最小寸法は試料担体２０の最小寸法よりも小さく、そのため試料担体２０は通路１８内に位置してドレイン１５への流れを塞ぐことがないようにする必要がある。このようにして、少なくとも流体通路１８の一部は常にドレイン１５と連通し、図２、３、４に示したように、試料担体１５がウエル１２内に置かれたとき担体が流れを阻止しないようにする。担体２０がゲル片の場合には、自動化ピッカーロボットに見出される円形プラグカッターがゲル部分を一様に切断する。しかし、本発明では流体通路１８が不規則形状の担体が使用される場合にも流体通路を塞ぐことがないので、一定形状の担体に限定する必要がない。例えば、担体よりも長い単一スリット模本発明の範囲内にある。
【００２２】
単一通路１８は試料担体２０の周りに流路を形成するには充分であるが、好ましくは複数の通路を設けることが望ましい。少なくとも２つ、最も好ましくは３つの通路１８が図５Ａ及び図７のようにドレイン１５の周りに対称に形成される。通路がドレイン１５の周りに対称に形成されると、担体２０の向きに関係なくウエル１２及びドレイン１５の間に流通関係が維持される。通路１８の形状及び角度関係は担体２０の形状に合致しない限り特に限定されない。好ましくは通路１８は耳たぶ形、正方形、段付き円形、突起付き円錐形、又は横棒形等の適当な形状が可能である。図７に示したように、テーパした耳たぶ形をなし、ドレインに近づくにつれて深くなるものが好ましい。
【００２３】
通路１８は好ましくは底部１３の表面に非対称性を形成することにより形成する。これはこの表面に溝、又は表面の上に隆起部又は突部、例えば図９のように横棒１１７、又は図１０のようにリブないしバンプ１１８を形成することにより形成することができる。好ましくは通路１８は長さ約１ｍｍ、深さ約０．２ｍｍ、幅約０．３５ｍｍを有する溝である。突部を用いる実施例では、突部はドレイン１５の最大開口が試料担体２０の最小寸法よりも小さくなるように定める。その目的は試料担体２０がドレイン１５内に位置してそれを塞ぐことがないようにするためである。
【００２４】
図１と図７に示したように、ドレイン１５は、好ましくは円筒形であってその軸線がウエル１２の縦軸に位置している孔である。ドレイン１５は通路１８と連絡している。少なくともドレイン１５の一部は好ましくは吸着複合構造体２５（図５、図５Ａ）が収納されている。適当な吸着複合構造体はその場で注入される重合体により結合された粒子を担持する吸着性膜構造体であり、例えば米国特許第６０４８４５７号に記載された、バインダで結合されたクロマトグラフビーズより構成されたもの等があるので同文献を参照されたい。このような構造体の好ましい一つは多孔室重合体基質に捕捉した複数の吸着粒子であって約１０以下、好ましくは約５以下のアスペクト比（平均直径／平均厚さ）のものである。構造体２５は好ましくはドレイン１５の底と同じ面からドレイン内に延びており、好ましくはさらにドレイン１５の全長に延び、通路１８まで延びることができる（図５）。複合構造体２５は通路１８を完全に満たすことができるが、通路１８の一部好ましくは約５０％（好ましくは上側半分）が構造物２５の無い状態にして通路１８が試料担体２０により塞がれないようにする。
【００２５】
図８および図８Ａに示したように、複合構造体２５には試料担体２０の最大寸法よりも大きい寸法部分を一カ所以上有するように形成してウエルとドレインの間の流通を、流れのための表面領域を維持するための通路を形成することなく可能にすることができる。例えば複合構造体の正面形状は長い脚部２５Ａを備えた円形或いは眼形にし、それにより、複合構造体の表面のある部分が流れを阻害しない状態にとどまり、試料担体２０の向きにかかわりなく流路を確保するようにする。
【００２６】
本発明の装置は、異なった官能基を有する複数の樹脂材料による複数の複合構造体を含むことにより、電荷、寸法、親和性、及び又は疎水性等により変わる試料の分画を実施することができる。別法として異なった官能性膜を備えた装置を組み合わせて使用して同様の結果を得ることもできる。同様に、１以上の膜を適当なハウジング内で注型する前又は注型した後に官能性を付与することができる。
【００２７】
他の実施例では、ドレインは媒体を含まないことも可能で、この場合、装置は消化したタンパク質を分析又は濃縮用の捕集ウエルに供給する無閉塞処理装置として使用することができる。
【００２８】
試料担体中のタンパク質を染色された後、目的のタンパク質を含む担体の小片を染色場所から削り取り、各担体をそれぞれのウエル内に挿入する。適当量のタンパク質分解酵素溶液をピペットによるなどして各ウエルに滴下する。酵素はタンパク質を効果的に消化するのに十分な量で添加する。好ましくは過剰量の酵素を、担体が各ウエル内で浸される程度に添加する。タンパク質を消化し、得られるペプチドを担体から拡散する培養期間の後に、好ましくは約５〜１０ｐｓｉ（０．３５〜０．７０ｋｇ／ｃｍ２）の差圧を生じるように各ウエルに真空を加え、それにより抽出されたペプチドをドレイン１５に流出させ、そこに吸着剤がある場合には吸着させ、次いで通常の方法で洗浄し、緩衝液、塩その他の汚染物から分離する。濃縮されたペプチドを次に溶出し、分析のために適当なターゲット又はＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　ＭＳ等の表示装置に送る。
【００２９】
自動化した多重添加工程の間に、もしも閉塞が生じたらウェルがオーバーフローすることがあり得る。本発明は装置にオーバーフロー抑制の特徴を具備させたために他のウエルの汚染を減少又は無くする。特に、図６に示したように、各ウエル１２の少なくとも一部の周りに凹入部３０を備える。この凹入部３０は好ましくはトレイ３５の頂面３２にほぼ一致した各ウエル１２の頂面２９から、ウエル１２の深さの約５０％のところまで下方（ドレイン１５の方向）に延び、底壁３４に終端している。凹入部の深さは少なくとも１つのウエルからのオーバーフローを閉じ込めることができるに十分な深さなら適当でよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による多数試料を調製するための装置に使用する単一ウエルの断面図である。
【図２】ゲル片を挿入した本発明による多数試料を調製するための装置に使用する単一ウエルの部分断面斜視図である。
【図３】ゲル片を挿入した本発明による多数試料を調製するための装置に使用する単一ウエルの断面図である。
【図４】ゲル片を挿入した本発明による多数試料を調製するための装置に使用する単一ウエルの拡大断面図である。
【図５】ゲル片（仮想線で示した）とドレインに吸着性を有するマトリックスとを挿入した本発明による多ウエル試料調製装置に使用する単一ウエルの拡大断面図である。
【図５Ａ】本発明によりウエルに流体通路を形成した平面図である。
【図６】２つのウエルを隣り合って並べた多ウエル試料調製装置の一部断面で示した斜視図である。
【図７】本発明によるウエルのドレイン及び通路の強化部材の斜視図である。
【図８】ゲル片（仮想線で示した）とドレインに吸着性を有するマトリックスとを挿入した本発明の他の実施例による多ウエル試料調製装置に使用する単一ウエルの拡大断面図である。
【図８Ａ】図８の実施例のウエルに形成された流体通路を示す平面図である。
【図９】本発明の実施例による分割部材を有する実施例の斜視図である。
【図１０】本発明の実施例による盛り上がりバンプを通するウエルの断面図である。
【符号の説明】
１０　ウエル装置
１２　ウエル
１３　底部
１５　ドレイン
１８　流体通路
２０　試料担体
２５　複合構造体
２５Ａ　脚部
２９　頂面
３０　凹入部
３２　頂面
３４　底壁
１１７　横棒
１１８　バンプ

Claims (21)

  1. 分析のためにタンパク質を含有する試料の調製する方法において、
    前記試料を含有する担体を用意し、
    入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路であって前記担体の最小寸法よりも小さい最大寸法を有する通路とを有する少なくとも１つのウエルを用意し、
    前記担体を前記底部表面に支持させ、前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持し、
    酵素溶液を添加することにより前記担体中の前記試料中に含有されたタンパク質を消化させ、
    溶液を前記ウエルに加えて前記担体からペプチドを抽出し、
    前記ウエルに真空を印加し、次いで
    前記抽出されたペプチドを前記少なくとも１つの通路を経由して前記ドレインに流す工程よりなる、試料調製方法。
  2. 前記通路は前記ドレインの周りに３個配置されている請求項１の方法。
  3. 前記ペプチドは前記ドレイン中に配置されている吸着構造体により前記ドレイン中で吸着される請求項１の方法。
  4. 前記構造体は多孔質基質に捕捉された複数の吸着剤粒子である請求項３の方法。
  5. 前記担体はゲルを含む請求項１の方法。
  6. 前記担体は膜を含む請求項１の方法。
  7. 分析のためにタンパク質を含有する試料の調製する方法において、
    前記試料を含有する複数の担体を用意し、
    各々が、入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路であって前記担体の最小寸法よりも小さい寸法を有する通路とを有する複数のウエルを用意し、前記複数の担体の各一つを対応した各ウエルの前記底部表面に支持させ、前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持し、
    酵素を添加することにより前記担体中の前記試料中に含有されたタンパク質を消化させ、
    溶液を前記ウエルに加えて前記担体からペプチドを抽出し、
    前記ウエルに同時に真空を印加し、次いで
    前記抽出されたペプチドを各ウエルの前記少なくとも１つの通路を経由して前記各ドレインに流す工程よりなる、試料調製方法。
  8. 前記通路は前記ドレインの周りに３個配置されている請求項７の方法。
  9. 入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路とを有し、試料担体を受容する少なくとも１つのウエル、及び前記ウエルに連通した真空源より構成され、前記少なくとも１つの通路は、前記試料担体の最小寸法よりも小さい寸法を有することにより、前記試料担体が前記ウエル内に装入されているときに前記底部表面と前記ドレインとの間を前記少なくとも１つの通路を介して流体流通状態に維持するようにされている、試料調製装置。
  10. 前記少なくとも１つの通路は１．０ｍｍ以下の寸法を有する請求項９の装置。
  11. 前記少なくとも１つの通路は前記ドレインの周りに対称に配置された３個の通路である請求項９の装置。
  12. 前記ドレイン内に吸着構造体が配置されている請求項９の装置。
  13. 前記構造体は多孔基質に捕捉された複数の吸着剤粒子である請求項１２の装置。
  14. 前記試料担体はゲルである請求項９の装置。
  15. 前記ウエルは複数個のウエルである請求項９の装置。
  16. 前記複数のウエルは凹入部により取り囲まれている請求項１５の装置。
  17. 前記少なくとも１つの通路は前記ウエルの前記底面に設けた少なくとも１つのバンプにより形成されている請求項９の装置。
  18. 入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインの周りにおいて前記底部表面に形成した少なくとも１つの通路とを有し、試料担体を受容する少なくとも１つのウエル、前記ドレインに配置した複合構造体、及び前記ウエルに連通した真空源より構成され、前記複合構造体は、前記ドレインから前記ウエル内に延びて前記ウエルから前記ドレインへの流路を形成する部分を有し、前記ウエル内に前記試料担体が前記ウエル内に配置されたときに前記部分を介して前記底部表面と前記ドレインとの間の流体流通を確保するように構成された、試料調製装置。
  19. 前記試料担体はゲルである請求項１８の装置。
  20. 入口と、底部表面と、前記底部表面に設けたドレインと、前記ドレインを１つ以上の小ドレイン開口に分割するリブとを有する少なくとも１つのウエル、及び前記ウエルに連通した真空源よりなり、前記少なくとも１つのウエルは試料を受容するように適合し、前記小ドレイン開口は前記試料担体の最小寸法よりも小さい寸法を有している試料調製装置。
  21. 前記複合構造体は前記ドレイン内に配置されている請求項２０の装置。
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