-
Die Erfindung betrifft Verfahren
und Vorrichtungen für
den Verdau von kleinsten Proteinmengen in ausgeschnittenen Gelstückchen und
für das
Extrahieren der Verdaupeptide als Vorbereitung für eine massenspektrometrische
Analyse.
-
Die Erfindung besteht darin, einen
enzymatischen Verdau der Proteine innerhalb der Gelstückchen wandberührungsarm
vorzunehmen und die Verdaupeptide anschließend durch mildes Zentrifugieren
in Gefäßen mit
durchlässigen,
aber lyophoben Böden
schnell und praktisch vollständig
aus den Gelstückchen
und aus den Gefäßen zu entfernen.
Es ist vorteilhaft, die Peptide dann möglichst rasch an geeigneten
Oberflächen
reversibel zubinden. Die Gefäßböden können dafür peptidanlagernde
Strukturen enthalten, die sich zum Waschen und späteren Eluieren
der Peptide eignen. Eine Vielzahl von Gefäßen können zu Platten zusammengeschlossen
sein, die beispielsweise die Größe von Mikrotiterplatten
besitzen.
-
Stand der Technik
-
Die zweidimensionale Gel-Elektrophorese gehört immer
noch zu den besten und verbreitesten Methoden der Trennung der Proteine
eines Zellverbands, dem so genannten "Proteom". Die Massenspektrometrie
bietet die empfindlichsten Methoden zur Identifizierung und Strukturaufklärung der
einzelnen Proteine, wobei ein enzymatischer Verdau der Proteine
zu Peptiden vorgeschaltet wird. Das Verfahren und die dabei auftretenden
Schwierigkeiten seien hier kurz beschrieben.
-
Die Proteine werden nach ihrer Trennung
im Gel angefärbt,
kleine Gelstücke
mit dem Protein von Interesse werden um den Färbepunkt herum ausgeschnitten
oder ausgestanzt. Die Gelstücke
werden in ein kleines Gefäß gegeben
und dort entfärbt.
Auffüllen
mit einer Enzymlösung
(beispielsweise Trypsin) führt
zu einem gezielten Verdau an durch das Enzym vorgegebenen Schnittstellen.
Die Verdaupeptide haben bei Anwendung von Trypsin, das genau an
zwei bestimmten Aminosäuren
schneidet, ein mittleres Molekulargewicht von etwa 1000 atomaren
Masseneinheiten mit breiter Streuung, die präzisen Massen der Verdaupeptide
charakterisieren das Protein meist eindeutig. Die Verdaupeptide
können
im Gel diffundieren, sie wandern durch Diffusion langsam (in einigen
Stunden) aus dem Gel in die umgebende Flüssigkeit.
-
Die in der Flüssigkeit enthaltenen Verdaupeptide
werden gereinigt einer geeigneten massenspektrometrischen Messmethode
zugeführt.
Die Ionisierung erfolgt dabei in der Regel durch so genannte matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI), die Messung der präzisen
Massen der Verdaupeptide in einem Flugzeitmassenspektrometer (TOF).
Andere Methoden der Ionisierung sind bekannt und werden ebenfalls
angewandt, meist mit Nachweis durch andere Arten von Massenspektrometern.
Für die
MALDI-TOF-Analyse werden die Verdaupeptide auf geeigneten Probenträgern in
kleine Kristalle von Matrixsubstanzen eingebracht und dort im Massenspektrometer
mit Laserpulsen beschossen. Über
die Flugzeit der Ionen im TOF wird ihre präzise Masse bestimmt.
-
Auch wenn beim Prozessieren einige
der Verdaupeptide verlorengehen, ergeben die präzise gemessenen Massenwerte
der noch verfügbaren Verdaupeptide
mit geeigneten Suchprogrammen für Proteinsequenzdatenbanken überwiegend
eine eindeutige Identifizierung des Proteins. Mehrdeutige Identifizierungen
können
durch weitergehende Messungen von Fragmenten einzelner Verdaupeptide, die
mit besonderen Methoden erzeugt werden und Aufklärung über deren interne Struktur
geben, aufgeklärt
werden. Identifizierung in diesem Sinne heißt, dass das Protein, wenn
bekannt, mit einem Namen, einer Code-Bezeichnung, einer Herkunft
und einer Molekularstruktur belegt werden kann.
-
Auf die Messung von Fragmentionen
und die weitergehenden Methoden zur de-novo-Sequenzierung von Proteinen
wird hier nicht weiter eingegangen.
-
Stand einige Jahrelang eine solch
einfache Identifizierung der Proteine im Vordergrund, so interessieren
heute mehr und mehr die Unterschiede, die die untersuchten Proteine
zu denen in der Datenbank aufweisen. Diese Unterschiede beruhen
auf mutativen oder posttranslationalen Veränderungen der Proteine, heute
und in Zukunft Brennpunkt des Interesses. Dazu ist es aber erforderlich,
nicht nur einige der Verdaupeptide messen zu können – was für eine reine Identifizierung
meist ausreicht – sondern
möglichst
ausnahmslos alle Verdaupeptide. Bei dem oben kurz geschilderten
Verfahren gehen jedoch viele Verdaupeptide durch Wandadsorptionen
verloren.
-
Es interessieren dabei nicht nur
die sehr konzentriert vorkommenden Proteine, die in Mengen von etwa
10 bis 100 Picomol im Gel enthalten sind. Es interessieren häufig besonders
die Proteine kleiner Konzentrationen, die nur mit 10 bis 100 Femtomol vorhanden
sind. Wenn nun ein Verdaupeptid von beispielsweise 20 Femtomol Menge
in 20 Mikroliter umgebende Flüssigkeit
austritt, werden die einzelnen Verdaumoleküle dabei in der Flüssigkeit
umherschwimmen und dabei im Stunden dauernden Diffusionsprozess
vielfach mit der Wand des Gefäßes in Berührung kommen.
Diese Flüssigkeitsmenge
von 20 Mikrolitern hat in einem kleinen Gefäß von etwa drei Millimetern
Durchmesser eine Wandberührungsfläche von
etwa 40 Quadratmillimetern. Ist diese Wand adsorptiv für eines
der Verdaupeptide, so wird sie sich mindestens monomolekular mit
diesem Verdaupeptid bedecken. Dabei kann sie in dieser monomolekularen
Bedeckungsschicht insgesamt etwa 40 Picomol an Verdaupeptid des
Molgewichts von 1000 atomaren Masseneinheiten aufnehmen, also etwa das
2000-fache dessen, was in unserem Beispiel überhaupt in der Lösung zur
Verfügung
steht. Selbst wenn die Adsorptivität der Gefäßwand durch geeignete Maßnahmen
auf ein Tausendstel reduziert werden könnte, würde immer noch das interessierende Verdaupeptid
vollständig
adsorbiert werden können, und
es wäre
das Peptid – im
Falle einer häufig
vorliegenden irreversiblen Bindung – durch keine Maßnahme wieder
in Lösung
zu bringen.
-
Das hier gerechnete Beispiel von
20 Mikrolitern Probelösung
betrifft eine Lösungsmenge,
die heute als groß erachtet
wird. Geht man auf einen Mikroliter oder sogar 100 Nanoliter über (mit
gleicher Konzentration der Analytmoleküle), so steigen die Einflüsse der
Wandkontakte nochmals dramatisch an.
-
Es ist charakteristisch für die moderne
Biochemie und Molekularbiologie, dass Proben in großer Anzahl
simultan prozessiert werden. Ein sichtbarerer Exponent dieser Entwicklung
ist die sogenannte Mikrotiterplatte mit ihren zunächst 96,
dann 384 und jetzt 1536 Reaktionsgefäßen. In jüngster Zeit wurde eine NanoWellTM-Platte mit 3456 Reaktionsgefäßen vorgestellt.
Eine Erhöhung
dieser Anzahl ist nur eine Frage der Zeit und der zur Verfügung gestellten Werkzeuge
für das
Prozessieren. Für
die bisher üblichen
Mikrotiterplatten sind entsprechende Pipettier- und Bearbeitungsroboter
mit Ablagesystemen für viele
Mikrotiterplatten, mit Barcode-Kennzeichnungen, mit Multipipettenköpfen und
Mehrfachdispensersystemen entwickelt worden.
-
Die benötigten Mengen an Probenmolekülen für die chemische,
enzymatische und analytische Prozessierung sind dabei immer geringer
geworden, so dass auch Proteine mit sehr kleinen Konzentrationen
gemessen werden können.
Die Prozessierung ist längst
vom Nanomolbereich in den Pico-, Femto- und sogar Attomolbereich
vorgedrungen. Nachteilig ist aber, dass mit der fortschreitenden
Verkleinerung der prozessierten Flüssigkeitsmengen der relative Wandanteil
der umschließenden
Cavitäten
in Bezug auf das Volumen immer größer wird. Damit werden chemische
und physikalische Einflüsse
der Cavitätswände auf
das Prozessierungsgeschehen immer kritischer.
-
Die Mikrotiterplatte bildet auch
die ideale Grundlage für
das Prozessieren der Proteine eines Proteoms, beipielsweise in Verbindung
mit einem automatisch arbeitenden Gel-Ausstecher. Bisherige Mikrotiterplatten
fangen aber einen großen
Teil der Verdaupeptide weg.
-
Für
die Belegung von MALDI-Probenträgerplatten
sind eine Reihe von Verfahren und Vorrichtungen bekannt. In der
Offenlegungsschrift
DE
196 18 032 A1 sind MALDI-Probenträger mit vorpräparierten Aufträgen der
Matrix-Substanzen mit besonderem Oxidationsschutz beschrieben. Die
Offenlegungsschrift
DE
197 12 195 A1 zeigt auf, wie man eine MALDI-Probenträgerplatte
belegen kann, wenn die Rastermaße
verwendeter Vielfach-Pipetten einerseits und der MALDI-Probenorte
andererseits nicht übereinstimmt.
Ein weiteres Belegungsverfahren für MALDI-Probenträgerplatten
mit einem sehr dichten Rastermaß wird
in
DE 196
28 178 C1 wiedergegeben. Die Offenlegungsschrift
DE 197 54 978 A1 beschreibt
Probenträger
und Verfahren zum Belegen der Probenträger unter Verwendung von hydrophilen Ankerflächen in
hydrophober Umgebung. Eine ähnliche
MALDI-Probenträgerplatte
mit Probenorten, die durch Gräben
voneinander getrennt sind, ist in WO 99/00657 bekannt geworden.
In
DE 196 43 921 A1 wird
ein pipettenloses Übertragungssystem
von Probenvorbereitungsgefachen zu MALDI-Probenträgern beschrieben.
-
Die Offenlegungsschrift
DE 198 11 732 A1 beschreibt
eine Wandbelegung von Probenvorbereitungsgefäßen mit Biomolekülen. IN
WO 98/24543 werden Probenvorbereitungsgefäße beschrieben, die im Boden
Mikrokanäle
zum Rückhalten
von Partikeln wie Kunstharz-Kügelchen
besitzen.
-
Die Patentschrift
DE 44 08 034 C1 beschreibt
ein zu dieser Erfindung konkurrierendes Verfahren, wobei nach ihrer
Trennung auf 2D-Elektrophorese-Gelen unverdaute oder verdaute Proteine durch
eine direkte, ortstreue Übertragung
auf einen MALDI-Probenträger
aufgebracht und dort analysiert werden.
-
Es ist die Aufgabe der Erfindung,
Verfahren und Vorrichtungen für
die Probenvorbereitung kleinster Proteinmengen aus Gelstückchen für die massenspektrometrische
Analyse zu finden, die sich durch besonders geringe Verluste an
verlustgefährdeten Peptiden
durch Wandadsorption und hohe Ausbeute für alle Peptide auszeichnen.
-
Kurze Beschreibung
der Erfindung
-
Das Verfahren der Erfindung unter
Benutzung von proteinhaltigen Gelstückchen und einem enzymatischen,
gelinternen Verdau der Proteine besteht im Einzelnen aus folgenden
Schritten:
- 1) die Gelstückchen mit den Proteinen werden
in Gefäße mit lyophob-porösem Boden
eingefüllt,
- 2) den Gelstückchen
werden solche Menge Enzymlösung
zugegeben, wie von den Gelstückchen
aufgenommen werden können,
- 3) die Proteine in den Gelstückchen
werden verdaut, und
- 4) die Gefäße mit den
Gelstückchen
werden zentrifugiert, so dass die Enzymlösung mit den Verdaupeptiden
aus den Gelstückchen
ausgepresst und aus den Gefäßen ausgeschleudert
wird.
-
Besonders günstig ist es, wenn die Verdaupeptide
in der ausgepressten Enzymlösung
sofort an reversibel peptidadsorptiven Oberflächen adsorbiert werden, so
dass sie keiner unkontrollierten Wandadsorption mehr zugänglich sind.
-
Unter einer lyophoben Oberfläche wird
hier eine Fläche
verstanden, die nicht nur wasserabweisend ist (also nicht nur hydrophob),
sondern auch abweisend für
die in der Peptidchemie verwendeten organischen Lösungsmittel
wie beispielsweise Methylalkohol oder Acetonitril, zumindest in
wässriger
Lösung über weite
Konzentrationsbereiche.
-
Die Vorrichtung der Erfindung besteht
darin, die Gefäße mit den
lyophob porösen
Böden bereitzustellen,
wobei die Porösität der Böden durch
eine oder mehrere lyophobisierte Kapillarkanäle hergestellt wird. Diese
können
mit vliesartigen Membranen, Teilchenpackungen, frittenartigen Strukturen oder
offenporigen Festkörperschäumen verschlossen
sein. Es können
viele Gefäße mit jeweils
porösen Böden in einer
Platte vereinigt sein, beispielsweise in der Größe einer Mikrotiterplatte.
Die Membranen, Teilchenpackungen, Fritten oder Festkörperschäume dienen
durch besondere Präparationen
ihrer Oberflächen
als Adsorptivoberflächen
für die
Bindung der Peptide. Die kapillaren Kanäle in den Böden der Gefäße sind lyophobisiert, um durch
abstoßende
Kapillarwirkung ein Ablaufen von frisch eingefüllten Flüssigkeiten aus den Gefäßen unter
normaler Schwerkraft zu verhindern, unter Zentrifugalkraft aber
zu ermöglichen.
Die inneren Oberflächen
der Gefäße können dabei
ebenfalls lyophobisiert sein, um ein schnelles Zusammenlaufen von
Flüssigkeiten
an diesen Oberflächen
und ein schnelles Ablaufen unter der Wirkung der Zentrifugalkräfte zu bewirken.
Außerdem
bewirken lyophobisierte Oberflächen
einen geringeren Wandkontakt, da berührende Flüssigkeiten an der Wand nicht
benetzend auseinanderlaufen.
-
Das Verfahren nach der Erfindung
hat grundsätzlich
das Ziel, die molekularen Wandkontakte der gelösten Verdaupeptide, die proportional
zum Produkt aus Wandberührungsfläche der
Lösung
und Berührungsdauer
sind, möglichst
gering zu halten. Die Peptide werden dann nach dem Verdau des Proteins möglichst
rasch reversibel an geeigneten Oberflächen gebunden, so dass sie
baldmöglichst
weiteren unkontrollierten Wandkontakten entzogen werden; das Verfahren
wird dabei durch die Vorrichtung nach dieser Erfindung unterstützt. Die
gewollte Bindung an geeignete Oberflächen erlaubt weiteres Prozessieren
der Peptide wie beispielsweise Waschen, und die Reversibilität der Bindung
erlaubt die Zuführung
der Peptide zu massenspektrometrischen Messmethoden, beispielsweise
die Überführung auf
geeignete massenspektrometrische MALDI-Probenträger.
-
Es ist besonders vorteilhaft, die
Gelstückchen
vor oder nach dem Einfüllen
in Schritt 1) des Verfahrens teilweise von der Quellflüssigkeit
zu befreien. Die Quellflüssigkeit
kann aus den Gelen beispielswesie nach dem Einfüllen in die Gefäße durch Zentrifugieren,
besser aber noch durch partielles Vakuumtrocknen teilweise entfernt
werden. Das Vakuumtrocknen ergibt eine offenporige Struktur des Gels,
günstig
für die
Aufnahme der Enzymlösung
in Schritt 2); das Trocknen darf jedoch nicht zu vollkommen getrockneten
Gelen führen,
da diese die Flüssigkeit
sehr schlecht wieder aufnehmen.
-
Die Zugabe der Enzymlösung in
Schritt 2) des Verfahrens kann durch Pipettieren, gegebenenfalls
mit Vielkopfpipetten, aber auch durch berührungsloses Dispensieren mit
Piezo- oder Solenoiddispensern vorgenommen werden. Die Aufnahme der
Enzymlösung
durch Quellen der partiell getrockneten, porösen Gelstückchen bringt die Enzyme schnell
und gleichmäßig in die
Gelstückchen,
was bei nicht partiell getrockneten Gelen durch die dann notwendige
Diffusion der Enzyme nicht der Fall ist. Nach dem Aufsaugen der
Enzymlösung
durch das Gelstückchen
bestehen nur noch minimale Berührungsflächen mit
der Wand des Gefäßes. Da innerhalb
der Gelstückchen
die Diffusion der in Schritt 3) produzierten Verdaupeptide behindert
ist, werden die Verluste durch Wandadsorption vernachlässigbar
klein.
-
Der Verdau in Schritt 3) des Verfahrens
wird durch Erwärmen
der Gefäße (Inkubieren)
auf Verdautemperatur begünstigt,
bei optimaler Temperatur ist der Verdauvorgang in etwa zwei bis
vier Stunden abgeschlossen. Der Verdau ist somit der zeitbestimmende
Schritt. Die Gefäße sind
während
des Inkubierens gut zu verschließen, um ein Austrocknen der Gelstückchen zu
verhindern.
-
In Schritt 4) wird dann die Enzymflüssigkeit mit
den Verdaupeptiden durch die Zentrifugalkraft aus den Gelstückchen in
Sekunden ausgetrieben und sofort. durch die porösen Böden in darunterliegende Gefäße ein-
oder auf massenspektrometrische Probenträger aufgebracht. Es genügen sehr moderate
Zentrifugierbedingungen mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute.
-
Danach oder währenddessen können die Peptide
an Oberflächen
gebunden werden, entweder an porösen
Strukturen der Gefäßböden, an
Oberflächen
von Partikeln, die sich in den Auffanggefäßen befinden, oder an Oberflächenbereichen
der Probenträgerplatten.
Die Partikel in den Auffanggefäßen können beispielsweise
magnetische Kügelchen
mit geeignet präparierten
Oberflächen
sein; diese lassen sich durch magnetische Kräfte halten oder sogar in bekannter
Weise durch wechselnde Magnetfelder hin und her durch die Waschflüssigkeiten
ziehen. Im Fall der Probenträger
können
Bereiche der Oberfläche mit
adsorptiven Schichten, beispielsweise mit Alkanketten C18,
belegt sein, um ein anschließendes
Waschen ermöglichen.
-
Die oberflächengebundenen Peptide können nach
Abschluss des erfindungsgemäßen Verfahrens in üblicher
Form gewaschen und so von den Enzymen, Puffern, Salzen und allen übrigen Verunreinigungen
befreit werden. Durch eine Eluatlösung, beispielsweise 30% Acetonitril
in ionenfreiem Wasser, können
die Peptide von den Oberflächen
abgelöst der
Massenspektrometrie zugeführt,
beispielsweise auf massenspektrometrisch eingesetzte Probenträger überführt werden.
-
Auch ein sofortiges, direktes Aufbringen
der Peptide auf MALDI-Probenträgerplatten
während des
Zentrifugierens ohne eine adsorptive Bindung ist möglich, beispielsweise
auf mit MALDI-Matrixsubstanzen vorpräparierten Platten. Dabei ist
es wiederum günstig,
wenn in der Enzymlösung
für den
Verdau keine alkalimetallischen Salze als Puffer vorhanden sind;
diese können
für diesen
Fall beispielsweise durch Ammoniumbikarbonat ersetzt werden.
-
1 zeigt
eine übliche
Mikrotiterplatte nach dem Stande der Technik, hier mit 96 Gefäßen, die
es aber auch mit 384, 1536 oder sogar mehr Gefäßen gibt.
-
2 zeigt
einen Querschnitt durch eine 384-Mikrotiterplatte nach dieser Endung
mit mit je einem lyophobisierten, kapillaren Kanal im Gefäßboden.
Die Kanäle
enthalten keine chromatographische Packung. Gefäßdurchmesser ist hier 1,8 Millimeter, Kanaldurch messer
0,2 Millimeter. Eingefüllte
Flüssigkeiten
werden durch abstoßende
Kapillarkräfte
im kapillaren Kanal am Auslaufen gehindert. Erst Zentrifugieren
kann die Kapillarkräfte überwinden
und die Flüssigkeit
ausschleudern.
-
3 zeigt
einen vergrößerten Querschnitt durch
eine 384-Mikrotiterplatte mit ausgestanzten Gelstückchen in
ihren Gefäßen, wobei
die lyophoben Kanäle
in leichten Erweiterungen chromatographische Packungen enthalten.
Es handelt sich bei den Packungen um einen offenporigen Festkörperschaum
mit peptidadsorptiven Eigenschaften, der an Ort und Stelle aufgeschäumt und
polymerisiert wurde und eine feste Bindung mit der Wand hat, so
dass er das Zentrifugieren übersteht.
-
Bevorzugte Ausführungsformen
-
Es werde hier von zweidimensionaler
Gelelektrophorese als Separationsverfahren für die Proteine ausgegangen.
Es ist aber das Verfahren auch auf eindimensionale Geltrennungen
verschiedener Art, also beispielsweise nur nach isoelektischem Punkt oder
nur nach elektrophoretischer Mobilität, anwendbar.
-
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren
bedient sich eines Stanzroboters, der die proteinhaltigen Gelstückchen auf
Grund ihrer Anfärbung
automatisch erkennt, aus dem feuchten Gel ausstanzt und in die Gefäße mit den
porösen
Böden einfüllt. Solche
Stanzroboter sind in ersten Ausführungsformen
bereits kommerziell erhältlich;
sie enthalten zylindrische Hohlstanzer mit Durchmessern zwischen 0,8
und 2 Millimetern, die ein rundes Stückchen Gel ausstanzen können. Die
Hohlstanzer befinden sich anstelle von Pipetten an beweglichen Köpfen, die
die ausgestanzten Gelstückchen
vorteilhafterweise mit einer Pipettierflüssigkeit, weniger vorteilhaft
mit Gas, wieder aus den Hohlstanzern ausstoßen und so in den Gefäßen ablegen
können.
Die Stanzroboter enthalten Kameras oder Scanner und eine Erkennungssoftware
für die
angefärbten
Flecken; manuelle Nachbearbeitung am Bildschirm oder automatisch arbeitende
Vergleichsprogramme für
mehrere Gele erlauben, bestimmte Auswahlen an Flecken und damit
Proteinen zu treffen.
-
Für
geringere Anzahlen an Proteinen können auch mit gutem Erfolg
Handstanzer eingesetzt werden, die aber eine gut geführte manuelle
Dokumentation der Gelpositionen und der Gefäßcodierungen erfordern, die
bei Stanzrobotern automatisch anfällt.
-
Die Stanzer können zwischen den Stanzvorgängen gewaschen
werden, es hat sich aber in der Praxis erwiesen, dass eine Übertragung
von Proteinen von einem Gelstückchen
zum nächsten
praktisch nicht stattfindet.
-
Als Gefäße dienen zweckmäßigerweise
die Cavitäten
einer entsprechend der Erfindung ausgestalteten Mikrotiterplatte.
Diese kann 96, 384, 864 oder sogar 1536 Cavitäten im Raster von 9, 4, 5,
3 oder 2,25 Millimeter enthalten; wobei die Durchmesser der Cavitäten etwa
bei 1,5 bis 2 Millimetern liegen. Die Böden der Cavitäten sind
so mit lyophobisierten Kanälen
aus gestattet, dass Flüssigkeiten
unter der Wirkung normaler Schwerkraft nicht ausfließen können, wohl
aber unter der viel höheren
Zentrifugalkraft einer Zentrifuge. Günstige Durchmesser der kapillaren
Kanäle
sind etwa 0,2 bis 0,3 Millimeter.
-
Die Entwicklung der Mikrotiterplatten
geht zu immer höheren
Dichten an Cavitäten,
wobei der ursprüngliche
Rasterabstand von neun Millimetern mit fortschreitend höheren Zahlen
ganzzahlig geteilt wird.
-
Zweckmäßigerweise wird zum Ausstoßen der
Gelstückchen
bereits eine Pipettierflüssigkeit
verwendet, die die Anfärbungen
der Proteine beseitigt, sofern diese Anfärbungen einer späteren massenspektrometrischen
Analyse im Wege stehen. Nach Entfärbung der Gelstückchen wird
dann ein erstes Mal zentrifugiert, jedoch sehr vorsichtig, um nicht
die Gelstückchen
vollkommen platt zu pressen. Es können ein oder mehrere Waschvorgänge folgen,
die jedes Mal aus Zupipettieren, Quellen und Zentrifugieren bestehen.
Für diese
und die folgenden Pipettierschritte wird zweckmäßigerweise eine Vielkopfpipette
mit beispielsweise 96 oder sogar 384 Pipetten benutzt, um mit wenigen
Pipettierschritten alle Gefäße zu befüllen.
-
Sind die Gelstückchen genügend gewaschen, so werden sie
teilweise von der Quellflüssigkeit
befreit. Das kann zunächst
durch vorsichtiges Zentrifugieren wie schon bei den Waschvorgängen geschehen,
und wird vorzugsweise durch partielles Vakuumtrocknen ergänzt. Ein
schnelles, kurzzeitiges Vakuumtrocknen bringt die Quellflüssigkeit
zum Sieden unter erniedrigtem Druck; die Siedeperlen erzeugen eine
offenporige Struktur des Gels, günstig
für die
Aufnahme der Enzymlösung
im nächsten
Schritt. Das Trocknen darf jedoch nicht zu vollkommen ausgetrockneten
Gelen führen,
da diese die Flüssigkeit sehr
schlecht wieder aufnehmen.
-
Die Zugabe der Enzymlösung in
Schritt 2) des Verfahrens kann durch wiederum durch Pipettieren
erfolgen, wobei die Abgabe der geringen Menge an Enzymlösung ein
Berühren
des Gels durch die Pipettiertröpfchen
verlangt. Die Praxis zeigt, dass dabei praktisch keine Proteine
von einem Gelstückchen mit
den Pipettenspitzen zum nächsten übertragen werden.
Bei der Benutzung von Vielkopfpipetten wird diese Gefahr nochmals
herabgesetzt, weil nur wenige Pipettierschritte erforderlich sind
und ein Waschen der Pipettenspitzen zwischendurch ohne wesentliche Zeitverluste
möglich
ist. Es kann die Enzymlösung aber
auch durch berührungsloses
Dispensieren mit Piezo- oder Solenoiddispensern zugeführt werden, um
jede Verschleppung von Proteinspuren von einem Gelstückchen zum
anderen sicher zu vermeiden.
-
Die Aufnahme der Enzymlösung durch
kapillares Eindringen und Quellen der partiell getrockneten und
leicht porösen
Gelstückchen
bringt die Enzyme schnell und gleichmäßig in die Gelstückchen,
was bei nicht partiell getrockneten Gelen durch die dann notwendige,
langsame Diffusion der Enzyme nicht so vorteilhaft der Fall ist.
-
Nach dem Aufsaugen der Enzymlösung durch
das Gelstückchen
bestehen nur noch minimale Berührungsflächen der
Enzymlösung
mit der Wand des Gefäßes. Eine
Lyophobisierung der Wandflächen
verringert diese Berührungsflächen nochmals, da
kein Auseinanderlaufen der Flüssigkeit
durch Benetzung der Oberfläche
stattfindet. Die Wandkontakte der allmählich entstehenden Verdaupeptide
sind einerseits durch die Verkleinerung der Berührungsflächen, andererseits dadurch
herabgesetzt, dass innerhalb der Gelstückchen die Diffusion der Verdaupeptide
stark behindert ist. Somit werden die Verluste durch Wandadsorption
vernachlässigbar
klein.
-
Der Verdau der Proteine an den durch
das Enzym vorgegebenen Schnittstellen wird durch Erwärmen der
Gefäße auf eine
günstige
Verdautemperatur eingeleitet und begünstigt; der Verdauvorgang durch
Trypsin beispielsweise ist bei einer optimalen Temperatur von 37 °C in etwa
zwei bis vier Stunden abgeschlossen. Die Gefäße sind während des Inkubierens gut zu
verschließen,
um ein Austrocknen der Gelstückchen
zu verhindern. Der Verdau durch Inkubieren ist aber nach wie vor
der zeitbestimmende Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die gelinterne
Verdauung ist besonders effektiv, da die Proteine vollkommen entfaltet
vorliegen und einem Angriff der Enzyme daher ohne schützende Faltung der
Proteine ausgesetzt sind. Außerdem
zeigt die Erfahrung, dass der Selbstverdau der Enzyme im Gel gemindert
ist.
-
Nach dem Verdau wird die Enzymflüssigkeit mit
den Verdaupeptiden durch Zentrifugalkraft aus den Gelstückchen ausgetrieben.
Dazu sind nur einige Sekunden erforderlich. Die Flüssigkeit
tritt sofort durch die porösen
Böden in
in darunterliegende Auffanggefäße. Es genügen sehr
moderate Zentrifugierbedingungen mit etwa 2000 Umdrehungen pro Minute,
um den größten Teil
der Flüssigkeit
auszutreiben; Ultrazentrifugen sind nicht notwendig oder sogar schädlich.
-
In einer Ausführungsform werden die Enzymlösungen mit
den Verdaupeptiden direkt auf die unterliegenden, mit Matrixsubstanzen
vorpräparierten
Probenträgerplatten
für die
massenspektrometrische Analyse aufgebracht. Dort werden sie eingetrocknet
und sind dann fertig für
die Analyse. Dabei können
sich auf den Platten lyophile Anker in lyophober Umgebung befinden,
um die Lösungen
aus den verschiedenen Gefäßen voneinander
zu trennen.
-
In einer weiteren Ausführungsform
befinden sich auf den lyophilen Ankern der Probenträgerplatten
chemisch kovalent gebundene Belegungen mit Alkanketten, beispielsweise
C18, die die Verdaupeptide reversibel adsorbieren.
Die Peptide können
dann gewaschen und besonders von allen alkalimetallischen Ionen
befreit werden. Durch Zugabe einer in wässriger Acetonitrillösung gelösten Matrixsubstanz und
anschließendem
Eintrocknen kann die Präparation
für die
massenspektrometrische Analyse mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI)
abgeschlossen werden.
-
Die Peptide werden in einer anderen
Ausführungsform
des Verfahrens an die Oberflächen
der porösen
Strukturen der Gefäßböden gebunden.
Dazu sind die Böden
der Cavitäten
in besonde rer Form auszubilden. Die kapillaren Bohrungen werden
mit Packungen von chromatographischen Phasen versehen, wie in 3 sichtbar. Dabei können viele
der in der Flüssigkeitschromatographie
verwendeten Phasen zur Anwendung kommen, insbesondere Umkehrphasen
für Umkehrphasen-Chromatographie und
Affinitätsphasen.
Die Belegung sollte den oberen, lyophobisierten Eingang der kapillaren
Bohrungen frei halten, damit die zum Teil sehr hydrophilen Phasen
eingefüllte
Flüssigkeiten
aus den Cavitäten nicht
sofort aufsaugen und zum Auslaufen bringen. Eine Erweiterung der
Kapillaren im unteren Bereich zum Einfüllen der chromatographischen
Phasen erleichtert das Einbringen der Phasen.
-
Die Mikrotiterplatten mit den porösen, lyophoben
Kanälen
können
aus Metall oder Kunststoff gefertigt sein. Die kapillaren Kanäle können bereits durch
die Matrizenform für
die Herstellung der Mikrotiterplatten vorgegeben sein, aber auch
später
durch Bohren oder Laserbohren hinzugefügt werden. Es hat sich in der
Praxis gezeigt, dass die Gelstückchen auch
bei glatten Bodenformen der Gefäße nicht
in der Lage sind, die Kanalausgänge
aus den Gefäßen so zu
verschließen,
dass keine Flüssigkeit
mehr ausfließt.
Es ist aber vorteilhaft, die Gefäßböden um die Bohrungen
herum mit schmalen, reliefartig erhabenen Rippen oder vertieften
Rillen zu versehen, die ein Ablaufen der Flüssigkeit beim Zentrifugieren
begünstigen.
-
Unter einer lyophoben Oberfläche wird
hier eine Fläche
verstanden, die nicht nur Wasser abweist (also nicht nur hydrophob
ist), sondern auch die meisten organischen Lösungsmittel wie beispielsweise
Methylalkohol, Aceton oder Acetonitril.
-
Es sind in jüngster Zeit mehrere Verfahren zur
Erzeugung extrem lyophober Oberflächen bekannt geworden, die
sich für
die Lyophobisierung der Kanaloberflächen, der Gefäßwände oder
sogar der ganzen Mikrotiterplatten einsetzen lassen; die bekannteste
ist die Beschichtung mit perfluorierten Substanzen wie PTFE (beispielsweise
mit Teflon
®). Diese
sind nicht nur hydrophob, sondern auch oliophob. Während man
früher
annahm, dass sich Hydrophobie und Oliophobie gegenseitig ausschlössen, ist
der Gegensatz heute durch neuere Kenntnisse aufgehoben. Zu den lyophobisierenden
Mitteln gehören
aber auch die neuartigen organisch-anorganischen Sol-Gel Nanocompositmaterialien
(
DE 41 18 184 ), siehe
beispielsweise R. Kasemann; H. Schmidt, S. Brück, Bol. Soc. Esp. Ceram. Vid.
31–6, Vol.
7, (1992), 75. Diese Nanocompositmaterialien lassen sich auf Metallen,
Glas oder Kunststoffen als wenige Mikrometer dünne, kratzfeste Schichten einbrennen.
Auch Beschichtungen mit PTFE lassen sich durch Zugabe keramischer
Bestandteile höchst kratzfest
machen. Formteile aus geeigneten Kunststoffen wie beispielsweise
Polyethylen lassen sich auch oberflächlich in einem durch elektrische
Entladung erzeugten Fluorplasma perfluorieren, wodurch ebenfalls
eine lyophobe Oberfläche
ausgebildet wird.
-
Die Beschichtungen mit Lotos-Effekt
(W. Barthlott und C. Neinhuis, "Purity of the sacred lotus, or escape
from contamination in biological surfaces", Planta 202 (1997), 1)
gehören
nur bedingt zu dieser Gruppe der gleichzeitig hydrophoben und oliophoben Oberflächen. Sie verstärken lediglich
den abweisenden Effekt einer an sich bereits hydrophoben oder lyophoben
Oberfläche
durch eine besondere Art der Mikrostrukturierung. Diese Verstärkung der
Lyophobizität
kann in den Gefäßen und
Kanälen
nach dieser Erfindung ebenfalls eingesetzt werden.
-
Für
die Bindung der Peptide und ihre Reinigung sind in der jüngsten Zeit
besondere, offenporige Festschäume
bekannt geworden, beispielsweise PorosTM als
Kügelchen
oder ZipTipTM als chromatographische Füllungen
in Pipettenspitzen. Diese offenporigen Festschäume bestehen aus Polymeren,
die als Monomerlösungen
in die kapillaren Bohrungen eingebracht, dort aufgeschäumt und
auspolymerisiert werden können
(wie in 3 dargestellt).
Sie eignen sich besonders gut und bequem für das Binden und Reinigen von
Peptiden. Diese Packungen können
einige Male regeneriert werden, es ist also eine beschränkte Wiederverwendbarkeit
der Mikrotiterplatten zu erreichen.
-
Durch Eluierungslösungen wie beispielsweise 30%
Acetonitril in Wasser lassen sich die Peptide wieder ausschwemmen;
es versteht sich von selbst, dass die Peptidlösungen dann sofort der massenspektrometrischen
Messung zugeführt
werden müssen,
um Verluste durch Wandadsorptionen zu vermeiden.
-
In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird die Unterseite der Mikrotiterplatte mit einer vliesartigen
Membran belegt, die durch eine Gegenplatte mit weiteren, verlängernden
Kanälen
fest angepresst wird. Die Kanalausgänge sind also hier durch die
Membran porös
verschlossen. Die Membran kann in bekannter Weise peptidadsorptiv
gemacht werden. Die Membran kann leicht ausgewechselt werden, wodurch
die Mikrotiterplatten beliebig oft wiederverwendbar werden.
-
Es muss die Adsorption der Peptide
an Oberflächen
nicht schon in den Kanälen
der Mikrotiterplatten erfolgen. In einer anderen Ausführungsform
des Verfahrens werden die Peptide erst in den Auffanggefäßen des
Zentrifugierens an die Oberfläche
von Partikeln gebunden. Diese Partikel können bevorzugt als magnetische
Kügelchen
mit adsorptiv präparierten
Oberflächen
in einer sehr konzentrierten Aufschwemmung in den Auffanggefäßen vorhanden sein.
Nachdem die Enzymlösungen
mit den Peptiden durch Zentrifugieren zugegeben wurden, können die Kügelchen
durch eine Ultraschallbehandlung oder durch wechselnde Magnetfelder
in so genannten "Magnetschaukeln" in der Lösung verteilt oder durch die
Lösung
wiederholt hindurchbewegt werden, um alle Peptide zu binden. Das
Reinigen der Peptide an den Magnetkügelchen und die anschließende Überführung auf
MALDI-Platten sind weithin bekannt.
-
Die Mikrotiterplatten mit den Gefäßen nach dieser
Erfindung sind zweckmäßigerweise
mit automatisch lesbaren individuellen Kennungen versehen, die eine
Verwechslung ausschließen
und eine sehr genaue Verfolgung und Protokollierung der Proben und
ihrer Prozessierung in den Bearbeitungsrobotern erlauben. Die Kennungen
können
beispielsweise aufgedruckte Barcodes oder auch eingearbeitete Transponder
sein, die von den Bearbeitungsrobotern gelesen werden können.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein wichtiger
Schritt einer Analyse eines Proteoms. Unter Proteom wird die Gesamtheit
der Proteine eines Zellverbandes verstanden. Dieses Verfahren zur
Analyse eines Proteoms läuft
folgendermaßen
ab: Zunächst
werden die Eiweiße
eines Zellverbandes 2D-gelelektrophoretisch getrennt und mit einem
Färbemittel
angefärbt.
Sehr gute Verfahren der Gelelektrophorese liefern dabei etwa 5000
getrennt sichtbare Proteine, zufriedenstellende Verfahren liefern
etwa 2000 Proteine. Das Färbemittel
wird so gewählt,
dass es entweder die nachfolgende Analyse nicht stört oder
später
wieder entfernt werden kann. In Pipettierrobotern werden aus dem
Gel runde Gelstückchen
von etwa einem Millimeter Durchmesser ausgestochen. Ausstechen und
Ablegen in einem Gefäß in einer
384-Mikrotiterplatte dauern etwa sechs Sekunden, damit sind vier
384-Platten in etwa
2,5 Stunden mit 1536 Gelstückchen
befällt.
In drei Zyklen können so
in knapp 8 Stunden etwa 4600 Proteine ausgestanzt und zumindest
teilweise weiterbehandelt werden.
-
Die feuchten Gelstückchen werden
vom Stanzroboter automatisch in den Gefäßen der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte
abgelegt, wo sie in der zum Ausstoßen benutzten Flüssigkeit
schwimmen. Die Flüssigkeit
kann beispielsweise eine Entfärbeflüssigkeit
für die
Proteine sein. Die Flüssigkeit schützt die
Gelstückchen
vor Austrocknung während der
langdauernden Stanzvorgänge.
-
Wie oben geschildert, findet jetzt
das erfindungsgemäße Verfahren
zum Verdau der Proterine zu Verdaupeptiden, das Auszentrifugieren
und das Anbinden der Peptide an Oberflächen statt, wie oben ausführlich geschildert.
Anschließend
werden die Verdaupeptide üblicherweise
in ihrer immobilierten Stellung gewaschen. Es können zweckmäßigerweise immer vier 384-Mikrotiterplatten
parallel behandelt werden, der Zyklus für Inkubieren, Zentrifugieren, Waschen,
Adsorbieren und Überführen auf
MALDI-Probenträger
hält in
etwa mit dem Ausstanzen der Proteine für die nächsten vier Mikrotiterplatten Schritt.
-
Es werde für die folgende Beschreibung
angenommen, dass eine MALDI-TOF-Analyse vorgenommen werden soll.
Für andere
Arten der massenspektrometrischen Analyse kennt der Fachmann entsprechende
Schritte der weiteren Probenvorbereitung.
-
Eine Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure in 30
% Acetonitril und Wasser desorbiert die Verdaupeptide. Diese Lösung mit
den Verdaupeptiden wird dann sofort auf MALDI-Trägerplatten
aufgebracht und dort eingetrocknet. Die MALDI-Trägerplatten haben ebenfalls
Größe und Form
von Mikrotiterplatten, sie können
die gleiche Anzahl von Proben aufnehmen, wie die benutzten erfindungsgemäßen Mikrotiterplatten
für das
erfindungsgemäße Verfahren.
Die Peptide werden in die als MALDI-Matrix dienenden Kriställchen der
Zimtsäure
eingebaut, die sich während
des Trocknens bilden. Die getrocknete Trägerplatte ist nun fertig für die Aufnahme
eines MALDI-Flugzeitmassenspektrums der Verdaupeptide. Aus deren
genau bestimmten Massen lässt
sich das Protein in einer Proteinsequenzdatenbank in üblicher
Weise suchen.
-
Ein Proteom mit etwa 4600 Proteinen
lässt sich
somit in etwa acht Stunden automatisch ausstechen und in etwa zwölf 384-Mikrotiterplatten
prozessieren. Jeweils vier Platten werden für den Verdau gemeinsam inkubiert
und dann auch gemeinsam zentrifugiert. Die Verdaupeptide auf den
MALDI-Platten können
automatisch im Massenspektrometer gemessen werden, wozu bei heute
erhältlicher
Technik etwa 12 Stunden erforderlich sind. Mit automatisch arbeitenden
Massenspektrometern lassen sich so die Verdaupeptide eines vollen
Proteoms in einer Nacht messen. Die Identifizierung der Proteine
erfolgt in Echtzeit während
der Spektrenaufnahme der nächsten
Probe.
-
Proteine, die wie in der Einleitung
beschrieben gegenüber
der Proteinsequenzdatenbank in der Länge veränderte Peptide besitzen, können anschließend durch
die Aufnahme von PSD-Tochterionenspektren
einzelner Verdaupeptide in ihrer Sequenz oder ihren Veränderungen
bestimmt werden. Verluste durch wandadsorbierte Peptide treten mit der
erfindungsgemäßen Technik
praktisch nicht auf.
-
Dieses Verfahren mit erfindungsgemäßem Prozessieren
in den erfindunggemäßen Vorrichtungen
hat folgende Vorteile:
- Das Verfahren ist schnell;
die Analyse eines Proteoms mit einer einfachen Identifizierung der
Proteine kann in etwa zwei bis drei Tagen abgeschlossen werden,
wodurch weitgehend vermieden wird, dass sich die empfindlichen Proteine, die
sich nur in der natürlichen
Umgebung in ihrer Zelle stabil halten, zersetzen und damit nicht
mehr analysiert werden können.
Die weitergehende Aufklärung
von Strukturunterschieden, die aufwendige interaktive Leistungen
erfordert, ist allerdings nicht eingeschlossen.
- Die Analyse ist sehr einfach; an der Automatisierbarkeit wird
noch gearbeitet.
- Die Auffindungsrate für
die einzelnen Verdaupeptide eines Proteins ist groß; gegenüber bisher üblicher
Prozessierung in Gefäßen gibt
es eine wesentlich höhere
Findungsrate für
die Verdaupeptide. Besonders die stark hydrophoben Peptide gingen
bei bisheriger Technik häufig
durch Wandeinflüsse
verloren; sie wurden in der massenspektrometrischen Messung gar
nicht mehr gefunden. Da die Proteomforschung sich in zunehmender
Weise auf die Abweichungen zwischen realen Proteinen und den Sequenzen
der Proteindatenbanken konzentriert, sind diese Verluste an Verdaupeptiden
nicht mehr hinzunehmen.
-
Jedem Fachmann auf dem Gebiet des
Mikroprozessierens wird es mit den Kenntnissen über diese Erfindung und ihre
Anwendung möglich
sein, seine speziellen Bedürfnisse
an Prozessierungen mit den hier angegebenen Grundprinzipien zu verwirklichen,
auch wenn die spezielle Art der Prozessierung hier nicht beschrieben
sein sollte. Beispielsweise wird es ihm ein Leichtes sein, das Verfahren
für eine andere
Art der massenspektrometrischen Analyse umzuformen.
-
So ist es beispielsweise leicht möglich, die eluierten
Verdaupeptide einer Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatographie
zuzuführen,
wobei die separierten Peptide dann über eine online-Nanoelektrospray-Einrichtung
ionisiert und beipielsweise mit einem Ionenfallenmassenspektrometer
gemessen werden können.