DE102010000718B4

DE102010000718B4 - Mikrofluideinheit zum Entfernen von Kohlenhydraten von einem Glykoprotein, System zum Analysieren einer Probe, Verfahren zum Analysieren der Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen und Ausrüstung zur Glykananalyse

Info

Publication number: DE102010000718B4
Application number: DE102010000718.8A
Authority: DE
Inventors: Rudolf Grimm; Magdalena Anna Bynum; Kevin Killeen; Karla Robotti
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2023-02-23
Anticipated expiration: 2030-01-08
Also published as: US20100190146A1; DE102010000718A1; US10209259B2; US20150198611A1

Abstract

Mikrofluideinheit (101) zum Entfernen von Kohlenhydraten von einem Glykoprotein, wobei die Mikrofluideinheit (101) aufweist:eine Deglykosylierungs-Säule (110), die ein festes Substrat und ein auf dem festen Substrat immobilisiertes Enzym aufweist, wobei das Enzym Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann; eine Trap-Säule (120), die Kohlenhydrate binden kann; eine Trennsäule (130), die Kohlenhydrate trennen kann; und eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen (141-146);wobei die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit (101) mit einem Schaltelement verbunden wird, das mindestens einen Kanal (151, 153, 155) aufweist, die Kombination der Anschlüsse, Säulen und des mindestens einen Kanals ein Ventilsystem bildet, das zwischen mindestens einem ersten und einem zweiten Zustand umgeschaltet werden kann, wobei der erste Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule (110) und der Trap-Säule (120) und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule (120) und der Trennsäule (130) herstellt.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrofluideinheit zum Entfernen von Kohlenhydraten von einem Glykoprotein, ein System zum Analysieren einer Probe, ein Verfahren zum Analysieren der Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen und eine Ausrüstung zur Glykananalyse
Die Analyse der Struktur und Funktion von Glykoproteinen, die unter der Bezeichnung Glykomik bekannt ist, hat sich zu einem neuen und wichtigen Forschungsbereich entwickelt. Die Glykosylierung stellt die häufigste posttranslationale Modifizierung der Proteine an der Zelloberfläche und der extrazellulären Matrix dar. Glykoproteine spielen bei der Adhäsion an der Zelle und für die Immunantwort eine wichtige Rolle. Änderungen der Häufigkeit und der Profile von Glykanen sind mit dem Verlauf von Krankheiten wie Krebs und rheumatoide Arthritis korreliert worden. Außerdem ist die Analyse der Glykanprofile für die biotherapeutische Industrie von großer Bedeutung. Zum Beispiel enthalten biotherapeutische Antikörper glykosylierte Aminosäuren, welche dazu beitragen, die Aktivität von Medikamenten aufrechtzuerhalten und die Unterdrückung der Wirksamkeit von Medikamenten durch das Immunsystem zu verhindern. Deshalb müssen Unternehmen, welche diese Biotherapeutika herstellen, deren Glykanprofile überwachen und prüfen.
Die Glykananalyse erfolgt üblicherweise durch Verfahren wie die Kapillarelektrophorese oder die Massenspektrometrie. In beiden Fällen müssen die Glykane von den Glykoproteinen entfernt, getrennt und analysiert werden. Der Prozess des Entfernens der Glykane von den Glykoproteinen beinhaltet herkömmlicherweise eine enzymatische Reaktion mit PNGase F in Lösung, die eine Inkubationszeit von 24 Stunden erfordert. Nach der enzymatischen Reaktion müssen die Proteine abgeschieden werden, um die Glykane von den Proteinen zu trennen und dann zu analysieren. Abschließend werden die freien Glykane mittels Massenspektrometrie oder Kapillarelektrophorese analysiert. Diese Schritte sind sehr zeitaufwendig und umständlich, und die manuelle Behandlung ist fehleranfällig. Außerdem wird eine große Menge an Ausgangsmaterial benötigt, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Deshalb ist eine bessere Vorgehensweise bei der Durchführung der Glykananalyse wünschenswert.
WO 2007/ 012 695 A2 offenbart Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat-Zusammensetzungen, Glykome, aus tierischen Geweben sowie Verfahren zur Analyse der Glykome, insbesondere massenspektrometrische Verfahren. US 2006 / 0 171 855 A1 zeigt eine mikrofluidische Vorrichtung mit mehreren Substraten zur Durchführung einer mehrdimensionalen Trennung von Probenkomponenten sowie Systeme und Verfahren zu deren Verwendung. TIAN, W.-C.; FINEHOUT, E.: Microfluidics for biological applications; Boston: Springer, 2009. pages 5, 165-184 liefert Einblicke in eine Vielzahl von biologischen Anwendungen der Mikrofluidik für biologische Anwendungen in den Bereichen Biotechnologie, Pharmazie und Biowissenschaften und führt in die Grundlagen der Mikrofluidik ein.
Figurenliste

1A ist eine schematische Darstellung der Draufsicht auf einen Mikrofluid-Chip, der zur Glykananalyse von Glykoproteinen verwendet werden kann. 1B ist eine schematische Darstellung der Draufsicht auf ein Schaltelement in Form einer Drehscheibe, die mit dem in 1A gezeigten Chip verbunden werden kann. 1C zeigt einen Zustand eines Ventilsystems, das gebildet wird, wenn der Chip von 1A mit der Drehscheibe von 1B verbunden wird. In diesem Zustand ist die Trap-Säule mit der Deglykosylierungssäule verbunden. 1D zeigt einen anderen Zustand des Ventilsystems, in dem die Trap-Säule mit der Trennsäule verbunden ist.
2 zeigt zwei Ebenen eines Mikrofluid-Chip.
3 ist eine dreidimensionale Darstellung, in der gezeigt wird, wie die Deglykosylierung und Glykananreicherung in einer Mikrofluideinheit gemäß der vorliegenden Patentanmeldung erfolgt. Ferner sind einige Kanäle eines mit der Mikrofluideinheit verbundenen Schaltelements gezeigt.
4 zeigt eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit in einer Schaltstellung, in der gesammelte Glykane zu einer Trennsäule geleitet werden. Ferner sind einige Kanäle gezeigt, die von einem mit der Mikrofluideinheit verbundenen Schaltelement führen.
Die 5 und 6 zeigen eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit, die drei Ebenen aufweist. Ferner sind einige Kanäle gezeigt, die von einem mit der Einheit verbundenen Schaltelement führen.
7 zeigt das Massenspektrum einer Antikörperprobe, die auf dem Chip (rechts) oder in Lösung (links) bearbeitet wurde.
8 zeigt den chemischen Ablauf der enzymatischen Reaktion von PNGase F.
9 zeigt die Übereinstimmung der Glykane, die den Peaks der in 7 gezeigten Massenspektren entsprechenden.
10 zeigt die Trennung von isomeren Glykanen G1' und G1" nach einem kurzen Gradienten in der Flüssigkeitschromatografie.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues, schnelles und elegantes Verfahren zum Herstellen, Trennen und Analysieren von Glykanen unter Verwendung einer Mikrofluideinheit bereit. Darüber hinaus wird aufgrund der Bauart der Mikrofluideinheit dieser Erfindung im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren eine höhere Ausbeute an Glykanen und eine ausgezeichnete chemische Trennung von Isomeren erreicht sowie eine wesentlich geringere Menge an Ausgangsmaterialien benötigt.
Vor der detaillierten Beschreibung der Erfindung werden, falls nicht anderweitig dargestellt, die in dieser Patentanmeldung gebrauchten Begriffe definiert.
Definitionen
In dieser Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen beinhalten die Einzahlformen „ein“, „eine“ und „der, die, das“ auch die Mehrzahlbedeutung, sofern aus dem Zusammenhang nicht ausdrücklich anderes hervorgeht.
Eine „Mikrofluideinheit “ ist eine Einheit, die Kammern und/oder Kanäle mit Mikrometer- oder Submikrometerabmessungen aufweist, durch welche eine Flüssigkeit fließen kann. Die Kammern oder Kanäle weisen einen Durchmesser (oder, wenn diese nicht kreisrund sind, eine größte Abmessung des Querschnitts) auf, der im Allgemeinen zwischen 1 µm und weniger als 1000 µm beträgt, zum Beispiel 1 µm bis 500 µm, 10 µm bis 300 µm oder 50 µm bis 250 µm.
Eine „Säule“ ist eine Vorrichtung für einen bestimmten Zweck, die normalerweise zum Binden oder Zurückhalten vorzugsweise einer Substanz oder einer Substanzklasse dient. Üblicherweise weist eine Säule ein Gehäuse auf, in dem sich eine Füllung befindet, wobei die Füllung in der Lage ist, vorzugsweise eine Substanz oder eine Substanzklasse zu binden oder zurückzuhalten. Bei einigen Ausführungsform kann die Füllung einfach nur ein Medium darstellen, durch welches sich verschiedene Substanzen bewegen, die sich (z.B. aufgrund eines elektrischen Feldes) mit unterschiedlicher Geschwindigkeit vorwärts bewegen. Eine Säule (oder ein Gehäuse oder eine Füllung) kann eine beliebige Größe, Form oder Struktur aufweisen und aus einem beliebigen Material hergestellt sein, das für den Verwendungszweck der Säule geeignet ist.
Im vorliegenden Zusammenhang kann das „Verbinden“ durch direkte oder indirekte Verbindungen erfolgen. Unter einer direkten Verbindung ist zu verstehen, dass zwei miteinander verbundene Objekte in physischem Kontakt miteinander stehen. Unter einer indirekten Verbindung ist zu verstehen, dass zwei miteinander verbundene Objekte nicht in physischem Kontakt miteinander stehen, sondern über mindestens ein dazwischen liegendes Objekt miteinander verbunden sind.
Eine „Fluidverbindung“ zwischen zwei Objekten bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass zwischen den beiden Objekten eine Leitung besteht, durch welche ein Fluid von einem zum anderen Objekt fließen kann. Als Leitung kann eine Pore, ein Durchgang, eine Öffnung, ein Kanal, eine Röhre oder Ähnliches dienen.
Der Begriff „Kohlenhydrat“ bezieht sich auf jede Verbindung aus der Gruppe der Kohlenhydrate, darunter Zucker, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, einfache Kohlenhydrate, komplexe Kohlenhydrate und Ähnliches.
Mikrofluideinheit und mikrofluidische Verfahren
1A veranschaulicht eine beispielhafte Einheit 101 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Einheit 101 weist eine Deglykosylierungs-Säule 110 zum Abspalten der Glykane aus den Glykoproteinproben, eine Trap-Säule 120 zum Binden und Anreichern der abgespalteten Glykane und eine Trennsäule 130 zum Trennen der Glykane auf. Obwohl die Zeichnungen für die Einheit 101 und jede ihrer Komponenten eine bestimmte Form zeigen, können für diese Erfindung veränderte Formen oder relative Abmessungen verwendet werden. Desgleichen sind die anderen in dieser Beschreibung beschriebenen Einheiten und Komponenten nicht auf die in den Zeichnungen dargestellten Formen und Abmessungen beschränkt.
Die Deglykosylierungs-Säule 110 weist ein festes Substrat auf, auf welchem ein Enzym fixiert ist, das Kohlenhydrate von einem Glykoprotein abspalten kann. Bei den meisten Glykoproteinen hängt der Kohlenhydratanteil am Stickstoff der Amidgruppe von Asparaginresten (N-terminale Glykane) oder am Sauerstoff der Hydroxylgruppe in Serin- oder Threoninresten (O-terminale Glykane). Bei der vorliegenden Erfindung kann jedes Enzym verwendet werden, welches den Kohlenhydratanteil von Glykoproteinen abspalten kann, einschließlich solcher Enzyme, die speziell auf N-terminale oder O-terminale Glykane ausgerichtet sind. Diese Enzyme sind nach dem Stand der Technik bekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F₁, Endo F₂, Endo F₃, und Endo H. Ebenso sind Materialien und Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf festen Substraten nach dem Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Palm und Novotny, 2005). Zum Beispiel können als festes Substrat in der Deglykolisierungs-Säule 110 Glas- oder Polymerperlen oder ein kompaktes Medium (zum Beispiel Polymethacrylat, Polystyrol, Polyacrylamid oder Ähnliches) verwendet werden.
Die Trap-Säule 120 ist in der Lage, anstelle von Proteinen vorzugsweise Kohlenhydrate zu binden. Zum Beispiel kann zum Zurückhalten und Entsalzen der in der Deglykosylierungs-Säule freigesetzten Glykane eine in der Flüssigkeitschromatografie übliche, hydrophil wirkende stationäre Phase (HILIC) verwendet werden. Die Trennsäule 130 ist in der Lage, aufgrund ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften Glykane voneinander zu trennen. Es gibt zwei Hauptarten von Trennsäulen: Flüssigkeitschromatografie-Säulen und Kapillarelektrophorese-Säulen.
Die Einheit 101 enthält auch eine Vielzahl von Eingangs-/ Ausgangsanschlüssen 141 bis 146. Ein Eingangs-/Ausgangsanschluss (oder „Anschluss“) kann ein Loch, ein Durchgang oder eine Öffnung sein, die jeweils mit einer Leitung (insbesondere mit einer Kurzschlussleitung) oder Ähnlichem verbunden ist, soweit der Anschluss den Transport des Fluids von einem zum anderen Ende des Anschlusses ermöglicht. Die Anschlüsse 141 bis 146 können in verschiedenen Arbeitsphasen zum Verbinden diverser Teile der Mikrofluideinheit 101 miteinander verwendet werden, wenn die Mikrofluideinheit mit entsprechenden Kanälen zur Deckung gebracht und mit diesen verbunden wird. Zum Beispiel kann die Mikrofluideinheit 101 über einer Drehscheibe 150 angebracht werden, die drei Kanäle 151, 153 und 155 aufweist (1B). Die Drehscheibe 150 kann so gedreht werden, dass durch jeden Kanal in der Drehscheibe jeweils verschiedene Anschlüsse in der Einheit 101 miteinander verbunden werden, wenn sich die Drehscheibe in einer anderen Stellung befindet. Zum Beispiel kann die Drehscheibe in eine Stellung gedreht werden, in der die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 141 und 142 durch den Kanal 151 miteinander verbunden sind (1C). In dieser Stellung sind auch die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 143 und 144 (durch den Kanal 153) und die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 145 und 146 (durch den Kanal 155) miteinander verbunden. Eine Probe, die Glykoproteine enthält oder enthalten kann, wird durch den Eingangsanschluss 111 in die Deglykosylierungs-Säule 110 eingeführt. Die Glykoproteine werden in der Deglykosylierungs-Säule 110 zerlegt, aus der die freien Glykane und der verbleibende Teil der Glykoproteine austreten. Dieses Gemisch fließt bis zum Ende der Deglykosylierungs-Säule, die mit dem Anschluss 141 verbunden ist und tritt durch den Kanal 151 in die Trap-Säule 120 ein. In der Trap-Säule 120 werden die Glykane an die kohlenhydratbindende Substanz gebunden, während die übrigen Komponenten des Gemischs durch die Säule fließen und gesammelt oder über den Kanal 155 entsorgt werden.
Dann wird das System in eine andere Stellung umgeschaltet (siehe 1D), in der die folgenden Eingangs-/Ausganganschlüsse miteinander verbunden werden: Anschluss 142 mit Anschluss 143, Anschluss 144 mit Anschluss 145 und Anschluss 146 mit Anschluss 141. Dadurch stehen die Trap-Säule 120 und die Trennsäule 130 nunmehr über den Kanal 153 in Fluidverbindung miteinander, sodass die Deglykosylierungs-Säule 110 nicht mehr mit der Trap-Säule 120 verbunden ist. Über den Anschluss 143 kann eine Elutionslösung in die Trap-Säule 120 eingeführt werden, und das Eluat fließt vom Anschluss 145 zum Anschluss 144 und tritt dann in die Trennsäule 130 ein. In der Trennsäule 130 werden dann die Glykane voneinander getrennt. Der Ausgang der Trennsäule 130 kann mit dem Probeneingang eines Massenspektrometers verbunden werden, um die Glykane massenspektrometrisch weiter zu analysieren.
Obwohl oben eine Drehscheibe als Schaltelement zum Wechseln des Zustands der Fluidverbindung zwischen den Säulen in der Einheit beschrieben wird, können auch andere Schaltelemente verwendet werden. Zum Beispiel können eine Reihe von Kanälen und Ventilen so mit der Einheit 101 verbunden werden, dass beim Schalten eines oder mehrerer Ventile die Deglykosylierungs-Säule von der Trap-Säule getrennt und diese mit der Trennsäule verbunden wird.
Bei einigen Ausführungsformen werden die Deglykosylierungs-Säule 110 und die Trap-Säule 120 kontinuierlich betrieben. Zum Beispiel kann die Einheit 101 anstelle von zwei diskontinuierlich betriebenen Säulen 110 und 120 eine Kammer haben, die ein Deglykosylierungsmaterial (ein auf einem festen Substrat immobilisiertes Deglykosylierungsenzym) in einem ersten Teil der Kammer, welcher eine Deglykosylierungs-Säule darstellt, und ein Bindungsmaterial (das anstelle von Proteinen vorzugsweise Kohlenhydrate bindet) im anderen Teil der Kammer aufweist, welcher eine Trap-Säule darstellt. Gemäß einem weiteren Beispiel kann eine Deglykosylierungs-Säule über einen Durchgang oder eine Leitung in der Einheit 101 so mit einer Trap-Säule verbunden sein, dass zwischen den beiden Säulen in der Struktur der Mikrofluideinheit 101 eine Fluidverbindung besteht. Bei diesen Ausführungsformen kann ein einfacheres Schaltelement verwendet werden, welches die Deglykosylierungs-Säule nicht mit der Trap-Säule zu verbinden braucht. Denkbar ist, dass das Schaltelement als Mindestausstattung einen Kanal und ein Ventil zur Steuerung des Kanals aufweisen kann, wobei der Kanal so angeordnet werden kann, dass er die Trap-Säule und die Trennsäule miteinander verbindet. Wenn das Ventil abgeschaltet ist, besteht zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule keine Fluidverbindung. In diesem Zustand können das Einführen der Probe, die Deglykosylierung und die Anreicherung der Glykane (Binden) erfolgen. Dann wird das Ventil eingeschaltet, um die Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule herzustellen, die Trap-Säule zu eluieren und die Glykane zu trennen.
Bei einigen Ausführungsformen sind verschiedene Teile der Einheit in verschiedenen Ebenen oder Chips angeordnet, die in geeigneter Weise zusammengefügt die Einheit bilden (siehe z.B. die US 2006/0171855 A1 Zum Beispiel zeigt 2 einen Chip 210, der die Trap-Säule 120 und die Trennsäule 130 enthält. Ein weiterer Chip („Deglykosylierungs-Chip“) 220 enthält die Deglykosylierungs-Säule. Der Deglykosylierungs-Chip 220 kann zum Beispiel durch mechanisches Anheften auf der Oberseite des Chip 210 so mit diesem verbunden werden, dass zwischen dem Eingangs-/Ausgangsanschluss 141 des Chip 210 und dem Anschluss 141' des Deglykosylierungs-Chip 220 eine Fluidverbindung entsteht. Dabei ist zu beachten, dass der Deglykosylierungs-Chip 220 bei dieser Ausführung für die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 144 und 145 keine passenden Gegenöffnungen aufweist, da die Anschlüsse 144 und 145 für die Verbindung zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule benötigt werden, die sich auf dem Chip 210 befinden. Der Chip 220 kann jedoch entsprechende Gegenöffnungen (143' und 146') für die Eingangsanschlüsse 143 und 146 aufweisen, die ausschließlich zur Justierung dienen. Wenn die Chips 210 und 220 zusammengesetzt werden, wird also der Anschluss 143 mit dem Anschluss 143' und der Anschluss 146 mit dem Anschluss 146' zur Deckung gebracht.
Im Betriebszustand ist die komplette Zwei-Chip-Einheit mit einem mehrere Kanäle enthaltenden Schaltelement verbunden, zum Beispiel mit der in 1B gezeigten Drehscheibe. In den Eingangsanschluss 111, der als Eingang in die Deglykosylierungs-Säule 110 dient, wird eine Probe eingeführt. Nach der Deglykosylierung fließt das Reaktionsgemisch nacheinander zum Eingangs-/ Ausgangsanschluss 141, zum Eingangs-/Ausgangsanschluss 141' auf dem Chip 210, der mit dem Anschluss 141 verbunden ist, dann zu einem Kanal in der Drehscheibe, der den Anschluss 141' mit dem Anschluss 142 verbindet, dann zum Anschluss 142 und schließlich zur Trap-Säule 120. Nach dem Fixieren in der Trap-Säule wird die Drehscheibe weitergedreht, um (durch einen Kanal in der Drehscheibe, der die Anschlüsse 144 und 145 miteinander verbindet) eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule 120 und der Trennsäule 130 herzustellen, und die Glykane werden in der oben beschriebenen Weise eluiert und getrennt.
Die 3 und 4 zeigen dreidimensionale Ansichten zur Funktionsweise einiger Ausführungsformen von Trenneinheiten mit zwei Ebenen in Verbindung mit einem Schaltelement. Gemäß der Darstellung in 3 wird die Probe in den Eingangsanschluss 111 injiziert, um in die Deglykosylierungs-Säule zu gelangen, die bei der Ausführungsform in dieser Figur die Form einer Leitungsschleife aufweist. Gezeigt sind nur der Anfangs- und der Endteil der Leitungsschleife. Diese spezielle Ausführungsform unterscheidet von der in 2 gezeigten dadurch, dass sich der Anschluss 141 unterhalb des Eingangsanschlusses 111 befindet, und sie stellt eine Abwandlung dar, die derselben Funktion dient. Die aus der Deglykosylierungs-Säule austretende Probe wird durch den Kanal 151 in die Trap-Säule geleitet, in der die Glykan-Anreicherung erfolgt und die sich in einer Ebene unterhalb der Deglykosylierungs-Säule befindet. Proteine ohne Kohlenhydratanteil fließen durch die Trap-Säule und verlassen diese durch den Kanal 155. In 4 wird die Trap-Säule (durch Umschalten eines in der Figur nicht vollständig dargestellten Schaltelements) mit den Kanälen 151 und 153 verbunden und durch den Kanal 151 eine Elutionslösung in die Trap-Säule eingeführt, sodass die Glykane aus der Trap-Säule eluiert werden und durch den Kanal 153 in die Trennsäule gelangen.
Bei einigen Ausführungsformen weist die Mikrofluideinheit ferner eine Reinigungssäule auf, die anstelle der Kohlenhydrate vorzugsweise Proteine binden kann. Zum Beispiel werden die Proteine durch eine C18- oder C8-Packung oder andere unpolare Umkehrphasen zurückgehalten, während die freien Glykane ungehindert durchfließen. Zum Binden von Proteinen wie beispielsweise Antikörpern kann ein Protein A verwendet werden, das anstelle der Glykane den Antikörper bindet. Die in der Reinigungssäule gebundenen Proteine können entweder entsorgt oder analysiert werden, um das Proteinprofil und den Proteingehalt in der Probe zu ermitteln. Diese Ausführungsformen weisen Eingangs-/Ausgangsanschlüsse auf, die zusammen mit einem Schaltelement gleichzeitig oder nacheinander die Verbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule und der Reinigungssäule sowie zwischen der Reinigungssäule und der Trap-Säule herstellen können. Es ist bei einigen Ausführungsformen auch denkbar, dass gleichzeitig oder nacheinander die Deglykosylierungs-Säule mit der Trap-Säule und die Trap-Säule mit der Reinigungssäule verbunden werden kann. Somit können bei einigen Ausführungsformen alle drei Säulen gleichzeitig in der Reihenfolge Deglykosylierungs-Säule - Reinigungssäule - Trap-Säule oder Deglykosylierungs-Säule - Trap-Säule - Reinigungssäule miteinander verbunden werden.
Die 5 und 6 zeigen eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit mit drei Ebenen, die eine Reinigungssäule aufweist. Die erste Ebene beinhaltet eine Deglykosylierungs-Säule 110, die mittlere Ebene eine Protein-Reinigungssäule 115 und die untere Ebene eine Trap-Säule 120 sowie eine Trennsäule 130. Die Figuren zeigen auch drei von einem Schaltelement ausgehende Kanäle.
Beispiel 1 beschreibt Experimente, bei denen die in den 5 und 6 dargestellte Ausführungsform zum Analysieren der Glykanzusammensetzungen in der Probe eines Antikörpers verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mikrofluideinheit der vorliegenden Erfindung eine schnelle Analyse ermöglicht, bei der die ursprüngliche chemische Struktur der Glykane erhalten bleiben kann. Eine parallel dazu in Lösung durchgeführte herkömmliche Analyse hingegen zeigt, dass sich die chemischen Strukturen der Glykane bei der herkömmlichen Analyse während der langen Inkubationszeit verändert haben. Überraschenderweise können Isomere der Glykane, die nun in ihren ursprünglichen Strukturen (Aminoglykan-Strukturen) vorliegen, in der Trennsäule viel besser aufgelöst werden, während bisher ein längerer und zeitaufwendiger und somit kostspieliger Trennprozess zum Trennen der Isomere erforderlich war, was bis jetzt ein großes Problem darstellte.
Die Geschwindigkeit der vorliegenden Verfahren hängt von der Komplexität der Proben ab, da die Trennung umso länger dauert, je mehr Glykane getrennt werden müssen. Wenn außerdem, wie bei der Trennung von Isomeren, eine feinere Trennung gewünscht ist, ist eine längere Trennsäule und somit ebenfalls eine längere Trenndauer erforderlich. Durch die vorliegenden Verfahren kann der Prozess der Deglykosylierung, Reinigung, Fixierung und Trennung im Allgemeinen in einem Zeitraum von einer Minute bis zu einer Stunde abgewickelt werden, zum Beispiel in 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Minuten. Bei einigen Ausführungsformen kann der Prozess unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen ein wesentlicher Anteil der Glykane in Form von Aminoglykanen erhalten bleibt. Dieser wesentliche Anteil kann zum Beispiel mindestens 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40 oder 30 % der Glykane in der Probe betragen.
Die Ergebnisse zeigen auch, dass eine geringe Probenmenge (100 ng Glykoproteine) starke Signale lieferte, sodass die Probenmenge durchaus verringert werden kann. Somit können die vorliegenden Verfahren bei einigen Ausführungsformen dazu verwendet werden, eine Probe mit einem Gehalt von bis zu 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 ng Glykoproteinen zu analysieren.
Somit stellen einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Mikrofluideinheiten bereit, die üblicherweise die Form von Chips haben und Folgendes aufweisen:

eine Deglykosylierungs-Säule, die ein festes Substrat und ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist, das Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann.
eine Trap-Säule, die Kohlenhydrate binden kann;
eine Trennsäule, die Kohlenhydrate trennen kann; und
eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen;
wobei die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit mit einem Schaltelement zur Deckung gebracht wird, das einen Kanal oder eine Vielzahl von Kanälen aufweist, die Kombination dieser Anschlüsse, Säulen und Kanäle ein Ventilsystem bildet, das mindestens zwischen einem ersten und einem zweiten Zustand umgeschaltet werden kann, wobei der erste Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule und der Trap-Säule und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule herstellt.

Die Mikrofluideinheit kann ferner wahlweise eine Reinigungssäule aufweisen, die Proteine zu binden vermag. Die Reinigungssäule kann zum Binden und Entsorgen von Proteinen verwendet werden, die bei Glykananalysen stören können. Alternativ kann die Reinigungssäule dazu eingesetzt werden, zusätzlich zur Glykananalyse auch Proteine für eine Proteinanalyse zu gewinnen.
Bei einigen nicht erfindungsgemäßen anderen Ausführungsformen kann die Mikrofluideinheit unter Wegfall der Trap-Säule eine Deglykosylierungs-Säule, eine Reinigungssäule und eine Trennsäule aufweisen. Diese Ausführungsformen gliedern sich in zwei Gruppen. Eine Gruppe kann zur Proteinanalyse eingesetzt werden, wobei die Trennsäule nicht für die Kohlenhydrat-, sondern für die Proteintrennung geeignet ist. In Verbindung mit dieser Gruppe muss ein Schaltelement verwendet werden, das die Reinigungssäule mit der Trennsäule verbinden kann. Die andere Gruppe kann für eine abgekürzte Glykananalyse eingesetzt werden, bei der auf die Glykananreicherung verzichtet wird. Ausführungsformen aus dieser Gruppe weisen eine Trennsäule zur Trennung von Kohlenhydraten auf.
Mikrofluideinheiten werden üblicherweise durch Erzeugen von Kanälen und Kammern in einem Material hergestellt, welches die Mikrofluideinheit oder deren Ebenen bildet. Geeignete Werkstoffe zur Bildung der Mikrofluideinheit oder deren Ebenen werden unter Berücksichtigung der physikalischen und chemischen Eigenschaften ausgewählt, die für das ordnungsgemäße Funktionieren der Mikrofluideinheit wünschenswert sind. Zum Beispiel wird eine Mikrofluideinheit aus einem Werkstoff hergestellt, in welchem Strukturmerkmale mit hoher Auflösung, d.h. Mikrokanäle, Mikrokammern und Ähnliches mit Abmessungen im Mikrometer- oder Submikrometerbereich, gebildet werden können. Daher muss das Material durch Mikrofabrikationsprozesse, z.B. durch Trockenätzen, Nassätzen, Laserätzen, Laserablation, Spritzgussverfahren, Prägen oder Ähnliches, bearbeitet werden können, um die gewünschten Mikrostrukturen in der Oberfläche zu erzeugen. Mikrostrukturen können auf einer Materialoberfläche auch durch Auftragen von Materialien gebildet werden, zum Beispiel können auf der Oberfläche eines Glassubstrats Polymerkanäle lithografisch unter Verwendung von Polyimid gebildet werden. Ferner müssen alle für die Mikrofluideinheit verwendeten Werkstoffe gegenüber allen Substanzen chemisch inert und physikalisch stabil sein, mit denen sie beim Einführen einer Fluidprobe in Kontakt kommen (z.B. gegenüber deren pH-Wert, elektrischen Feldern usw.). Als Werkstoffe zur Bildung der vorliegenden Mikrofluideinheiten sind unter anderem, aber nicht ausschließlich, Polymerwerkstoffe, Keramik (einschließlich Aluminiumoxid und Ähnlichem), Glas, Metalle, Verbundwerkstoffe und deren Laminate geeignet.
Als Polymerwerkstoffe dienen in der Regel organische Polymere in Form von Homo- oder Copolymeren, die in der Natur vorkommen oder synthetisch hergestellt werden und die vernetzt oder unvernetzt sind. Von besonderem Interesse sind unter anderem, aber nicht ausschließlich, Polyimide, Polycarbonate, Polyester, Polyamide, Polyether, Polyurethane, Polyfluorkohlenstoffe, Polystyrole, Poly(acrylnitril-butadien-styrol)(ABS), Acrylat- und Acrylsäurepolymere wie beispielsweise Polymethylmethacrylat und andere substituierte und nichtsubstituierte Polyolefine und deren Copolymere. Von besonderem Interesse sind Polyimide, die sich in vielen Fällen als äußerst brauchbares Substratmaterial bewährt haben. Auch Polyetheretherketone (PEEK) weisen eine geeignete Resistenz gegen Biofouling auf.
Die Mikrofluideinheiten der Erfindung können auch aus einem „Komposite“ (engl. composite), d.h. aus einem Verbund verschiedener Materialien, hergestellt werden. Das Komposite kann aus einem Blockverbund bestehen, z.B. einem A-B-A-Blockverbund, einem A-B-C-Blockverbund oder Ähnlichem. Alternativ kann das Komposite aus einem heterogenen Materialverbund, bei dem die Materialien von einzelnen Phasen verschieden sind, oder einer homogenen Kombination ungleicher Materialien bestehen. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet die Verwendung des Begriffs „Komposite“ auch ein „Laminat“-Komposite. Als „Laminat“ wird ein Komposite bezeichnet, das aus mehreren verschiedenen miteinander verbundenen Schichten aus gleichem oder unterschiedlichem Material besteht. Zu weiteren bevorzugten Komposite-Materialien zählen Polymerlaminate, Polymer-Metall-Laminate, z.B. mit Kupfer beschichtete Polymere, ein Keramik-in-Metall- oder ein Polymer-in-Metall-Komposite. Ein bevorzugtes Komposite-Material stellt ein Polyimidlaminat dar, das aus einer ersten Polyimidschicht wie Kapton® gebildet und mit einer zweiten dünnen Schicht aus einem heißklebenden Polyimid mit der Bezeichnung KJ® coextrudiert wurde, wobei beide Werkstoffe von DuPont (Wilmington, Delaware, USA) erhältlich sind.
Die vorliegenden Mikrofluideinheiten können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, darunter, aber nicht darauf beschränkt, Mikrospritzguss- und -gießverfahren, Prägeverfahren, abtragende Bearbeitung von Oberflächen und massivem Material. Das letztere Verfahren beinhaltet die Bildung von Mikrostrukturen durch direktes Ätzen in ein massives Material, üblicherweise durch chemisches Nassätzen oder reaktives lonenätzen („RIE“). Die abtragende Bearbeitung von Oberflächen beinhaltet die Herstellung aus Schichten, die auf der Oberfläche eines Substrats abgeschieden wurden. Ein beispielhafter Prozess der abtragenden Bearbeitung von Oberflächen ist unter der Bezeichnung „LIGA“ bekannt. Siehe zum Beispiel Becker et al. (1986), Ehrfeld et al. (1988), und Guckel et al. (1991). Beim LIGA-Verfahren wird eine relativ dicke Schicht eines Röntgenstrahlen-Abdecklacks auf einem Substrat abgeschieden und durch eine Röntgenstrahlung absorbierende Maske hochenergetischer Röntgenstrahlunausgesetzt, woraufhin die bestrahlten Abdecklack-Bereiche unter Verwendung eines chemischen Entwicklers entfernt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Mikrofluideinheiten stellt die Laserablation dar. Bei der Laserablation werden kurze Impulse von ultraviolettem Licht in einer dünnen Oberflächenschicht eines Materials absorbiert. Vorzugsweise werden Impulsenergien von mehr als ungefähr 100 Millijoule pro Quadratzentimeter und Impulslängen von weniger als ungefähr 1 Mikrosekunde verwendet. Unter diesen Bedingungen führt die intensive Ultraviolettstrahlung zur Fotodissoziation der chemischen Bindungen in der Substratoberfläche. Die absorbierte Energie der Ultraviolettstrahlung wird auf ein so kleines Materialvolumen konzentriert, dass die dissoziierten Bruchstücke rasch erhitzt und von der Substratoberfläche weggeschleudert werden. Da diese Prozesse so schnell ablaufen, kann sich die Wärmeenergie nicht in das angrenzende Material ausbreiten. Dadurch werden die angrenzenden Bereiche nicht aufgeschmolzen oder anderweitig geschädigt, und der Umfang der abgetragenen Teile kann mit der Genauigkeit in der Größenordnung von ungefähr einem Mikrometer oder weniger die Form des einfallenden Lichtstrahls nachbilden. Bei der Laserablation werden üblicherweise Hochleistungslaser wie beispielsweise Excimer-Laser vom F₂-, ArF-, KrCl-, KrF- oder XeCI-Typ verwendet. Gleichermaßen können jedoch auch andere UV-Lichtquellen mit im Wesentlichen denselben optischen Wellenlängen und Energiedichten verwendet werden. Laserablationsverfahren werden zum Beispiel von Znotins et al. (1987) sowie in den US 5 291 226 A und US 5 305 015 A von Schantz et al. beschrieben.
Einen weiteren Aspekt dieser Erfindung stellen Systeme dar, die eine Mikrofluideinheit gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen. Das System kann ferner ein Schaltelement zum Schalten eines Ventilsystems aufweisen, um ausgewählte Verbindungen zwischen den verschiedenen Säulen der Mikrofluideinheit herzustellen. Als Schaltelement kann zum Beispiel eine Drehscheibe mit einer Vielzahl von Kanälen dienen, die mit den Eingangs-/ Ausgangsanschlüssen des Chip zur Deckung gebracht werden können, wenn der Chip in die Drehscheibe einrastet. Darüber hinaus kann die Drehscheibe zwischen mindestens zwei verschiedenen Zuständen hin- und hergeschaltet werden, die jeweils für die Verbindung von verschiedenen Anschlüssen auf dem Chip sorgen. Als Schaltelement kann auch ein Schieber verwendet werden, der zwischen mindestens zwei verschiedenen Stellungen zur Verbindung verschiedener Anschlüsse verschoben werden kann und beispielsweise in der US-Patentschrift 6 702 256 beschrieben wird. Es können jedoch auch andere Schaltelemente verwendet werden. Wahlweise kann das System auch ein Zwischenelement zur Übertragung der aus der Mikrofluideinheit austretenden Substanzen (der abgetrennten Glykane) zum Eingang eines Massenspektrometers oder anderer Analysemittel aufweisen. Alternativ können die aus der Mikrofluideinheit austretenden Substanzen auch direkt in die Ionisationskammer eines Massenspektrometers eingegeben werden. Ferner kann das System auch ein Massenspektrometer oder andere Analysemittel aufweisen.
Andere Ausführungsformen können auch eine Ausrüstung bereitstellen, die eine Mikrofluideinheit gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist. Die Ausrüstung kann ferner auch folgende Materialien einzeln oder in Kombination aufweisen: eine Probenlösung, eine Elutionslösung für jede der Säulen, Auffrischungsreagenzien für jede der Säulen, eine Standardprobe (zum Beispiel einen Antikörperstandard, einen Glykanstandard usw.), eine Bedienungsanweisung und einen Behälter für die Komponenten.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen dieser Erfindung und sind keinesfalls als Einschränkung des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Obwohl bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung gezeigt und beschrieben werden, können daran verschiedene Änderungen in Form und Details vorgenommen werden, ohne vom Geist und Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE

In den folgenden Beispielen haben die folgenden Abkürzungen die folgenden Bedeutungen. Nicht definierte Abkürzungen haben ihre allgemein anerkannten Bedeutungen.

°C	Grad Celsius
h	Stunde
min	Minute
s	Sekunde
mM	Millimol
µM	Mikromol
nM	Nanomol
µm	Mikrometer
ml	Milliliter
µl	Mikroliter
nl	Nanoliter
mg	Milligramm
µg	Mikrogramm
HPLC	Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
LC	Flüssigkeitschromatografie
MS	Massenspektrometrie
QTOF	Quadrupol-Laufzeitspektrometrie

BEISPIEL 1
Glykananalyse mit chipgebundenen enzymatischen Reaktionen
Chipherstellung
Das Enzym PNGase F wurde 22 h lang in Phosphat-Pufferlösung (pH 8) chemisch auf epoxidmodifizierten Siliciumdioxidperlen mit einem Durchmesser von 5 µm fixiert. Dann wurden die Perlen in eine auf einem ersten Polyimid-Chip befindliche Kammer gepackt. In eine zweite Kammer auf einem zweiten Polyimid-Chip wurden 5 µm große C8-Umkehrphaseperlen zur Proteinreinigung gepackt. Die dritte Chip-Ebene enthielt eine Probenanreicherungssäule (40 nl), eine Trennsäule (75 mm), die mit zu Grafit umgewandeltem Kohlenstoff für die HPLC-Analyse gefüllt war, und eine integrierte MS-Spitze zur Eingabe in ein Massenspektrometer. Die drei Chips wurden aufeinander gelegt, miteinander zur Deckung gebracht und in eine Chip-Halterung eingesetzt.
Verfahren
Die Antikörperproben wurden in Phosphatpuffer (pH 7,5) auf eine Konzentration von 6 pmol/µl verdünnt. Das verwendete HPLC-System arbeitete mit typischen mobilen Phasen von 0,1 % Ameisensäure in Wasser mit MS-Reinheitsgrad (Lösemittel A) und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (Lösemittel B). Der Autosampler wurde auf ein Injektionsvolumen von 0,1 µl Antikörper eingestellt. Die Kapillarpumpe wurde auf eine Flussrate der Probe durch die Deglykosylierungs-Säule und die C8-Säule von 1 µl/min eingestellt. Diese Flussrate entspricht einer Deglykosylierungszeit von 8 s und bewirkt eine Deglykosylierung von 100 %. Als Lösemittel für die Beschickung und die Deglykosylierung wurde eine Lösung von 50 mM Natriumphosphat verwendet. Der Gradient für die schnelle Deglykosylierung und die Glykananalyse betrug 2 auf 32 % Lösemittel B in 1,5 min, 32 auf 75 % Lösemittel B in 30 s, wurde weitere 30 s lang auf 75 % Lösemittel B konstant gehalten und betrug anschließend während der letzten 30 s 75 auf 2 % Lösemittel B, wobei die Flussrate der Nanopumpe 300 nl/min betrug. Zur Trennung von Isomeren wurde der Gradient gedehnt.
Die getrennten Glykane wurden unter Verwendung eines QTOF-Tandem-Massenspektrometers mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle analysiert. Die Massenspektren wurden im positiven lonenmodus aufgezeichnet. Die Spannung der Abdeckung wurde auf 1750 V eingestellt und ein Trocknungsgas mit einer Temperatur von 325°C und einer Strömungsgeschwindigkeit von 8 L/min eingeleitet. Die Fragmentierungsspannung betrug 120 V. Die Trennkapillarspannung betrug 65 V. Die Daten wurden im 2 GHz-Modus erfasst.
Ergebnisse
Unter Verwendung des Chip und des Verfahrens, die oben beschrieben wurden, wurden Antikörperproben deglykosyliert und die entstandenen Glykane durch HPLC abgetrennt und massenspektrometrisch analysiert. Die erwarteten Glykane beinhalten folgende Spezies: Tabelle 1. Infrage kommende Glykane

Bezeichnung Struktur Glycanmasse Wichtigste lonenspezies [m/z+2]+2

G0
1462,54 732,27

G1'
1624,59 813,29

G1"

G2
1786,65 894,32

Mann-5
1234,43 618,21

Leerer Kreis: Galaktose
Quadrat: GlcNAc
Voller Kreis: Mannose
Dreieck: Fucose
7 (linke Seite) zeigt ein typisches Ergebnis der herkömmlichen, in Lösung durchgeführten Analyse, bei der die Probe über Nacht in Lösung durch PNGase F aufgespaltet wurde und die insgesamt 24 Stunden in Anspruch nahm. Von den Haupt-Peaks entsprechen die Peaks 303 und 305 den beiden Stereoisomeren (α- und β-Anomere) von G0, und die Peaks 304 und 306 den beiden Isomeren von G1, G1' und G1" (siehe Tabelle 1 oben). Alle diese Glykanspezies wurden im Zeitraum zwischen 3,4 und 3,7 Minuten eluiert. Außerdem sind noch die kleineren Peaks 301 und 302 zu sehen, die nach ungefähr 3,2 Minuten eluiert wurden. Die Ergebnisse der mit derselben Probe auf dem Chip durchgeführten Analyse unterschieden sich jedoch hiervon. Gemäß 7 (rechte Seite) lieferte die Probe einen markanten Peak (310) und zwei kleinere Peaks (311 und 312), die sämtlich um die 3,2 Minuten herum liegen. Zwischen 3,4 und 3,7 Minuten erschienen vier kleinere Peaks 313 bis 316, wo die Haupt-Peaks der in Lösung durchgeführten Analyse lagen. Es zeigt sich, dass die Positionen 313 bis 316 gut mit den Peaks 303 bis 306 der in Lösung durchgeführten Analyse übereinstimmen, wie auch die Peaks 310 und 311 ungefähr zur selben Zeit wie die Peaks 301 und 302 eluiert wurden.
Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen für die Analyse in Lösung und auf dem Chip lassen sich durch den Wirkmechanismus des Enzyms PNGase F und die effiziente Online-Verfahrensweise des Chip erklären. Rasmussen et al., 1992 (siehe 8), zufolge besteht die Wirkung des Enzyms PNGase F darin, dass es zuerst die C-N-Bindung der glykosylierten Asparagin-Seitenkette spaltet und der Asparaginrest dann in Asparaginsäure umgesetzt wird. Bei dem abgespalteten Glykan handelt es sich zunächst um ein Aminoglykan, jedoch wird die Aminogruppe unter Freisetzung von Ammoniak langsam zu einer Hydroxylgruppe hydrolysiert. Ausgehend von den Massen jedes Peak in 7 wurde angenommen, dass der Peak 310 dem Aminoglykan G0 entspricht, das nach langer Inkubationszeit zu Hydroxylglykanen (Peaks 313 und 315) hydrolysiert wird. Zur Überprüfung dieser Annahme wurde eine Zeitreihe gemessen, bei der die Probe für eine Dauer von 0, 15, 30, 60, 120 bzw. 240 Minuten in der Deglykosylierungs-Säule auf dem Chip belassen wurde. Dabei zeigte es sich, dass tatsächlich mit zunehmender Inkubationszeit die Intensität des Peak 310 abnahm und die Intensität der Peaks 313 und 315 zunahm. Desgleichen gingen auch die Peaks für G1 (304 und 306) bei der in Lösung durchgeführten Analyse zurück, während der Peak 311 zunahm. Somit ergibt sich auf der Grundlage der zeitlichen Änderungen und der Massen der Peaks die Schlussfolgerung (siehe 9), dass die Peaks 310, 311 und 312 Aminoglykanen und die Peaks 313 bis 316 Hydroxylglykanen entsprechen. Für jedes Hydroxylglykan gibt es zwei Peaks (313 und 315, sowie 314 und 316), da die Hydroxylglykane leicht zum α-Anomer und zum β-Anomer isomerisieren.
Die Online-Arbeitsweise des Chip trägt ebenfalls zur Wirksamkeit der Reaktion bei. Wenn eine Probe in die Deglykosylierungs-Säule eingeführt wird und diese durchläuft, gelangt jede „Front“ der Probe in Kontakt mit einem Überschuss an Enzym und wird augenblicklich aufgespaltet. Andererseits enthält das Inkubationsgemisch in der Lösung für jedes Substrat ein geringeres Enzym-Substrat-Verhältnis, und nach der Reaktion bleiben eine Vielzahl unvollständig umgesetzter Produkte zurück. Überdies laufen die gespalteten Glykane beim Online-Prozess weiter, werden in der Trap-Säule gebunden und werden in der Trennsäule getrennt. Somit bleiben die Glykane während des größten Teils der Zeit durch andere Moleküle gebunden und neigen weniger dazu, Isomere zu bilden oder andere chemische Reaktionen einzugehen.
Da die vorliegende Erfindung in der Lage ist, die Aminoglykane abzufangen, können die beiden Isomere von G1 wirksam getrennt werden. G1 liegt in zwei Isomeren vor (G1' Und G1" in Tabelle 1). Bisher war man der Meinung, dass G1' und G1" nur unter Verwendung eines sehr langen Gradienten getrennt werden können. Deshalb bestand bisher ein Problem darin, Glykangemische ohne großen materiellen und zeitlichen Aufwand für einen langen Trennschritt genau zu analysieren. Es wurde jedoch gefunden, dass die Aminoformen einfach getrennt werden können. Der folgende kurze Gradient wurde in der Trennsäule des in diesem Beispiel beschriebenen Chip verwendet, und G1' und G1" wurden in wenigen Minuten deutlich aufgelöst (10):

Zeit (min) % Lösemittel B

0 2

10 22

12 80

15 80

16 2
Diese Ergebnisse zeigen somit, dass die in dieser Beschreibung beschriebenen Chips nicht nur die für die Glykananalyse erforderliche Zeit erheblich verkürzen, sondern dass die von den Chips gewonnenen Daten die Strukturen der Glykane zuverlässiger wiedergeben. Außerdem wird zum Erreichen derselben Ergebnisse nur eine geringe Menge an eingesetzter Probe benötigt. Die bei diesem Beispiel eingesetzte Probe enthielt nur 100 ng Glycoproteine, und die Signale in den Massenspektren waren sehr intensiv. Deshalb kann auch eine kleinere Probenmenge verwendet werden.
BEISPIELHAFTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Folgendes:

A. Eine Mikrofluideinheit zum Entfernen von Kohlenhydraten aus einem Glykoprotein, wobei die Mikrofluideinheit aufweist:
- eine Deglykosylierungs-Säule, die ein festes Substrat und ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist, das Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann;
  - eine Trap-Säule, die Kohlenhydrate binden kann;
  - eine Trennsäule, die Kohlenhydrate trennen kann; und eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen;
- wobei die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit mit einem Schaltelement verbunden wird, das mindestens einen Kanal aufweist, die Kombination dieser Anschlüsse, Säulen und des mindestens einen Kanals ein Ventilsystem bildet, das zwischen mindestens einem ersten und einem zweiten Zustand umgeschaltet werden kann, wobei der erste Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule und der Trap-Säule und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule herstellt.
B. Die Mikrofluideinheit nach Ausführungsform A, die ferner eine Reinigungssäule zum Binden von Proteinen aufweist, wobei die Reinigungssäule so beschaffen ist, dass sie durch das Ventilsystem mit der Deglykosylierungs-Säule und/oder mit der Trap-Säule verbunden werden kann.
C. Die Mikrofluideinheit nach Ausführungsform A oder B, wobei als Enzym N-Glykosidase F verwendet wird.
D. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis C, wobei das feste Substrat in der Deglykosylierungs-Säule Perlen oder ein kompaktes Medium aufweist.
E. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis D, wobei als Trennsäule eine flüssigkeitschromatografische Säule dient.
F. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis D, wobei als Trennsäule eine kapillarelektrophoretische Vorrichtung dient.
G. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis F, die zwei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule in einer Ebene befindet und sich die Trap-Säule und die Trennsäule in der anderen Ebene befinden.
H. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen B bis F, die drei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule in einer ersten Ebene, die Reinigungssäule in einer zweiten Ebene befindet und sich die Trap-Säule und die Trennsäule in einer dritten Ebene befinden.
I. Ein System zum Analysieren einer Probe, wobei das System die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis H, das Schaltelement und ein Massenspektrometer aufweist.
J. Das System nach Ausführungsform I, wobei das Massenspektrometer eine Elektrospray-Ionenquelle aufweist.
K. Ein Verfahren zum Analysieren der Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen, wobei das Verfahren aufweist:
- Einführen einer Probe, die Glykoproteine aufweisen kann, in die Mikrofluideinheit von Ausführungsform A;
- Zerlegen der Glykoproteine in der Deglykosylierungs-Säule, um abgespaltete Kohlenhydrate zu erhalten;
- Binden der abgespalteten Kohlenhydrate in der Trap-Säule;
- Eluieren der abgespalteten Kohlenhydrate aus der Trap-Säule; und
- Trennen der abgespalteten Kohlenhydrate in der Trennsäule.
L. Das Verfahren nach Ausführungsform K, das ferner nach dem Zersetzen das Entfernen der Proteine mit einer Reinigungssäule aufweist, die in der Lage ist, Proteine zu binden.
M. Das Verfahren von Ausführungsform K oder L, wobei die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Flüssigkeitschromatographie getrennt werden.
N. Das Verfahren von Ausführungsform K oder L, wobei die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Kapillarelektrophorese getrennt werden.
O. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K bis N, wobei das Verfahren ferner das Analysieren der abgespalteten Kohlenhydrate unter Verwendung der Massenspektrometrie aufweist.
P. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K bis O, wobei die Probe bis zu 50 ng Glykoproteine enthält.
Q. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K bis P, wobei das Verfahren innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen ist.
R. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K bis Q, das unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen zumindest einige der abgespalteten Kohlenhydrate in Form von Aminoglykanen verbleiben und die Aminoglykan-Strukturen in der Trennsäule getrennt werden. Vorzugsweise verbleibt ein wesentlicher Anteil der abgespalteten Kohlenhydrate in Form von Aminoglykanen.
S. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K bis R, wobei die Glykoproteine mittels N-Glykosidase F zersetzt werden.
T. Eine Ausrüstung zur Glykananalyse, welche die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen A bis H und mindestens ein Reagens zum Verdünnen der Probe oder zum Eluieren einer Säule aufweist.

LITERATUR

Palm und Novotny (2005), „A monolithic PNGase F enzyme microreactor enabling glycan mass mapping of glycoproteins by mass spectrometry,“ Rapid Comm. Mass Spectrometry 19: S. 1730-1738.
Rasmussen et al. (1992), „Identification and derivatization of (oligosaccharyl)amines obtained by treatment of asparagine-linked glycopeptides with N-GLYCANASE enzyme,“ J. Am. Chem. Soc., 114(3): S. 1124 - 1126.
Becker et al. (1986), „Fabrication of Microstructures with High Aspect Ratios and Great Structural Heights by Synchrotron Radiation Lithography Galvanoforming, and Plastic Moulding (LIGA Process),“ Microelectronic Engineering 4(1), S. 35 bis 36.
Ehrfeld et al. (1988), „1988 LIGA Process: Sensor Construction Techniques via X-Ray Lithography,“ Tech. Übersichtsartikel vom IEEE Solid-State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head, SC.
Guckel et al. (1991), J. Micromech. Microeng. 1, S. 135-138.
Znotins et al. (1987), Laser Focus Electro Optics, S. 54-70.
US 6 702 256 B2 US 5 291 226 A und US 5 305 015 A .
US 2006/0171855 A1 .

Alle oben oder an beliebiger Stelle in dieser Patentanmeldung erwähnten Veröffentlichungen, Patentschriften und Patentanmeldungen sind hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit im selben Umfang aufgenommen, als ob die Darlegung jeder einzelnen Veröffentlichung, Patentanmeldung oder Patentschrift besonders und einzeln gekennzeichnet wäre, dass sie in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Es wurde eine Anzahl von Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Ungeachtet dessen sollte klar sein, dass daran verschiedene Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

Mikrofluideinheit (101) zum Entfernen von Kohlenhydraten von einem Glykoprotein, wobei die Mikrofluideinheit (101) aufweist: eine Deglykosylierungs-Säule (110), die ein festes Substrat und ein auf dem festen Substrat immobilisiertes Enzym aufweist, wobei das Enzym Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann; eine Trap-Säule (120), die Kohlenhydrate binden kann; eine Trennsäule (130), die Kohlenhydrate trennen kann; und eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen (141-146); wobei die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit (101) mit einem Schaltelement verbunden wird, das mindestens einen Kanal (151, 153, 155) aufweist, die Kombination der Anschlüsse, Säulen und des mindestens einen Kanals ein Ventilsystem bildet, das zwischen mindestens einem ersten und einem zweiten Zustand umgeschaltet werden kann, wobei der erste Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule (110) und der Trap-Säule (120) und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule (120) und der Trennsäule (130) herstellt.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, die ferner eine Reinigungssäule (115) zum Binden von Proteinen aufweist, wobei die Reinigungssäule (115) so beschaffen ist, dass sie durch das Ventilsystem mit der Deglykosylierungs-Säule (110) und/oder mit der Trap-Säule (120) verbunden werden kann.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, wobei als Enzym N-Glykosidase F verwendet wird.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, wobei das feste Substrat in der Deglykosylierungs-Säule (110) Perlen oder ein kompaktes Medium aufweist.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Trennsäule (130) um eine flüssigkeitschromatografische Säule handelt.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Trennsäule (130) um eine Kapillarelektrophorese-Vorrichtung handelt.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, die zwei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule (110) in einer Ebene befindet und sich die Trap-Säule (120) und die Trennsäule (130) in der anderen Ebene befinden.
Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 2, die drei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule (110) in einer ersten Ebene und die Reinigungssäule (115) in einer zweiten Ebene befindet und sich die Trap-Säule (120) und die Trennsäule (130) in einer dritten Ebene befinden.
System zum Analysieren einer Probe, wobei das System die Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1, das Schaltelement und ein Massenspektrometer aufweist.
System nach Anspruch 9, wobei das Massenspektrometer eine Elektrospray-Ionenquelle aufweist.
Verfahren zum Analysieren der Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen, wobei das Verfahren aufweist: Einführen einer Probe, die Glykoproteine aufweisen kann, in die Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1; Zersetzen der Glykoproteine in der Deglykosylierungs-Säule (110), um abgespaltete Kohlenhydrate zu erhalten; Binden der abgespalteten Kohlenhydrate in der Trap-Säule (120); Eluieren der abgespalteten Kohlenhydrate aus der Trap-Säule (120); und Trennen der abgespalteten Kohlenhydrate in der Trennsäule (130).
Verfahren nach Anspruch 11, das ferner nach dem Zersetzen das Entfernen der Proteine mittels einer Reinigungssäule (115) aufweist, die in der Lage ist, Proteine zu binden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Flüssigkeitschromatographie getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Kapillarelektrophorese getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren ferner das Analysieren der abgespalteten Kohlenhydrate unter Verwendung der Massenspektrometrie aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Probe bis zu 50 ng Glykoproteine enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, das unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen zumindest einige der abgespalteten Kohlenhydrate in Form von Aminoglykanen verbleiben und die Aminoglykan-Strukturen in der Trennsäule (130) getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Glykoproteine mittels Enzym N-Glykosidase F zerlegt werden.
Ausrüstung zur Glykananalyse, welche die Mikrofluideinheit (101) nach Anspruch 1 und mindestens ein Reagens zum Verdünnen der Probe oder zum Eluieren einer Säule aufweist.