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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Analyse der Struktur und Funktion von Glykoproteinen, die unter
der Bezeichnung Glykomik bekannt ist, hat sich zu einem neuen und
wichtigen Forschungsbereich entwickelt. Die Glykosylierung stellt
die häufigste posttranslationale Modifizierung der Proteine
an der Zelloberfläche und der extrazellulären
Matrix dar. Glykoproteine spielen bei der Adhäsion an der
Zelle und für die Immunantwort eine wichtige Rolle. Änderungen
der Häufigkeit und der Profile von Glykanen sind mit dem
Verlauf von Krankheiten wie Krebs und rheumatoide Arthritis korreliert
worden. Außerdem ist die Analyse der Glykanprofile für
die biotherapeutische Industrie von großer Bedeutung. Zum
Beispiel enthalten biotherapeutische Antikörper glykosylierte
Aminosäuren, welche dazu beitragen, die Aktivität
von Medikamenten aufrechtzuerhalten und die Unterdrückung
der Wirksamkeit von Medikamenten durch das Immunsystem zu verhindern.
Deshalb müssen Unternehmen, welche diese Biotherapeutika
herstellen, deren Glykanprofile überwachen und prüfen.
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Die
Glykananalyse erfolgt üblicherweise durch Verfahren wie
die Kapillarelektrophorese oder die Massenspektrometrie. In beiden
Fällen müssen die Glykane von den Glykoproteinen
entfernt, getrennt und analysiert werden. Der Prozess des Entfernens
der Glykane von den Glykoproteinen beinhaltet herkömmlicherweise eine
enzymatische Reaktion mit PNGase F in Lösung, die eine
Inkubationszeit von 24 Stunden erfordert. Nach der enzymatischen
Reaktion müssen die Proteine abgeschieden werden, um die
Glykane von den Proteinen zu trennen und dann zu analysieren. Abschließend
werden die freien Glykane mittels Massenspektrometrie oder Kapillarelektrophorese
analysiert. Diese Schritte sind sehr zeitaufwendig und umständlich,
und die manuelle Behandlung ist fehleranfällig. Außerdem
wird eine große Menge an Ausgangsmaterial benötigt,
um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Deshalb ist eine bessere
Vorgehensweise bei der Durchführung der Glykananalyse wünschenswert.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A ist
eine schematische Darstellung der Draufsicht auf einen Mikrofluid-Chip,
der zur Glykananalyse von Glykoproteinen verwendet werden kann. 1B ist
eine schematische Darstellung der Draufsicht auf ein Schaltelement
in Form einer Drehscheibe, die mit dem in 1A gezeigten
Chip verbunden werden kann. 1C zeigt
einen Zustand eines Ventilsystems, das gebildet wird, wenn der Chip
von 1A mit der Drehscheibe von 1B verbunden
wird. In diesem Zustand ist die Trap-Säule mit der Deglykosylierungssäule
verbunden. 1D zeigt einen anderen Zustand
des Ventilsystems, in dem die Trap-Säule mit der Trennsäule
verbunden ist.
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2 zeigt
zwei Ebenen eines Mikrofluid-Chip.
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3 ist
eine dreidimensionale Darstellung, in der gezeigt wird, wie die
Deglykosylierung und Glykananreicherung in einer Mikrofluideinheit
gemäß der vorliegenden Patentanmeldung erfolgt.
Ferner sind einige Kanäle eines mit der Mikrofluideinheit
verbundenen Schaltelements gezeigt.
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4 zeigt
eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit in einer Schaltstellung,
in der gesammelte Glykane zu einer Trennsäule geleitet
werden. Ferner sind einige Kanäle gezeigt, die von einem
mit der Mikrofluideinheit verbundenen Schaltelement führen.
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Die 5 und 6 zeigen
eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit, die drei
Ebenen aufweist. Ferner sind einige Kanäle gezeigt, die
von einem mit der Einheit verbundenen Schaltelement führen.
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7 zeigt
das Massenspektrum einer Antikörperprobe, die auf dem Chip
(rechts) oder in Lösung (links) bearbeitet wurde.
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8 zeigt
den chemischen Ablauf der enzymatischen Reaktion von PNGase F.
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9 zeigt
die Übereinstimmung der Glykane, die den Peaks der in 7 gezeigten
Massenspektren entsprechenden.
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10 zeigt
die Trennung von isomeren Glykanen G1' und G1'' nach einem kurzen
Gradienten in der Flüssigkeitschromatografie.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neues, schnelles und elegantes
Verfahren zum Herstellen, Trennen und Analysieren von Glykanen unter
Verwendung einer Mikrofluideinheit bereit. Darüber hinaus
wird aufgrund der Bauart der Mikrofluideinheit dieser Erfindung
im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren eine höhere Ausbeute
an Glykanen und eine ausgezeichnete chemische Trennung von Isomeren
erreicht sowie eine wesentlich geringere Menge an Ausgangsmaterialien
benötigt.
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Vor
der detaillierten Beschreibung der Erfindung werden, falls nicht
anderweitig dargestellt, die in dieser Patentanmeldung gebrauchten
Begriffe definiert.
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Definitionen
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In
dieser Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen
beinhalten die Einzahlformen ”ein”, ”eine” und ”der,
die, das” auch die Mehrzahlbedeutung, sofern aus dem Zusammenhang
nicht ausdrücklich anderes hervorgeht.
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Eine ”Mikrofluideinheit” ist
eine Einheit, die Kammern und/oder Kanäle mit Mikrometer-
oder Submikrometerabmessungen aufweist, durch welche eine Flüssigkeit
fließen kann. Die Kammern oder Kanäle weisen einen
Durchmesser (oder, wenn diese nicht kreisrund sind, eine größte
Abmessung des Querschnitts) auf, der im Allgemeinen zwischen 1 μm
und weniger als 1000 μm beträgt, zum Beispiel
1 μm bis 500 μm, 10 μm bis 300 μm
oder 50 μm bis 250 μm.
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Eine ”Säule” ist
eine Vorrichtung für einen bestimmten Zweck, die normalerweise
zum Binden oder Zurückhalten vorzugsweise einer Substanz
oder einer Substanzklasse dient. Üblicherweise weist eine
Säule ein Gehäuse auf, in dem sich eine Füllung
befindet, wobei die Füllung in der Lage ist, vorzugsweise
eine Substanz oder eine Substanzklasse zu binden oder zurückzuhalten.
Bei einigen Ausführungsform kann die Füllung einfach
nur ein Medium darstellen, durch welches sich verschiedene Substanzen
bewegen, die sich (z. B. aufgrund eines elektrischen Feldes) mit
unterschiedlicher Geschwindigkeit vorwärts bewegen. Eine
Säule (oder ein Gehäuse oder eine Füllung)
kann eine beliebige Größe, Form oder Struktur
aufweisen und aus einem beliebigen Material hergestellt sein, das
für den Verwendungszweck der Säule geeignet ist.
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Im
vorliegenden Zusammenhang kann das ”Verbinden” durch
direkte oder indirekte Verbindungen erfolgen. Unter einer direkten
Verbindung ist zu verstehen, dass zwei miteinander verbundene Objekte
in physischem Kontakt miteinander stehen. Unter einer indirekten
Verbindung ist zu verstehen, dass zwei miteinander verbundene Objekte
nicht in physischem Kontakt miteinander stehen, sondern über
mindestens ein dazwischen liegendes Objekt miteinander verbunden
sind.
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Eine ”Fluidverbindung” zwischen
zwei Objekten bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass zwischen
den beiden Objekten eine Leitung besteht, durch welche ein Fluid
von einem zum anderen Objekt fließen kann. Als Leitung
kann eine Pore, ein Durchgang, eine Öffnung, ein Kanal,
eine Röhre oder Ähnliches dienen.
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Der
Begriff ”Kohlenhydrat” bezieht sich auf jede Verbindung
aus der Gruppe der Kohlenhydrate, darunter Zucker, Disaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, einfache Kohlenhydrate, komplexe
Kohlenhydrate und Ähnliches.
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Mikrofluideinheit und mikrofluidische
Verfahren
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1A veranschaulicht
eine beispielhafte Einheit 101 gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Einheit 101 weist
eine Deglykosylierungs-Säule 110 zum Abspalten
der Glykane aus den Glykoproteinproben, eine Trap-Säule 120 zum
Binden und Anreichern der abgespalteten Glykane und eine Trennsäule 130 zum
Trennen der Glykane auf. Obwohl die Zeichnungen für die
Einheit 101 und jede ihrer Komponenten eine bestimmte Form
zeigen, können für diese Erfindung veränderte
Formen oder relative Abmessungen verwendet werden. Desgleichen sind
die anderen in dieser Beschreibung beschriebenen Einheiten und Komponenten
nicht auf die in den Zeichnungen dargestellten Formen und Abmessungen
beschränkt.
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Die
Deglykosylierungs-Säule 110 weist ein festes Substrat
auf, auf welchem ein Enzym fixiert ist, das Kohlenhydrate von einem
Glykoprotein abspalten kann. Bei den meisten Glykoproteinen hängt
der Kohlenhydratanteil am Stickstoff der Amidgruppe von Asparaginresten
(N-terminale Glykane) oder am Sauerstoff der Hydroxylgruppe in Serin-
oder Threoninresten (O-terminale Glykane). Bei der vorliegenden
Erfindung kann jedes Enzym verwendet werden, welches den Kohlenhydratanteil
von Glykoproteinen abspalten kann, einschließlich solcher
Enzyme, die speziell auf N-terminale oder O-terminale Glykane ausgerichtet
sind. Diese Enzyme sind nach dem Stand der Technik bekannt und beinhalten,
ohne darauf beschränkt zu sein, PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase,
Endo F1, Endo F2,
Endo F3, und Endo H. Ebenso sind Materialien
und Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf festen Substraten
nach dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Palm und Novotny,
2005). Zum Beispiel können als festes Substrat in der Deglykolisierungs-Säule 110 Glas-
oder Polymerperlen oder ein kompaktes Medium (zum Beispiel Polymethacrylat,
Polystyrol, Polyacrylamid oder Ähnliches) verwendet werden.
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Die
Trap-Säule 120 ist in der Lage, anstelle von Proteinen
vorzugsweise Kohlenhydrate zu binden. Zum Beispiel kann zum Zurückhalten
und Entsalzen der in der Deglykosylierungs-Säule freigesetzten
Glykane eine in der Flüssigkeitschromatografie übliche,
hydrophil wirkende stationäre Phase (HILIC) verwendet werden.
Die Trennsäule 130 ist in der Lage, aufgrund ihrer
physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften Glykane voneinander
zu trennen. Es gibt zwei Hauptarten von Trennsäulen: Flüssigkeitschromatografie-Säulen
und Kapillarelektrophorese-Säulen.
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Die
Einheit 101 enthält auch eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen 141 bis 146.
Ein Eingangs-/Ausgangsanschluss (oder ”Anschluss”)
kann ein Loch, ein Durchgang oder eine Öffnung sein, die
jeweils mit einer Leitung (insbesondere mit einer Kurzschlussleitung)
oder Ähnlichem verbunden ist, soweit der Anschluss den
Transport des Fluids von einem zum anderen Ende des Anschlusses
ermöglicht. Die Anschlüsse 141 bis 146 können
in verschiedenen Arbeitsphasen zum Verbinden diverser Teile der
Mikrofluideinheit 101 miteinander verwendet werden, wenn
die Mikrofluideinheit mit entsprechenden Kanälen zur Deckung
gebracht und mit diesen verbunden wird. Zum Beispiel kann die Mikrofluideinheit 101 über
einer Drehscheibe 150 angebracht werden, die drei Kanäle 151, 153 und 155 aufweist
(1B). Die Drehscheibe 150 kann so gedreht werden,
dass durch jeden Kanal in der Drehscheibe jeweils verschiedene Anschlüsse
in der Einheit 101 miteinander verbunden werden, wenn sich
die Drehscheibe in einer anderen Stellung befindet. Zum Beispiel
kann die Drehscheibe in eine Stellung gedreht werden, in der die
Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 141 und 142 durch
den Kanal 151 miteinander verbunden sind (10).
In dieser Stellung sind auch die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 143 und 144 (durch
den Kanal 153) und die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 145 und 146 (durch
den Kanal 155) miteinander verbunden. Eine Probe, die Glykoproteine
enthält oder enthalten kann, wird durch den Eingangsanschluss 111 in
die Deglykosylierungs-Säule 110 eingeführt.
Die Glykoproteine werden in der Deglykosylierungs-Säule 110 zerlegt,
aus der die freien Glykane und der verbleibende Teil der Glykoproteine
austreten. Dieses Gemisch fließt bis zum Ende der Deglykosylierungs-Säule,
die mit dem Anschluss 141 verbunden ist und tritt durch
den Kanal 151 in die Trap-Säule 120 ein.
In der Trap-Säule 120 werden die Glykane an die
kohlenhydratbindende Substanz gebunden, während die übrigen
Komponenten des Gemischs durch die Säule fließen und
gesammelt oder über den Kanal 155 entsorgt werden.
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Dann
wird das System in eine andere Stellung umgeschaltet (siehe 1D),
in der die folgenden Eingangs-/Ausganganschlüsse miteinander
verbunden werden: Anschluss 142 mit Anschluss 143,
Anschluss 144 mit Anschluss 145 und Anschluss 146 mit
Anschluss 141. Dadurch stehen die Trap-Säule 120 und
die Trennsäule 130 nunmehr über den Kanal 153 in
Fluidverbindung miteinander, sodass die Deglykosylierungs-Säule 110 nicht
mehr mit der Trap-Säule 120 verbunden ist. Über
den Anschluss 143 kann eine Elutionslösung in
die Trap-Säule 120 eingeführt werden,
und das Eluat fließt vom Anschluss 145 zum Anschluss 144 und
tritt dann in die Trennsäule 130 ein. In der Trennsäule 130 werden
dann die Glykane voneinander getrennt. Der Ausgang der Trennsäule 130 kann
mit dem Probeneingang eines Massenspektrometers verbunden werden,
um die Glykane massenspektrometrisch weiter zu analysieren.
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Obwohl
oben eine Drehscheibe als Schaltelement zum Wechseln des Zustands
der Fluidverbindung zwischen den Säulen in der Einheit
beschrieben wird, können auch andere Schaltelemente verwendet
werden. Zum Beispiel können eine Reihe von Kanälen
und Ventilen so mit der Einheit 101 verbunden werden, dass beim
Schalten eines oder mehrerer Ventile die Deglykosylierungs-Säule
von der Trap-Säule getrennt und diese mit der Trennsäule
verbunden wird.
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Bei
einigen Ausführungsformen werden die Deglykosylierungs-Säule 110 und
die Trap-Säule 120 kontinuierlich betrieben. Zum
Beispiel kann die Einheit 101 anstelle von zwei diskontinuierlich
betriebenen Säulen 110 und 120 eine Kammer
haben, die ein Deglykosylierungsmaterial (ein auf einem festen Substrat
immobilisiertes Deglykosylierungsenzym) in einem ersten Teil der
Kammer, welcher eine Deglykosylierungs-Säule darstellt,
und ein Bindungsmaterial (das anstelle von Proteinen vorzugsweise
Kohlenhydrate bindet) im anderen Teil der Kammer aufweist, welcher
eine Trap-Säule darstellt. Gemäß einem
weiteren Beispiel kann eine Deglykosylierungs-Säule über
einen Durchgang oder eine Leitung in der Einheit 101 so
mit einer Trap-Säule verbunden sein, dass zwischen den
beiden Säulen in der Struktur der Mikrofluideinheit 101 eine
Fluidverbindung besteht. Bei diesen Ausführungsformen kann
ein einfacheres Schaltelement verwendet werden, welches die Deglykosylierungs-Säule
nicht mit der Trap-Säule zu verbinden braucht. Denkbar
ist, dass das Schaltelement als Mindestausstattung einen Kanal und
ein Ventil zur Steuerung des Kanals aufweisen kann, wobei der Kanal so
angeordnet werden kann, dass er die Trap-Säule und die
Trennsäule miteinander verbindet. Wenn das Ventil abgeschaltet
ist, besteht zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule
keine Fluidverbindung. In diesem Zustand können das Einführen
der Probe, die Deglykosylierung und die Anreicherung der Glykane
(Binden) erfolgen. Dann wird das Ventil eingeschaltet, um die Fluidverbindung
zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule herzustellen,
die Trap-Säule zu eluieren und die Glykane zu trennen.
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Bei
einigen Ausführungsformen sind verschiedene Teile der Einheit
in verschiedenen Ebenen oder Chips angeordnet, die in geeigneter
Weise zusammengefügt die Einheit bilden (siehe z. B. die
US-Patentanmeldung Nr. 2006/0171855). Zum Beispiel zeigt 2 einen
Chip 210, der die Trap-Säule 120 und
die Trennsäule 130 enthält. Ein weiterer
Chip (”Deglykosylierungs-Chip”) 220 enthält
die Deglykosylierungs-Säule. Der Deglykosylierungs-Chip 220 kann
zum Beispiel durch mechanisches Anheften auf der Oberseite des Chip 210 so
mit diesem verbunden werden, dass zwischen dem Eingangs-/Ausgangsanschluss 141 des
Chip 210 und dem Anschluss 141' des Deglykosylierungs-Chip 220 eine
Fluidverbindung entsteht. Dabei ist zu beachten, dass der Deglykosylierungs-Chip 220 bei
dieser Ausführung für die Eingangs-/Ausgangsanschlüsse 144 und 145 keine
passenden Gegenöffnungen aufweist, da die Anschlüsse 144 und 145 für
die Verbindung zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule
benötigt werden, die sich auf dem Chip 210 befinden.
Der Chip 220 kann jedoch entsprechende Gegenöffnungen
(143' und 146') für die Eingangsanschlüsse 143 und 146 aufweisen, die
ausschließlich zur Justierung dienen. Wenn die Chips 210 und 220 zusammengesetzt
werden, wird also der Anschluss 143 mit dem Anschluss 143' und
der Anschluss 146 mit dem Anschluss 146' zur Deckung
gebracht.
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Im
Betriebszustand ist die komplette Zwei-Chip-Einheit mit einem mehrere
Kanäle enthaltenden Schaltelement verbunden, zum Beispiel
mit der in 1B gezeigten Drehscheibe. In
den Eingangsanschluss 111, der als Eingang in die Deglykosylierungs-Säule 110 dient,
wird eine Probe eingeführt. Nach der Deglykosylierung fließt
das Reaktionsgemisch nacheinander zum Eingangs-/Ausgangsanschluss 141,
zum Eingangs-/Ausgangsanschluss 141' auf dem Chip 210,
der mit dem Anschluss 141 verbunden ist, dann zu einem Kanal
in der Drehscheibe, der den Anschluss 141' mit dem Anschluss 142 verbindet,
dann zum Anschluss 142 und schließlich zur Trap-Säule 120.
Nach dem Fixieren in der Trap-Säule wird die Drehscheibe
weitergedreht, um (durch einen Kanal in der Drehscheibe, der die
Anschlüsse 144 und 145 miteinander verbindet)
eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule 120 und
der Trennsäule 130 herzustellen, und die Glykane
werden in der oben beschriebenen Weise eluiert und getrennt.
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Die 3 und 4 zeigen
dreidimensionale Ansichten zur Funktionsweise einiger Ausführungsformen
von Trenneinheiten mit zwei Ebenen in Verbindung mit einem Schaltelement.
Gemäß der Darstellung in 3 wird die
Probe in den Eingangsanschluss 111 injiziert, um in die
Deglykosylierungs-Säule zu gelangen, die bei der Ausführungsform
in dieser Figur die Form einer Leitungsschleife aufweist. Gezeigt
sind nur der Anfangs- und der Endteil der Leitungsschleife. Diese
spezielle Ausführungsform unterscheidet von der in 2 gezeigten
dadurch, dass sich der Anschluss 141 unterhalb des Eingangsanschlusses 111 befindet,
und sie stellt eine Abwandlung dar, die derselben Funktion dient.
Die aus der Deglykosylierungs-Säule austretende Probe wird
durch den Kanal 151 in die Trap-Säule geleitet,
in der die Glykan-Anreicherung erfolgt und die sich in einer Ebene
unterhalb der Deglykosylierungs-Säule befindet. Proteine
ohne Kohlenhydratanteil fließen durch die Trap-Säule
und verlassen diese durch den Kanal 155. In 4 wird
die Trap-Säule (durch Umschalten eines in der Figur nicht
vollständig dargestellten Schaltelements) mit den Kanälen 151 und 153 verbunden und
durch den Kanal 151 eine Elutionslösung in die
Trap-Säule eingeführt, sodass die Glykane aus
der Trap-Säule eluiert werden und durch den Kanal 153 in
die Trennsäule gelangen.
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Bei
einigen Ausführungsformen weist die Mikrofluideinheit ferner
eine Reinigungssäule auf, die anstelle der Kohlenhydrate
vorzugsweise Proteine binden kann. Zum Beispiel werden die Proteine
durch eine C18- oder C8-Packung oder andere unpolare Umkehrphasen
zurückgehalten, während die freien Glykane ungehindert
durchfließen. Zum Binden von Proteinen wie beispielsweise
Antikörpern kann ein Protein A verwendet werden, das anstelle
der Glykane den Antikörper bindet. Die in der Reinigungssäule
gebundenen Proteine können entweder entsorgt oder analysiert
werden, um das Proteinprofil und den Proteingehalt in der Probe
zu ermitteln. Diese Ausführungsformen weisen Eingangs-/Ausgangsanschlüsse
auf, die zusammen mit einem Schaltelement gleichzeitig oder nacheinander
die Verbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule und
der Reinigungssäule sowie zwischen der Reinigungssäule
und der Trap-Säule herstellen können. Es ist bei
einigen Ausführungsformen auch denkbar, dass gleichzeitig
oder nacheinander die Deglykosylierungs-Säule mit der Trap-Säule
und die Trap-Säule mit der Reinigungssäule verbunden
werden kann. Somit können bei einigen Ausführungsformen
alle drei Säulen gleichzeitig in der Reihenfolge Deglykosylierungs-Säule – Reinigungssäule – Trap-Säule
oder Deglykosylierungs-Säule – Trap-Säule – Reinigungssäule
miteinander verbunden werden.
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Die 5 und 6 zeigen
eine dreidimensionale Ansicht einer Mikrofluideinheit mit drei Ebenen,
die eine Reinigungssäule aufweist. Die erste Ebene beinhaltet
eine Deglykosylierungs-Säule 110, die mittlere
Ebene eine Protein-Reinigungssäule 115 und die
untere Ebene eine Trap-Säule 120 sowie eine Trennsäule 130. Die
Figuren zeigen auch drei von einem Schaltelement ausgehende Kanäle.
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Beispiel
1 beschreibt Experimente, bei denen die in den 5 und 6 dargestellte
Ausführungsform zum Analysieren der Glykanzusammensetzungen
in der Probe eines Antikörpers verwendet wurde. Die Ergebnisse
zeigen, dass die Mikrofluideinheit der vorliegenden Erfindung eine
schnelle Analyse ermöglicht, bei der die ursprüngliche
chemische Struktur der Glykane erhalten bleiben kann. Eine parallel
dazu in Lösung durchgeführte herkömmliche
Analyse hingegen zeigt, dass sich die chemischen Strukturen der
Glykane bei der herkömmlichen Analyse während
der langen Inkubationszeit verändert haben. Überraschenderweise
können Isomere der Glykane, die nun in ihren ursprünglichen
Strukturen (Aminoglykan-Strukturen) vorliegen, in der Trennsäule
viel besser aufgelöst werden, während bisher ein
längerer und zeitaufwendiger und somit kostspieliger Trennprozess
zum Trennen der Isomere erforderlich war, was bis jetzt ein großes
Problem darstellte.
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Die
Geschwindigkeit der vorliegenden Verfahren hängt von der
Komplexität der Proben ab, da die Trennung umso länger
dauert, je mehr Glykane getrennt werden müssen. Wenn außerdem,
wie bei der Trennung von Isomeren, eine feinere Trennung gewünscht
ist, ist eine längere Trennsäule und somit ebenfalls
eine längere Trenndauer erforderlich. Durch die vorliegenden
Verfahren kann der Prozess der Deglykosylierung, Reinigung, Fixierung
und Trennung im Allgemeinen in einem Zeitraum von einer Minute bis
zu einer Stunde abgewickelt werden, zum Beispiel in 1, 2, 3, 4,
5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Minuten. Bei einigen
Ausführungsformen kann der Prozess unter Bedingungen durchgeführt
werden, bei denen ein wesentlicher Anteil der Glykane in Form von
Aminoglykanen erhalten bleibt. Dieser wesentliche Anteil kann zum
Beispiel mindestens 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40 oder 30% der Glykane
in der Probe betragen.
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Die
Ergebnisse zeigen auch, dass eine geringe Probenmenge (100 ng Glykoproteine)
starke Signale lieferte, sodass die Probenmenge durchaus verringert
werden kann. Somit können die vorliegenden Verfahren bei
einigen Ausführungsformen dazu verwendet werden, eine Probe
mit einem Gehalt von bis zu 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder
100 ng Glykoproteinen zu analysieren.
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Somit
stellen einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
Mikrofluideinheiten bereit, die üblicherweise die Form
von Chips haben und Folgendes aufweisen:
eine Deglykosylierungs-Säule,
die ein festes Substrat und ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist,
das Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann.
eine Trap-Säule,
die Kohlenhydrate binden kann;
eine Trennsäule, die
Kohlenhydrate trennen kann; und
eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen;
wobei
die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit
mit einem Schaltelement zur Deckung gebracht wird, das einen Kanal
oder eine Vielzahl von Kanälen aufweist, die Kombination
dieser Anschlüsse, Säulen und Kanäle
ein Ventilsystem bildet, das mindestens zwischen einem ersten und
einem zweiten Zustand umgeschaltet werden kann, wobei der erste
Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Deglykosylierungs-Säule
und der Trap-Säule und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung
zwischen der Trap-Säule und der Trennsäule herstellt.
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Die
Mikrofluideinheit kann ferner wahlweise eine Reinigungssäule
aufweisen, die Proteine zu binden vermag. Die Reinigungssäule
kann zum Binden und Entsorgen von Proteinen verwendet werden, die
bei Glykananalysen stören können. Alternativ kann
die Reinigungssäule dazu eingesetzt werden, zusätzlich
zur Glykananalyse auch Proteine für eine Proteinanalyse
zu gewinnen.
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Bei
einigen anderen Ausführungsformen kann die Mikrofluideinheit
unter Wegfall der Trap-Säule eine Deglykosylierungs-Säule,
eine Reinigungssäule und eine Trennsäule aufweisen.
Diese Ausführungsformen gliedern sich in zwei Gruppen.
Eine Gruppe kann zur Proteinanalyse eingesetzt werden, wobei die
Trennsäule nicht für die Kohlenhydrat-, sondern
für die Proteintrennung geeignet ist. In Verbindung mit
dieser Gruppe muss ein Schaltelement verwendet werden, das die Reinigungssäule
mit der Trennsäule verbinden kann. Die andere Gruppe kann
für eine abgekürzte Glykananalyse eingesetzt werden,
bei der auf die Glykananreicherung verzichtet wird. Ausführungsformen
aus dieser Gruppe weisen eine Trennsäule zur Trennung von
Kohlenhydraten auf.
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Mikrofluideinheiten
werden üblicherweise durch Erzeugen von Kanälen
und Kammern in einem Material hergestellt, welches die Mikrofluideinheit
oder deren Ebenen bildet. Geeignete Werkstoffe zur Bildung der Mikrofluideinheit
oder deren Ebenen werden unter Berücksichtigung der physikalischen
und chemischen Eigenschaften ausgewählt, die für
das ordnungsgemäße Funktionieren der Mikrofluideinheit
wünschenswert sind. Zum Beispiel wird eine Mikrofluideinheit
aus einem Werkstoff hergestellt, in welchem Strukturmerkmale mit
hoher Auflösung, d. h. Mikrokanäle, Mikrokammern
und Ähnliches mit Abmessungen im Mikrometer- oder Submikrometerbereich,
gebildet werden können. Daher muss das Material durch Mikrofabrikationsprozesse, z.
B. durch Trockenätzen, Nassätzen, Laserätzen,
Laserablation, Spritzgussverfahren, Prägen oder Ähnliches, bearbeitet
werden können, um die gewünschten Mikrostrukturen
in der Oberfläche zu erzeugen. Mikrostrukturen können
auf einer Materialoberfläche auch durch Auftragen von Materialien
gebildet werden, zum Beispiel können auf der Oberfläche
eines Glassubstrats Polymerkanäle lithografisch unter Verwendung
von Polyimid gebildet werden. Ferner müssen alle für
die Mikrofluideinheit verwendeten Werkstoffe gegenüber
allen Substanzen chemisch inert und physikalisch stabil sein, mit
denen sie beim Einführen einer Fluidprobe in Kontakt kommen
(z. B. gegenüber deren pH-Wert, elektrischen Feldern usw.).
Als Werkstoffe zur Bildung der vorliegenden Mikrofluideinheiten
sind unter anderem, aber nicht ausschließlich, Polymerwerkstoffe,
Keramik (einschließlich Aluminiumoxid und Ähnlichem),
Glas, Metalle, Verbundwerkstoffe und deren Laminate geeignet.
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Als
Polymerwerkstoffe dienen in der Regel organische Polymere in Form
von Homo- oder Copolymeren, die in der Natur vorkommen oder synthetisch
hergestellt werden und die vernetzt oder unvernetzt sind. Von besonderem
Interesse sind unter anderem, aber nicht ausschließlich,
Polyimide, Polycarbonate, Polyester, Polyamide, Polyether, Polyurethane,
Polyfluorkohlenstoffe, Polystyrole, Poly(acrylnitril-butadien-styrol)(ABS),
Acrylat- und Acrylsäurepolymere wie beispielsweise Polymethylmethacrylat
und andere substituierte und nichtsubstituierte Polyolefine und
deren Copolymere. Von besonderem Interesse sind Polyimide, die sich
in vielen Fällen als äußerst brauchbares
Substratmaterial bewährt haben. Auch Polyetheretherketone (PEEK)
weisen eine geeignete Resistenz gegen Biofouling auf.
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Die
Mikrofluideinheiten der Erfindung können auch aus einem ”Komposite” (engl.
composite), d. h. aus einem Verbund verschiedener Materialien, hergestellt
werden. Das Komposite kann aus einem Blockverbund bestehen, z. B.
einem A-B-A- Blockverbund, einem A-B-C-Blockverbund oder Ähnlichem.
Alternativ kann das Komposite aus einem heterogenen Materialverbund,
bei dem die Materialien von einzelnen Phasen verschieden sind, oder
einer homogenen Kombination ungleicher Materialien bestehen. Im
vorliegenden Zusammenhang beinhaltet die Verwendung des Begriffs ”Komposite” auch
ein ”Laminat”-Komposite. Als ”Laminat” wird ein
Komposite bezeichnet, das aus mehreren verschiedenen miteinander
verbundenen Schichten aus gleichem oder unterschiedlichem Material
besteht. Zu weiteren bevorzugten Komposite-Materialien zählen
Polymerlaminate, Polymer-Metall-Laminate, z. B. mit Kupfer beschichtete
Polymere, ein Keramik-in-Metall- oder ein Polymer-in-Metall-Komposite.
Ein bevorzugtes Komposite-Material stellt ein Polyimidlaminat dar,
das aus einer ersten Polyimidschicht wie Kapton® gebildet
und mit einer zweiten dünnen Schicht aus einem heißklebenden
Polyimid mit der Bezeichnung KJ® coextrudiert
wurde, wobei beide Werkstoffe von DuPont (Wilmington, Delaware,
USA) erhältlich sind.
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Die
vorliegenden Mikrofluideinheiten können unter Verwendung
jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, darunter, aber nicht
darauf beschränkt, Mikrospritzguss- und -gießverfahren,
Prägeverfahren, abtragende Bearbeitung von Oberflächen
und massivem Material. Das letztere Verfahren beinhaltet die Bildung
von Mikrostrukturen durch direktes Ätzen in ein massives
Material, üblicherweise durch chemisches Nassätzen
oder reaktives Ionenätzen (”RIE”). Die
abtragende Bearbeitung von Oberflächen beinhaltet die Herstellung
aus Schichten, die auf der Oberfläche eines Substrats abgeschieden
wurden. Ein beispielhafter Prozess der abtragenden Bearbeitung von
Oberflächen ist unter der Bezeichnung ”LIGA” bekannt.
Siehe zum Beispiel Becker et al. (1986), Ehrfeld
et al. (1988), und Guckel et al. (1991).
Beim LIGA-Verfahren wird eine relativ dicke Schicht eines Röntgenstrahlen-Abdecklacks
auf einem Substrat abgeschieden und durch eine Röntgenstrahlung
absorbierende Maske hochenergetischer Röntgenstrahlunausgesetzt,
woraufhin die bestrahlten Abdecklack-Bereiche unter Verwendung eines
chemischen Entwicklers entfernt werden.
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Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Mikrofluideinheiten
stellt die Laserablation dar. Bei der Laserablation werden kurze Impulse
von ultraviolettem Licht in einer dünnen Oberflächenschicht eines
Materials absorbiert. Vorzugsweise werden Impulsenergien von mehr
als ungefähr 100 Millijoule pro Quadratzentimeter und Impulslängen
von weniger als ungefähr 1 Mikrosekunde verwendet. Unter
diesen Bedingungen führt die intensive Ultraviolettstrahlung
zur Fotodissoziation der chemischen Bindungen in der Substratoberfläche.
Die absorbierte Energie der Ultraviolettstrahlung wird auf ein so
kleines Materialvolumen konzentriert, dass die dissoziierten Bruchstücke
rasch erhitzt und von der Substratoberfläche weggeschleudert werden.
Da diese Prozesse so schnell ablaufen, kann sich die Wärmeenergie
nicht in das angrenzende Material ausbreiten. Dadurch werden die
angrenzenden Bereiche nicht aufgeschmolzen oder anderweitig geschädigt,
und der Umfang der abgetragenen Teile kann mit der Genauigkeit in
der Größenordnung von ungefähr einem
Mikrometer oder weniger die Form des einfallenden Lichtstrahls nachbilden.
Bei der Laserablation werden üblicherweise Hochleistungslaser
wie beispielsweise Excimer-Laser vom F
2-,
ArF-, KrCl-, KrF- oder XeCl-Typ verwendet. Gleichermaßen
können jedoch auch andere UV-Lichtquellen mit im Wesentlichen
denselben optischen Wellenlängen und Energiedichten verwendet
werden. Laserablationsverfahren werden zum Beispiel von
Znotins
et al. (1987) sowie in den
US-Patentschriften
5 291 226 und
5 305
015 von
Schantz et al. beschrieben.
-
Einen
weiteren Aspekt dieser Erfindung stellen Systeme dar, die eine Mikrofluideinheit
gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen. Das
System kann ferner ein Schaltelement zum Schalten eines Ventilsystems aufweisen,
um ausgewählte Verbindungen zwischen den verschiedenen
Säulen der Mikrofluideinheit herzustellen. Als Schaltelement
kann zum Beispiel eine Drehscheibe mit einer Vielzahl von Kanälen
dienen, die mit den Eingangs-/Ausgangsanschlüssen des Chip
zur Deckung gebracht werden können, wenn der Chip in die Drehscheibe
einrastet. Darüber hinaus kann die Drehscheibe zwischen
mindestens zwei verschiedenen Zuständen hin- und hergeschaltet
werden, die jeweils für die Verbindung von verschiedenen
Anschlüssen auf dem Chip sorgen. Als Schaltelement kann
auch ein Schieber verwendet werden, der zwischen mindestens zwei
verschiedenen Stellungen zur Verbindung verschiedener Anschlüsse
verschoben werden kann und beispielsweise in der
US-Patentschrift 6 702 256 beschrieben
wird. Es können jedoch auch andere Schaltelemente verwendet
werden. Wahlweise kann das System auch ein Zwischenelement zur Übertragung
der aus der Mikrofluideinheit austretenden Substanzen (der abgetrennten
Glykane) zum Eingang eines Massenspektrometers oder anderer Analysemittel
aufweisen. Alternativ können die aus der Mikrofluideinheit
austretenden Substanzen auch direkt in die Ionisationskammer eines
Massenspektrometers eingegeben werden. Ferner kann das System auch
ein Massenspektrometer oder andere Analysemittel aufweisen.
-
Andere
Ausführungsformen können auch eine Ausrüstung
bereitstellen, die eine Mikrofluideinheit gemäß der
vorliegenden Erfindung aufweist. Die Ausrüstung kann ferner
auch folgende Materialien einzeln oder in Kombination aufweisen:
eine Probenlösung, eine Elutionslösung für
jede der Säulen, Auffrischungsreagenzien für jede
der Säulen, eine Standardprobe (zum Beispiel einen Antikörperstandard,
einen Glykanstandard usw.), eine Bedienungsanweisung und einen Behälter
für die Komponenten.
-
Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen
dieser Erfindung und sind keinesfalls als Einschränkung
des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Obwohl
bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung gezeigt und
beschrieben werden, können daran verschiedene Änderungen
in Form und Details vorgenommen werden, ohne vom Geist und Geltungsbereich der
Erfindung abzuweichen.
-
BEISPIELE
-
In
den folgenden Beispielen haben die folgenden Abkürzungen
die folgenden Bedeutungen. Nicht definierte Abkürzungen
haben ihre allgemein anerkannten Bedeutungen.
- °C
- = Grad Celsius
- h
- = Stunde
- min
- = Minute
- s
- = Sekunde
- mM
- = Millimol
- μM
- = Mikromol
- nM
- = Nanomol
- μm
- = Mikrometer
- ml
- = Milliliter
- μl
- = Mikroliter
- nl
- = Nanoliter
- mg
- = Milligramm
- μg
- = Mikrogramm
- HPLC
- = Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
- LC
- = Flüssigkeitschromatografie
- MS
- = Massenspektrometrie
- QTOF
- = Quadrupol-Laufzeitspektrometrie
-
BEISPIEL 1
-
Glykananalyse mit chipgebundenen enzymatischen
Reaktionen
-
Chipherstellung
-
Das
Enzym PNGase F wurde 22 h lang in Phosphat-Pufferlösung
(pH 8) chemisch auf epoxidmodifizierten Siliciumdioxidperlen mit
einem Durchmesser von 5 μm fixiert. Dann wurden die Perlen
in eine auf einem ersten Polyimid-Chip befindliche Kammer gepackt.
In eine zweite Kammer auf einem zweiten Polyimid-Chip wurden 5 μm
große C8-Umkehrphaseperlen zur Proteinreinigung gepackt.
Die dritte Chip-Ebene enthielt eine Probenanreicherungssäule
(40 nl), eine Trennsäule (75 mm), die mit zu Grafit umgewandeltem
Kohlenstoff für die HPLC-Analyse gefüllt war,
und eine integrierte MS-Spitze zur Eingabe in ein Massenspektrometer.
Die drei Chips wurden aufeinander gelegt, miteinander zur Deckung
gebracht und in eine Chip-Halterung eingesetzt.
-
Verfahren
-
Die
Antikörperproben wurden in Phosphatpuffer (pH 7,5) auf
eine Konzentration von 6 pmol/μl verdünnt. Das
verwendete HPLC-System arbeitete mit typischen mobilen Phasen von
0,1% Ameisensäure in Wasser mit MS-Reinheitsgrad (Lösemittel
A) und 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (Lösemittel
B). Der Autosampler wurde auf ein Injektionsvolumen von 0,1 μl
Antikörper eingestellt. Die Kapillarpumpe wurde auf eine Flussrate
der Probe durch die Deglykosylierungs-Säule und die C8-Säule
von 1 μl/min eingestellt. Diese Flussrate entspricht einer
Deglykosylierungszeit von 8 s und bewirkt eine Deglykosylierung
von 100%. Als Lösemittel für die Beschickung und
die Deglykosylierung wurde eine Lösung von 50 mM Natriumphosphat
verwendet. Der Gradient für die schnelle Deglykosylierung
und die Glykananalyse betrug 2 auf 32% Lösemittel B in
1,5 min, 32 auf 75% Lösemittel B in 30 s, wurde weitere
30 s lang auf 75% Lösemittel B konstant gehalten und betrug
anschließend während der letzten 30 s 75 auf 2%
Lösemittel B, wobei die Flussrate der Nanopumpe 300 nl/min
betrug. Zur Trennung von Isomeren wurde der Gradient gedehnt.
-
Die
getrennten Glykane wurden unter Verwendung eines QTOF-Tandem-Massenspektrometers
mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle analysiert. Die Massenspektren
wurden im positiven Ionenmodus aufgezeichnet. Die Spannung der Abdeckung
wurde auf 1750 V eingestellt und ein Trocknungsgas mit einer Temperatur
von 325°C und einer Strömungsgeschwindigkeit von
8 L/min eingeleitet. Die Fragmentierungsspannung betrug 120 V. Die
Trennkapillarspannung betrug 65 V. Die Daten wurden im 2 GHz-Modus
erfasst.
-
Ergebnisse
-
Unter
Verwendung des Chip und des Verfahrens, die oben beschrieben wurden,
wurden Antikörperproben deglykosyliert und die entstandenen
Glykane durch HPLC abgetrennt und massenspektrometrisch analysiert.
Die erwarteten Glykane beinhalten folgende Spezies: Tabelle
1. Infrage kommende Glykane
-
- Leerer Kreis: Galaktose
- Quadrat: GlcNAc
- Voller Kreis: Mannose
- Dreieck: Fucose
-
7 linke
Seite) zeigt ein typisches Ergebnis der herkömmlichen,
in Lösung durchgeführten Analyse, bei der die
Probe über Nacht in Lösung durch PNGase F aufgespaltet
wurde und die insgesamt 24 Stunden in Anspruch nahm. Von den Haupt-Peaks
entsprechen die Peaks 303 und 305 den beiden Stereoisomeren
(α- und β-Anomere) von G0, und die Peaks 304 und 306 den
beiden Isomeren von G1, G1' und G1'' (siehe Tabelle 1 oben). Alle
diese Glykanspezies wurden im Zeitraum zwischen 3,4 und 3,7 Minuten
eluiert. Außerdem sind noch die kleineren Peaks 301 und 302 zu
sehen, die nach ungefähr 3,2 Minuten eluiert wurden. Die
Ergebnisse der mit derselben Probe auf dem Chip durchgeführten
Analyse unterschieden sich jedoch hiervon. Gemäß 7 (rechte
Seite) lieferte die Probe einen markanten Peak (310) und
zwei kleinere Peaks (311 und 312), die sämtlich
um die 3,2 Minuten herum liegen. Zwischen 3,4 und 3,7 Minuten erschienen
vier kleinere Peaks 313 bis 316, wo die Haupt-Peaks
der in Lösung durchgeführten Analyse lagen. Es
zeigt sich, dass die Positionen 313 bis 316 gut
mit den Peaks 303 bis 306 der in Lösung
durchgeführten Analyse übereinstimmen, wie auch
die Peaks 310 und 311 ungefähr zur selben
Zeit wie die Peaks 301 und 302 eluiert wurden.
-
Die
Unterschiede zwischen den Ergebnissen für die Analyse in
Lösung und auf dem Chip lassen sich durch den Wirkmechanismus
des Enzyms PNGase F und die effiziente Online-Verfahrensweise des
Chip erklären. Rasmussen et al., 1992 (siehe 8),
zufolge besteht die Wirkung des Enzyms PNGase F darin, dass es zuerst
die C-N-Bindung der glykosylierten Asparagin-Seitenkette spaltet
und der Asparaginrest dann in Asparaginsäure umgesetzt
wird. Bei dem abgespalteten Glykan handelt es sich zunächst
um ein Aminoglykan, jedoch wird die Aminogruppe unter Freisetzung
von Ammoniak langsam zu einer Hydroxylgruppe hydrolysiert. Ausgehend
von den Massen jedes Peak in 7 wurde
angenommen, dass der Peak 310 dem Aminoglykan G0 entspricht,
das nach langer Inkubationszeit zu Hydroxylglykanen (Peaks 313 und 315)
hydrolysiert wird. Zur Überprüfung dieser Annahme
wurde eine Zeitreihe gemessen, bei der die Probe für eine
Dauer von 0, 15, 30, 60, 120 bzw. 240 Minuten in der Deglykosylierungs-Säule
auf dem Chip belassen wurde. Dabei zeigte es sich, dass tatsächlich
mit zunehmender Inkubationszeit die Intensität des Peak 310 abnahm
und die Intensität der Peaks 313 und 315 zunahm.
Desgleichen gingen auch die Peaks für G1 (304 und 306)
bei der in Lösung durchgeführten Analyse zurück,
während der Peak 311 zunahm. Somit ergibt sich
auf der Grundlage der zeitlichen Änderungen und der Massen
der Peaks die Schlussfolgerung (siehe 9), dass
die Peaks 310, 311 und 312 Aminoglykanen
und die Peaks 313 bis 316 Hydroxylglykanen entsprechen.
Für jedes Hydroxylglykan gibt es zwei Peaks (313 und 315,
sowie 314 und 316), da die Hydroxylglykane leicht
zum α-Anomer und zum β-Anomer isomerisieren.
-
Die
Online-Arbeitsweise des Chip trägt ebenfalls zur Wirksamkeit
der Reaktion bei. Wenn eine Probe in die Deglykosylierungs-Säule
eingeführt wird und diese durchläuft, gelangt
jede ”Front” der Probe in Kontakt mit einem Überschuss
an Enzym und wird augenblicklich aufgespaltet. Andererseits enthält
das Inkubationsgemisch in der Lösung für jedes
Substrat ein geringeres Enzym-Substrat-Verhältnis, und
nach der Reaktion bleiben eine Vielzahl unvollständig umgesetzter
Produkte zurück. Überdies laufen die gespalteten
Glykane beim Online-Prozess weiter, werden in der Trap-Säule
gebunden und werden in der Trennsäule getrennt.
-
Somit
bleiben die Glykane während des größten
Teils der Zeit durch andere Moleküle gebunden und neigen
weniger dazu, Isomere zu bilden oder andere chemische Reaktionen
einzugehen.
-
Da
die vorliegende Erfindung in der Lage ist, die Aminoglykane abzufangen,
können die beiden Isomere von G1 wirksam getrennt werden.
G1 liegt in zwei Isomeren vor (G1' Und G1'' in Tabelle 1). Bisher
war man der Meinung, dass G1' und G1'' nur unter Verwendung eines
sehr langen Gradienten getrennt werden können. Deshalb
bestand bisher ein Problem darin, Glykangemische ohne großen
materiellen und zeitlichen Aufwand für einen langen Trennschritt
genau zu analysieren. Es wurde jedoch gefunden, dass die Aminoformen
einfach getrennt werden können. Der folgende kurze Gradient
wurde in der Trennsäule des in diesem Beispiel beschriebenen
Chip verwendet, und G1' und G1'' wurden in wenigen Minuten deutlich
aufgelöst (
10):
Zeit
(min) | %
Lösemittel B |
0 | 2 |
10 | 22 |
12 | 80 |
15 | 80 |
16 | 2 |
-
Diese
Ergebnisse zeigen somit, dass die in dieser Beschreibung beschriebenen
Chips nicht nur die für die Glykananalyse erforderliche
Zeit erheblich verkürzen, sondern dass die von den Chips
gewonnenen Daten die Strukturen der Glykane zuverlässiger
wiedergeben. Außerdem wird zum Erreichen derselben Ergebnisse nur
eine geringe Menge an eingesetzter Probe benötigt. Die
bei diesem Beispiel eingesetzte Probe enthielt nur 100 ng Glycoproteine,
und die Signale in den Massenspektren waren sehr intensiv. Deshalb
kann auch eine kleinere Probenmenge verwendet werden.
-
BEISPIELHAFTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beinhalten, ohne darauf beschränkt
zu sein, Folgendes:
- A. Eine Mikrofluideinheit
zum Entfernen von Kohlenhydraten aus einem Glykoprotein, wobei die
Mikrofluideinheit aufweist:
eine Deglykosylierungs-Säule,
die ein festes Substrat und ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist,
das Kohlenhydrate von Glykoproteinen abspalten kann;
eine Trap-Säule,
die Kohlenhydrate binden kann;
eine Trennsäule, die
Kohlenhydrate trennen kann; und
eine Vielzahl von Eingangs-/Ausgangsanschlüssen;
wobei
die Anschlüsse so beschaffen sind, dass, wenn die Mikrofluideinheit
mit einem Schaltelement verbunden wird, das mindestens einen Kanal
aufweist, die Kombination dieser Anschlüsse, Säulen
und des mindestens einen Kanals ein Ventilsystem bildet, das zwischen
mindestens einem ersten und einem zweiten Zustand umgeschaltet werden
kann, wobei der erste Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen
der Deglykosylierungs-Säule und der Trap-Säule
und der zweite Schaltzustand eine Fluidverbindung zwischen der Trap-Säule
und der Trennsäule herstellt.
- B. Die Mikrofluideinheit nach Ausführungsform A, die
ferner eine Reinigungssäule zum Binden von Proteinen aufweist,
wobei die Reinigungssäule so beschaffen ist, dass sie durch
das Ventilsystem mit der Deglykosylierungs-Säule und/oder
mit der Trap-Säule verbunden werden kann.
- C. Die Mikrofluideinheit nach Ausführungsform A oder
B, wobei als Enzym N-Glykosidase F verwendet wird.
- D. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
A bis C, wobei das feste Substrat in der Deglykosylierungs-Säule
Perlen oder ein kompaktes Medium aufweist.
- E. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
A bis D, wobei als Trennsäule eine flüssigkeitschromatografische
Säule dient.
- F. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
A bis D, wobei als Trennsäule eine kapillarelektrophoretische
Vorrichtung dient.
- G. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
A bis F, die zwei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule
in einer Ebene befindet und sich die Trap-Säule und die
Trennsäule in der anderen Ebene befinden.
- H. Die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
B bis F, die drei Ebenen aufweist, wobei sich die Deglykosylierungs-Säule
in einer ersten Ebene, die Reinigungssäule in einer zweiten
Ebene befindet und sich die Trap-Säule und die Trennsäule
in einer dritten Ebene befinden.
- I. Ein System zum Analysieren einer Probe, wobei das System
die Mikrofluideinheit nach einer der Ausführungsformen
A bis H, das Schaltelement und ein Massenspektrometer aufweist.
- J. Das System nach Ausführungsform I, wobei das Massenspektrometer
eine Elektrospray-Ionenquelle aufweist.
- K. Ein Verfahren zum Analysieren der Kohlenhydratanteile von
Glykoproteinen, wobei das Verfahren aufweist:
Einführen
einer Probe, die Glykoproteine aufweisen kann, in die Mikrofluideinheit
von Ausführungsform A;
Zerlegen der Glykoproteine
in der Deglykosylierungs-Säule, um abgespaltete Kohlenhydrate
zu erhalten;
Binden der abgespalteten Kohlenhydrate in der
Trap-Säule;
Eluieren der abgespalteten Kohlenhydrate
aus der Trap-Säule; und
Trennen der abgespalteten
Kohlenhydrate in der Trennsäule.
- L. Das Verfahren nach Ausführungsform K, das ferner
nach dem Zersetzen das Entfernen der Proteine mit einer Reinigungssäule
aufweist, die in der Lage ist, Proteine zu binden.
- M. Das Verfahren von Ausführungsform K oder L, wobei
die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Flüssigkeitschromatographie
getrennt werden.
- N. Das Verfahren von Ausführungsform K oder L, wobei
die abgespalteten Kohlenhydrate mittels Kapillarelektrophorese getrennt
werden.
- O. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K
bis N, wobei das Verfahren ferner das Analysieren der abgespalteten
Kohlenhydrate unter Verwendung der Massenspektrometrie aufweist.
- P. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K
bis 0, wobei die Probe bis zu 50 ng Glykoproteine enthält.
- Q. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K
bis P, wobei das Verfahren innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen
ist.
- R. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K
bis Q, das unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen
zumindest einige der abgespalteten Kohlenhydrate in Form von Aminoglykanen
verbleiben.
- Vorzugsweise verbleibt ein wesentlicher Anteil der abgespalteten
Kohlenhydrate in Form von Aminoglykanen.
- S. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen K
bis R, wobei die Glykoproteine mittels N-Glykosidase F zersetzt
werden.
- T. Eine Ausrüstung zur Glykananalyse, welche die Mikrofluideinheit
nach einer der Ausführungsformen A bis H und mindestens
ein Reagens zum Verdünnen der Probe oder zum Eluieren einer
Säule aufweist.
-
LITERATUR
-
- Palm und Novotny (2005), "A monolithic
PNGase F enzyme microreactor enabling glycan mass mapping of glycoproteins
by mass spectrometry," Rapid Comm. Mass Spectrometry 19:
S. 1730–1738.
- Rasmussen et al. (1992), "Identification and
derivatization of (oligosaccharyl) amines obtained by treatment
of asparagine-linked glycopeptides with N-GLYCANASE enzyme," J.
Am. Chem. Soc., 114(3): S. 1124–1126.
- Becker et al. (1986), "Fabrication of Microstructures
with High Aspect Ratios and Great Structural Heights by Synchrotron
Radiation Lithography Galvanoforming, and Plastic Moulding (LIGA
Process)," Microelectronic Engineering 4(1), S. 35 bis
36.
- Ehrfeld et al. (1988), "1988 LIGA Process:
Sensor Construction Techniques via X-Ray Lithography," Tech. Übersichtsartikel
vom IEEE Solid-State Sensor and Actuator Workshop, Nilton Head,
SC.
- Guckel et al. (1991), J. Micromech. Microeng. 1, S.
135–138.
- Znotins et al. (1987), Laser Focus Electro Optics, S.
54–70.
- US-Patentschriften 6 702
256 ; 5 291 226 und 5 305 015 .
- US-Patentanmeldung 2006/0171855.
-
Alle
oben oder an beliebiger Stelle in dieser Patentanmeldung erwähnten
Veröffentlichungen, Patentschriften und Patentanmeldungen
sind hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit im selben Umfang
aufgenommen, als ob die Darlegung jeder einzelnen Veröffentlichung,
Patentanmeldung oder Patentschrift besonders und einzeln gekennzeichnet
wäre, dass sie in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen
ist.
-
Es
wurde eine Anzahl von Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Ungeachtet dessen sollte klar sein, dass daran verschiedene Änderungen
vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Geltungsbereich
der Erfindung abzuweichen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
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des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 5291226 [0042]
- - US 5305015 [0042]
- - US 6702256 [0043]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Becker et
al. (1986) [0041]
- - Ehrfeld et al. (1988) [0041]
- - Guckel et al. (1991) [0041]
- - Znotins et al. (1987) [0042]
- - Schantz et al. [0042]
- - Rasmussen et al., 1992 [0053]