DE102013212179A1

DE102013212179A1 - Derivatisierung von PNGase F-freigesetzter Glykane auf einem HPLC-Chip

Info

Publication number: DE102013212179A1
Application number: DE201310212179
Authority: DE
Inventors: Brian Phillip Smart; Magdalena Anna Ostrowski; Gregory Staples
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2014-02-06
Also published as: US20140038215A1; US8927263B2

Abstract

Mikrofluidische Vorrichtung für die Glykananalyse umfassend eine Entglykosylierungssäule, die eine an einem festen Trägermaterial befestigte Glykosidase umfasst; eine Markierungssäule, die einen reaktiven Ester für die Reaktion mit einer Aminogruppe umfasst, wobei die Markierungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert angeordnet ist; eine Analysesäule umfassend eine stationäre Phase, die dazu in der Lage ist, derivatisiertes Glykan abzutrennen, und eine Vielzahl ein Einlass-/Auslassöffnungen, die mit Kanälen eines Schaltelements verbindbar ausgestaltet sind, um Fließwege auszubilden.

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Analyse von Glykanen aus Glykoproteinen, insbesondere die Analyse von Glykanen unter Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Glykolisierung ist die am weitesten verbreitete post-translatorische Modifikation der Zelloberflächenproteine und extrazellulärer Matrixproteine. Die Glykoprotein-Glykane, die von einem bestimmten Organismus exprimiert werden, umfassen komplexese Gemische, die die Vorlagen-unabhängig gesteuerte Biosynthese dieser post-translationalen Modifikationen widerspiegelt. Die Gemische enthalten Bestandteile, die, obwohl physiologisch relevant, nur eine kleine Fraktion des gesamten Glykanbestandes repräsentieren. Die Charakterisierung von Glykoproteinen stellt somit eine herausfordernde Aufgabe dar.
Glykoproteine spielen eine wichtige Rolle bei vielen zellulären Funktionen, wie beispielsweise der Zelladhäsionen und der Immunantwort. Veränderungen im Glykanprofil wurden mit Veränderungen physiologischer Zustände und Krankheitsstadien, wie beispielsweise Krebs oder rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht. Die Fähigkeit, die Glykanbestandteile zu detektieren und quantifizieren, ist daher wichtig.
Glykoproteine können an verschiedenen Glykosylierungsstellen (Glycosites) glykosyliert sein. Typischerweise erfolgt die Glykosylierung an einem Asparaginrest (N-Glykosylierung) oder Serinrest (O-Glykosylierung) der Glykosylierungsstellen. Zusätzlich können an jeder bestimmten Glykosylierungsstelle verschiedene Glykane (Oligosaccharide) angebunden werden. Diese strukturelle Heterogenität erschwert das Studium von Glykoproteinen, insbesondere von den Kohlehydraten, die mit den Glykoproteinen verbunden sind. Erschwerend zur Glykanheterogenität ist die Tatsache, dass die Menge einer Glykoproteinprobe, die für die Analyse aus biologischen Quellen zur Verfügung steht, oftmals begrenzt ist. Aus diesen Gründen hat sich die Massenspektrometrie, die sowohl hoch sensitiv als auch geeignet ist, komplexe Stoffgemische zu charakterisieren, als ideale Technologie für die Glykananalyse herausgebildet. Unglücklicherweise haben Glykane jedoch von Natur aus eine sehr geringe lonisationseffizienz.
Aus diesem Grunde haben bereits viele Forscher versucht, Glykane mit chemischen Verbindungen zu derivatisieren, welche die Ionisationseffizienz verbessern (siehe Hase, S., Precolumn derivatization for chromatographic and electrophoretic analyses of carbohydrates, J. Chromatography A, 1996, 720(1–2): S. 173–182). Das am meisten verbreitete Markierungsverfahren ist die reduktive Aminierung des freien reduzierenden Endes (d. h. der Aldehydform bei geöffnetem Ring) des Glykans mit einer aromatischen Verbindung, die ein primäres Amin enthält. Diese Arbeitsschritte erfordern die Zugabe von Reduktionsmitteln, von denen Natriumcyanoborhydrid die meiste Anwendung findet, um das Imin, das während der Derivatisierungsreaktion gebildet wird, zu stabilisieren. Diese Strategien erfordern somit ein erhebliches Maß an Behandlungs- und Aufreinigungsschritten der Probe, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass wertvolle Analyte verloren gehen.
Wie bei der Herangehensweise mit reduktiver Aminierung ist aber auch der Einsatz von R-Glykosylamin-Zwischenprodukten für die Derivatisierungschemie mit einem erheblichen Aufwand an Probenvorbereitung und Probenhandhabung verbunden, und nicht kompatibel mit einer Glykananalyse mit hohem Durchsatz. Gegenwärtig gibt es somit keine experimentellen Protokolle, welche die Vorteile der Glykanderivatisierung (verbesserte Ionisierungseffizienz) mit einer schnellen Probenvorbereitung oder geringen Probenhandhabung verbinden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung für die Glykananalyse. Eine mikrofluidische Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Entglykosylierungssäule, die eine an einem festen Trägermaterial befestigte Glykosidase umfasst; eine Markierungssäule, die einen reaktiven Ester für die Reaktion mit einer Aminogruppe umfasst, wobei die Markierungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert (auch stromabwärts) angeordnet ist; eine Analysesäule umfassend eine stationäre Phase, die dazu in der Lage ist, ein derivatisiertes Glykan abzutrennen; und eine Vielzahl Einlass-/Auslassöffnungen, die mit Kanälen eines Schaltelements verbindbar ausgestaltet sind, um Fließwege auszubilden.
Gemäß Ausführungen der Erfindung kann die Glykosidase PNGase F oder PNGase A sein.
Gemäß einigen Ausführungen der Erfindung kann jede der oben beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtungen ferner eine Reinigungssäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, ein Protein zu binden, umfassen, wobei die Reinigungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert und der Markierungssäule vorgelagert (stromauf) angeordnet ist. Die Reinigungssäule kann eine Umkehrphase als stationäre Phase umfassen.
Gemäß weiterer Ausführungsformen der Erfindung kann jede der oben beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtungen ferner eine Fangsäule mit einer stationären Phase umfassen, die dazu in der Lage ist, das derivatisierte Glykan zu binden, wobei die Fangsäule ausgestaltet ist, um in Fließrichtung nach der Markierungssäule und vor der Analysesäule verbunden zu werden. Die Fangsäule kann eine Umkehrphase als stationäre Phase aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein System für die Analyse einer Probe, das eine der oben genannten mikrofluidischen Vorrichtungen, ein Schaltelement und ein Massenspektrometer umfassen kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von Glykan. Ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst: Applizieren einer Probe, die Glykoproteine umfasst, auf die Entglykosylierungssäule der mikrofluidischen Vorrichtung, um ein entglykosyliertes Gemisch zu erzeugen; Passieren des entglykosylsierten Gemisches durch die Markierungssäule, um derivatisierte Glykosylamine zu erzeugen; und Trennen der derivatisierten Glykosylamine auf der Analysesäule.
Gemäß Ausführungen der Erfindung kann in einem der oben beschriebenen Verfahren die Glykosidase PNGase F oder PNGase A sein.
Gemäß einigen Verfahren der Erfindung kann jede der oben beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtungen ferner eine Reinigungssäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, ein Protein zu binden, umfassen, wobei die Reinigungssäule stromabwärts der Entglykosylierungssäule und stromaufwärts der Markierungssäule angeordnet ist. Die Reinigungssäule kann eine Umkehrphase als stationäre Phase umfassen. Das Verfahren kann ferner ein Leiten des entglykosylierten Gemisches durch die Reinigungssäule vor dem Leiten des entglykosylsierten Gemisches durch die Markierungssäule umfassen.
Gemäß einigen Verfahren der Erfindung kann jede der oben beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung ferner eine Fangsäule mit einer stationären Phase umfassen, die dazu in der Lage ist, ein derivatisiertes Glykan zu binden, wobei die Fangsäule ausgestaltet ist, um stromabwärts zur Markierungssäule und stromaufwärts zur Analysesäule verbunden zu sein. Die Fangsäule kann eine Umkehrphase als stationäre Phase aufweisen. Das Verfahren umfasst ferner das Durchleiten der derivatisierten Glykane durch die Fangsäule vor dem Trennen der derivatisierten Glykosylamine auf der Analysesäule umfassen.
Andere Aspekte und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Reaktionsmechanismus für die Entglykolsylierung und Derivatisierung von einem Glykosylamin oder einem Glykan.
2A zeigt eine mikrofluidische Vorrichtung gemäß der Erfindung, die eine Entglykosylierungsreaktion und eine Markierungsreaktion darstellt.
2B zeigt eine mikrofluidische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, welche die Analysierung von einem derivatisierten Glykan darstellt.
3 zeigt ein Verfahren für die Vorbereitung von einem reaktiven Ester, der an einem festen Träger gebunden ist, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
4 zeigt Arbeitsschritte, welche die Entglykosylierung, gefolgt von der Derivatisierung der erzeugten Glykosylamine unter Verwendung eines aktiven Esters, der an ein festes Trägermaterial gebunden ist, gemäß einer Ausführung der Erfindung darstellen.
5 zeigt weitere Beispiele von aktivierten Estern, die gemäß anderer Ausführungen der Erfindung verwendet werden können.
Definitionen
Eine „mikrofluidische Vorrichtung” ist eine Vorrichtung, die Kammern und/oder Kanäle mit Abmessungen im Mikrometer oder Submikrometerbereich umfasst, die den Durchlass eines Fluides ermöglichen. Die Kammern oder Kanäle haben generell Durchmesser (oder, wenn sie nicht kreisförmig sind, die größte Ausdehnung eines Querschnitts) von 1 μm bis weniger als 1000 μm, wie 1 μm bis 500 μm, 10 μm bis 300 μm, 50 μm bis 250 μm, um einige Beispiele zu nennen.
Der Ausdruck „Entglykosylierungssäule” oder „Enzymreaktor”, so wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf eine mikrofluidische Säule/einen mikrofluidischen Kanal, der eine Glykosidase enthält, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist.
Der Ausdruck „Reinigungssäule”, so wie er hier gebraucht wird, betrifft eine mikrofluidische Säule/einen mikrofluidischen Kanal zum Binden von Proteinen oder Peptiden, so dass die Proteine oder Peptide nach der Entglykosylierungsreaktion von Glykanen getrennt werden können. Die Reinigungssäule kann eine stationäre Phase umfassen, an welche die Proteine oder Peptide sich binden können, wie beispielsweise eine Umkehrphase oder stationäre PGC Phase.
Der Ausdruck „Markierungssäule” oder „Derivatisierungssäule”, so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine mikrofluidische Säule/einen mikrofluidischen Kanal, der einen an einen festen Träger gebundenen reaktiven Ester enthält. Der reaktive Ester ist dazu in der Lage, mit einer Aminogruppe von einem Glykosylamin zu reagieren. Der reaktive Ester (auch aktivierter Ester) kann beispielsweise einen Phenolester, einen HOBt Ester, einen HOAt Ester oder einen NHS Ester umfassen, wie noch näher in dieser Beschreibung erläutert werden wird.
Der Ausdruck „Fangsäule”, so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Säule von einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine stationäre Phase zum Binden von derivatisierten Glykanen aufweist, so dass die derivatisierten Glykane von anderen Stoffen abgetrennt werden können. Für Glykane, die mit einer hydrophoben Gruppe derivatisiert wurden, kann die Fangsäule eine PGC oder eine Umkehrphase als stationäre Phase umfassen, wobei die Umkehrphase als stationäre Phase Polymer-basiert oder Silikon-basiert sein kann. Jede aus dem Stand der Technik bekannte Umkehrphase, beispielsweise eine C-1, C-4, C-8 und C-18-Phase, kann als stationäre Phase verwendet werden.
Der Begriff „Analysesäule”, so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Säule von einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine stationäre Phase für die Trennung derivatisierter Glykane aufweist. Die „Analysesäule” kann die derivatisierten Glykane mittels Elektrophorese oder Flüssigchromatographie (LC), insbesondere HPLC trennen. Beispiele von HPLC-„Analysesäulen”, die in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, enthalten Säulen mit einer PGC- oder Umkehrphase als stationäre Phase, wobei die Umkehrphase als stationäre Phase Polymer-basiert oder Silikon-basiert sein kann. Jede aus dem Stand der Technik bekannte Umkehrphase, beispielsweise eine C-1, C-4, C-8 und C-18-Phase, kann als stationäre Phase verwendet werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt, basieren die derzeitigen Strategien zur Derivatisierung von mit PBGase F freigesetzten N-Glykanen auf Ansätzen mit Lösungen, in denen die Amin-enthaltenden Stoffe mit den reduzierenden Enden von den Glykanen reagieren, gefolgt von einer Reduktion (unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid) der Iminprodukte. Diese Ansätze beinhalten einen erheblichen Aufwand an Probenhandhabung. Zusätzlich ist es erforderlich, überschüssige Markierungsreagenzien vor der IC/MS-Analyse zu entfernen. Diese Lösungs-basierten Ansätze benötigen einen erheblichen Zeitaufwand für die Glykanfreisetzung und Glykanderivatisierung, was den Durchsatz der Glykananalyse erheblich verringert.
Die Freisetzung von N-gebundenen Glykanen aus Glykoproteinen mittels Glykosidasen (z. B. PNGase F) stellt eine einzigartige Möglichkeit zur Markierung von Glykanen dar, weil die Enzyme die Glykane als β-Glykosylamine mit reduzierendem Ende freisetzen. Die freie Aminogruppe der β-Glykosylamine besitzt eine Reaktivität, die ideal für Derivatisierungsreaktionen ist. Allerdings sind β-Glykosylamine kurzlebig; sie werden leicht hydrolisiert, um Glykane mit freien reduzierenden Enden zu produzieren. In herkömmlichen Experimenten mit Lösungsphasen, die PNGase F einsetzen, denen es üblicherweise gestattet ist, für etwa 16 Stunden voranzuschreiten, werden die β-Glykosylamin-Zwischenprodukte vollständig in die Form mit freiem reduzierendem Ende umgesetzt. Aus diesen Gründen ist es nicht überraschend, dass es nur einen Bericht gibt, in dem die Verwendung dieser kurzlebigen Chemie mit reduzierendem Ende zur Glykanmarkierung dokumentiert ist (Rasmussen, J. R. et al., Identification and Derivatization of (Oligosaccharyl) Amines Obtained by Treatment of Asparagine-Linked Glycopeptides with N-Glykanase Enzyme, Journal of the American Chemical Society, 1992, 114(3): S. 1124–1126).
Die Tatsache, dass das β-Glykosylamin-Zwischenprodukt kurzlebig ist, erschwert es, dieses Zwischenprodukt bei der Charakterisierung von Glykanen unter Verwendung der herkömmlichen lösungsbasierten Ansätzen einzusetzen. Kürzlich haben Bynum et al. eine mikrofluidische Vorrichtung für die Analyse von Kohlehydraten, die von Glykoproteinen freigesetzt werden, vorgestellt (US-Patentanmeldung Nr. 2010/0190146, deren Offenbarung mittels Bezugnahme in dieser Anmeldung gänzlich enthalten ist). Diese mikrofluidische Vorrichtung ist effizient und geeignet für die Analyse von Kohlehydraten, die von Glykoproteinen freigesetzt werden. Wichtigerweise enthalten diese mikrofluidischen Vorrichtungen immobilisierte Glykosidasen, die sich als sehr effizient bei der Glykanspaltung von Glykoproteinen gezeigt haben. Diese effiziente Spaltung macht es einfacher, die β-Glykosylamin-Zwischenprodukte zu detektieren.
Die Vorrichtung, die in der '146-Anmeldung offenbart ist, ist ähnlich zum Agilent mAb-Glyco-Chip, der für die Glykosylierung von monoclonalen Antikörpern (mAbs) und für die ausreichende Anreicherung auf dem Chip, der Trennung und der MS-basierte Detektion der abgespaltenen N-Glykane mittels einem Agilent HPLC-Chip/MS-System entworfen wurde. Die Entglykosylierung basiert auf einer integrierten Enzymreaktorsäule mit immobilisierter PNGase F (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Ausführungen der Erfindung betreffen mikrofluidische Chips für die Analyse von Glykanen, die von Glykoproteinen freigesetzt werden. Mikrofluidische Chips der Erfindung sind ähnlich zu dem mAb-Glyco-Chip von Agilent Technologies, Inc. (Santa Clara, CA) und ähnlich zu den mikrofluidischen Vorrichtungen, die in der '146-Anmeldung offenbart sind. Allerdings enthalten die mikrofluidischen Vorrichtungen der Erfindung einzigartige Glykanderivatisierungssäulen, um die Charakterisierung von Glycanen zu erleichtem.
Einige Ausführungen der Erfindung betreffen Verfahren für die Analyse von Glyanen, die von Glykoproteinen freigesetzt werden, unter Verwendung eines mikrofluidischen Chips der Erfindung. Diese Verfahren kombinieren Reaktionen, die online enzymatisch Glykan freisetzen, mit neuen, schnellen (schnell genug, um die Markierung von β-Glykosylamin-Zwischenprodukten zuzulassen) Derivatisierungen, um markierte Glykane für eine verbesserte MS-Detektion bereitzustellen. Diese Strategie enthält die Vorteile der Glykanmarkierung, wie sie bei den herkömmlichen Ansätzen mit einer Lösungsphase demonstriert wurde, während die manuellen Probenhandhabungsschritte eliminiert und der Durchsatz maximiert wird.
1 zeigt eine schematische Darstellung einer Entglykosylierungsreaktion mit einer Glykosidase (z. B. PNGase F). Das Glykan wird, wie gezeigt, vom Asparaginrest durch Spaltung der Amidbindung entfernt, was in der Ausbildung von einem β-Glykosylamin resultiert. Das β-Glykosylamin hat eine primäre Aminogruppe (-NH₂), die für die Derivatisierung verwendet werden kann, wie bei der Reaktion mit dem Agens Z, das eine reaktive Acylgruppe aufweist, gezeigt ist. Die Reaktion zwischen Agens (oder Mittel) Z und der Aminogruppe bildet ein Amidderivat. Durch geeignete Auswahl der Gruppe am Agens Z kann man die Eigenschaften der Glykane für die Analyse verbessern. Man kann beispielsweise ein Agens Z auswählen, das eine hydrophone Gruppe enthält, um die Auftrennung und/oder Analyse von den Glykane mittels HPLC und MS zu erleichtern.
1 zeigt ferner, dass das β-Glykosylamin nicht stabil ist und mit der Zeit in Lösung hydrolisiert, um die Aminogruppe von dem Glykosylamin freizusetzen, was zur Ausbildung von einem herkömmlichen Kohlenhydrat führt. Das Kohlenhydrat hat ein reduzierendes Ende (eine Aldehydgruppe, wenn es in der offenen Form vorliegt), das verwendet werden kann, um ein Derivat mit einem Agens Y, das typischerweise eine Aminogruppe für die Ausbildung von einem Imin (Schiff'sche Base) mit dem reduzierenden Zucker (d. h. der Aldehydgruppe) verwendet werden kann. Das Ausgangsiminprodukt ist nicht sehr stabil. Im herkömmlichen Ansatz wird das Imin daher mit Natriumcyanoborhydrid reduziert, um eine Aminogruppe auszubilden, wie in der obigen Diskussion erläutert wurde.
Aus 1 wird klar, dass die Derivatisierungsreaktionen einfacher wären, wenn man den Vorteil der Reaktivität von der Aminogruppe (-NH₂) an dem anfänglichen β-Glykosylamin-Produkt ausnutzen könnte. Ausführungen der Erfindung basieren auf dieser Art von Derivatisierungsreaktionen. Ferner verwenden Ausführungen der Erfindung mikrofluidische Vorrichtungen. Es wurde gezeigt, dass die Glykosylierungsreaktionen in mikrofluidischen Vorrichtungen, die immobilisierte Glykosidasen verwenden, überraschenderweise effizienter ablaufen (siehe Bynum et al., US-Patentanmeldung Nr. 2010/0190146). Bei Verwendung von mikrofluidischen Vorrichtungen kann man auch die Menge der für die Analyse benötigten Probe minimieren und die aufwendigen manuellen Schritte vermeiden.
Einige Ausführungen der Erfindung betreffen mikrofluidische Vorrichtungen für die Entglykosylierung von Glykoproteinen und die Derivatisierung von den freigesetzten Glykanen, um die Glykananalyse zu vereinfachen. In 2A und 2B ist ein Beispiel von einer mikrofluidischen Vorrichtung der Erfindung und seiner Arbeitsweise gezeigt. Eine mikrofluidische Vorrichtung 20 umfasst, wie in 2A gezeigt ist, mehrere Säulen 22 bis 26 und eine Vielzahl von Einlass-/Auslassöffnungen 28. Die Einlass-/Auslassöffnungen 28 sind mit verschiedenen Kanälen 29 einer oder mehrerer Schaltvorrichtungen verbindbar ausgestaltet, um verschiedene Fließwege auszubilden.
Ein mikrofluidischer Chip der Erfindung kann auf einer Modifikation von dem mAb-Glyco-Chip, der von Agilent Technologies, Inc. (Santa Clara, CA) erhältlich ist, basieren. Die Modifikation umfasst das Hinzufügen von einem Kanal/einer Säule, die ein Glykan-Markierungsreagenz enthält, das an einer Festphase immobilisiert sein kann, wie in 2A und 2B gezeigt ist. Ein mikrofluidischer Chip der Erfindung kann zwei Betriebszustände haben; Probenvorbereitung (2A) und Probenanalyse (2B).
In dem Probenvorbereitungsmodus, der in 2A gezeigt ist, wird eine Glykoproteinprobe mittels einer Kapillarpumpe 21 (oder einer vergleichbaren Vorrichtung) in den mikrofluidischen Chip 20 gepumpt. Die Glycoproteinprobe tritt zuerst in die Entglykosylierungssäule (oder den Enzymreaktor) 22 ein, wo sie mittels der immobilisierten Glykosidase (z. B. PNGase F) entglykolisiert wird.
Gemäß Ausführungen der Erfindungen kann die Entglykosylierungssäule (Enzymreaktor) 22 ein festes Trägermaterial, an welches ein Entglykosylierungsenzym angehängt ist, umfassen. Das Entglykosylierungsenzym ist in der Lage, Kohlenhydrate von einem Glykoprotein abzuspalten. Bei den meisten Glykoproteinen ist die Kohlenhydrateinheit an den Stickstoff der β-Amidgruppe eines Asparaginrestes (N-gebundenes Glykan) oder an den Sauerstoff der Hydroxylgruppe von einem Serin- oder Threoninrest (O-gebundenes Glykan) angebunden. Ausführungen der Erfindung beziehen sich auf N-gebundene Glykane.
Jedes Enzym, das N-gebundene Glykane von Glykoproteinen abspalten kann (d. h. N-Glykanase) kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Diese Enzyme sind Stand der Technik und enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, PNGase A und PNGase F. Bevorzugte Ausführungen der Erfindung können PNGase F verwenden. Es hat sich gezeigt, dass immobilisierte PNGase F effizient bei der Glykanabspaltung von Glykoproteinen ist, und die Reaktionen laufen üblicherweise innerhalb weniger Sekunden bis einiger Minuten vollständig ab (siehe Bynum et al., US-Patentanmeldung Nr. 2010/0190146, deren Offenbarung hiermit gänzlich in der vorliegenden Anmeldung enthalten ist).
Materialien und Verfahren für die Immobilisierung von Proteinen an festen Trägermaterialien sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Palm und Novotny, 2005). Das feste Trägermaterial in der Entglykosylierungssäule (Ezymreaktor) 22 können Glas- oder Polymerkügelchen sein, oder ein monolitischer Medium (wie Polymethacrylat, Polystyrol, Polyacrylamid, oder ähnliches). Beispiele zum Herstellen von Säulen mit immobilisierter Glykosidase können in der US-Patentanmeldung Nr. 2010/0190146 von Bynum et al. gefunden werden, die vergleichbare Entglykosylierungssäulen offenbart. Die Offenbarung von dieser Anmeldung ist mittels Bezugnahme hiermit gänzlich hierin enthalten.
Nach der Entglykosylierung können die Proteine optional von den Glykanen getrennt werden mittels Entfernen der Proteine unter Verwendung einer Reinigungssäule 23. Die Reinigungssäule 23 kann eine stationäre Phase zum Binden von Peptiden oder Proteinen enthalten. Solche stationären Phasen können eine Umkehrphase oder poröser graphitierter Kohlenstoff (PGC) sein. Bevorzugte Ausführungen der Erfindung können eine Reinigungssäule 23 verwenden, die eine Umkehrphase als stationäre Phase enthält, so wie eine C-1, C-4, C-8 oder C-18 Säule. Die Reinigungssäule 22 [sic] kann sowohl entglykosylierte Proteine als auch intakte Glykoproteine (aufgrund einer unvollständigen Entglykosylierungsreaktion) binden. Die freien Glykane sind hydrophil und werden von solchen Reinigungssäulen nicht zurückgehalten.
Die freien Glykane, die durch die Reinigungssäule 23 hindurchfließen, werden einem Kanal/einer Säule 24, die ein Amino-reaktives Reagenz enthält, für die Derivatisierung der Glykosylamine ausgesetzt. Diese Säule 24 kann als eine Markierungssäule 24 bezeichnet werden. Die Markierungsreaktion ist möglich, weil der Enzymreaktor 22 sehr effizient ist und innerhalb einer kurzen Zeit (z. B. von wenigen Sekunden bis wenigen Minuten) eine quantitative Spaltung erzeugen kann. Die schnelle und effiziente Abspaltung von Glykanen von den Glykoproteinen ermöglicht es den relativ instabilen Glykosylaminen, die Markierungssäule 24 zu erreichen, bevor die Glykosylamine in den entsprechenden reduzierenden Zucker hydrolisiert werden.
Gemäß Ausführungen der Erfindung enthält die Markierungssäule Amino-reaktive Reagenzien, die vorzugsweise reaktive Ester sind. Die „reaktiven Ester” oder „aktivierten Ester” können substituierte Phenolester, NHS-Ester, HOBt-Ester, HOAt-Ester oder dergleichen sein. Gemäß Ausführungen der Erfindung können solche Amino-reaktiven Reagenzien in der Markierungssäule 24 an feste Trägermaterialien gebunden sein. Nach der Reaktion werden die Glykosylamine mit einem Rest markiert, der die Trennung und Detektion von den Glykosylaminderivaten mittels HPLC und MS erleichtert.
Als nächstes können die markierten Glykane optional auf einer Fangsäule 25 zurückgehalten werden, während alle Verunreinigungen aus der Probe in den Abfall ausgewaschen werden. Die Fangsäule 25 kann eine stationäre Phase für die Bindung von derivatisierten Glykanen (die z. B. den Markierungsrest binden) enthalten. Wenn der Markierungsrest eine hydrophobe Gruppe enthält, kann die Markierungssäule z. B. eine Umkehrphase oder PGC stationäre Phase enthalten. Bei hydrophoben Markierungsresten enthält die stationäre Phase bevorzugt eine Umkehrphase, so wie C-1, C-4, C-8 oder C-18.
Sobald das markierte Glykan auf der Fangsäule 25 gefangen ist, kann es auf einer Trennungs-/Analysesäule 26 weiter abgetrennt und dann zur Analyse an ein Massenspektrometer geschickt werden. In 2B ist der mikrofluidische Chip, der in den Analysemodus umgeschaltet ist, gezeigt. Die Umschaltung kann durch Rotieren eines Schaltelementes (oder eine Rotors) (nicht gezeigt), das Kanäle 29 zum Verbinden verschiedener Einlass-/Auslassöffnungen auf dem mikrofluidischen Chip 20 enthält, erreicht werden.
Eine Einlass-/Auslassöffnung (oder „Öffnung”) 28 kann ein Loch, eine Mündung, Öffnung oder eine Kombination davon sein, die mit einer Leitung bzw. einem Kanal (speziell einer kurzen Leitung), oder dergleichen verbunden ist, solange die Öffnung Flüssigkeit erlaubt, vom einen Ende der Öffnung bis zum anderen zu fließen. Die Öffnungen 28 können verwendet werden, um verschiedene Säulen der Vorrichtung (die verschiedenen Säulen 22 bis 26) an den verschiedenen Stufen zu verbinden, wenn der Mikrochip 20 mit dem entsprechenden Kanal 29 auf dem Rotor oder Schalter (nicht gezeigt) ausgerichtet und verbunden ist. Der Mikrochip kann z. B. oben auf einem inneren Rotor oder einem äußeren Rotor sitzen, wie bei dem Agilent mAb-Glyco-Chip. Der innere und/oder äußere Rotor können so gedreht werden, dass verschiedene Öffnungen des Mikrochips über die Kanäle in dem Rotor verbunden werden. Die verschiedenen Kanäle in dem Rotor verbinden die verschiedenen Öffnungen, um verschiedene Fließwege auszubilden. In Verbindung mit den Kanälen auf dem Rotor/Schalter können die Einlass-/Auslassöffnungen auf dem Mikrochip somit verschiedene Fließwege bereitstellen, um die verschiedenen Säulen zu verbinden oder deren Verbindung zu trennen. Die Verwendung von solchen Rotoren/Schaltern in mikrofluidischen Vorrichtungen ist aus dem Stand der Technik bekannt, wie z. B. dem Einsatz des Agilent mAb-Glyco-Chips und der US-Patentanmeldung Nr. 2010/0190146, deren Offenbarung mittels Bezugnahme enthalten ist.
Auch wenn ein Rotor oben als ein Schaltelement zum Verändern des Zustandes der Fluidkommunikation von den Säulen in der mikrofluidischen Vorrichtung beschrieben ist, können anderen Schaltelemente (Schalter) verwendet werden, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel kann eine Reihe von Kanälen und Ventilen mit der mikrofluidischen Vorrichtung so verwendet werden, dass die verschiedenen Säulen zu den verschiedenen Phasen im Fließweg liegen.
Wie in 2B gezeigt ist, ist der mikrofluidische Chip 20, nach Umschalten, jetzt im Analysemodus, in dem die Fangsäule 25 fluidisch mit der Analysesäule 26 kommuniziert. Eine Nanopumpe 27 kann verwendet werden, um eine mobile Phase mit Gradienten zu erzeugen, welche die Trennung ausführt. Die markierten Glykane bewegen sich von der Fangsäule 25 zur Analysesäule 26, wo sie getrennt werden, bevor sie in das MS-System eingeführt werden. Während ein Elektrospray Ionisations-(ESI)MS gezeigt ist, versteht der Fachmann, dass andere Massenspektrometer verwendet werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Wie in den 2A und 2B gezeigt ist, kann die Glykanderivatisierung in einer Säule, die in einem mikrofluidischen Chip von der Erfindung integriert ist, durchgeführt werden. Die Derivatisierung kann die Ionisationseffektivität von den Glykanen erhöhen, um deren Detektion mittels Massenspektrometrie zu erleichtern.
Ein reaktives Agens Z für die Derivatisierung von Glykosylaminen kann, wie in 1 gezeigt ist, ein Acylderivat sein, das Acylhalide, Anhydride, reaktive Ester, etc. umfassen kann. Um in den Ausführungen der Erfindung eingesetzt zu werden, sollten solche reaktiven Reagenzien jedoch (zumindest über eine bestimmte Zeitdauer) in einer wässrigen Umgebung stabil sein. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung können daher aktive Ester verwenden, die mit Aminen reagieren und in einer wässrigen Umgebung relativ stabil sind. Verschiedene reaktive Estertypen sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise Phenolester, N-Hydroxysuccinimid-(NHS)Ester, Hydroxybenotriazol-(HOBt)Ester, Hydroxy-7-aza-benzotriazol-(HOAt)Ester, und dergleichen.
Gemäß Ausführungen der Erfindung sind die reaktiven Ester für die Reaktion mit Glykosylaminen so an feste Trägermaterialien gebunden, dass der Acylteil von den aktiven Estern die Aminogruppe der Glykosylamine acylieren wird und sich vom festen Trägermaterial ablöst. Die Produkte der Derivatisierungsreaktion sind daher acylierte Glykosylamine, die sich mit der mobilen Phase zur nächsten Säule (gezeigt als die Fangsäule 25 in den 2A und 2B) bewegen werden.
3 zeigt ein Beispiel von einem Ansatz, um einen aktiven Ester, der an ein festes Trägermaterial befestigt ist, zu produzieren. Dieses Beispiel verwendet eine Triphenylphosphoniummarkierung für die Glykanmarkierung. Inagaki et al. berichten, dass eine vergleichbare Triphenylphosphoniummarkierung die MS-Sensitivität für derivatisierte Aminosäuren 500-fach erhöht (Inagaki, S. et al., Highly sensitive and positively charged precolumn derivatization reagent for amines and amino adds in liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2010, 24(9): S. 1358–1364). Die Verwendung von Triphenylphosphonium ist jedoch nur beispielhaft. Der Fachmann erkennt, dass andere Markierungsreste verwendet werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
3 zeigt, wie eine Triphenylphosphoniummarkierung so modifiziert werden kann, dass sie an ein Festphasenharz angehängt werden kann. Zuerst wird ein substituiertes Phenol in der para-Stellung sulfonyliert und in ein Sulfonylchlorid umgewandelt, welches dann an eine Aminogruppe auf einem Linker, der mit dem festen Trägermaterial verbunden ist, gekoppelt wird. Das Phenolderivat an dem festen Trägermaterial wird dann mittels Acylierung mit einer 5-Triphenylphosphoniumpentansäure, die durch Reagieren von 5-Brompentansäure mit Triphenylphosphin hergestellt wird, in einen Ester umgewandelt. Die Acylierung kann mit einem Carbodiimid (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)) oder einem anderen geeigneten Kopplungsreagenz, gefördert werden. Die Reaktionsbedingungen für diese Reaktionen können denen entsprechen, die in Inagaki, S. et al., Highly sensitive and positively charged precolumn derivatization reagent for amines and amino adds in liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2010, 24(9): S. 1358–1364 berichtet sind.
Das Endprodukt der obigen Reaktion ist 5-Triphenylphosphoniumpentansäurephenylester, wobei die Phenylgruppe über ein Sulfonylamid mit dem festen Trägermaterial verknüpft ist. Anders ausgedrückt, die Triphenylphosphoniummarkierung ist mit der Festphase mittels einer aktivierten Ester-Abgangsgruppe verbunden, die an der Festphase gebunden bleibt, nachdem ein Glykosylamin dem Markierungsreagenz ausgesetzt wird, wie in 4 gezeigt ist.
Ein Glykoprotein kann, wie in 4 gezeigt ist, durch einen Ezymreaktor (z. B. eine Entglykosylierungssäule 22 in 2A), der eine an ein festes Trägermaterial gebundene PNGase F enthält, hindurchgeführt werden. Die Ausgangsprodukte der Entglykosylierungsreaktion enthalten ein Glykosylamin, das in der Markierungssäule (gezeigt als 24 in 2A) mit dem aktivierten Esterreagenz Z, das über eine Abgangsgruppe (d. h. den Phenolester) an ein festes Trägermaterial gebunden ist, reagiert. Das Produkt der Acylierungs-(Derivatisierungs)Reaktion ist ein acyliertes Glykosylamin. Die Acylgruppe in diesem Beispiel ist eine Triphenylphosphoniumpentanoylgruppe.
Weil die „Abgangsgruppe” (LG) an der Festphase gebunden bleibt, könnte die Derivatisierungs(Markierungs-)Säule vor der nächsten Probenanalyse regeneriert werden, um die Lebensdauer des Chips zu verlängern. Um diese Markierungssäule zu reaktivieren, könnte man einfach ein Gemisch aus der Markierung und DCC (oder eines vergleichbaren Verbindungsagens) durch den Reaktionskanal (oder die Reaktionssäule) hindurchfließen lassen, gefolgt von einem gründlichen Spülen mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Acetonitril).
Das Markierungsreagenz kann, wie in 4 gezeigt ist, als „Z-LG-festes Trägermaterial” dargestellt werden. Der „Z”-Rest ist schließlich an das Glykosylamin angehängt. Gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann der „Z”-Rest (oder die Markierungsgruppe) als „R-CO-„ dargestellt werden. Die R-Gruppe kann ausgewählt werden, um die erwünschten Eigenschaften für die derivatisierten Glykosylamine bereitzustellen. Die R-Gruppe kann beispielsweise ausgewählt werden aus einem Alkyl (z. B. C₁-C₂₀ Alkyl, C₁-C₁₀ Alkyl, oder C₁-C₄ Alkyl), einem Alkenyl (z. B., C₁-C₂₀ Alkenyl, C₁-C₁₀ Alkenyl, oder C₁-C₄ Alkenyl), einem Aryl (z. B., C₆-C₂₀ Aryl, C₆-C₁₅ Aryl, oder C₆-C₁₀ Aryl), einem Alkylaryl (wobei der Alkylteil und der Arylteil wie zuvor definiert sind), einem Heteroaryl (z. B. C₃-C₂₀ Heteroaryl, C₃-C₁₅ Heteroaryl, oder C₃-C₁₀ Heteroaryl), oder einem Alkyl-Heteroaryl (wobei der Alkylteil und der Heteroarylteil wie oben definiert sein können), wobei jedes der Alkyle, Alkenyle, Aryle, Alkylaryle, Heteroaryle oder Alkyl-Heteroaryle optional mit einem oder mehreren Halogenen, -OH, -O-Alkyl, -NH₂, -NO₂, -CN, oder einem a C₁-C₆-Alkyl substituiert sein kann. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die R-Gruppe eine hydrophobe Gruppe, wie beispielsweise eine Aryl-, eine Alkylaryl-, eine Heteroaryl- oder eine Alkyl-Heteroaryl-Gruppe.
Die Abgangsgruppe (LG) umfasst in dem in 3 gezeigten Beispiel eine Phenolgruppe. Andere Gruppen, die aktivierte Ester ausbilden können, können ebenfalls in Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Solch anderen Gruppen können zum Beispiel Hydroxybenzotriazole (HOBt), Hydroxy-7-aza-benzotriazole (HOAt), oder N-Hydroxysuccinimide (NHS) enthalten, wie in 5 dargestellt ist. Diese Gruppen (HOBt, HOAt oder NHS) können ebenfalls in aktivierte Ester mit einer Acylgruppe mittels eines Verbindungsagenzes, wie beispielsweise DCC, verwandelt werden.
Verglichen mit den bestehenden Derivatisierungsabläufen können die Verfahren der Erfindung eine oder mehrere der folgenden Vorteile enthalten. Ausführungen der Erfindung benötigen verringerte Probenhandhabung und verringerte Reaktionszeit. Als ein Resultat reduzieren sich die Mengen an Ausgangsmaterialien (z. B. Mikrogramm an mAb), die für eine genaue Glykanprofilierung benötigt werden, und selbst geringere Glykanbestandteile können einfacher detektiert werden. Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass man die ausgewählten Markierungen die chemische Natur von den freigesetzten Glykanen signifikant verändern, was die Quantifizierung von Glykanen, die verschiedene chemische Eigenschaften (wie beispielsweise die Anzahl von Sialinsäureresten, die sie enthalten) haben, viel genauer macht. Anders ausgedrückt, die Ionisationseffizienz von den Glykanen hängt mehr von der Markierung ab, die sie alle gemeinsam haben, als von ihrer individuellen Struktur. Weil die ausgewählten Markierungen hydrophober Art sind, wird es ferner möglich, die freigesetzten Glykane mittels Umkehrphasenchromatographie zu trennen, und diese Trennungsart ist erheblich robuster als die Chromatographie mit porösem graphitierten Kohlenstoff (PGC), die derzeitig in dem mAb-Glyco-Chip integriert ist.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf eine begrenzte Anzahl an Ausführungsformen beschrieben wurde, erkennt der Fachmann, der die vorliegenden Erfindung nutzen kann, dass andere Ausführungen entwickelt werden können, die nicht von dem Umfang der Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, abweichen. Demzufolge sollte der Umfang der Erfindung nur durch die anhängigen Ansprüche begrenzt sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Rasmussen, J. R. et al., Identification and Derivatization of (Oligosaccharyl) Amines Obtained by Treatment of Asparagine-Linked Glycopeptides with N-Glykanase Enzyme, Journal of the American Chemical Society, 1992, 114(3): S. 1124–1126 [0030]
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Inagaki, S. et al., Highly sensitive and positively charged precolumn derivatization reagent for amines and amino adds in liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2010, 24(9): S. 1358–1364 [0054]
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Claims

Mikrofluidische Vorrichtung für die Glykananalyse, umfassend: eine Entglykosylierungssäule, die eine an einem festen Trägermaterial befestigte Glykosidase umfasst; eine Markierungssäule, die einen reaktiven Ester für die Reaktion mit einer Aminogruppe umfasst, wobei die Markierungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert angeordnet ist; eine Analysesäule umfassend eine stationäre Phase, die dazu in der Lage ist, derivatisiertes Glykan zu trennen; und eine Vielzahl Einlass-/Auslassöffnungen, die mit Kanälen eines Schaltelements verbindbar ausgestaltet sind, um Fließwege auszubilden.
Mikrofluidische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Glykosidase PNGase F oder PNGase A ist.
Mikrofluidische Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend eine Reinigungssäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, ein Protein zu binden, wobei die Reinigungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert und der Markierungssäule vorgelagert angeordnet ist, und wobei die Reinigungssäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst.
Mikrofluidische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend eine Fangsäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, das derivatisierte Glykan zu binden, wobei die Fangsäule ausgestaltet ist, um in Fließrichtung nach der Markierungssäule und vor der Analysesäule verbunden zu werden, wobei die Fangsäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst, und wobei die Analysesäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst.
System für die Analyse einer Probe, das die mikrofluidische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, ein Schaltelement und ein Massenspektrometer umfasst.
Verfahren zum Analysieren von Glykan unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: Applizieren einer Probe, die Glykoproteine umfasst, auf die Entglykosylierungssäule der mikrofluidischen Vorrichtung, um ein entglykolisiertes Gemisch zu erzeugen; Passieren des entglykolisierten Gemisches durch die Markierungssäule, um derivatisierte Glykosylamine zu erzeugen; und Trennen der derivatisierten Glykosylamine auf der Analysesäule.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Glykosidase PNGase F oder PNGase A ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei eine mikrofluidische Vorrichtung ferner eine Reinigungssäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, ein Protein zu binden, umfasst, wobei die Reinigungssäule der Entglykosylierungssäule nachgelagert und der Markierungssäule vorgelagert angeordnet ist, wobei das Verfahren ferner ein Leiten des entglykosylierten Gemisches durch die Reinigungssäule vor dem Leiten des entglykosylierten Gemisches durch die Markierungssäule umfasst, und wobei die Reinigungssäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei eine mikrofluidische Vorrichtung ferner eine Fangsäule mit einer stationären Phase, die dazu in der Lage ist, ein derivatisiertes Glykan zu binden, umfasst, wobei die Fangsäule ausgestaltet ist, um in Fließrichtung nach der Markierungssäule und vor der Analysesäule verbunden zu werden, wobei das Verfahren ferner das Leiten der derivatisierten Glykane durch die Fangsäule vor dem Trennen der derivatisierten Glykolylamine auf der Analysesäule umfasst, wobei die Fangsäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst und die Analysesäule vorzugsweise eine Umkehrphase als stationäre Phase umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die stationäre Umkehrphase C-18 ist.