CN101874037A - 选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使特定蛋白/肽标记方案与待分析的翻译后修饰的蛋白和/或肽的特异性选择进行组合，从复杂样品中选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽，其中所述翻译后修饰是糖基化。

Description

选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽
发明主题
本发明涉及通过使特定蛋白/肽标记方案与待分析的翻译后修饰的蛋白和/或肽的特异性选择进行组合，从复杂样品中选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽，其中所述翻译后修饰是糖基化。
发明背景
从复杂样品中鉴定、分离和分析特定蛋白或蛋白亚组对于揭示生物过程如何在分子水平上发生、或者蛋白在各种细胞类型中或在生理状态之间差异到何种程度是非常有价值的。
现代生物学中的主要挑战涉及由生物编码的整个蛋白组的表达、功能和调节的理解，即通常称为蛋白组学的技术领域。然而，因为不存在扩增蛋白的可能性，所以这个领域中的研究一般是相当费力的，因为即使相对简单的原核生物的细胞提取物也包含包括巨大浓度范围的多种蛋白。因此，此种任务超出任何目前简单分析法的能力。
因此，由于方法学限制，蛋白组分析不仅依赖于用于鉴定且定量蛋白的方法，还在相当大的程度上也依赖于根据其结构和/或功能性质允许其精确和可靠分离的方法，其中这些亚组随后更易于进一步分析。
蛋白组具有动态性质，响应细胞环境中的外界刺激或改变而具有蛋白合成、激活和/或翻译后修饰的改变。因此，蛋白组的固有复杂性超过细胞的基因组或转录组mRNA互补序列的复杂性。
由于在此种蛋白组学研究中待处理的非常大量的数据，所以蛋白/肽鉴定过程需要巨大的分辨能力。通常用于分辨此种高度复杂混合物的两种方法是二维凝胶电泳(2D-GE；参见例如，O′Farrell，P.H.(1975)J.Biol.Chem.250，4007-4021)和(二维)液相层析((2D)-LC；参见例如，Lipton，M.S.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，11049-11054)。通过2D-GE或2D-LC分离的肽和蛋白通常通过质谱法或通过测定氨基酸组成和/或氨基酸序列进行鉴定。
然而，尽管对于许多应用有用，但这些鉴定技术在要研究高度复杂样品的蛋白质组学研究方面具有主要缺点。例如，疏水膜蛋白质、高度碱性或酸性蛋白质、非常大或非常小的蛋白质通常经由2D-GE弱分辨。此外，这些方法的检测(灵敏度)限制以及标记技术中的缺陷不允许平行可靠分析多种样品，例如用于比较不同疾病组、疾病的不同进展阶段之间，或疾病状态与健康对照之间的相对蛋白水平或用于执行高通量筛选分析。
因此，高度希望开发克服上述局限性并且使得能够平行处理多种复杂样品的方法。
一般而言，特别是蛋白组学中，蛋白分析的另一个重要方面涉及研究翻译后蛋白修饰的可能性，翻译后蛋白修饰可以影响蛋白的活性和结合并且改变其在细胞内的作用(参见例如，Pandey，A.和Mann，M.(2000)Nature 405，837-846)。例如，蛋白的(可逆)磷酸化对于调节许多信号转导级联例如G蛋白偶联的受体信号传递或磷酸-酪氨酸激酶信号传递是关键的，蛋白糖基化在多细胞生物中的细胞/细胞和细胞/底物识别中起决定性作用，而遍在蛋白化对蛋白进行标记从而进行降解，等等。
蛋白组学的独特特征之一是翻译后修饰可以在较总体的水平上进行研究，因此允许分析包括特定修饰的整个蛋白亚组。单一基因的表达产物代表可能包含大量微异质性的蛋白群体，每个不同状态(即在翻译后修饰的氨基酸残基数目方面不同的类似蛋白)对那种蛋白的表达概况增加大量多样性。
目前，存在几种可用的技术，例如质谱法，由于特定修饰的存在或不存在，其在原则上可以区分类似蛋白或肽。然而，由于有限的检测灵敏度，这些改变通常在总体蛋白组学研究中未观察到。因此，为了研究特定翻译后修饰，通常通过某些形式的亲和纯化而针对该修饰富集样品和/或从该样品中分离富集的经修饰的蛋白亚组将是有用的。然而，可用方法一般受用合适亲和标记物标记蛋白的需求或需要使用可能干扰进一步分析的特异性抗体或其他试剂的阻遏。因此，基于亲和纯化的此种方法特别不适合于平行处理多种样品。
此外，基于捕获或亲和纯化方案来区分具有特定修饰的不同亚组的蛋白和/或肽(例如，酪氨酸磷酸化的与丝氨酸/苏氨酸磷酸化的蛋白或N-连接的糖蛋白与O-连接的糖蛋白与糖基磷脂酰肌醇-锚着的蛋白)一般是麻烦的。
蛋白糖基化的研究近年来已指数增长，这是由于来自各个学科的研究者已认识到，关键细胞功能受到此种类型的遍在翻译后修饰类型的调节。
重要的是，聚糖组成显著反映细胞类型和状态，例如物种、组织、发育阶段等的差异。此外，聚糖比核酸和蛋白具有高得多的发挥结构多样性的潜能(Laine，R.A.(1994)Glycobiology 4，759-767)。糖组分的数目相对小，包括例如葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、L-岩藻糖、L-木糖、L-阿拉伯糖和N-乙酰神经氨酸，但键和分支的高度变化使糖基化可能是最复杂的翻译后修饰。
此外，显示了细胞糖基化谱在肿瘤发生过程中显著改变(例如在Caprioli，R.M.(2005)Cancer Res.65，10642 10645中综述)；因此，对可以作为肿瘤诊断的生物标记物的肿瘤分泌的糖蛋白继续进行研究。
因此，持续需要关于允许从复杂样品中选择性富集翻译后修饰的蛋白和/或肽的方法。特别地，将希望提供不仅以高灵敏度还无需特定试剂的、用于分离和/或区分糖基化蛋白和/或肽的方法。此外，还将希望提供允许进行多路分析的此种方法。
发明目的和概述
提供用于从复杂样品中选择性富集翻译后修饰的肽和/或蛋白，特别是糖基化蛋白和/或肽的新方法是本发明的一个目的。更具体而言，提供用于平行执行多个此种分析的方法是本发明的一个目的。
提供允许使翻译后修饰的蛋白和/或肽与其未经修饰的对应物分离和/或区分这些经修饰的蛋白和/或肽的不同亚组是本发明的进一步目的。
这些目的以及根据后续说明书将明确的其他目的通过独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案通过从属权利要求的主题限定。
在一个实施方案中，本发明涉及用于从样品选择性富集和/或分离翻译后修饰的蛋白和/或肽的方法，包括：
(a)对样品中包含的蛋白和/或肽进行单或双化学标记；
(b)捕获翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，所述蛋白和/或肽的亚组包含要分析的特定翻译后修饰；和
(c)分离捕获的翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，
其中所述要分析的翻译后修饰是糖基化。
在进一步的实施方案中，该方法进一步包括在进行步骤(a)之前和/或与进行步骤(a)同时将蛋白切割成肽。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，双化学标记包括同位素和同量异位素标记。特别优选地，在同量异位素标记前进行同位素标记。
在一些实施方案中，在将蛋白切割成肽之前进行同位素标记。
在分析糖基化蛋白和/或肽的情况下，步骤(b)典型地包括凝集素亲和捕获和糖蛋白化学捕获中的至少一种。
在本发明方法的另一优选实施方案中，步骤(c)包括从至少第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽除去翻译后修饰。典型地，化学或酶促除去翻译后修饰。
在进一步的优选实施方案中，第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽包括N-糖基化蛋白和/或肽。特别优选地，通过肽：N-糖苷酶F，从所述N-糖基化蛋白和/或肽酶促除去糖基化。
在本发明方法的另一实施方案中，在进行步骤(c)后，使蛋白分子的其余亚组进行另外的步骤(a)-(c)的循环，并且其中步骤(c)包括从至少第二亚组的蛋白分子除去翻译后修饰。
在一个特定实施方案中，第二亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽包括C-糖基化蛋白和/或肽。
在另一实施方案中，该方法进一步包括通过质谱分析分离的蛋白和/或肽。在一些实施方案中，该方法以高通量形式进行。
本发明的方法可以用于进行定性和/或定量蛋白组分析。
根据下文详述可以明确本发明的其他实施方案。
图例
图1描述了选择性糖基化肽(糖肽)的本发明的一个优选实施方案的示例性说明。首先，使用同位素亲和标签(Isotope-coded AffinityTag)技术(ICAT)对给定样品中包含的蛋白进行同位素标记，并且进行酶促消化。随后，使用用于相对和绝对定量的同量异位素标记(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)技术(iTRAQ)对所得到的肽进行同量异位素标记。合并标记的糖基化肽，通过阳离子交换色谱进行捕获。最后，将糖基化的ICAT/iTRAQ肽和糖基化的iTRAQ肽与它们的非糖基化对应物分离。
图2描绘了用于选择性富集糖基化肽的本发明的另一优选实施方案的示例性说明。在160-或180-标记的水(同位素标记)存在下酶促消化样品中包含的蛋白。然后用iTRAQ对得到的肽的各个合并物进行同量异位素标记。合并标记的糖基化肽，通过阳离子交换层析捕获。最后，将糖基化的160/180-标记的/iTRAQ肽与它们的非糖基化的对应物分离。
图3描绘了用于选择性富集糖基化肽的本发明的另-优选实施方案的示例性说明。使蛋白进行图1描述的相同标记程序以及涉及ICAT-肽(即含半胱氨酸的肽)的亲和选择的两倍捕获/选择程序和图1和2描述的阳离子交换层析。然后，将糖基化的ICAT/iTRAQ肽与它们的非糖基化的对应物分离。
发明详述
本发明基于出乎意料的下述发现：使特定蛋白/肽方案与要分析的翻译后修饰的蛋白和/或肽的特异性选择组合，允许从复杂样品中快速和高度选择性富集和/或分离所述修饰的蛋白。此外，通过适应反应条件，相同方法还适合于区分具有特定翻译后修饰的不同蛋白亚组。
在下文中举例说明性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限定条件的情况下进行实践。
本发明将针对特定实施方案且参考特定附图进行描述，但本发明并不限于其，而仅受权利要求限制。
所述附图仅是示意性的而不是限制性的。在附图中，为了举例说明性目的，某些要素的大小可能是放大的而未按比例描绘。
当术语“包括”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他要素或步骤。为了本发明的目的，术语“由......组成”视为术语“包括”的一个优选实施方案。如果在下文中组定义为包括至少特定数目的实施方案，那么这还应理解为公开优选仅由这些实施方案组成的组。
当提及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”、“该”时，这包括那个名词的复数，除非具体陈述其他事物。
在本发明上下文中的术语“约”指本领域技术人员应当理解仍确保所讨论特征的技术效果的准确度区间。该术语一般指示与所指出的数值±10％、且优选±5％的偏差。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似要素，并且不一定用于描述顺序或时间次序。应当理解如此使用的术语在合适情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以除本文所述或举例说明外的其他顺序操作。
更多的术语定义将在下文中使用术语的上下文中给出。
在一个实施方案中，本发明涉及从样品选择性富集和/或分离翻译后修饰的蛋白和/或肽的方法，包括：
(a)对样品中包含的蛋白和/或肽进行单或双化学标记；
(b)捕获翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，所述蛋白和/或肽的亚组包含要分析的特定翻译后修饰；和
(c)分离捕获的翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，
其中所述要分析的翻译后修饰是糖基化。
如本文所使用的，术语“蛋白”指包括经由肽键连接的多个天然或修饰氨基酸的任何天然存在或合成的(例如通过化学合成或重组DNA技术产生的)大分子。这种分子的长度可以从2-数千个氨基酸(该术语因此也包括通常称作寡肽的分子)。
典型地，术语“蛋白”涉及长度超过20个氨基酸的分子。因此，要在本发明中分析的蛋白可以具有约30至约2500个氨基酸、约50至约1000个氨基酸或约100至约1000个氨基酸的长度。
如本文所使用的，术语“肽”指上述“蛋白”在切割一个或多个肽键后获得的任何片段。如本发明中使用的肽不以任何方式在其大小或性质方面进行限制。典型地，要在本发明中分析的肽可以具有约2至约20个氨基酸、约3至约18个氨基酸或约5至约15个氨基酸的长度。
如本文所使用的，术语“翻译后修饰”应当理解为不对蛋白和/或肽中包括的翻译后修饰的数目和/或类型进行限制。因此，给定蛋白在其序列中可以包括两个或更多个糖基化氨基酸，其可以是相同类型或不同类型(见下文)。
本文使用的术语“糖基化蛋白”(本文也称作“糖蛋白”)和“糖基化肽”(本文也称作“糖肽”)是指任何在一级序列中包含一个或多个糖基化氨基酸残基的蛋白和/或肽，其中所述糖基化可以是N-糖基化、O-糖基化或糖基磷脂酰肌醇-锚着。本文使用的术语“N-糖基化”(本文也称作“N-连接的糖基化”)是指任何糖部分(即碳水化合物或糖部分，包括单糖，如葡萄糖或半乳糖、二糖，如麦芽糖和蔗糖，以及寡糖或多糖)在天冬酰胺氨基酸残基的酰胺氮上的酶指导的和定点的添加，而本文使用的术语“O-糖基化”(本文也称作“O-连接的糖基化”)是指任何糖部分在丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基的羟基氧上的酶指导的和定点的添加。最后，本文使用的术语“糖基磷脂酰肌醇-锚着”(本文也称作“GPI-锚着”)是指在蛋白和/或肽的C-末端氨基酸上添加通过含碳水化合物的接头(例如与磷酸乙醇胺残基连接的葡糖胺和甘露糖)连接的疏水磷脂酰肌醇基团，其中磷脂酰肌醇基团内的两个脂肪酸将蛋白锚着于细胞膜。在本发明的范围内，通过翻译后蛋白修饰可以体内发生氨基酸糖基化，或通过采用特异性糖基转移酶可以体外发生氨基酸糖基化。
借助于本发明的方法从包括糖蛋白和/或糖肽的样品，优选从生物样品富集和/或分离糖蛋白和/或糖肽。如本文所使用的，术语“样品”不意指在执行本发明的方法前必须包括或排除任何处理步骤。样品可以是未经处理的(“粗”)样品、提取的蛋白级分、纯化的蛋白级分等。例如，所采用的样品可以通过一个或多个亚组的充足蛋白的免疫耗竭进行预处理。合适样品包括原核生物(例如细菌或病毒样品)或真核生物来源(例如真菌、酵母、植物、无脊椎动物、哺乳动物且特别是人样品)的样品。
如本文所使用的，术语“复杂样品”指下述事实：使用本发明的方法分析的样品典型地包括大量不同蛋白和/或肽(或此种蛋白和/或肽的不同变体)，其以不同浓度存在。例如，本发明内的复杂样品可以包括至少约500、至少约1000、至少约5000或至少约10000种蛋白和/或肽。本发明中使用的典型复杂样品尤其包括原核生物或真核生物来源的细胞提取物或裂解物以及人或非人体液例如全血、血清、血浆样品等。
如本文所使用的，术语“化学标记”指一种或多种可检测标记物(或“标记”)连接于或掺入本发明中使用的蛋白和/或肽内。如本文所使用的，术语“可检测标记物”指包括一种或多种合适化学物质或酶的任何化合物，其在化学、物理或酶促反应中直接或间接产生可检测化合物或信号。如本文所使用的，该术语应当理解为包括像这样的标记(即与蛋白和/或肽结合的化合物或部分)以及标记试剂(即在与肽或蛋白结合前的化合物或部分)。在本发明中使用的标记可以经由共价或非共价键与蛋白和/或肽的氨基酸残基连接。典型地，键是共价键。标记可以选自同位素标记、同量异位素标记、酶标记、有色标记、荧光标记、生色标记、发光标记、放射性标记、半抗原、生物素、金属络合物、金属和胶体金等，其中同位素标记和同量异位素标记是特别优选的。所有这些类型的标记是本领域充分建立的。
如本文所使用的，术语“单标记”指蛋白和/或肽由仅一类标记，例如仅同量异位素标记的一个或多个可检测标记物进行标记。如本文所使用的，术语“双标记”指蛋白和/或肽由两个不同类型标记，例如同位素标记和同量异位素标记的一个或多个可检测标记物进行标记。
在本发明方法的一个优选实施方案中，蛋白和/或肽是双标记的。特别优选地，蛋白和/或肽的双标记包括同位素标记和同量异位素标记，即同位素标记和同量异位素标记各自的一个或多个分别连接于或掺入要分析的蛋白和/或肽。在本发明的范围内，两个标记步骤可以以任何按顺序的次序或同时执行。然而，在本发明方法的典型实施方案中，同位素标记在同量异位素标记前。可以例如通过生长细胞的代谢标记(例如使用可商购的SILAC(在细胞培养中用氨基酸进行稳定的同位素标记)技术)、完整蛋白的标记(如ICAT标记)、标记(例如160-或180-标记的水)存在下的蛋白消化和消化的肽的标记(例如iTRAQ标记)，将稳定的标记在多个样品制备阶段引入蛋白和/或肽。
如本文所使用的，术语“同位素标记”指使用一组两个或更多个标记进行的标记事件，所述标记具有相同化学式但在一个或多个原子存在的同位素数目和/或类型方面彼此不同，导致可以例如经由质谱法检测的标记的蛋白和/或肽质量方面的差异。换言之，由不同同位素标记进行标记的在其他方面等同的蛋白和/或肽可以因此基于质量方面的差异进行区别。虽然同量异位素标记(参见下文)在原则上构成特定类型的同位素标记，但在本发明的上下文中，术语同位素标记将用于指并非同量异位素但可以因此基于其分子量区分的标记。
根据本发明的同位素标记的例子包括160-或180标记的水或同位素亲和标签(ICAT)标记等等(参见Gygi，S.P.等人(1999)Nat.Biotechnol.17，994-999)。ICAT试剂使用3种功能元件：用于选择性标记还原的半胱氨酸氨基酸残基的硫醇反应基团，允许选择性分离标记的肽的生物素亲和标记，和同位素标记，其以两种同位素形式合成，即“轻”(非同位素)和“重”(利用例如2H或13C)形式。在本发明的范围内，同位素标记可以在肽水平上(例如通过在160-或180标记的水的存在下切割要分析的样品中包含的蛋白)、或例如通过采用商购可得的ICAT试剂(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)直接在蛋白水平上(即在切割前)进行。
如本文所使用的，术语“同量异位素标记”指使用具有相同结构和相同质量的一组两个或更多个标记进行的标记事件，所述标记在断裂后释放由于同量异位素标记内同位素的差异分布而具有相同结构但在质量方面不同的特定片段。同量异位素标记典型地包括在质谱法分析中在碰撞诱导的解离(CID，即片段释放)后产生强标志离子的报道基团、和包括特定补偿数目同位素的平衡基团，以便确保报道基团和平衡基团的组合质量对于不同同量异位素标记是恒定的。平衡基团可以在CID后从标记中释放或不释放。
根据本发明的同量异位素标记的例子包括用于相对和绝对定量标记的同量异位素标记物(iTRAQ)等等(参见Ross，P.L.等人(2004)Mol.Cell.Proteomics 3，1154-1169)。这种方法采用4种不同的iTRAQ试剂，其各自包含报道基团、平衡基团和与伯胺基团(例如，赖氨酸氨基酸残基的ε氨基)反应的肽反应基团。依赖于每种试剂中12C/13C和160/180的不同同位素组合，报道基团具有114、115、116或117Da的质量。平衡基团在质量方面从31到28Da不等，以确保报道基团和平衡基团的组合质量对于4种试剂保持恒定(145Da)。因此，相同肽由这些试剂中的每一种进行标记，得到这样的肽：其是同量异位的，并且因此例如在液相层析中共洗脱，并且因而彼此无法层析区别。然而，在质谱法过程中，至少各自的报道基团在CID后释放，显示114至117Da的不同质量。这些片段的强度可以用于在单次分析中对各个蛋白和/或肽进行定量。
本发明特别涉及组合使用同位素标记和同量异位素标记来进行多路蛋白分析，即，用于平行进行多种分析，例如，2、4、8或16个平行样品。特别地，所述组合的标记策略也使得能够比较不同样品之间的相对蛋白水平。同位素和同量异位素标记的组合物可以具有以下优点：即，仅仅需要例如通过MALDI-MS/MS分析或iTRAQ定量来特异性分析观察到差异表达水平的那些肽，由此得到更快和较不复杂的样品分析。
在优选实施方案中，该方法进一步包括在标记蛋白和/或肽之前或同时，将蛋白切割为肽。在一些实施方案中，在蛋白的同位素标记之后(但在同量异位素标记之前)进行蛋白切割。此种蛋白切割可以用化学(例如，经由酸或碱处理，其采用化学物质例如溴化氰、2-(2′-硝基苯磺酰基)-3-甲基-3-溴-假吲哚(BNPS)、甲酸、羟胺、碘苯甲酸和2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸)或经由本领域众所周知的蛋白酶(包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K等)酶促实现。
本文使用的术语“捕获”是指用于鉴定和随后富集和/或选择特定糖蛋白和/或糖肽亚组的程序，所述糖蛋白和/或糖肽要通过将所述糖蛋白和/或糖肽亚组共价或非共价连接(由此固定)于合适的结合成员(例如合适的基质或树脂；参见下文)的方式进行分析，所述结合成员使得能够将捕获的翻译后修饰的蛋白和/或肽与它们的未标记的对应物进一步分离。任选地，结合成员可以附着于固体支持物如表面(例如顺磁聚苯乙烯颗粒或乳胶珠的表面)，所述固定促进随后分离捕获的蛋白和/或肽亚组。
典型地，捕获步骤至少包括亲和纯化或亲和层析步骤，即，将翻译后修饰的蛋白和/或肽亚组连接(即捕获)于对要选择的蛋白和/或肽亚组具有特异性结合活性的结合成员。但是，捕获步骤也可以依赖于离子交换层析、大小排阻层析、疏水相互作用层析和/或反相排阻层析中的一种或多种。在本发明的范围内，也可以将相同或不同类型的两个或更多个捕获步骤，例如两个亲和层析步骤(使用相同类型或不同类型的基质)或亲和纯化步骤和离子交换层析进行组合。
在一个优选实施方案中，捕获步骤包括凝集素亲和捕获和糖蛋白化学捕获中的至少一种。本文使用的“凝集素亲和捕获”是指采用凝集素作为结合成员的捕获方案。本文使用的术语“凝集素”是指植物、细菌、真菌和动物中发现的一类蛋白，已知其结合特定寡糖部分(综述于Lis，H.，和Sharon，N.(1998)Chem.Rev.98，637 674)。与抗原-抗体结合亲和力不同，单糖和寡糖与大多数凝集素结合的亲和常数在低微摩尔范围，但也可以在毫摩尔范围内。对于亲和捕获目的，寡糖和凝集素这两者自身的多价性质使这些相互作用对层析分离有用。合适的凝集素包括α-sarcin、rizin、concavalin A和钙连接蛋白，等等。用于凝集素亲和捕获的一些方案是本领域已知的(参见例如Kaji等(2003)Nat.Biotechnol.21，667-672；Hirabayashi，J.(2004)Glycoconj.J.21，35 40；Drake，R.R.等(2006)Mol.Cell.Proteomics 5，1957-1967)。
本文使用的术语“糖蛋白化学捕获”是指用于糖蛋白的任何化学捕获程序，但不涉及使用凝集素。很多这些程序涉及离子交换层析步骤。一些程序是本领域充分确立的(参见例如Zhang，H.et al.(2003)Nat.Biotechnol.21，660-666；Sun，B.et al.(2007)Mol.Cell.Proteomics 6，141-149)。
典型地，在这些化学捕获程序中，要分析的蛋白是单或双化学标记的，并且例如通过使用胰蛋白酶或任何其它蛋白酶切割成肽。将消化的肽溶解于终浓度为2mg/100μl缓冲液的偶联缓冲液(100mM醋酸钠，150mM NaCl，pH 5.5)中。通过离心除去任何未溶解的固体。将上清液用于后面的反应。首先通过加入10mM高碘酸钠(终浓度)并且在颠倒旋转下在暗处在室温下将样品温育30分钟，将碳水化合物的顺式二醇基团氧化为醛。随后，加入20mM亚硫酸钠(终浓度)用于猝灭，并且在室温下将样品温育10分钟，以便灭活任何过量的氧化剂。
然后，通过在猝灭的样品中引入终浓度为20mg/ml的酰肼树脂(商购珠的形式)而起始偶联反应。通过形成共价腙键，将碳水化合物的醛基团与酰肼树脂偶联。为了确保固体与液体的比是1∶5，在样品中加入适量的偶联缓冲液。在颠倒旋转下在37℃进行偶联反应过夜。
随后，分别用milliQ-纯净水、1.5M NaCl、甲醇和乙腈将树脂彻底和按顺序洗涤两次。洗涤后是缓冲液交换步骤(即阳离子交换层析步骤)，以调节100mM NH4HCO3的终浓度。
最后，在使用磁珠的情况下，例如通过离心或磁力分离，从样品分离捕获的翻译后修饰的蛋白和/或肽(即连接于结合成员和任选连接于任何固体支持物的蛋白和/或肽)。
在本发明的一个优选实施方案中，分离步骤包括从至少第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽除去翻译后修饰，这促进进一步分离，并且也允许在分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽的不同亚组之间进行区分，其中要除去的翻译后修饰是糖基化。
本文使用的术语“至少第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽”应以这样的方式理解：即，它可以涉及存在的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽的总数或涉及其特定部分。
本文使用的术语“除去”是指要分析的翻译后修饰的完全消除，例如通过化学裂解或酶作用(也参见下文的讨论)。因此，从至少一个亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽除去翻译后修饰，也导致它们从结合成员(任选从固体支持物)的释放。
优选地，通过特定糖苷酶，化学(例如经β-消除)或酶促除去翻译后修饰。
在本发明方法的一个优选实施方案中，至少第一亚组的分离的糖蛋白和/或糖肽包括N-糖基化蛋白和/或肽。
从蛋白和/或肽除去N-连接的糖基修饰优选可以通过以下方法实现：用浓度为500U(1μl)PNGase F/2-6mg粗蛋白的肽∶N-糖苷酶F(PNGase F)在37℃下从糖基部分酶促切割N-连接的肽过夜。PNGase F是一种酰胺酶，其在最内部的GlcNAc和天冬酰胺残基之间，从N-连接的糖蛋白切割出高甘露糖、杂合和复杂寡糖。可以通过离心收集含释放的去糖基化肽的上清液。因此，该程序使得能够选择性区分N-糖基化的蛋白和/或肽与其它类型的糖蛋白和/或糖肽(即分别是O-糖基化的和GPI锚着的蛋白和/或肽)。
尽管PNGase F去糖基化从糖肽除去糖部分，仍然可以通过质谱分析检测糖基化位点，因为对于每个天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸(相应于+1Da的质量差异)。
在另一个典型的实施方案中，本发明的方法，特别是分离步骤，进一步包括在进行步骤(c)后使其余的蛋白分子亚组进行另外的步骤(a)-(c)的循环，其中步骤(c)包括从至少第二亚组的蛋白分子除去翻译后修饰。在本发明方法的另一优选实施方案中，至少第二亚组的分离的糖蛋白和/或糖肽包括O-糖基化蛋白和/或肽。
可以通过采用特定O-糖苷酶的酶促裂解或化学方法例如通过β-消除(即，本领域充分确立的一类消除反应，其中从底物的两个相邻原子除去原子或原子基团，同时形成π键)，实现从蛋白和/或肽除去O-连接的糖基修饰。
在其它实施方案中，该方法进一步包括通过质谱分析分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽，质谱是一种用于测量离子的质量与电荷比的分析技术。采用的具体质谱分析可以取决于不同样品中确定的蛋白和/或肽表达的水平。在一些实施方案中，以高通量形式执行本发明的方法。
在进一步的实施方案中，本发明涉及本文描述的方法用于进行定性和/或定量蛋白组分析的用途。
尽管针对某些优选实施方案描述了上述发明，但这不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员清楚地知道进一步的实施方案和关于先前所述实施方案的改变仍在本发明的范围内。
实施例
实施例1
按照制造商的说明书，分别使用商购的试剂ICAT和iTRAQ进行要分析的样品中包含的蛋白的同位素和同量异位素标记。在进行ICAT标记后，在加入iTRAQ试剂前，将蛋白酶促切割为肽。或者，通过标记一半的样品进行同位素标记步骤，所述标记是通过蛋白酶介导的、将160或180掺入样品中存在的肽的C末端中而进行的。
随后，使双标记的肽进行糖肽捕获程序。将干燥的胰蛋白酶消化的肽溶解于终浓度为2mg/100μl缓冲液的偶联缓冲液(100mM醋酸钠，150mM NaCl，pH 5.5)中。通过离心除去任何未溶解的固体。将上清液用于后面的反应。
首先通过加入10mM高碘酸钠(终浓度)并且在颠倒旋转下在暗处在室温下将样品温育30分钟，将碳水化合物的顺式二醇基团氧化为醛。随后，加入20mM亚硫酸钠(终浓度)，并且在室温下将样品温育10分钟，以便灭活样品中任何过量的氧化剂。
通过在猝灭的样品中引入终浓度为20mg/ml的商购酰肼树脂(珠)而起始偶联反应。为了确保固体与液体的比是1∶5，在样品中加入适量的偶联缓冲液。在颠倒旋转下在37℃进行偶联反应过夜。随后，分别用milliQ-纯净水、1.5M NaCl、甲醇和乙腈将树脂彻底和按顺序洗涤两次。洗涤后是缓冲液交换步骤(即阳离子交换层析步骤)，以调节100mM NH4HCO3的终浓度。
用浓度为500U(1ul)PNGase F/2-6mg粗蛋白的肽∶N-糖苷酶F(PNGase F)在37℃下从糖基部分酶促切割N-连接的肽过夜。PNGase F是一种酰胺酶，其在最内部的GlcNAc和天冬酰胺残基之间，从N-连接的糖蛋白切割出高甘露糖、杂合和复杂寡糖。通过离心收集含释放的去糖基化肽的上清液，与80％乙腈洗涤的上清液合并。
此后，干燥溶液，用0.1％甲酸中的1％乙腈重配，并且进行质谱(MS)分析。该程序仅仅选择N-连接的糖肽。尽管PNGase F去糖基化从糖肽除去糖部分，仍然可以通过质谱分析检测糖基化位点，因为对于每个天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸。或者，可以通过特定O-糖苷酶或通过化学裂解，例如β-消除，选择性切割O-连接的糖肽。

Claims (15)

1.用于从样品选择性富集和/或分离翻译后修饰的蛋白和/或肽的方法，包括：
(a)对样品中包含的蛋白和/或肽进行单或双化学标记；
(b)捕获翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，所述蛋白和/或肽的亚组包含要分析的特定翻译后修饰；和
(c)分离捕获的翻译后修饰的蛋白和/或肽的亚组，
其中所述要分析的翻译后修饰是糖基化。
2.权利要求1的方法，进一步包括：在进行步骤(a)之前和/或与进行步骤(a)同时将蛋白切割成肽。
3.权利要求1或2的任一项的方法，其中双标记包括同位素和同量异位素标记。
4.权利要求3的方法，其中在同量异位素标记之前进行同位素标记。
5.权利要求3或4的方法，其中在将蛋白切割成肽之前进行同位素标记。
6.权利要求1-5的任一项的方法，其中步骤(b)包括凝集素亲和捕获和糖蛋白化学捕获中的至少一种。
7.权利要求1-6的任一项的方法，其中步骤(c)包括从至少第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽除去翻译后修饰。
8.权利要求7的方法，其中化学或酶促除去翻译后修饰。
9.权利要求7或8的方法，其中第一亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽包括N-糖基化蛋白和/或肽。
10.权利要求9的方法，其中通过肽：N-糖苷酶F，酶促除去糖基化。
11.权利要求7-10的任一项的方法，其中在进行步骤(c)后，使蛋白分子的其余亚组进行另外的步骤(a)-(c)的循环，并且其中步骤(c)包括从至少第二亚组的蛋白分子除去翻译后修饰。
12.权利要求11的方法，其中第二亚组的分离的翻译后修饰的蛋白和/或肽包括C-糖基化蛋白和/或肽。
13.权利要求1-12的任一项的方法，进一步包括：通过质谱分析分离的蛋白和/或肽。
14.权利要求1-13的任一项的方法，其中该方法以高通量形式进行。
15.权利要求1-14的任一项的方法用于进行定性和/或定量蛋白组分析的用途。
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