JP4583168B2 - 糖タンパク質を定量的プロテオ−ム分析する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プロテオーム規模のスケールでの糖タンパク質およびグリコペプチドの定量的プロファイリングのための方法を提供する。本発明の方法によって複雑なサンプルにおける糖タンパク質の同定および定量、ならびにグリコシル化の部位の決定が可能になる。本発明の方法を用いて、健常および疾患において生物学的システムおよび生物体の動揺に応答して生じる、糖タンパク質の量の変化およびそれらの糖タンパク質上の個々のグリコシル化部位でのグリコシル化の状態の変化を決定することが可能になる。
結合したグリコペプチドを遊離するために酵素切断または化学的切断を用いることに加えて、結合した炭水化物の性質にかかわらず、結合した分子が遊離され得るように固体支持体を設計してもよい。グリコポリペプチドが結合する固体支持体上の反応性基は、切断可能なリンカーでこの固体支持体に連結され得る。例えば、固体支持体反応性基は、切断可能なリンカー、例えば光切断可能なリンカーを介して固体支持体に共有結合されてもよい。例示的な光切断可能なリンカーとしては、例えば、O−ニトロベンジル、デシル、トランス−o−シンナモイル、m−ニトロフェニル、ベンジルスルホニル基を含むリンカーが挙げられる(例えば、DormanおよびPrestwich,Trends Biotech.18:64〜77(2000);GreeneおよびWuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第二版.,John Wiley & Sons,New York(1991);米国特許第5,143,854号;同第5,986,076号;同第5,917,016号;同第5,489,678号;同第5,405,783号を参照のこと)。同様に、反応性基は化学的に切断可能なリンカーを介して固体支持体に連結されてもよい。インタクトな炭水化物を用いるグリコペプチドフラグメントの遊離は、この炭水化物部分が、質量分析法を含む周知の方法を用いて特徴付けられるべきである場合、特に有用である。脱グリコシル化されたペプチドフラグメントを遊離するためのグリコシダーゼの使用はまた、炭水化物部分の性質に対する情報を提供する。
5つの主な血漿タンパク質が総タンパク質の80%より多くに相当する
上記のように、非グリコシル化ペプチドフラグメントは、タンパク質分解または化学的な切断後に固体支持体から遊離される(図1を参照のこと)。必要に応じて、遊離されたペプチドフラグメントを特徴づけして、サンプルから単離されたグリコポリペプチドの性質のさらなる情報を得ることができる。特に有用な方法は、同位体コードされたアフィニティータグ(ICAT(商標))の使用方法である(本明細書に参考として援用される、Gygiら、Nature Biotechnol.17:994〜999(1999))。ICAT(商標)型の試薬の方法は、質量分析法を用いて容易に識別可能である同位体で示差的に標識され得るアフィニティータグを用いる。ICAT(商標)型のアフィニティー試薬は、3つの構成要素である、アフィニティータグ、リンカーおよび反応性基から構成される。
(グリコペプチドの定量的解析)
本実施例は、同位体タグを用いたグリコペプチドの精製および示差的な標識を記載する。
本実施例は、ヒト血清における糖タンパク質のプロファイリングを記載する。
(マクロファージによって分泌された糖タンパク質の定量的プロファイリング)
本実施例は、刺激されたRAW 264.7マウス単球/マクロファージ細胞株から分泌されたタンパク質サンプルの調製を記載する。
(細胞表面タンパク質の定量的なグリコペプチドプロファイリング)
本実施例は、細胞表面糖タンパク質のプロファイリングを記載する。
(マウス腹水の定量的なグリコペプチドプロファイリング)
本実施例は、マウス腹水由来の糖タンパク質のプロファイリングを記載する。
(既知の比を有するコントロールの糖タンパク質の定量的なグリコペプチド解析)
本実施例は、既知の比を有する純粋な糖タンパク質混合物から、および2つの等量のヒト血清タンパク質からの糖タンパク質の定量的解析を記載する。
(N連結グリコシル化のためのN連結グリコシル化部位およびコンセンサスモチーフの同定)
本実施例は、天然のタンパク質においてN連結炭水化物によって占められるアスパラギン残基の同定、および同定されたN連結グリコシル化部位のアラインメントからのコンセンサスモチーフの決定を記載する。
前立腺癌の細胞外基質における糖タンパク質の定量的プロファイリング
前立腺癌は、西洋では男性における最も一般的なガンであって、ガンの死亡率の第二の主な原因である。前立腺は著しくガンを発達させる傾向であって、原因についてはほとんど未知であるので、予防方法は策定できない。前立腺特異抗原(PSA)に基づくスクリーニングの使用によって、前立腺癌のうち80%が局所療法によって処置できる段階で検出され得る。しかし、PSAレベルが上昇することによって示されるような処置の失敗の率は10%〜40%に及び得る。前立腺からのガン細胞の逸脱は明らかに早期の事象であり、多くの患者の試験がその血液および骨髄においてこれらの細胞について陽性である。前立腺癌の診断および処置における課題は、早期に、さらに根治できる段階で、疾患を検出するためのガン診断のためのさらに良好なマーカーを開発すること;さらに正確な予後診断のために前立腺癌進行を分子的に規定すること;および治療標的としてガン細胞表面特異的抗原を同定することである。
(皮膚癌を有するマウスからのグリコペプチドの定量的プロファイリングおよびバイオマーカーの同定)
本実施例は、皮膚癌に関連するバイオマーカーの同定を記載する。
(一晩の絶食の前後に得たヒトの血清サンプル由来のグリコペプチドの定量的プロファイリング)
本実施例は、一晩の絶食の前後の3人の個体の血清サンプル由来のグリコペプチドの定量的プロファイリングおよびクラスタ分割解析を記載する。
(健常な個体またはI型先天性グリコシル化異常症(CDG)を有する患者から得た血清サンプルからのグリコシル化占有率の決定)
本実施例は、グリコシル化の障害を有する個体のグリコペプチドプロファイリングを記載する。
(糖尿病の肥満マウス血清からのグリコシル化のレベルの決定)
本実施例は、糖尿病のモデルにおけるグリコシル化の決定を記載する。
(重型同位体で標識された合成ペプチド標準を用いるN連結グリコペプチドの定量)
本実施例は、標識された合成ペプチド標準を用いる定量を記載する。
(酵素切断を用いるO連結グリコペプチドの同定)
本実施例は、O連結グリコペプチドの同定を記載する。
(ビオチンタグ化ヒドラジンによって単離されるグリコペプチドの同定)
本実施例は、ビオチンタグ化ヒドラジドによって単離されるグリコペプチドの同定を記載する。
(TECANワークステーションを用いるグリコペプチド捕獲方法の自動化)
本実施例は、グリコペプチド解析方法の自動化への適合を記載する。
Claims (48)
- (a)グリコポリペプチドの炭水化物基を誘導体化する工程と;
(b)固体支持体と該誘導体化された炭水化物基との間の共有結合を介して該固体支持体に対して該グリコポリペプチドを固定し、これによって、固定されたグリコポリペプチドを生成する工程と;
(c)該固体支持体を洗浄して非特異的に結合した非グリコシル化ポリペプチドを除去する工程と;
(d)非グリコシル化ペプチドフラグメントを遊離して、固定されたグリコペプチドフラグメントを保持するように、該固定されたグリコポリペプチドを切断する工程と;
(e)同位体タグを用いて該固定されたグリコペプチドを標識する工程と;
(f)該固体支持体から該標識されたグリコペプチドフラグメントを遊離して、これによって標識されたグリコペプチドフラグメントを生成する工程と;
(g)質量分析法を用いて該標識されたグリコペプチドフラグメントを同定および定量して、これによって、該標識されたグリコペプチドフラグメントの同一性および量が、該サンプル中のグリコポリペプチドの同一性および量と相関する工程と;
を包含する、ポリペプチドサンプル中のグリコポリペプチドを同定および定量するための方法。 - 前記固体支持体がヒドラジド部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがグリコシダーゼを用いて前記固体支持体から遊離される、請求項1に記載の方法。
- 前記グリコシダーゼがN−グリコシダーゼまたはO−グリコシダーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがN−グリコシダーゼおよびO−グリコシダーゼの連続的な添加を用いて前記固体支持体から遊離される、請求項4に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントが化学的切断を用いて前記固体支持体から遊離される、請求項1に記載の方法。
- 前記グリコポリペプチドが過ヨウ素酸塩を用いて酸化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記固定されたグリコポリペプチドがトリプシンで切断される、請求項1に記載の方法。
- 前記遊離された非グリコシル化ペプチドフラグメントが同位体標識されて、質量分析法によって解析される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが体液、分泌型タンパク質および細胞表面タンパク質から選択される、請求項1に記載の方法。
- (a)固体支持体とグリコポリペプチド上の誘導体化された炭水化物基との間の共有結合を介して該固体支持体に対して該グリコポリペプチドを結合させ、これによって、固定されたグリコポリペプチドを生成する工程と;
(b)該固体支持体を洗浄して非特異的に結合した非グリコシル化ポリペプチドを除去する工程と;
(c)非グリコシル化ペプチドフラグメントを遊離して、固定されたグリコペプチドフラグメントを保持するように、該固定されたグリコポリペプチドを切断する工程と;
(d)同位体タグを用いて該固定されたグリコペプチドフラグメントを標識する工程と;
(e)該固体支持体から該標識されたグリコペプチドフラグメントを遊離して、これによって、標識されたグリコペプチドフラグメントを生成する工程と;
(f)該標識されたグリコペプチドフラグメントを同定および定量して、これによって、該標識されたグリコペプチドフラグメントの同一性および量が、該サンプル中のグリコポリペプチドの同一性および量と相関する工程と;
を包含する、ポリペプチドサンプル中のグリコペプチドを同定および定量するための方法。 - 前記グリコポリペプチドが酸化されている、請求項11に記載の方法。
- 前記固体支持体がヒドラジド部分を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記グリコポリペプチドが過ヨウ素酸塩を用いて酸化される、請求項12に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがグリコシダーゼを用いて前記固体支持体から遊離される、請求項11に記載の方法。
- 前記グリコシダーゼがN−グリコシダーゼまたはO−グリコシダーゼである、請求項15に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがN−グリコシダーゼおよびO−グリコシダーゼの連続的な添加を用いて前記固体から遊離される、請求項16に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントが化学的切断を用いて前記固体支持体から遊離される、請求項11に記載の方法。
- 前記固定されたグリコポリペプチドがトリプシンで切断される、請求項11に記載の方法。
- 前記遊離された非グリコシル化ペプチドフラグメントが質量分析法によって解析される、請求項11に記載の方法。
- (a)固体支持体とグリコポリペプチド上の誘導体化された炭水化物基との間の共有結合を介して該固体支持体に対して該グリコポリペプチドを結合させ、これによって、固定されたグリコポリペプチドを生成する工程と;
(b)該固体支持体を洗浄して非特異的に結合した非グリコシル化ポリペプチドを除去する工程と;
(c)非グリコシル化ペプチドフラグメントを遊離して、固定されたグリコペプチドフラグメントを保持するように、該固定されたグリコポリペプチドを切断する工程と;
(d)該固体支持体から該固定されたグリコペプチドフラグメントを遊離して、これによって、遊離されたグリコペプチドフラグメントを生成する工程と;
(e)該遊離されたグリコペプチドフラグメントを同定および定量して、これによって、該遊離されたグリコペプチドフラグメントの同一性および量が、該サンプル中のグリコポリペプチドの同一性および量と相関する工程と;
を包含する、サンプル中のグリコペプチドを同定および定量するための方法。 - 前記グリコポリペプチドが酸化されている、請求項21に記載の方法。
- 前記固体支持体がヒドラジド部分を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記グリコポリペプチドが過ヨウ素酸塩を用いて酸化される、請求項22に記載の方法。
- 前記固定されたグリコペプチドフラグメントがグリコシダーゼを用いて前記固体支持体から遊離される、請求項21に記載の方法。
- 前記グリコシダーゼがN−グリコシダーゼまたはO−グリコシダーゼである、請求項25に記載の方法。
- 前記固定されたグリコペプチドフラグメントがN−グリコシダーゼおよびO−グリコシダーゼの連続的な添加を用いて前記固体から遊離される、請求項26に記載の方法。
- 前記固定されたグリコペプチドフラグメントが化学的切断を用いて前記固体支持体から遊離される、請求項21に記載の方法。
- 前記固定されたグリコポリペプチドがトリプシンで切断される、請求項21に記載の方法。
- 前記遊離された非グリコシル化ペプチドフラグメントが質量分析法によって解析される、請求項21に記載の方法。
- (a)試験サンプル由来のグリコポリペプチド上の誘導体化された炭水化物基との間の共有結合を介して第一の固体支持体に対して該試験サンプル由来のグリコポリペプチドを結合させ、これによって、固定された試験グリコポリペプチドを生成する工程と;
(b)コントロールサンプル由来のグリコポリペプチド上の誘導体化された炭水化物基との間の共有結合を介して第二の固体支持体に対して該コントロールサンプル由来のグリコポリペプチドを固定させ、これによって、固定されたコントロールグリコポリペプチドを生成する工程と;
(c)該第一の支持体および第二の固体支持体を洗浄して非特異的に結合した非グリコシル化ポリペプチドを除去する工程と;
(d)非グリコシル化ペプチドフラグメントを遊離して、固定されたグリコペプチドフラグメントを保持するように、該第一の支持体および第二の固体支持体上の該固定されたグリコポリペプチドを切断する工程と;
(e)該各々の支持体上で異なる同位体タグを用いて、該第一の支持体および第二の支持体上の該固定されたグリコペプチドフラグメントを標識する工程と;
(f)該固体支持体から該標識されたグリコペプチドフラグメントを遊離して、これによって、標識されたグリコペプチドフラグメントを生成する工程と;
(g)該標識されたグリコペプチドフラグメントを解析する工程と;
(h)試験サンプルとコントロールサンプルとの間で異なるグリコシル化を有する1つ以上のグリコポリペプチドを同定する工程と;
を包含する、疾患についての診断マーカーを同定する方法。 - 前記グリコポリペプチドが酸化される、請求項31に記載の方法。
- 前記固体支持体がヒドラジド部分を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記グリコポリペプチドが過ヨウ素酸塩を用いて酸化される、請求項32に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがグリコシダーゼを用いて前記固体支持体から遊離される、請求項31に記載の方法。
- 前記グリコシダーゼがN−グリコシダーゼまたはO−グリコシダーゼである、請求項35に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントがN−グリコシダーゼおよびO−グリコシダーゼの連続的な添加を用いて前記固体から遊離される、請求項36に記載の方法。
- 前記標識されたグリコペプチドフラグメントが化学的切断を用いて前記固体支持体から遊離される、請求項31に記載の方法。
- 前記固定されたグリコポリペプチドがトリプシンで切断される、請求項31に記載の方法。
- 前記遊離された非グリコシル化ペプチドフラグメントが質量分析法によって解析される、請求項31に記載の方法。
- 前記疾患がガンである、請求項31に記載の方法。
- ヒドラジド樹脂、過ヨウ素酸塩、および1対の示差的に標識された同位体タグを備える、請求項1〜20または31〜41のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキット。
- 前記方法の工程が工程(a)から始まる、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)が工程(b)に先行する、請求項43に記載の方法。
- 前記方法の工程が工程(a)から始まる、請求項11に記載の方法。
- 工程(c)が工程(a)に先行する、請求項45に記載の方法。
- 前記方法の工程が工程(a)から始まる、請求項21に記載の方法。
- 工程(c)が工程(a)に先行する、請求項47に記載の方法。
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