DE102013212131A1 - Ein mikrofluidischer HPLC-Chip für Glykopeptid-Analyse mit integrierter HILIC-Anreicherung - Google Patents

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Abstract

Ein mikrofluidisches Gerät zur Glykopeptid-Analyse enthält eine Anreicherungssäule, die zum Binden von Kohlenhydraten in der Lage ist; eine Trapping-Säule, die zum Binden von Peptiden in der Lage ist; wobei die Trapping-Säule konfiguriert ist, stromabwärts der Anreicherungssäule angeschlossen zu werden; eine Trennsäule, wobei die Trennsäule konfiguriert ist, stromabwärts der Trapping-Säule angeschlossen zu werden; und eine Mehrzahl von Ports, die zum Zusammenarbeiten mit einem Schaltgerät konfiguriert sind, um eine Mehrzahl von Flusspfaden zu bilden, wobei einer der Mehrzahl von Flusspfaden es erlaubt, dass die Trapping-Säule in Fluidkommunikation mit der Trennsäule ist. Ein Verfahren zur Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts, aufweisend eine Trapping-Säule und eine Trennsäule, wobei das Verfahren aufweist: Applizieren einer Probe von Peptiden an das mikrofluidische Gerät; Trappen der Peptide an der Trapping-Säule; Eluieren der Peptide von der Trapping-Säule in die Trennsäule; und Trennen der Peptide an der Trennsäule.

Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Analyse von Glykopeptiden. Insbesondere betrifft die Erfindung mikrofluidische Geräte für die Analyse von Glykopeptiden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Glykosylierung ist die üblichste nachtranslatorische Modifikation der Zelloberfläche und extrazellulärer Matrixproteine. Glykoproteine spielen wichtige Rollen in vielen Zellfunktionen, wie zum Beispiel Zelladhäsion und Immunreaktionen. Veränderungen in Profilen von Glykoproteinen sind mit veränderten physiologischen Bedingungen und mit Krankheitszuständen korreliert worden, wie zum Beispiel Krebs und Gelenkrheumatismus. Daher ist es wichtig, in der Lage zu sein, die Zustände der Protein-Glykosylierung zu charakterisieren.
  • Glykoproteine können an unterschiedlichen Glykosylierungsstellen (Glycosites) glycosyliert werden. Glykosylierung findet typischerweise an Asparagin- (N-Glykosylierung) oder Serin-(O-Glykosylierung) Resten der Glycosites statt. An jeder potentiellen Glycosite kann oder kann nicht ein Glycin an das Protein angelagert werden. Selbst wenn Glycine an einem bestimmten Glycosite vorliegen, können verschiedene Glycine (Oligosaccharide) an der Glycosite angelagert werden. Diese strukturelle Heterogenität kompliziert das Studium von Glykoproteinen.
  • Das Abbilden von Glykosylierungsstellen in Proteinen ist eine schwierige und zeitaufwendige Aufgabe, die Wissen auf Expertenniveau erfordert. In einem typischen Arbeitsablauf wird ein Glykoprotein oder eine Mischung von Glykoproteinen mit Trypsin (oder einer anderen Protease) verdaut und dann unter Verwendung des Enzyms PNGase F in Lösung deglykosyliert. Wie oben angemerkt, sind diese manuellen Prozesse zeitaufwendig und erfordern eine relativ große Menge von Probe.
  • Strukturelle Studien von Glykoproteinen werden oft mit Massenspektrometrie (MS) durchgeführt. Eine MS-Analyse von Glykoproteinen oder Glykopeptiden ist historisch eine herausfordernde Aufgabe gewesen. Eine der Begrenzungen des Fortschritts ist das Fehlen von robusten, schnellen und einfachen Werkzeugen zum Profilieren von Glycosites. Die Schwierigkeit in diesen Analysen ist hauptsächlich mit den einzigartigen Eigenschaften von Polypeptiden verbunden: (1) In einem gegebenen Proteinverdau (protein digest) können Glykopeptide hinsichtlich ihrer Menge viel niedriger sein als die Nicht-Glykopeptid-Gegenstücke; (2) Glykosylierungsstellen werden oft von einer heterogenen Mischung von Glykoformen besetzt, was ihre Signalintensitäten in dem MS-Modus verringert (aufgrund der Verteilung des Gesamtsignals auf mehrere Peaks); und (3) Elektrospray-Ionisierung (die üblicherweise für MS-Analyse von Biomolekülen eingesetzt wird) von Glykopeptiden wird durch Nicht-Glykopeptide unterdrückt, die in derselben Probe vorliegen können. In einigen Fällen kann das Vorliegen von Nicht-Glykopeptiden die Ionisierung von Glykopeptiden vollständig unterdrücken, und daher ihre MS-Signale. Um mit diesen Schwierigkeiten umzugehen, werden Glykopeptide typischerweise von Proteinverdau durch eine Anzahl von Techniken gereinigt, wobei in den häufigsten Fällen eine Art von mühsamer Offline-Festphasenextraktion involviert wird. Dieser Ansatz ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig.
  • Vor Kurzem haben Bynum et al. ein mikrofluidisches Gerät zum Analysieren von Kohlenhydraten offenbart, die von Glykoproteinen freigesetzt worden sind (US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2010/0190146, wobei deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in die vorliegende Offenbarung mit einbezogen wird). Das offenbarte mikrofluidische Gerät ist effizient und für die Analyse von Kohlenhydraten bequem, die von Glykoproteinen freigesetzt sind. Das Gerät, das in der 2010/0190146-Anmeldung offenbart ist, ist ähnlich zu dem Agilent mAb-Glyco-Chip, der für Onchip-Deglykosylierung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) genauso wie für eine nachfolgende Onchip-Anreicherung, Trennung und MS-basierte Detektion von geschnittenen N-Glycinen mit einem Agilent HPLC-Chip/MS-System ausgebildet ist. Deglykosylierung basiert auf einer integrierten immobilisierten PNGase F Enzym-Reaktionssäule (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien).
  • Während Glykopeptide analysiert werden können, wie sie sind (zum Beispiel mit den Kohlenhydraten, die an den Peptiden angelagert sind), ist es manchmal wünschenswert, die Kohlenhydrate an den Glykopeptiden zu entfernen, so dass es einfacher wäre, die Kohlenhydrate und die Peptid-Fragmente separat zu charakterisieren. Der Prozess des Entfernens von Kohlenhydraten von Glykoproteinen oder Glykopeptiden (das heißt Deglykosylierung) beinhaltet traditionell eine enzymatische Reaktion in Lösung mit PNGase F oder einer ähnlichen Glykosidase, was eine lange (zum Beispiel 12 Stunden oder länger) Inkubationszeit erfordert. Der Deglykosylierungsprozess ist zeitaufwendig und ist mühsam, und die manuellen Operationen sind fehleranfällig.
  • Daher gibt es ein anhaltendes Erfordernis für verbesserte mikrofluidische Geräte für Glykopeptid-Analyse.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein exemplarisches Ausführungsbeispiel der Erfindung stellt ein mikrofluidisches Gerät zur Glykopeptid-Analyse bereit, das enthält: eine Anreicherungssäule, die zum Binden von Kohlenhydraten in der Lage ist; eine Trapping-Säule, die zum Binden von Peptiden in der Lage ist; wobei die Trapping-Säule konfiguriert ist, stromabwärts der Anreicherungssäule angeschlossen zu werden; eine Trennsäule, wobei die Trennsäule konfiguriert ist, stromabwärts der Trapping-Säule angeschlossen zu werden; und eine Mehrzahl von Ports, die zum Zusammenarbeiten mit einem Schaltgerät konfiguriert sind, um eine Mehrzahl von Flusspfaden zu bilden, wobei einer der Mehrzahl von Flusspfaden es erlaubt, dass die Trapping-Säule in Fluidkommunikation mit der Trennsäule ist.
  • Ein anderes exemplarisches Ausführungsbeispiel der Erfindung stellt ein Verfahren zur Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts bereit, aufweisend eine Trapping-Säule und eine Trennsäule, wobei das Verfahren aufweist: Applizieren einer Probe von Peptiden an das mikrofluidische Gerät; Trappen der Peptide an der Trapping-Säule; Eluieren der Peptide von der Trapping-Säule in die Trennsäule; und Trennen der Peptide an der Trennsäule.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Ansatz bereit, zum Beispiel in der Form eines HPLC-LC/MS-Chips, der den Prozess der Glykopeptid-Analyse signifikant verbessert. Die Erfindung verwendet eine HILIC-Anreicherung mit einer Trennung stromabwärts unter Verwendung von Umkehrphasen (reversed phase, RP)-Chromatographie. Die hierin beschriebenen Geräte koppeln einzigartig HILIC-Reinigung mit C18-Trennung, was aufgrund der Unterschiede in dem organischen Gehalt, der zum Probenladen (hochorganisch für HILIC und hochwässrig für RP) verwendet wird, zuvor als eine unmögliche Anordnung gesehen worden ist. Hierin auch offenbart ist ein HPLC-Chip, der eine schnelle N-Deglykosylierung von Glykopeptiden von Proteinverdau bereitstellt, was zum Ermitteln von N-Glycosites und von N-Glycosite-Besetzung nützlich ist.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung im Allgemeinen mikrofluidische Geräte für Polypeptid-Analyse. Ein Gerät gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung weist eine Trapping-Säule auf, die eine stationäre Phase aufweist, die dazu in der Lage ist, Peptide zu binden; eine Trennsäule, die eine stationäre Phase aufweist, die zum Trennen von Peptiden in der Lage ist; und eine Mehrzahl von Ports, die konfiguriert sind, mit einem Schaltgerät zu arbeiten, um eine Mehrzahl von Flusspfaden zu bilden, wobei einer der Mehrzahl von Flusspfaden es erlaubt, dass die Trapping-Säule in Fluidverbindung mit der Trennsäule ist. Ein Gerät kann ferner eine Anreicherungssäule aufweisen, die zum Binden von Kohlenhydraten in der Lage ist. Die Anreicherungssäule kann eine hydrophile Interaktions (HILIC, hydrophilic interaction)-stationäre Phase aufweisen. Die Trapping-Säule kann eine hydrophile Interaktions (HILIC)-stationäre Phase aufweisen, eine Umkehrphasen-stationäre Phase oder eine poröse Graphitkohle (PGC, porous graphitic carbon) stationäre Phase aufweisen. Die Trennsäule weist eine Umkehrphasen-stationäre Phase oder eine poröse Graphitkohle (PGC) stationäre Phase auf, wobei die Umkehrphasen-stationäre Phase eine C-18 Silica-basierte stationäre Phase sein kann.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann ein hierin beschriebenes mikrofluidisches Gerät ferner eine Deglykosylierungssäule aufweisen, die eine Festkörperbasis aufweist, die immobilisiert daran eine Glykosidase hat. Die Glykosidase kann aus PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 oder Endo H ausgewählt sein. Vorzugsweise ist die Glykosidase PNGase F. In dem hierin beschriebenen Gerät kann die Trapping-Säule eine Polymer-basierte Umkehrphasen-Säule und die Trennsäule eine Silica-basierte Umkehrphasen-Säule sein.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann ein beliebiges der obigen mikrofluidischen Geräte Teil eines Systems zum Analysieren einer Probe sein, insbesondere einer Probe von Glykoproteinen oder Glykopeptiden. Das System kann ferner ein Schaltgerät (zum Beispiel ein Rotor oder ein Rotorschalter) und/oder ein Massenspektrometer aufweisen. Ein Schaltgerät (oder ein Rotor) enthält Kanäle, die an Einlass-/Auslass-Ports an dem mikrofluidischen Gerät angeschlossen werden können, um unterschiedliche Flusspfade zu bilden.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung im Allgemeinen Verfahren für die Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts, das eine Trapping-Säule und eine Trennsäule aufweist. Ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung enthält das Applizieren einer Probe von Peptiden auf das mikrofluidische Gerät; Trappen der Peptide an der Trapping-Säule; Eluieren der Peptide von der Trapping-Säule in die Trennsäule; und Trennen der Peptide an der Trennsäule.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das mikrofluidische Gerät ferner eine Anreicherungssäule aufweisen, und das Verfahren weist darüber hinaus den Schritt des Anreicherns der Peptide an der Anreicherungssäule vor dem Trappen der Peptide an der Trapping-Säule auf. Die Anreicherungssäule weist eine hydrophile Interaktions (HILIC)-stationäre Phase auf.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das mikrofluidische Gerät ferner eine Deglykosylierungssäule aufweisen, die eine Festkörperbasis aufweist, die daran immobilisiert eine Glykosidase aufweist, und das Verfahren kann ferner das Passierenlassen der Probe von Peptiden durch die Deglykosylierungssäule vor dem Trappen der Peptide an den Trapping-Säulen aufweisen. Die Glykosidase kann ausgewählt werden aus PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 oder Endo H. Vorzugsweise ist die Glykosidase PNGase F. Die Trapping-Säule ist eine Polymer-basierte Umkehrphasen-Säule. Die Trennsäule ist eine Silica-basierte Umkehrphasen-Säule.
  • Andere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen offensichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens von Glykoprotein-Analyse gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 2 zeigt eine schematische Ansicht eines mikrofluidischen Geräts für Glykoprotein- oder Glykopeptid-Analyse gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 3 zeigt ein mikrofluidisches Gerät für Glykoprotein- und Glykopeptid-Analyse und die Operationen von unterschiedlichen Zuständen des Geräts gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 4 zeigt ein anderes mikrofluidisches Gerät für Glykoprotein- oder Glykopeptid-Analyse gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 5 zeigt ein Flussdiagramm, das unterschiedliche Verfahren von Glykoprotein- oder Glykopeptid-Analyse gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt.
  • 6 zeigt ein anderes mikrofluidisches Gerät für Glykoprotein- oder Glykopeptid-Analyse, das einen Deglykosylierungsreaktor gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung implementiert.
  • 7 zeigt Ergebnisse einer Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines Geräts von 3 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 8 zeigt Ergebnisse einer Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines Geräts von 4 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 9 zeigt die Peptidsequenz und die Glykosylierungsstellen der Peaks, die in 8 gezeigt sind.
  • 10 zeigt Ergebnisse der Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines Geräts von 6 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 11 zeigt Ergebnisse der Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines Geräts von 6 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 12 zeigt einen Reaktionsmechanismus von einer Glykosidase-Reaktion. 13A zeigt Massenspektrometrie-Ergebnisse einer Glykosidase-Reaktion, die in regulärem Wasser durchgeführt worden ist.
  • 13B zeigt Massenspektrometrie-Ergebnisse einer Glykosidase-Reaktion, die gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung in 18O angereichertem Wasser durchgeführt worden ist.
  • 14 zeigt eine Gestaltung des Glykopeptid-Anreicherungschips.
  • 15 zeigt eine Analyse eines Transferrin-tryptischen Verdauens.
  • 16 zeigt eine Analyse eines Fetuin-tryptischen Verdauens.
  • 17 zeigt eine Gestaltung eines HPLC-Chips für Online-N-Deglykosylierung von Glykopeptiden.
  • 18 zeigt eine Online-N-Deglykosylierung eines Fetuin-tryptischen Verdauens.
  • 19 zeigt eine Online-N-Deglykosylierung eines Transferrin-tryptischen Verdauens.
  • Definitionen
  • Ein „mikrofluidisches Gerät“ ist ein Gerät, das Kammern und/oder Kanäle von Mikrometer- oder Submikrometer-Dimensionen aufweist, welche das Passieren von Fluid erlauben. Die Kammern oder Kanäle sind im Allgemeinen zwischen 1 µm bis weniger als 1000 µm im Durchmesser (oder, falls nicht kreisförmig, die größte Dimension des Querschnitts), wie zum Beispiel 1 µm bis 500 µm, 10 µm bis 300 µm, 50 µm bis 250 µm, um Beispiele anzugeben.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Glykoprotein“ auf ein natürlich vorkommendes Protein, das daran angelagert ein oder mehrere Kohlenhydrate hat. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Glykopeptid“ auf ein Fragment eines Glykoproteins, das daran angelagert ein oder mehrere Kohlenhydrate hat. „Glykopeptide“ werden typischerweise von „Glykoproteinen“ mittels Protease-Spaltung erzeugt. Ein „Glykopeptid“ kann ein „Peptidteil“ und ein oder mehrere „Kohlenhydratteile“ aufweisen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „deglykosyliertes Peptid“ auf ein Glykopeptid, das Gegenstand einer Deglykosylierungsreaktion gewesen ist, um seine Kohlenhydrate zu entfernen. Mit anderen Worten stammt ein „deglykosyliertes Peptid“ von einem Glykopeptid, aber hat kein oder im Wesentlichen kein Kohlenhydrat daran angelagert. Deglykosylierungsreaktionen involvieren typischerweise Glykosidasen, was Enzyme sind, die Kohlenhydrate von Glykoproteinen entfernen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Anreicherungssäule“ auf eine Säule an einem mikrofluidischen Gerät, die eine stationäre Phase zum Binden von Kohlenhydratteilen an Glykopeptiden derart hat, dass Glykopeptide in Hinsicht auf Konzentrationen angereichert werden. Beispiele von „Anreicherungssäulen“ zur Verwendung in Ausführungsbeispielen der Erfindung weisen Säulen auf, die eine stationäre Phase für hydrophile Interaktions-Chromatographie (hydrophilic interaction chromatography, HILIC) haben. Viele HILIC-stationäre Phasen sind im Stand der Technik bekannt und können mit Ausführungsbeispielen der Erfindung verwendet werden. Die stationäre Phase von HILIC weist typischerweise polare Materialien, wie zum Beispiel Silica, Cyano, Amino, Diol, etc., auf.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Trapping-Säule“ auf eine Säule an einem mikrofluidischen Gerät mit einer stationären Phase zum Binden von entweder den Kohlenhydratteilen oder den Peptidteilen von Glykopeptiden, so dass Peptide (zum Beispiel Glykopeptide und/oder deglykosylierte Peptide) in Hinsicht auf Konzentrationen getrappt oder angereichert werden. Wenn eine „Trapping-Säule“ ausgewählt wird, um die Kohlenhydratteile von Glykopeptiden zu binden, kann die Trapping-Säule eine stationäre Phase für hydrophile Interaktions-Chromatographie (HILIC) haben. Allerdings kann oder kann nicht die besondere stationäre Phase, die in der Trennsäule verwendet wird, dieselbe sein, die in der Anreicherungssäule verwendet wird, wie oben beschrieben. Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Anreicherungssäule und die Trapping-Säule dieselbe Säule sein – das heißt, diese zwei Funktionen werden durch eine einzige Anreicherungs-/Trapping-Säule verwirklicht. Wenn eine „Trapping-Säule“ ausgewählt wird, um die Peptidteile von Glykopeptiden zu binden, kann die Trapping-Säule eine PGC- oder Umkehrphasen-stationäre Phase aufweisen, wobei die Umkehrphasen-stationäre Phase eine Polymer-basierte oder Silica-basierte stationäre Phase sein kann. Jede beliebige Umkehrphasen-stationäre Phase, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, wie zum Beispiel C-1, C-4, C-8 und C-18.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Trennsäule“ eine analytische Säule an einem mikrofluidischen Gerät, die eine stationäre Phase zum Trennen von Peptiden (zum Beispiel Glykopeptiden und/oder deglykosylierten Peptiden) hat. Die „Trennsäule“ kann die Peptide mittels Elektrophorese oder Flüssigchromatographie (LC), insbesondere HPLC, trennen. Beispiele für HPLC- „Trennsäulen“ zur Verwendung in Ausführungsbeispielen der Erfindung enthalten Säulen mit einer PGC- oder Umkehrphasen-stationären Phase, wobei die Umkehrphasen-stationäre Phase eine Polymer-basierte oder Silica-basierte stationäre Phase sein kann. Jede beliebige Umkehrphasen-stationäre Phase, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, wie zum Beispiel C-1, C-4, C-8 und C-18.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Ausführungsbeispiele der Erfindung betreffen mikrofluidische Geräte für Glykopeptid-Analyse. Im Speziellen sind mikrofluidische Geräte der Erfindung für die Analyse von Glykopeptid abgeleiteten Peptiden, mit oder ohne daran angelagerten Kohlenhydraten. Solche Peptide können Glykopeptide sein, die mittels Protease-Spaltung aus Glykoproteinen erzeugt werden. Diese Glykopeptide können „wie sie sind“ analysiert werden (das heißt ohne Entfernung der Kohlenhydrate). Alternativ können die Glykopeptide weiter deglykosyliert werden, unter Verwendung von Glykosidasen, und dann als deglykosylierte Peptide analysiert werden. Diese mikrofluidischen Geräte stellen bequeme und effiziente Werkzeuge für die Analyse von Glykostellen bereit.
  • Daher verbessert der HPLC-LC/MS-Chip der Erfindung signifikant den Prozess der Glykopeptid-Analyse. Die Erfindung verwendet HILIC-Anreicherung mit Stromabwärtstrennung unter Verwendung von Umkehrphasen-Chromatographie. Die hierin beschriebenen Geräte koppeln in einzigartiger Weise HILIC-Reinigung mit C18-Trennung, was früher als eine unmögliche Anordnung angesehen worden ist, aufgrund der Unterschiede in dem organischen Gehalt, der zum Probenbeladen verwendet wird (hochorganisch für HILIC und hochwässrig für RP). Auch hierin offenbart ist ein HPLC-Chip, der schnelle N-Deglykosylierung von Glykopeptiden von Proteinverdau bereitstellt, was zum Ermitteln von N-Glycosites und N-Glycositebesetzung nützlich ist.
  • 1 zeigt ein Flussdiagramm, das einen allgemeinen Prozess für Glykoprotein-Analyse darstellt. Wie gezeigt, kann ein Verfahren 10 mit dem Denaturieren der Glykoproteine und dem Erzeugen der Peptid-Fragmente starten (Schritt 11). Die Denaturierung von Proteinen kann optional das Reduzieren mit einem Thiol-Reagenten (zum Beispiel DTT) oder einem anderen Reduktionsmittel aufweisen, um die Disulfid-Bindungen aufzubrechen. Die reduzierte Thiol(-SH) Gruppe kann alkyliert werden (zum Beispiel unter Verwendung von Iodoacetate oder Iodoacetamide), um die reduzierten Thiole vom Wiederbilden der Disulfid-Bindungen abzuhalten. Es wird angemerkt, dass die Denaturierung der Glykoproteine auch mit Hitze oder anderen Mitteln erreicht werden kann. Die denaturierten Glykoproteine werden dann mit Proteasen in kleinere Fragmente geschnitten, um die Analyse zu vereinfachen.
  • Das Schneiden von Glykoprotein wird üblicherweise mit spezifischen Proteasen durchgeführt, wie zum Beispiel Trypsin (spezifische Hydrolyse der Peptid-Bindungen an der Carboxyl-Stelle von Lysin oder Arginin) oder Glu-C Protease (spezifisch für die Peptid-Bindungen an der Carboxyl-Stelle von Glutaminsäure), die vorhersagbare Fragmente produzieren werden. Andere Proteasen, die auch verwendet werden können, können Chymotrypsin, Thrombin, Enterokinase, Faktor Xa oder dergleichen aufweisen.
  • Die proteolytischen Fragmente (Peptide und Glykopeptide) von den Glykoproteinen werden dann einer Reinigung und Identifizierung ausgesetzt, typischerweise unter Verwendung von Chromatographie und Massenspektrometrie (zum Beispiel HPLC/MS) (Schritt 12). Typischerweise verwendetes MS kann Flugzeit (TOF, Time of Flight) MS oder Quadrupol-TOF (Q-TOF) MS aufweisen. Die MS-Analyse kann auch Tandem-MS/MS einsetzen, um Sequenzinformation zu erhalten. Information, die von der MS-Analyse erhalten wird, kann verwendet werden, um die Glykosylierungsstellen und die Identitäten der Kohlenhydrate zu ermitteln (Schritt 13).
  • Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf mikrofluidische HPLC-Chips, welche die Reinigung und die Analyse (zum Beispiel HPLC/MS) von Glykopeptiden vereinfachen können. 2 zeigt ein funktionales Blockdiagramm, das einen Mikrochip gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung darstellt. Wie in 2 gezeigt, kann der Mikrochip 20 drei funktionelle Einheiten aufweisen: Anreicherungseinheit 21, Konzentrations-(Trapping-)Einheit 22 und Trenn-/Analyse-Einheit 23. Diese unterschiedlichen funktionellen Einheiten können durch unterschiedliche Flusspfade an unterschiedlichen Stufen der Operationen (siehe Diskussion unter Bezugnahme auf 3 unten) verbunden werden. Es ist zu beachten, dass in einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung die Anreicherungseinheit 21 und die Trapping-Einheit 22 dieselbe (eine einzige) Einheit sind, wie unten beschrieben.
  • Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Verbindungen zwischen unterschiedlichen funktionalen Einheiten 21, 22 und 23 unter Verwendung von mikrofluidischen Schaltern (oder Rotoren) gesteuert werden. Ein Beispiel eines mikrofluidischen Chips, der Mikrorotoren und Schalter hat, wird in dem Agilent mAb-Glyko-Chip gefunden, welcher für die Analyse von Kohlenhydraten gestaltet ist, assoziiert mit monoklonalen Antikörpermolekülen. Die US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2010/0190146 von Bynum et al. offenbart auch ähnliche mikrofluidische Geräte für die Analyse von Glycinen, die von Glykoproteinen abgelöst worden sind.
  • Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Anreicherungseinheit 21 eine Säule aufweisen, die eine stationäre Phase zum Binden von Kohlenhydraten hat, die an Glykopeptiden angelagert sind. Eine Säule zum Binden von Kohlenhydraten kann eine hydrophile Säule sein. Beispiele für hydrophile Säulen enthalten hydrophile Interaktions-Chromatographie (HILIC). Die stationäre Phase von HILIC weist typischerweise polare Materialien, wie zum Beispiel Silica, Cyano, Amino, Diol, etc. auf. HILIC involviert typischerweise eine mobile Phase mit einem hohen organischen Lösungsmittelanteil. Eine Probe, die Glykopeptide aufweist, die in die Anreicherungseinheit 21 fließen, wird aufgrund der Bindung ihrer Kohlenhydratteile die Glykopeptide anreichern, während Nicht-Kohlenhydrat aufweisende Komponenten (zum Beispiel Peptide oder Salze) hindurchgelangen werden.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann der Mikrochip 20 optional eine Trapping-/Konzentrations-Einheit 22 aufweisen, welche zum Konzentrieren von Glykopeptiden zum Vereinfachen der nachfolgenden Analyse der Glykopeptide unter Verwendung von HPLC verwendet wird. Die hauptsächliche Funktion dieser Konzentrationssäule ist das Trappen und Konzentrieren der Glykopeptide. Daher kann eine Trapp-Säule eine stationäre Phase aufweisen, welche die Kohlenhydratteile und/oder die Peptidteile der Glykopeptide unter den ausgewählten Bedingungen binden kann.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Trapping-Säulen ausgewählt werden, um die Kohlenhydratteile der Glykopeptide zu binden. Solche Säulen zum Binden von Kohlenhydraten können hydrophile Interaktions-Flüssigchromatographie (HILIC)-Säulen aufweisen. Gemäß anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Trennsäulen ausgewählt werden, um die Peptidteile der Glykopeptide zu binden. Solche Säulen zum Binden von Peptiden können zum Beispiel poröse Graphitkohle (PGC) Säulen oder Umkehrphasen (zum Beispiel C-4, C-8 oder C-18) Säulen aufweisen.
  • Gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung können sowohl die Anreicherungs- als auch die Trapping-Säulen hinsichtlich ihrer Fähigkeiten zum Binden der Kohlenhydratteile der Glykopeptide ausgewählt werden. In diesem Fall kann die Verwendung von separaten Anreicherungs- und Trapping-Säulen entbehrlich sein. Statt dessen können diese beiden Funktionen (Anreicherung und Trappen) unter Verwendung einer einzigen Säule durchgeführt werden, wie zum Beispiel einer HILIC-Säule.
  • Falls separate Anreicherungs- und Trapping-Säulen verwendet werden, können diese für ein optimales Binden der Glykopeptide unter den ausgewählten Bedingungen ausgewählt werden. Zum Beispiel wird zur Anreicherung unter Verwendung einer HILIC-Säule ein Lösungsmittel mit einem hohen organischen Gehalt verwendet. In diesem Fall kann man eine orthogonale Bedingung (zum Beispiel eine wasserbasierte mobile Phase) auswählen, um das Trappen unter Verwendung einer Umkehrphasen- oder porösen Graphitkohle-(PGC) Säule durchzuführen. Unter Verwendung solcher orthogonaler Bedingungen können vor der Analyse mehr Unreinheiten entfernt werden.
  • Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung wird die Trenn-/Analyse-Einheit 23 zum Trennen von unterschiedlichen Glykopeptid-Komponenten verwendet. Die Trenn-/Analyse-Einheit kann Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) oder Elektrophorese verwenden, vorzugsweise HPLC. Die HPLC-Säulen, die zur Glykopeptid-Trennung und -Analyse verwendet werden, können zum Beispiel Umkehrphasen- (zum Beispiel C-1, C-4, C-8 oder C-18) oder PGC-stationäre Phasen aufweisen. Die individuellen Komponenten, die an dieser Einheit getrennt werden, können in ein Massenspektrometer zur Identifizierung eingeführt werden. Jedes beliebige Massenspektrometer (zum Beispiel Time of Flight (TOF) MS oder Elektrosprayionisierung (ESI) MS) können mit einem Mikro-HPLC-Chip der Erfindung verwendet werden.
  • 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Mikrochips 30 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Wie gezeigt, weist der Mikrochip 30 eine HILIC-Säule 31 für die Anreicherung von Glykopeptiden, eine Konzentrations-(Trapping-)Säule 32 zum Trappen der Glykopeptide und eine analytische HPLC-Säule 33 für die Trennung der verschiedenen Glykopeptid-Komponenten auf. Der Auslass der HPLC-Säule 33 ist als Schnittstelle mit einem ESI MS gezeigt.
  • Der Mikrochip 30 enthält auch eine Mehrzahl von Einlass/Auslass-Ports 37, die, in Kombination mit Kanälen 36 in einem Rotor oder Schalter 34 oder 35, unterschiedliche Flusspfade bilden können. Ein Einlass-/Auslass-Port (oder „Port“) kann ein Loch, eine Aussparung, eine Öffnung oder eine Kombination von obigen sein, angeschlossen an eine Leitung (zum Beispiel eine kurze Leitung), oder dergleichen, solange der Port es Fluid erlaubt, von einem Ende des Ports zu dem anderen zu gelangen. Die Ports können zum Verbinden unterschiedlicher Teile des Geräts an unterschiedlichen Stufen verwendet werden, wenn der Mikrochip 30 mit geeigneten Kanälen an einem Rotor oder Schalter ausgerichtet und gekoppelt ist. Zum Beispiel kann der Mikrochip 30 an eine Oberseite eines inneren Rotors 34 und eines äußeren Rotors 25 eingepasst werden. Die inneren und/oder äußeren Rotoren können so rotiert werden, dass unterschiedliche Ports in dem Mikrochip 30 mittels Kanälen in dem Rotor verbunden werden. Die unterschiedlichen Kanäle in dem Rotor verbinden unterschiedliche Ports, um unterschiedliche Flusspfade zu bilden. Daher können in Kombination mit den Kanälen an einem Rotor/Schalter die Einlass-/Auslass-Ports an dem Mikrochip 30 unterschiedliche Flusspfade bereitstellen, um eine Anreicherungssäule, eine Trapping-Säule und/oder eine analytische Säule zu verbinden oder zu entkoppeln. Die Verwendung von solchen Rotoren/Schaltern in mikrofluidischen Geräten ist im Stand der Technik bekannt und wird hier nicht im Detail beschrieben, siehe zum Beispiel den Betrieb des Agilent mAb-Glyko-Chip und die US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2010/0190146.
  • Obwohl ein Rotor oben als ein Schaltelement zum Verändern des Fluidkommunikationszustands der Säulen in dem mikrofluidischen Gerät beschrieben worden ist, können andere Schaltelemente (Schalter) verwendet werden, ohne von dem Umfang der Erfindung abzugeraten. Zum Beispiel kann ein Satz von Kanälen und Ventilen mit dem mikrofluidischen Gerät so verwendet werden, dass unterschiedliche Säulen in den Flusspfaden in unterschiedliche Zustände gesetzt werden.
  • In diesem besonderen Beispiel hat der innere Rotor 34 Kanäle zum Anschließen der inneren sechs Ports des Mikrochips 30, wohingegen der äußere Rotor 35 Kanäle zum Anschließen der zehn äußeren Ports an dem Mikrochip 30 aufweist. Die besondere Anzahl von Ports kann verändert werden, um besondere Anforderungen zu erfüllen. Daher dienen diese besonderen Anzahlen nur zur Veranschaulichung und bezwecken nicht, den Umfang der Erfindung zu begrenzen. Verschiedene Anschlusskonfigurationen können mittels Schaltens des inneren Rotors 34 und/oder des äußeren Rotors 35 erreicht werden, um unterschiedliche Einlass/Auslass-Ports an dem Mikrochip 30 auszurichten, wie unten beschrieben.
  • 3 veranschaulicht auch den Betrieb dieses Chips gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung. In einem ersten Schritt (3, oberes linkes Paneel) wird die HILIC-Anreicherungssäule in Linie geschaltet. Eine Glykopeptid-Probe wird in einem hochorganischen Lösungsmittel gelöst und mittels einer Probenpumpe 34 durch die Anreicherungssäule 31 gepumpt. Die Glykopeptide in der Probe binden aufgrund der Anwesenheit von Kohlenhydraten an die HILIC-Anreicherungssäule 31, wohingegen andere Komponenten (Salze, nicht-glykosylierte Peptide, etc.) in den Waste fließen.
  • Dann wird in dem zweiten Schritt (3, oberes rechtes Paneel) die HILIC-Anreicherungssäule 31 Offline geschaltet, zum Beispiel mittels Schaltens des äußeren Rotors 35. Der Flusspfad wird dann mit einem hochwässrigen Lösungsmittel gewaschen.
  • Sobald der Flusspfad mit einem wässrigen Lösungsmittel gefüllt ist, wird in dem dritten Schritt (3, unteres linkes Paneel) der äußere Rotor 35 wieder geschaltet, um die HILIC-Anreicherungssäule 31 zurück in Linie mit dem LC-Fluss zu schalten. Gleichzeitig wird der innere Rotor 34 geschaltet, um die Trapping-Säule 32 (die eine Umkehrphasen-Säule oder eine PGC-Säule sein kann) stromabwärts der HILIC-Anreicherungssäule 31 zu platzieren. Der hochwässrige Gehalt der mobilen Phase bewirkt eine Elution der Glykopeptide von der HILIC-Anreicherungssäule 31. Die eluierten Glykopeptide werden nachfolgend mittels der Trapping-Säule 33 getrappt.
  • Schließlich wird in Schritt 4 (3, unteres rechtes Paneel) der innere Rotor 34 geschaltet, um die Trapping-Säule 32 in Linie mit der analytischen Säule 33 zu platzieren. Die analytische Säule 33 kann eine Umkehrphasen- oder PGC-Säule sein. Die Komponenten der Glykopeptide werden an der analytischen Säule 33 mit einem Gradienten von zunehmend organischem Lösungsmittel getrennt, der mittels der Mikropumpe 38 erzeugt wird. Die getrennten Glykopeptide können zur Analyse oder Identifizierung an ein ESI MS geschickt werden.
  • Wie oben angemerkt, können gemäß einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung die Anreicherung und das Trappen von Glykopeptiden dieselbe Säule verwenden, wie zum Beispiel eine HILIC-Säule. 4 zeigt ein solches Beispiel, in dem eine HILIC-Säule verwendet wird, um die Glykopeptide anzureichern und zu trappen. Dann wird eine analytische Säule (zum Beispiel eine Umkehrphasen-Säule, C-18-Säule) zum Trennen der Glykopeptid- Komponenten verwendet. Es ist zu beachten, dass die hier gezeigten spezifischen Säulen nur aus Gründen der Veranschaulichung gezeigt sind. Ein Fachmann auf dem technischen Gebiet würde erkennen, dass Modifikationen und Variationen möglich sind, ohne von dem Umfang der Erfindung abzugeraten. Zum Beispiel ist es möglich, eine PGC-Säule (statt einer Umkehrphasen-Säule) zu verwenden, um die Glykopeptide zu trennen/zu analysieren.
  • Die obige Beschreibung offenbart Geräte und Verfahren zum Analysieren von Glykopeptiden mittels Verwendens des Vorteils von Kohlenhydratteilen als Handhabe zum Anreichern und Trappen der Glykopeptide. Während die Anwesenheit von Kohlenhydraten an den Glykopeptiden solche Vorteile haben kann, können diese Kohlenhydrate in der Analyse Schwierigkeiten verursachen. Zum Beispiel kann die Heterogenität von Kohlenhydraten die MS- Peaksignale durch Verteilen der Signalintensität über mehrere Peaks aufgrund von Kohlenhydratheterogenität verringern. Zusätzlich ist bekannt, dass die Anwesenheit von Kohlenhydraten an Peptiden auch die Ionisierung der Glykopeptide substantiell unterdrückt, was zu niedrigen Signalintensitäten in dem MS-Spektrum führt. Daher ist es manchmal wünschenswert, in der Lage zu sein, die Kohlenhydrate von den Glykopeptiden vor der Analyse zu entfernen. 5 zeigt ein allgemeines Schema, das unterschiedliche Methoden für die Analyse von Glykoproteinen oder Glykopeptiden darstellt.
  • Wie in 5 gezeigt, werden Glykoproteine typischerweise mit Proteasen hydrolisiert, um kleinere Glykopeptid-Fragmente zu erzeugen, die der Trennung und der Analyse besser zugänglich sind. Das Proteaseschneiden kann mittels beliebigen geeigneten Proteasen durchgeführt werden. Häufig verwendete Proteasen haben bekannte Substratspezifizierungen, wie zum Beispiel Trypsin, Glu-C, Pepsin, etc. Unter diesen Proteasen werden Trypsin und Glu-C häufiger verwendet. Trypsin ist spezifisch für das Schneiden an den grundlegenden Aminosäureseiten (das heißt Lysin oder Arginin), wohingegen Glu-C nach den Glutaminsäuren schneidet.
  • Die Glykopeptid-Fragmente können unter Verwendung der oben beschriebenen Mikrochipgeräte (siehe zum Beispiel 3) getrennt und analysiert werden. Alternativ können die Glykopeptide weiterverarbeitet werden, um die Kohlenhydratteile von den Glykopeptiden zu entfernen, um deglykosylierte Peptide 54 zu erzeugen. Das Entfernen von Kohlenhydraten kann unter Verwendung einer beliebigen bekannten Glykosidase durchgeführt werden, wie zum Beispiel PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 und Endo H.
  • Sobald die Kohlenhydratteile von den Glykopeptiden entfernt sind, können die verbleibenden kohlenhydratfreien Peptid-Fragmente (das heißt deglykosylierte Peptide 54) getrennt und analysiert werden wie normale Peptide, unter Verwendung von Techniken, die für reguläre Peptide 55 bekannt sind, wie zum Beispiel LC/MS.
  • Einige Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf mikrofluidische Chips für die Analyse von Glykopeptiden als deglykosylierte Peptide. Die deglykosylierten Peptide können mit Deglykosylierungsreaktoren erzeugt werden, die an dem mikrofluidischen Chip enthalten sein können. Diese mikrofluidischen Chips sind ähnlich zu dem Agilent mAb-Glyco-Chip. Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung weisen Schlüsselmerkmale von diesen mikrofluidischen HPLC-Chips einen integrierten Deglykosylierungsenzymreaktor, eine deglykosylierte Peptid-Trapping-Säule und eine analytische Säule auf.
  • Die Trapping-Säule kann eine beliebige geeignete Säule sein, die Peptide binden kann, wie zum Beispiel Umkehrphasen-Säulen oder PGC-Säulen. Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die Umkehrphasen-Trapping-Säulen vorzugsweise Polymer-basierte Umkehrphasen-Säulen, da die mobilen Phasen, die von den Enzymreaktoren kommen, neutrale oder leicht alkalische pH-Werte haben können.
  • Die analytischen Säulen für die Analyse der deglykosylierten Peptide können PGC-Säulen oder Umkehrphasen-Säulen sein. Für die Umkehrphasen-Säulen gilt, dass sie Polymer-basierte oder Silica-basierte Umkehrphasen-Säulen sein können.
  • 6(A) und 6(B) zeigen einen mikrofluidischen Chip, der einen Deglykosylierungsenzymreaktor gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung aufweist. Wie gezeigt, weist der mikrofluidische Chip 60 eine Deglykosylierungssäule 61, eine Trapping-Säule 62 und eine Trenn-/Analyse- Säule 63 auf. Wie andere HPLC-Chips können die Geräte Einlass-/Auslass- Ports aufweisen, die in Kombination mit Rotoren unterschiedliche Flusspfade bereitstellen können. Zum Beispiel können ein innerer Rotor (6-Port) und ein äußerer Rotor (10-Port), wie oben beschrieben, verwendet werden, um mit unterschiedlichen Einlass-/Auslass-Ports an den Chips verbunden zu werden, um unterschiedliche Flusspfade zu steuern und zu schalten.
  • Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung weist die Deglykosylierungssäule 61 eine Festkörperbasis auf, an welcher ein Enzym angelagert ist, wobei das Enzym dazu in der Lage ist, Kohlenhydrate von einem Glykoprotein abzuschneiden. In den meisten Glykoproteinen ist der Kohlenhydratrest an den Stickstoff der Amid-Gruppe in Asparagin-Resten (N-gelinkte Glycine) angelagert, oder an den Sauerstoff der Hydroxyl-Gruppe in Serin oder Threonin-Resten (O-gelinkte Glycine). Ein beliebiges Enzym, das die Kohlenhydratreste von Glykoproteinen schneiden kann, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, inklusive Enzyme, die spezifisch für N-gelinkte oder O-gelinkte Glycine sind. Diese Enzyme sind aus dem Stand der Technik bekannt und weisen auf, aber sind nicht beschränkt auf: PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 und Endo H.
  • Materialien und Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen an Festkörperbasen sind im Stand der Technik auch bekannt (siehe zum Beispiel Palm und Novotny, 2005). Die Festkörperbasis in der Deglykosylierungssäule 81 kann Glas oder können Polymerbeads sein, oder ein monolithisches Medium (wie zum Beispiel Polymethacrylat, Polystyren, Polyacrylamid oder dergleichen). Beispiele des Herstellens von Säulen mit immobilisierter Glykosidase können in der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2010/0190146 von Bynum et al. gefunden werden, die ähnliche Deglykosylierungssäulen offenbart.
  • Wie oben angesprochen, kann die Trapping-Säule 62 eine beliebige Säule aufweisen, die deglykosylierte Peptide trappen kann. Solche Säulen können hydrophile Interaktions-Säulen (HILIC-Säulen), Umkehrphasen-Säulen (zum Beispiel C-1, C-4, C-8 oder C-18) oder PGC-Säulen aufweisen.
  • Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Analysesäule 63 eine beliebige geeignete Säule für die Analyse von Peptiden aufweisen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Beispiele von solchen analytischen Säulen können PGC-Säulen, Umkehrphasen-Säulen (zum Beispiel C-1, C-4, C-8 oder C-18) oder Elektrophoresesäulen aufweisen.
  • Die Betriebsweisen von solchen Mikrochips werden Bezug nehmend auf 6(A) und 6(B) beschrieben. Bezug nehmend auf 6(A) wird eine Proteinverdauprobe (protein digest sample) mittels einer Probenpumpe 69 auf das mikrofluidische Gerät 60 geladen. Glykopeptide in der Probe werden in dem Enzymreaktor 81 (zum Beispiel PNGase F Reaktor) deglykosyliert. Dies kann entweder auf eine Durchflussweise oder auf eine „heart-cut“-Weise gemacht werden. Deglykosylierung an solchen immobilisierten Enzymreaktoren erfolgt effizient. Die Reaktion ist typischerweise innerhalb von wenigen Sekunden bis wenigen Minuten vollständig. Dies ist im Vergleich zu der traditionellen Deglykosylierung in Lösung bemerkenswert, was typischerweise 12 Stunden oder länger erfordert. Der Enzymreaktor (oder die Säule) 61 ist in diesem Beispiel so gezeigt, dass er PNGase F aufweist. Allerdings kann jede beliebige andere geeignete Glykosidase verwendet werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Die deglykosylierte Probe verlässt den Enzymreaktor 61 und fließt über die Trapping-Säule 62. Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die Trapping-Säule 62 vorzugsweise eine PGC- oder Polymer-basierte Umkehrphasen-Säule, statt eine Silica-basierte Umkehrphasen-Säule zu sein, weil die mobile Phase, die von dem Enzymreaktor 61 kommt, einen neutralen oder leicht alkalischen pH für die Deglykosylierungsreaktion hat.
  • Sobald die enzymatische Reaktion komplett ist, kann der innere Rotor 64 geschaltet werden, um die Trapping-Säule 62 in Linie mit der analytischen Säule 63 zu platzieren, wie in 6(B) gezeigt. Gemäß Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die analytische Säule 63 vorzugsweise eine Umkehrphasen-Säule. Bei Verwendung einer Umkehrphasen-analytischen Säule 63 kann ein Gradient von zunehmendem organischen Lösungsmittel mittels der analytischen Pumpe 68 erzeugt werden, um die Trennung der Peptide (nun eine Mischung von deglykosylierten Glykopeptiden und unmodifizierten Peptiden) anzutreiben. Die getrennten Peptide können mit Stromabwärts-MS-Detektion analysiert werden.
  • Mit einem Gerät der Erfindung, wie es in 6 gezeigt ist, ist es einfach möglich, die Deglykosylierungsreaktionssäule in Linie und aus der Linie zu schalten. Daher ist es bequem möglich, die Analyse unter Verwendung dieses Geräts unter unterschiedlichen Bedingungen mit oder ohne Deglykosylierung durchzuführen. Dementsprechend kann das Bestätigen der Gegenwart von Kohlenhydraten an Peptid-Fragmenten einfach durchgeführt werden, zum Beispiel mittels MS-Peakverschiebungen aufgrund von Massen(m/z)Veränderungen.
  • Daher stellt die Erfindung eine automatisierte, on-Chip-HILIC-Anreicherung von Glykopeptiden bereit. Minimales Probenbehandeln ist ausreichend, und aufwendige Offline-Reinigungsschritte sind vermieden. Zum Beispiel stellt die resultierende Trennung unter Verwendung einer 150 mm Umkehrphasen-Säule eine sehr hohe Auflösung von Glykoformen bereit. Dieser Chip sollte insbesondere für Glykopeptid-Abbilden geeignet sein, wo der Typ und die Menge von Glycinen an einer gegebenen Stelle identifiziert werden. Der Chip der Erfindung stellt ein schnelles Mittel des Ermitteln von Positionen von N-Glykosylierung an einem Protein bereit und kann auch zum Ermitteln der prozentualen Belegung von N-Glycinen an einer gegebenen Stelle verwendet werden. Online-N-Deglykosylierung von Glykopeptiden, zum Beispiel quantitative Deglykosylierung von N-Glykopeptiden, kann in weniger als 5 Minuten mit resultierender Umkehrphasen-Trennung durchgeführt werden.
  • Ausführungsbeispiele der Erfindung und ihre Anwendungen werden nun anhand der folgenden Beispiele weiter dargestellt. Es wird darauf hingewiesen, dass diese Beispiele nur der Veranschaulichung dienen. Ein Fachmann auf dem technischen Gebiet würde erkennen, dass Modifikationen und Variationen von diesen Beispielen möglich sind, ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Glycosite-Analyse von RNAse B.
  • In diesem Beispiel wird RNAse B, ein Glykoprotein, mit Trypsin verdaut. RNAse B Protein enthält eine einzige Glykosylierungsstelle (-NLT-), die unterschiedliche Kohlenhydrate daran angelagert haben kann. Die Kohlenhydrate sind von dem Hoch-Mannose-Typ, GlcNAc2Manx, wobei x eine ganze Zahl zwischen 5 und 9 sein kann.
  • Das tryptische Verdau wird als Glykopeptide (das heißt ohne Deglykosylierung) analysiert, unter Verwendung eines Mikrochipgeräts, wie in 3 gezeigt. Die Probe wird erst an einer HILIC-Säule angereichert (siehe die Anreicherungssäule 31 in 3), dann an einer PGC-Trapping-Säule konzentriert (siehe die Trapping-Säule 32 in 3). Schließlich werden die Glykopeptide an einer PGC-analytischen Säule (siehe die analytische Säule 33 in 3) getrennt.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der Analyse. Wie in 7 gezeigt, werden fünf unterschiedliche Glykopeptid-Spezies identifiziert, die fünf unterschiedliche Typen von Hoch-Mannose-Glycinen repräsentieren, die an der einzigen Glykosylierungsstelle an einem einzigen tryptischen Fragment angelagert sind. Die fünf Peaks in 7 sind 75 (GlcNAc2Man5), 76 (GlcNAc2Man6), 77 (GlcNAc2Man7), 78 (GlcNAc2Man8) bzw. 79 (GlcNAc2Man9). Die erfolgreiche Trennung von diesen fünf bekannten Spezies attestiert die Nützlichkeit von Ausführungsbeispielen der Erfindung. Ähnliche Ergebnisse werden mit Glu-C- (anstelle von Trypsin-) Verdauen erhalten (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 2: Glycosite-Analyse von Haptoglobin
  • 8 zeigt Ergebnisse unter Verwendung eines Geräts von 4 für die Charakterisierung eines Haptoglobin-Trypsin-Verdaus. Kurz gesagt wurde Haptoglobin zunächst mittels Trypsin verdaut. Ein 50 µg Aliquot von Haptoglobin wurde unter Verwendung einer Membran mit einem Molekulargewicht-Cutoff in 100 mM Ammoniumbicarbonat bei pH 8.0 einem Pufferaustausch unterzogen, mit Trifluorethanol (TFE) denaturiert und mit DDT und Iodoacetamide reduziert und alkalysiert. TFE und andere Salze wurden entfernt, und das Protein wurde mit Trypsin über Nacht bei 37°C verdaut.
  • Das Ergebnis der tryptischen Verdauung wurde an einer HILIC-Säule angereichert und dann an einer Umkehrphasen-C-18-Säule unter Verwendung eines Mikro-HPLC-Chips getrennt, wie in 4 gezeigt. Wie in den Resultaten von 8 gezeigt, sind verschiedene Glykopeptide gut aufgelöst und können mittels MS identifiziert werden. 9 zeigt die partialen Peptid-Sequenzen von Haptoglobin und seine vier N-Glykosylierungsstellen.
  • Ähnliche Experimente sind anstelle von Trypsin auch unter Verwendung von Glu-C durchgeführt worden (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich sind ähnliche Experimente auch unter Verwendung von Erythropoietin und einem Schneiden mit Trypsin oder Glu-C durchgeführt worden (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, und alle unterschiedlichen Spezies der Glykopeptide können identifiziert werden.
  • Beispiel 3: Glycosite-Analyse von Fetuin
  • Die obigen Beispiele zeigen die Nützlichkeit von Mikrochips der Erfindung für die Analyse von Glykopeptiden, die noch Kohlenhydrate enthalten (das heißt ohne Deglykosylierung). Dieses Beispiel und die folgenden Beispiele demonstrieren die Nützlichkeit von Mikrochips der Erfindung, die Deglykosylierungsreaktionen für die Analyse von Glykopeptiden beinhalten, unter Verwendung eines Geräts, wie es in 6 gezeigt ist.
  • 10 zeigt Ergebnisse einer Online-Deglykosylierung und einer Analyse unter Verwendung eines Geräts von 6 zum Analysieren von Fetuin. Fetuin ist ein Glykoprotein, das drei N-Glykosylierungsstellen hat, die von einer Anzahl von komplexen N-Glycinen besetzt werden können. Ein erfolgreicher Betrieb des Geräts wurde durch das Detektieren von allen drei deglykosylierten Peptiden demonstriert, die bei der Probe erwartet wurden, wie in 10 gezeigt. Die Peptidsequenzen sind unter der Figur gezeigt. Es ist zu beachten, dass nach der Deglykosylierung glykosylierte Asn-Reste in Asp-Reste umgewandelt würden (N→D).
  • 10(A) (oberer linker Graph) zeigt ein Total-Compound-Chromatogramm von einem Fetuin-tryptischen Verdau, deglykosyliert unter Verwendung eines „heart-cut“-Ansatzes. 10(B) (unterer linker Graph) zeigt ein Total-Compound-Chromatogramm von einem Fetuin-tryptischer Verdau ohne Deglykosylierung (das heißt die Kohlenhydrate sind noch an den Peptiden angelagert). Es ist zu beachten, dass drei neue Peaks in dem deglykosylierten (10(A)) Chromatogramm erscheinen, korrespondierend zu Glykopeptiden, die deglykosyliert worden sind (N-Glykosylierungsstellen 1, 2 und 3). Der hervorgehobene Bereich (gestrichelter Kasten) stellt Peaks entsprechend der Glykosylierung an Stelle 1 heraus, was ein deglykosyliertes Peptid zeigt (10(A)), das zu einer leicht späteren Retentionszeit als seine glykosylierte Form erscheint (10(B)).
  • Die Massenspektren auf der rechten Seite korrespondieren zu dem Peptid, das Stelle 1 in seiner deglykosylierten Form (10(C)) bzw. in seiner glykosylierten Form (10(D)) enthält. Das deglykosylierte MS-Spektrum ist viel einfacher, als ein Ergebnis des Entfernens von Glycin. Die Massendifferenz zwischen den 5+ Ladungszuständen, beobachtet in jedem Spektrum, korrespondiert mit einem triantennären, trisialysiertem Glycin (Tri-S3), wie erwartet.
  • Beispiel 4: Quantitative Deglykosylierung von menschlichem Transferrin
  • Die Deglykosylierungsreaktoren der Erfindung sind unerwartet effizient. Während Deglykosylierung in einer herkömmlichen Lösungsreaktion typischerweise viele Stunden erfordert (typischerweise 12 Stunden oder mehr), können die immobilisierten Enzyme der Erfindung Kohlenhydrate innerhalb von Minuten oder weniger entfernen. Noch wichtiger ist, dass solche immobilisierten Reaktoren sehr effizient sind und in den meisten Fällen eine komplette Reaktion erreichen können.
  • Die Fähigkeit eines Mikrochips der Erfindung, quantitative (100%) oder im Wesentlichen quantitative Deglykosylierung einer gegebenen Stelle an einem Glykopeptid durchzuführen, wird in diesem Beispiel demonstriert. Menschliches Transferrin, ein Glykoprotein mit zwei N-Glykostellen, wird mit oder ohne Deglykosylierung verdaut und analysiert.
  • 11 zeigt eine Online-Deglykosylierung eines Transferrin- Verdaus. Extrahierte Ionenchromatogramme, die m/z von einem reichlich vorhandenen Glykopeptid und das m/z von der deglykosylierten Version desselben Glykopeptids anpassen, wurden von LS/MS-Läufen von Transferrin mit und ohne Deglykosylierung produziert.
  • Wie gezeigt, verschwindet der Peak für das Glykopeptid mit m/z von 1181,47 (4+) (11(A)) beim Deglykosylieren (11(C)), was ein quantitatives Freisetzen des Kohlenhydrats anzeigt. Begleitend ist das Erscheinen von m/z von 839,37 (3+) (11(B) → 11(D)). Das m/z von 839,37 (3+) korrespondiert zu der Masse des Glykopeptids (m/z von 1181,47 (4+)), minus einem biantennären disialysierten N-Glycin. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Deglykosylierung vollständig ist.
  • Beispiel 5: Bestätigung der Deglykosylierungsreaktion
  • Die obigen Beispiele demonstrieren die Nützlichkeit von Deglykosylierung in der Charakterisierung von Glykoproteinen oder Glykopeptiden. Das Entfernen von Kohlenhydraten von den Glykopeptiden verändert ihre Eigenschaften so, dass man unterschiedliche Säulen für das Trappen und Analysieren der deglykosylierten Peptide verwenden kann. Noch wichtiger ist, dass die Deglykosylierung die Empfindlichkeit der MS-Analyse erhöht und die Peaks vereinfacht. Diese veränderten Eigenschaften können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Deglykosylierung stattgefunden hat, siehe zum Beispiel die Ergebnisse, die in 11 gezeigt sind.
  • Zusätzlich kann Deglykosylierung auch basierend auf seinem Reaktionsmechanismus bestätigt werden. Zum Beispiel stellt 12 den Reaktionsmechanismus einer Glykosidase-Reaktion heraus. Wie gezeigt, wird das N-Glycin auf eine solche Weise hydrolysiert, dass das N-Atom von dem Asparagin-Rest mit dem Kohlenhydratteil endet. Das initiale Produkt ist Kohlenhydrat-Glykosylamin. Das Glykosylamin ist nicht stabil und wird hydrolysiert werden, um die entsprechenden -OH-Spezies zu erzeugen (das heißt frei reduzierendes Ende).
  • Dann wird nach einer Glykosidase-Reaktion der Asparagin-Rest in einen Asparaginsäurerest umgewandelt, was von einer Massenverschiebung von 0,984 Da begleitet wird und mittels MS detektierbar ist. Leider ist die Massenverschiebung von 0,984 Dalton dieselbe wie beim Deamidieren einer beliebigen Amid-Gruppe an dem Peptid, was die Identifizierung der Glykosylierungsstelle mittels MS-Ansätzen vereitelt. Als eine Umgehungslösung könnte man die Deglykosylierung in H2 18O-Wasser durchführen, was ein 18O-Isotop in dem Asparagin-Rest mit einer Erhöhung von 2,989 Dalton bedingt, was leicht von einer Deamidierungsreaktion unterschieden werden kann.
  • 13B zeigt Ergebnisse einer Deglykosylierung in H2 18O unter Verwendung des beschriebenen Geräts, wie in 6 gezeigt. Für dieses Experiment wurde der tryptische Verdau von Transferrin in H2 18O vor dem Injizieren in das HPLC-Chip-Gerät verdünnt.
  • 13(A) zeigt Ergebnisse eines glykosylierten Peptids von Transferrin, hydrolysiert mittels PNGase in Standard-H2O. 13(B) zeigt Ergebnisse desselben glykosylierten Peptids von Transferrin, hydrolysiert mittels PNGase in H2 18O. Es ist anzumerken, dass die isotopische Verteilung der deglykosylierten Peptide durch das Inkorporieren eines 18O-Atoms als ein Ergebnis der experimentellen Bedingungen verändert wird. Diese Isotopenverschiebung kann sofort mit MS detektiert werden. Dieses Beispiel demonstriert, dass man bequem die Deglykosylierungsreaktion bestätigen kann, wenn man einen mikrofluidischen Chip der Erfindung verwendet.
  • Beispiel 6: Online-N-Deglykosylierung von Glykopeptiden
  • 14 zeigt die Gestaltung eines Glykopeptid-Anreicherungschips, welcher eine 40 nl HILIC-Trapping-Säule genauso wie eine 150 mm C18 analytische Säule enthält. Proben werden mittels des Autosamplers mit einer hohen Proportion von Acetonitril auf dem Chip geladen. Nachfolgend schaltet das innere Ventil des Chipwürfelrotors (nicht dargestellt), und die Probe wird von der HILIC-Trapping-Säule mittels des hochwässrigen Gehalts der Nanopumpe desorbiert. Schließlich werden die angereicherten Glykopeptide an der analytischen Säule getrennt. Proben werden mittels Standardmethoden vor der Verdünnung mit Acetonitril und der Analyse denaturiert, reduziert, alkylisiert und verdaut.
  • Die Analyse von Transferrin-tryptischem Verdau ist in 15 gezeigt. 15(A) zeigt eine Standard-C18-HPLC-Chiptrennung einer Transferrin-tryptischen Verdauung. 15(B) zeigt die Analyse von Transferrin-Verdau unter Verwendung von Online-HILIC-Anreicherung. Derselbe LC-Gradient wurde für beide Fälle verwendet, aber für 15(B) ist die Gradientenstartzeit gegenüber jener von 15(A) als ein Ergebnis der Zeit verschoben, die der Desorption der Probe von der HILIC-Trapping-Säule zugewiesen ist. Beide N-Glykosylierungsstellen von Transferrin wurden detektiert. Das mengenmäßig am meisten vorliegende Glycin, das an jeder Stelle vorliegt, ist wie erwartet Bi-S2.
  • 16 zeigt die Analyse von Fetuin-tryptischem Verdau. Das Total- Compound-Chromatogramm zeigt Anreicherung und Trennung von einem Fetuin-Verdau unter Verwendung des beschriebenen HPLC-Chips. Kolorierte Bereiche korrespondieren zu unterschiedlichen Glykopeptiden, welche dieselbe Peptid-Sequenz teilen (rechts angezeigt). Die Trennung basiert primär auf der Peptid-Sequenz und basiert sekundär auf der angelagerten Glykoform.
  • 17 stellt eine Gestaltung eines HPLC-Chips für Online-N-Deglykosylierung von Glykopeptiden dar. Der Chip enthält einen PNGase F Enzymreaktor, eine Polymer-basierte C18-Trapping-Säule und eine 43 mm C18 analytische Säule. 17(A) zeigt, dass mittels des Autosamplers Proteinverdau in
  • Deglykosylierungspuffer auf den Chip geladen wird, wo es sofort durch den Enzymreaktor fließt. Alternativ kann der äußere Rotor geschaltet werden, um eine Inkubation des Proteinverdaus in dem Enzymreaktor für eine benutzerdefinierte Zeitperiode zu erlauben. Nachdem Glycine freigesetzt sind, werden Peptide plus deglykosylierte Peptide an der C18-Trennsäule konzentriert. 17(B) zeigt, dass das innere Ventil des Chipwürfelrotors schaltet, und die Peptide werden an der Umkehrphasen-analytischen Säule getrennt.
  • 18 zeigt Online-N-Deglykosylierung von Fetuin-tryptischem Verdau. Ein tryptischer Verdau von Fetuin wurde präpariert und auf den HPLC-Chip geladen, der in 17 beschrieben ist. Die Aktion von PNGase F auf den tryptischen Verdau ist mittels des Chromatogramms (18(A)) dargestellt. Als ein Kontrollexperiment wurde der Enzymreaktor für das Experiment im Bypass-Modus platziert, wie in 18(C) dargestellt. Drei Peaks in 18(A), mit 1, 2 und 3 bezeichnet, korrespondieren zu deglykosylierten Peptiden, die von PNGase F-Freisetzung der drei N-Glykosylierungsstellen des Proteins erzeugt werden. Die Massenspektren in 18(B) und 18(D) korrespondieren zu einem deglykosylierten Peptid bzw. seinen entsprechenden Glykoformen. Die chromatografischen Peaks, die zum Erzeugen dieser Spektren aufsummiert werden, sind mittels eines gestrichelten Rechtecks in 18(A) und 18(C) dargestellt. Es ist anzumerken, wie einfach das Spektrum in 18(B) verglichen mit dem in 18(D) ist. Massendifferenzen in solchen Spektren korrespondieren zu Glycinen, zum Beispiel Tri-S3, wie in der Figur gezeigt.
  • 19 zeigt eine Online-N-Deglykosylierung von Transferrin-tryptischem Verdau. Ein tryptischer Verdau von Transferrin wurde präpariert und auf den HPLC-Chip geladen, der in 17 gezeigt ist. Experimente ohne (linke Seite) oder mit (rechte Seite) Online-PNGase F Deglykosylierung wurden durchgeführt. Die obere Hälfte der Figur zeigt das Signal entsprechend einem Glykopeptid, wohingegen die untere Hälfte der Figur das Signal entsprechend der deglykosylierten Version dieses Peptids zeigt. Es ist zu sehen, dass das Glykopeptid-Signal vollständig verschwindet, wenn der Enzymreaktor verwendet wird. Auf der anderen Seite tritt ein Signal für das resultierende deglykosylierte Peptid bei Wirksamwerden des Enzyms auf. Es wird beobachtet, dass sich die RT als ein Ergebnis der Deglykosylierung leicht ändert. Diese Information kann verwendet werden, um den Prozentsatz der Glycinstellenbesetzung zu berechnen (diese ist hier 100%).
  • Die obigen Beispiele demonstrieren, dass mikrofluidische Chips der Erfindung für die Analyse von Glykoproteinen und Glykopeptiden nützlich sind, mit oder ohne Deglykosylierung. Wenn Glykopeptide ohne Deglykosylierung analysiert werden, profitieren Ausführungsbeispiele der Erfindung vorteilhaft von den Kohlenhydratteilen an den Glykopeptiden, um die Glykopeptide für die Analyse an mikrofluidischen HPLC-Säulen anzureichern und zu konzentrieren. Mit einigen Ausführungsbeispielen der Erfindung werden sehr effiziente Deglykosylierungsreaktoren verwendet, um die Glykopeptide so zu deglykosylieren, dass sie ohne Beeinträchtigung durch die Kohlenhydratteile analysiert werden können. Da die Geräte der Erfindung einfach von einem mit einem Deglykosylierungsreaktor auf eines ohne einen Deglykosylierungsreaktor ausgetauscht werden können, kann man die Analyse einfach durchführen, um Reaktionen mit und ohne Deglykosylierung durchzuführen, um die Glykostellen zu bestätigen.
  • Vorteile von Ausführungsbeispielen der Erfindung können einer oder mehrere der folgenden sein: Ausführungsbeispiele der Erfindung stellen mikrofluidische Chips bereit, welche die Analyse für Glykopeptiden erleichtern. Die Verwendung von diesen Geräten ist bequem und würde keine Probe verschwenden. Zusätzlich würde man, da die enzymatischen Reaktionen unter Verwendung der immobilisierten Enzymreaktoren bemerkenswert effizienter sind und der Betrieb einfach ist, Zeit und Kosten sparen, wenn man diese Geräte verwendet.
  • Während die Erfindung Bezug nehmend auf eine begrenzte Anzahl von Ausführungsbeispielen beschrieben worden ist, werden Fachleute auf dem technischen Gebiet, die von dieser Offenbarung profitieren, anerkennen, dass andere Ausführungsbeispiele ins Auge gefasst werden können, die nicht von dem Umfang der Erfindung abweichen, wie sie hierin offenbart ist. Dementsprechend sollte der Umfang der Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt werden.
  • In dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen enthalten die Singularformen „ein“ und „der/die/das“ auch die entsprechende Pluralreferenz, sofern nicht der Kontext klar etwas anderes vorgibt.
  • Wenn dies nicht anderweitig definiert wird, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie diese üblicherweise von einem Fachmann verstanden werden. Obwohl beliebige Methoden und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen sind, die hierin beschrieben werden, auch in der Praxis oder zum Testen der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, werden die bevorzugten Methoden und Materialien nun beschrieben. Verfahren, die hierin zitiert werden, können in jeder beliebigen Reihenfolge ausgeführt werden, die logisch möglich ist, zusätzlich zu einer offenbarten bestimmten Reihenfolge.
  • Während die Erfindung Bezug nehmend auf eine begrenzte Anzahl von Ausführungsbeispielen beschrieben worden ist, werden die Fachleute, die von dieser Offenbarung profitieren, es zu schätzen wissen, dass andere Ausführungsbeispiele ins Auge gefasst werden können, die nicht von dem Umfang der Erfindung, wie diese hier offenbart ist, abweichen.
  • Dementsprechend sollte der Umfang der Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt werden.
  • Aufnahme durch Bezugnahme
  • Referenzen und Zitate von anderen Dokumenten, wie zum Beispiel Patente, Patentanmeldungen, Patentpublikationen, Journale, Bücher, Papers, Webinhalte sind in dieser Offenbarung gemacht worden. Alle solchen Dokumente werden hiermit mittels Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke aufgenommen. Jegliches Material oder Teile davon, von dem gesagt wird, dass dieses hierin durch Bezugnahme mit eingezogen wird, aber das mit existierenden Definitionen, Aussagen oder anderem Offenbarungsmaterial in Konflikt stehen, das hier ausdrücklich beschrieben wird, wird nur in dem Umfang aufgenommen, in dem kein Konflikt zwischen diesem aufgenommenen Material und dem vorliegenden Offenbarungsmaterial besteht. Im Falle eines Konflikts ist der Konflikt so aufzulösen, dass die vorliegende Offenbarung als die bevorzugte Offenbarung vorzuziehen ist.
  • Äquivalente
  • Die repräsentativen Beispiele, die hierin offenbart sind, beabsichtigen, die Erfindung zu veranschaulichen, aber werden nicht mit der Intention bereitgestellt, noch sollten sie so ausgelegt werden, dass der Umfang der Erfindung begrenzt wird. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung und viele weitere Ausführungsbeispiele davon, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, für Fachleute auf dem technischen Gebiet anhand des vorliegenden Gehalts dieses Dokuments offensichtlich werden, inklusive der Beispiele, die folgen, und der Referenzen auf die hierin zitierte wissenschaftliche Literatur und Patentliteratur. Die folgenden Beispiele enthalten wichtige zusätzliche Information, Erläuterungen und Führung, die auf die Praxis dieser Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsbeispielen und Äquivalenten davon hin adaptiert werden können.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Bynum et al. [0006]
    • Palm und Novotny, 2005 [0075]

Claims (17)

  1. Ein mikrofluidisches Gerät zur Glykopeptid-Analyse, aufweisend: eine Anreicherungssäule, die eine stationäre Phase aufweist, die in der Lage ist, Kohlenhydrate zu binden; eine Trapping-Säule, die eine stationäre Phase aufweist, die dazu in der Lage ist, Peptide zu binden, wobei die Trapping-Säule konfiguriert ist, stromabwärts der Anreicherungssäule angeschlossen zu werden; eine Trennsäule, die eine stationäre Phase aufweist, die dazu in der Lage ist, Peptide zu trennen, wobei die Trennsäule konfiguriert ist, stromabwärts der Trapping-Säule angeschlossen zu werden; und eine Mehrzahl von Ports, die zum Zusammenarbeiten mit einem Schaltgerät konfiguriert sind, um eine Mehrzahl von Flusspfaden zu bilden, wobei einer der Mehrzahl von Flusspfaden es der Trapping-Säule erlaubt, in Fluidkommunikation mit der Trennsäule zu sein.
  2. Das mikrofluidische Gerät gemäß Anspruch 1, wobei die Anreicherungssäule eine hydrophile Interaktions- (HILIC)-stationäre Phase aufweist.
  3. Das mikrofluidisches Gerät gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Trapping-Säule eine hydrophile Interaktions- (HILIC)-stationäre Phase, eine Umkehrphasen-stationäre Phase oder eine poröse Graphitkohle (PGC)-stationäre Phase aufweist.
  4. Das mikrofluidische Gerät gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Trennsäule eine Umkehrphasen-stationäre Phase oder eine poröse Graphitkohle (PGC)-stationäre Phase aufweist.
  5. Das mikrofluidische Gerät gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Umkehrphasen-stationäre Phase eine C-18 Silica-basierte stationäre Phase aufweist.
  6. Ein mikrofluidisches Gerät zur Glykopeptid-Analyse, aufweisend: eine Deglykosylierungssäule, die eine Festkörperbasis aufweist, die eine daran immobilisierte Glykosidase hat; eine Trapping-Säule, die eine stationäre Phase aufweist, die zum Binden von Peptiden in der Lage ist, wobei die Trapping-Säule konfiguriert ist, stromabwärts der Deglykosylierungssäule angeschlossen zu werden; eine Trennsäule, die eine stationäre Phase aufweist, die dazu in der Lage ist, Peptide zu trennen, wobei die Trennsäule konfiguriert ist, stromabwärts der Trapping-Säule angeschlossen zu werden; und eine Mehrzahl von Ports, die zum Zusammenarbeiten mit einem Schaltgerät konfiguriert sind, um eine Mehrzahl von Flusspfaden zu bilden, wobei einer der Mehrzahl von Flusspfaden es der Trapping-Säule erlaubt, in Fluidkommunikation mit der Trennsäule zu sein.
  7. Das mikrofluidische Gerät gemäß Anspruch 6, wobei die Glykosidase aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 und Endo H.
  8. Das mikrofluidische Gerät gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7, wobei die Glykosidase PNGase F ist.
  9. Das mikrofluidische Gerät gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Trapping-Säule eine Polymer-basierte Umkehrphasen-Säule ist.
  10. Das mikrofluidische Gerät gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Trennsäule eine Silica-basierte Umkehrphasen-Säule ist.
  11. Ein Verfahren zur Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts, das eine Anreicherungssäule aufweist, die dazu in der Lage ist, Kohlenhydrate zu binden, eine Trapping-Säule, die zum Binden von Peptiden in der Lage ist, und eine Trennsäule, wobei das Verfahren aufweist: Applizieren einer Probe von Glykopeptiden an das mikrofluidische Gerät; Anreichern der Glykopeptide an der Anreicherungssäule; Trappen der Glykopeptide von der Anreicherungssäule an der Trapping-Säule; Eluieren der Glykopeptide von der Trapping-Säule in die Trennsäule; und Trennen der Glykopeptide an der Trennsäule.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Anreicherungssäule eine hydrophile Interaktions-(HILIC)-stationäre Phase aufweist.
  13. Ein Verfahren zur Glykopeptid-Analyse unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts, das eine Deglykosylierungssäule hat, die eine Glykosidase daran immobilisiert hat, eine Trapping-Säule, die dazu in der Lage ist, Peptide zu binden, und eine Trennsäule, wobei das Verfahren aufweist: Applizieren einer Probe von Glykopeptiden an das mikrofluidische Gerät durch die Deglykosylierungssäule zum Erzeugen von deglykosylierten Peptiden; Trappen der deglykosylierten Peptide an der Trapping-Säule; Eluieren der deglykosylierten Peptide von der Trapping-Säule in die Trennsäule; und Trennen der deglykosylierten Peptide an der Trennsäule.
  14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Glykosidase ausgewählt ist aus einer Gruppe, die besteht aus PNGase F, β-N-Acetyl-glucosaminidase, α-Fucosidase, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Neuraminidase, α-Mannosidase, β-Glucosidase, β-Xylosidase, β-Mannosidase, Endo F1, Endo F2, Endo F3 und Endo H.
  15. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14, wobei die Glykosidase PNGase F ist.
  16. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Trapping-Säule eine Polymer-basierte Umkehrphasen-Säule ist.
  17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Trennsäule eine Silica-basierte Umkehrphasen-Säule ist.
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