DE60225140T2 - Verfahren zur analyse eines in der zelle auftretenden proteins oder einer mit dem protein wechselwirkenden substanz - Google Patents

Verfahren zur analyse eines in der zelle auftretenden proteins oder einer mit dem protein wechselwirkenden substanz Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung, Identifizierung und strukturellen Analyse von Substanzen, die mit Proteinen interagieren, die in Zellen von Organismen vorhanden sind, und betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins bestimmter Proteine in Zellen von Organismen durch Verwendung von Substanzen, die mit diesen Proteinen interagieren.
  • Technischer Hintergrund
  • Von der Oberflächenschicht von Zellen oder in Zellen (nachfolgend können beide Zustände einfach ausgedrückt werden als "in Zellen") ist bekannt, dass zahlreiche Proteine vorhanden sind, die unterschiedliche Rollen in einem lebenden Organismus spielen, wie beispielsweise eine Rolle als Rezeptoren, eine Rolle als Innenkanäle, eine Rolle als Transporter, eine Rolle als Antikörper, eine Rolle als Enzyme, und eine Rolle, die an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt ist. Es ist ebenfalls bekannt, dass es zahlreiche Substanzen gibt, die mit diesen Proteinen interagieren, um die Funktion dieser Proteine zu aktivieren oder zu inhibieren, oder die als Antigene für Antikörper fungieren, oder die als Substrate für Enzyme dienen.
  • Jedoch ist noch nicht alles über Proteine aufgeklart worden, die in Zellen von Organismen vorhanden sind, oder über Substanzen, die mit diesen Proteinen interagieren. Selbst heute werden Suchen nach neuen Proteinen, oder nach Substanzen, die mit zahlreichen intrazellulären Proteinen interagieren, von Forschern in der gesamten Welt energisch durchgeführt.
  • Um die natürliche Welt nach neuen physiologisch wirksamen Substanzen zu durchsuchen, die mit bestimmten Proteinen interagieren, sind bis jetzt allgemein Bioassays unter Verwendung von Proteinen mit bekannten Aktivitäten verwendet worden. Jedoch haben Bioassays mindestens zwei Probleme eingeschlossen. Zunächst werden die Materialien während der Reinigung von physiologisch aktiven Substanzen verbraucht, so dass große Mengen des Ausgangsinhaltsstoffs und natürlich auftretender Gegenstände (einschließlich Organismen) für die Extraktion des Inhaltsstoffs benötigt werden, und um ausreichende Mengen an Materialien für die Strukturbestimmung zu sichern. Zum zweiten sind die verfügbaren Bioassays limitiert und mit Standard-Bioassays bleiben viele neue physiologisch wirksame Substanzen unentdeckt.
  • Kürzlich wurde die Matrix-assistierte Laser-Desorption/Ionization-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), ein wirkungsvolles Werkzeug für die direkte Analyse von Peptidprofilen aus geringen Stücken sezierter Gewebe oder aus isolierten Einzelzellen (Garden et al., 1996; De Mit et al., 1997; Garden et al., 1998; Redeker et al., 1998). In diesen Experimenten ist es möglich, sehr kleine Bereiche an Proben zu analysieren und der daraus hervorgehende Peptid-Fingerabdruck zeigt die Biosynthese und Expression von bioaktiven Peptiden.
  • WO 02/12899 offenbart die Analyse von Peptiden, die von einem Protein in einer Zelle hergestellt wurden, wobei die Peptide an die Zelloberflächenproteine gebunden sind, insbesondere MHC-Moleküle.
  • WO 99/45150 offenbart Verfahren zum Analysieren der Interaktion zwischen Liganden und biomolekularen Zielen.
  • MALDI-TOF wird als geeignete Technik zur Untersuchung großer Biomoleküle erwähnt.
  • Shah et al., 2000, Microbial Ecology in Health and Disease, 12: 241–246 betrifft die Analyse verschiedener Bakterienstämme unter Verwendung von MALDI-TOF-MS auf Grundlage speziescharakteristischer Marker.
  • Li et al., 2000, TIBTECH, 18: 151–159 diskutiert die Verwendung von Einzelzellen-MALDI als ein Werkzeug für die direkte Peptidprofilierung. Diesem Dokument zufolge kann MALDI-MS die Peptide und Proteine aus einer Einzelzelle und aus kleinen Gewebeproben ohne Notwendigkeit einer aufwendigen Probenpräparierung im Profil darstellen, ausgenommen Zellisolierung und der Matrixapplikation.
  • Andererseits ist On-line Capillary Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (Kapillar-HPLC/MS und Kapillar-HPLC/MS/MS) in der modernen Bioanalytik verfügbar. Dieses Mittel stellt herausragende Information über die Molekulargewichte von Peptiden in Proben bereit, und das MS/MS-System ermöglicht, dass die Peptide fragmentiert werden, um Fragmentionen zu erzeugen, was ermöglicht, dass deren Aminosäuresequenzen abgeleitet werden können.
  • Es gab einen Bedarf für die Entwicklung eines neuen Verfahrens zum Durchmustern von Substanzen, die mit Proteinen interagieren, die in Zellen vorhanden sind, und für ein neues Verfahren zur Bestimmung auf das Vorhandensein bestimmter Proteine in Zellen unter Verwendung von Substanzen, die mit den Proteinen interagieren, wobei die neuen Verfahren nicht auf konventionellen Bioassays beruhen. Als Verfahren sind Methoden, die leicht zu bedienen sind und in der Lage sind, eine genaue und prompte Bestimmung zu liefern, erwünscht gewesen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Wir, die Erfinder der vorliegenden Erfindung, haben bereits ein Verfahren zum direkten Identifizieren der chemischen Struktur einer Substanz entwickelt, die in einem Gewebe oder in Zellen eines Organismus vorhanden sind, in dem MALDI-TOF MS verwendet wird, und wir haben eine Anmeldung hierfür als japanische Patentanmeldung Nr. 2000-060754 eingereicht. Die vorliegende Erfindung ist als Ergebnis von tiefgehenden Studien im Hinblick auf die Ausweitung des Anwendungsbereichs dieser Anmeldung erfüllt worden. Die vorliegende Erfindung hat es geschafft, ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Proteins zu entwickeln, welches auf einer Zellmembran oder in Zellen vorhanden ist, oder des Vorhandenseins einer Substanz, die mit diesem Protein interagiert, indem das Protein und die Substanz verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Liste, die die Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Messung einer Liganden(hANP)gebundenen Membranfraktion zeigt, welche durch die Verwendung von Zellen mit exprimiertem GC-A, Rezeptoren für hANP, in Beispiel 1 hergestellt wurde.
  • 2 ist eine Liste, welche die Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Messung einer Liganden(hANP)gebundenen Membranfraktion zeigt, die unter Verwendung von leeren Zellen, die frei von jeder Expression von GC-A in Beispiel 1 sind, hergestellt wurde.
  • 3 ist eine Liste, welche die Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Messung einer Liganden-gebundenen Membranfraktion zeigt, welche unter Verwendung eines Liganden (einer Peptidmischungslösung, umfassend vier Peptide, einschließlich hANP) und GC-A-exprimierenden Zellen in Beispiel 2 hergestellt wurde.
  • 4 ist eine Liste, die die Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Messung einer Liganden-gebundenen Membranfraktion zeigt, welche unter Verwendung eines Liganden (einer Peptidmischungslösung, umfassend vier Peptide einschließlich hANP) und leerer Zellen in Beispiel 2 hergestellt wurde.
  • 5 ist eine Liste, welche die Ergebnisse der MALDI-TOF-MS-Messung von ausschließlich der Peptidmischungslösung, die im Beispiel 2 verwendet worden ist, zeigt.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • Eine erste Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist, dass wenn ein bekanntes Protein auf einer Zellmembran oder in Zellen vorhanden ist, die Zellen und eine unbekannte Testsubstanz in Kontakt gebracht werden, was dazu führt, dass die Testsubstanz mit den Zellen in irgendeiner Form interagiert, wie beispielsweise durch Adsorption, Bindung oder Assoziierung. In diesem Zustand wird die Zelle oder ein Teil der Zelle (beispielsweise eine Zellmembran) gereinigt, und die Menge der Testsubstanz, die vorhanden ist, wird unter Verwendung von MALDI-TOF MS bestätigt. Durch dieses Verfahren kann beurteilt werden, ob die Testsubstanz mit dem bekannten Protein interagiert.
  • Eine zweite Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, welches der ersten Ausführungsform entgegen steht, und ein Verfahren ist, in dem eine bekannte Substanz verwendet wird, beispielsweise ein Ligand eines bestimmten Rezeptors, und beurteilt wird, ob ein unbekanntes Protein, das auf einer Zellmembran oder in Zellen exprimiert ist, vorhanden ist oder nicht. In diesem Fall werden die Zellen mit dem unbekannten Protein mit der bekannten Substanz in Kontakt gebracht. Wenn die bekannte Substanz mit den Zellen in irgendeiner Form interagiert hat, wie beispielsweise durch Adsorption, Bindung oder Assoziierung, kann beurteilt werden, dass das Protein, auf das die bekannte Substanz einwirkt, auf der Zellmembran oder in den Zellen vorhanden ist oder nicht.
  • Des weiteren kann die Aminosäuresequenz des Proteins, dessen Vorhandensein bestätigt worden ist, durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Liganden, welche auf verschiedene Rezeptoren einwirken, die auf der Kernmembran und der Mitochondrien-Membram wie auch der Zellmembran exprimiert werden gereinigt, während sie an die Membran adsorbiert sind, und dann wird die Liganden-gebundene Zellmembran mit einer Laserstrahl bestrahlt. Durch dieses Verfahren kann der Ligand allein direkt ionisiert werden, und der Ligand kann durch Massenspektrometrie analysiert werden.
  • Beispiele für die Rezeptoren sind Peptidhormonrezeptoren, Innenkanäle, Transporter und Antikörper, die in Lymphozyten und Makrophagen exprimiert werden. Die Liganden andererseits schließen nicht nur zahlreiche natürlich auftretende physiologisch wirksame Substanzen ein, wie beispielsweise Peptide, Aminosäuren, Amine und Steroide, sondern auch synthetische Verbindungen, die als Liganden dienen. So ist das vorliegende Verfahren wirksam als ein Mittel zum Suchen nach unbekannten Liganden, die mit derartigen Rezeptoren interagieren, und es kann verwendet werden, um nach Rezeptoren auf der Zellmembran zu suchen, welche unbekannte Funktionen haben.
  • Massenspektrometrie für die Verwendung in dem Analysesystem kann eine Analyse mit einer Zellmembranfraktion durchführen, die 104 bis 105 Zellen entspricht, beispielsweise im Fall von Zellen, oder mit nur einer geringen Menge einer Probe, die 2 mm × 2 mm × 0,1 mm Dicke misst, beispielsweise im Fall eines Gewebeschnitts. Das Massenspektrometrieverfahren kann ebenfalls gleichzeitig und in kurzer Zeit molekulare Information über das Molekulargewicht, die Arten an Molekülen (Typen, wie beispielsweise Peptidproteine, Steroide, Ligande, Katechine und Zucker; nachfolgend bezeichnet als "chemische Spezies") und die Struktur von Molekülen gewinnen. Das bedeutet, dass die Verwendung des MALDI-TOF-Modells als Massenspektrometer zu der Messung des Molekulargewichts des Liganden führt. Außerdem ermöglicht die vollständige Verwendung eines μ-Säulen-LC-ESI-QTOF-MS/MS-Analysegeräts mit seinen molekülverwandten Ionen als Vorläuferinnen, dass die chemische Spezies der adsorbierten Moleküle und selbst deren Struktur analysiert werden kann.
  • Durch Kombinieren dieser Verfahren kann das Vorhandensein neuer physiologisch wirksamer Substanzen oder Rezeptoren, die in kultivierten Zellen aus Geweben exprimiert werden, vorhergesagt werden. Diese Verfahren können teilweise zu der Entdeckung von Weisen-Rezeptoren (orphan receptors) und Liganden hierfür beitragen, und sind auch nützlich als Mittel zum Durchmustern nach neuen Medikamenten, oder sie sind auch nützlich zum Suchen nach Krankheitsmarkern.
  • Erfindungsgemäß kann das Verfahren der Erfindung auch nicht nur umfassend auf Kombinationen aus Rezeptoren und Liganden angewandt werden, sondern auch auf Substanzen, die mit Proteinen in irgendeiner Form interagieren. Diese Interaktionen schließen beispielsweise Wirkungen auf Proteine ein, die Innkanäle, Transporter, Antikörper und Enzyme sind. Substanzen mit derartigen Wirkungen schließen Antigene für Antikörper, Substrate für Enzyme oder Aktivatoren oder Inhibitoren ein.
  • Die vorliegende Erfindung wird beispielsweise unter Bezugnahme auf eine Ausführungsform beschrieben, in der ein Ligand für Zellen, die einen bekannten Rezeptor exprimieren, nachgewiesen und identifiziert wird.
  • Bekannte Zellen, die bekannte Rezeptoren exprimieren, werden kultiviert, um die Rezeptoren zu exprimieren. Die kultivierten Zellen werden als Probe-Zellen verwendet, und in einer Weise behandelt, die unten beschrieben wird. Zum Vergleich wird die gleiche Art Zellen, die nicht die Rezeptoren exprimieren, verwendet. Die vorliegende Erfindung kann nicht nur kultivierte Zellen verwenden, die solche bekannten Rezeptoren exprimieren, sondern auch Gewebezellen aus Organgeweben, und dissoziierte Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten und intraperitoneale Monozyten.
  • Destilliertes Wasser in einer geeigneten Menge, z. B. in einer Menge von 100 bis 800 μl, wird zu einer geeigneten Anzahl, beispielsweise 103 bis 105, vorzugsweise 104 bis 105, der Probe-Zellen gegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 3 bis 30 Minuten inkubiert, vorzugsweise für 5 bis 20 Minuten, um die Zellen aufzuschließen. Das System wird zentrifugiert, um die Zellmembranen zu präzipitieren, oder das System wird filtriert, um die Zellmembranen abzutrennen. Die Zellmembranen werden mit destilliertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert oder filtriert, um das Zytoplasma zu entfernen, wodurch eine Rezeptor exprimierende Zellmembranfraktion gewonnen wird.
  • Zu der resultierenden Membranfraktion wird eine Lösung einer Substanz gegeben, die ausreicht, um eine nicht spezifische Adsorptionsportion der Membranfraktion abzudecken, welche die Wirkung hat, die unspezifische Adsorption einer Substanz zu verhindern, beispielsweise 1 pmol/μl an Albumin (BSA), in einer Menge von 200 bis 500 μl, und das System wird dispergiert. Die Dispersion wird bei Raumtemperatur für 3 bis 30 Minuten inkubiert, vorzugsweise für 5 bis 20 Minuten, um den nicht-spezifischen Adsorptionsteil der Membranfraktion mit Albumin abzudecken. Die Membranfraktion wird durch Zentrifugation oder Filtration geerntet und mit destilliertem Wasser gewaschen, um das überschüssige Albumin zu entfernen.
  • Ein Ligand in einer ausreichenden Menge, um die Rezeptoren zu binden, beispielsweise 100 μl einer 10 pmol/μl Ligandenlösung wird zu der gewaschenen Albumin-beschichteten Membranfraktion zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 3 bis 30 Minuten inkubiert, vorzugsweise für 5 bis 20 Minuten. Dann wird das System einer Waschbehandlung unterworfen, die das Waschen mit destilliertem Wasser einschließt, gefolgt von Zentrifugation (oder Filtration). Diese Waschbehandlung wird zweimal oder mehr, vorzugsweise 4- bis 5-mal wiederholt, um Fraktionen zu entfernen, die nicht den überschüssigen Liganden adsorbiert haben.
  • Eine geeignete Menge, beispielsweise 5 bis 20 μl an destilliertem Wasser wird zu der resultierenden Ligandenadsorbierten Zellmembran hinzugegeben, und das System wird durch einen Votex suspendiert. Die Suspension (0,5 bis 3 μl) wird in eine Platte für MALDI eingefüllt und luftgetrocknet. Eine α-Cyan-4-hydroxycinnaminsäure (αCHCA) Matrixlösung wird zu der luftgetrockneten Suspension zugegeben, und eine MALDI-TOF-MS-Messung durchgeführt. Diese Messung wird gleichermaßen für Zellmembran zum Vergleich durchgeführt, die die Rezeptoren nicht exprimiert. Die Ergebnisse dieser Messungen werden verglichen, wobei der Ligand, der an die bekannten Rezeptoren gebunden ist, identifiziert werden kann, und wobei das Molekulargewicht als Indikator genommen wird.
  • Erfindungsgemäß ermöglicht die vollständige Verwendung eines μ-Säulen-LC-ESI-QTOF-MS/MS-Meters – unter Verwendung von laserionisierten molekülverwandten Ionen, welche für die Massenspektrometrie als Vorläuferinnen verwendet worden sind – dass die chemische Spezies der adsorbierten Moleküle und selbst ihre Struktur analysiert werden kann.
  • Erfindungsgemäß kann ein Protein, das auf einer Oberflächenschicht der Zellen oder in Zellen vorhanden ist oder eine Substanz, die mit dem Protein interagiert, nachgewiesen, identifiziert oder durch die nachfolgend beschriebenen Schritte analysiert werden.
  • Das obige Ziel kann erreicht werden durch ein Verfahren, das umfasst:
    • (1) Einen Schritt des Inkontaktbringens der Zellen mit einer Substanz, die mit einem Protein auf der Oberflächenschicht von Zellen, oder in den Zellen interagiert, und dazu führt, dass die Substanz mit den Zellen interagiert;
    • (2) den Schritt des Reinigens der Zellen, wobei die Zellen und die Substanz in einem interagierenden Zustand vorliegen;
    • (3) den Schritt des Bestrahlens der gereinigten Zellen mit einem Laser, mit der Substanz im interagierenden Zustand, um die Substanz direkt zu ionisieren; und
    • (4) den Schritt des Analysierens der ionisierten Substanz durch Massenspektrometrie.
  • Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls eine Substanz, die mit einem Protein, welches auf einer Oberflächenschicht von Zellen oder in Zellen vorhanden ist, screenen, wobei das Protein eine bekannte Aktivität besitzt, indem ein Verfahren verwendet wird, das die unten beschriebenen Schritte umfasst.
  • Ein Massenspektrum, das erhalten wird durch
    • (1) den Schritt des Inkontaktbringens einer Testsubstanz mit Zellen, auf denen ein bekanntes Protein bekanntermaßen vorhanden ist, um eine Interaktion zu verursachen;
    • (2) den Schritt des Reinigens der Zellen, die mit der Testsubstanz interagiert haben, oder einer Fraktion davon;
    • (3) den Schritt des Bestrahlens der gereinigten Zellen oder der Fraktion davon mit einem Laser, wodurch die Substanz, die mit den Zellen interagiert hat, direkt ionisiert wird; und
    • (4) den Schritt des Analysierens der ionisierten Substanz durch Massenspektrometrie; wird verglichen mit einem Massenspektrum, das durch Durchführen der Schritte (1) bis (4) unter Verwendung von Zellen gewonnen wird, bei denen das Protein nicht vorhanden ist. Wenn das zuvor erwähnte Massenspektrum zeigt, dass die Menge der Testsubstanz ansteigt, kann geurteilt werden, dass die Testsubstanz eine Substanz ist, die mit dem Protein interagiert. Die Identifizierung der Substanz macht es möglich, die Substanz auszumustern und zu identifizieren, die mit dem bekannten Protein interagiert, welches auf einer Oberflächenschicht der Zellen oder in Zellen vorhanden ist.
  • Des Weiteren können gemäß der vorliegenden Erfindung Expressionszellen oder Expressionsgewebe für Rezeptoren, die mit einem bekannten Liganden interagieren, beispielsweise durch das unten beschriebene Verfahren, durchmustert werden.
  • Dieses Verfahren umfasst das Vergleichen eines Massenspektrums, welches gewonnen wurde durch
    • (1) den Schritt des Inkontaktbringens eines bekannten Liganden mit Gewebe oder Zellen, bei denen das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Rezeptoren für den Liganden zu bestätigen ist, um eine Interaktion zu verursachen;
    • (2) den Schritt des Reinigens der Gewebe oder der Zellen, die mit dem Liganden in Kontakt gebracht wurden;
    • (3) den Schritt des Bestrahlens des gereinigten Gewebes oder der Zellen mit einem Laser, wodurch der vorhandene Ligand direkt ionisiert wird; und
    • (4) den Schritt des Analysierens des ionisierten Liganden durch Massenspektrometrie, mit einem Massenspektrum,
    das durch Durchführen von nur dem Schritt (2) und den anschließenden Schritten, ohne Durchführung des Schritts (1) gewonnen wird, bei dem der bekannte Ligand mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt gebracht wird. Wenn das erstgenannte Massenspektrum zeigt, dass die Menge an Ligand zunimmt, kann daraus gefolgert werden, dass die Rezeptoren, die mit dem Liganden interagieren, in dem Gewebe oder den Zellen vorhanden sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird in weiteren Details unter Bezugnahme auf die unten angebotenen Beispiele beschrieben.
  • [Beispiel 1]
  • Experimente zur Bindung zwischen menschlichem, atrialem, natriuretischem Peptid (nachfolgend bezeichnet als "hANP") und dem hANP-Rezeptor GC-A
  • Die kultivierten Zellen waren Rezeptor-exprimierende Zellen und leere Zellen. CHO/GC-A, d. h. CHO-Zellen (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters), die den hANP-Rezeptor GC-A exprimieren, wurden als Rezeptor-exprimierende Zellen verwendet. CHO-Wirtszellen wurde als leere Zellen verwendet. MALDI-TOF-MS-Messungsproben wurden durch das gleiche Verfahren in der folgenden Weise hergestellt:
  • Schritt 1. Herstellung der Membranfraktion
  • Destilliertes Wasser (500 μl) wurde zu 7,5 × 105 kultivierten Zellen (GC-A-exprimierende Zellen und leere Zellen) gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert, um Pellets zu gewinnen. Destilliertes Wasser (500 μl) wurde zusätzlich zu den Pellets zugegeben, und das Gemisch wurde wiederum zentrifugiert, gefolgt vom Entfernen des Überstands, um eine Membranfraktion zu gewinnen.
  • Schritt 2. Albuminbeschichtung
  • Zu der erhaltenen Membranfraktion wurden 500 μl einer 1 pmol/μl wässrigen Albuminlösung hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert, um Pellets zu gewinnen. Destilliertes Wasser (500 μl) wurde zusätzlich zu den Pellets gegeben und das Gemisch wurde, wird er zentrifugiert, um eine Albumin-beschichtete Membranfraktion zu gewinnen.
  • Schritt 3. Bindung des Liganden (hANP)
  • Zu der erhaltenen Albumin-beschichteten Membranfraktion wurden 100 μl einer wässrigen 10 pmol/μl hANP-Lösung gegeben und das Gemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert, um Pellets zu gewinnen. Die erhaltenen Pellets wurden ferner mit 500 μl destillierten Wassers gewaschen, und die Zentrifugation wurde erneut durchgeführt, um eine Liganden(hANP)-gebundene Membranfraktion zu erhalten.
  • Schritt 4. MALDI-TOF-MS-Messung
  • Destilliertes Wasser (10 μl) wurde zu der erhaltenen Liganden-gebundenen Membranfraktion gegeben, und die Mischung wurde suspendiert. Die Suspension (1 μl) wurde in eine Platte zur Analyse eingefüllt und luftgetrocknet. Dann wurden 1 μl α-Cyan-4-hydroxycinnaminsäure (α-CHCA) gesättigter Lösung (Methanol:Wasser = 1:1, 0,1% Trifluoressigsäure) zu der luftgetrockneten Suspension zugegeben und eine MALDI-TOF-MS-Messung (Voyager Elite) wurde durchgeführt.
  • Wie in 1 und 2 gezeigt ist, war das nachgewiesene hANP in den GC-A-exprimierenden Zellen (1) dreimal mehr als in den leeren Zellen (2). Aus diesen Befunden kann geurteilt werden, dass hANP mit GC-A-Rezeptoren interagiert.
  • [Beispiel 2]
  • Experimente bezüglich der Selektivität
  • Schritt 1. Herstellung einer Membranfraktion und Schritt 2. Albuminbeschichtung
  • Eine Albumin-beschichtete Membranfraktion (CHO/GC-A-Zellen und CHO-Wirtszellen) wurde auf gleiche Weise wie in Schritt 1 und Schritt 2 des Beispiels 1 erhalten.
  • Schritt 3. Bindung des Liganden (Peptidmischung)
  • Zu der erhaltenen Albumin-beschichteten Membranfraktion wurden 100 μl einer Peptid-Mixlösung gegeben, d. h. einer wässrigen Lösung einer Mischung aus 10 pmol/μl hANP, 10 pmol/μl Angiotensin I, 10 pmol/μl Substanz P (SP), und 10 pmol/μl Melanozyten-stimulierendes Hormon (α-MSH) gegeben, und die Mischung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert, um Pellets zu gewinnen. Die erhaltenen Pellets wurden mit 500 μl destilliertem Wasser zusätzlich gewaschen und eine Zentrifugation wurde wiederum durchgeführt, um eine Liganden-gebundene Membranfraktion zu erhalten.
  • Schritt 4. MALDI-TOF-MS-Messung
  • Die MALDI-TOF-MS-Messung wurde auf gleiche Weise wie im Schritt 4 des Beispiels 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 3 (GC-A-Rezeptoren wurden exprimiert) und 4 (die Leerprobe ohne Expression des GC-A-Rezeptors) gezeigt. Zum Vergleich wurde die MALDI-TOF-MS-Messung nur an 1 μl der Peptidmischlösung durchgeführt (10 pmol/μl hANP, 10 pmol/μl Angiotensin I, 10 pmol/μl SP und 10 pmol/μl α-MSH) (5).
  • Es wurde herausgefunden, dass hANP an die GC-A-Rezeptor exprimierende Zellmembranfraktion fünfmal stärker oder mehr selektiv als die drei anderen Peptide gebunden wurde. Auf diese Weise kann geurteilt werden, dass nur hANP mit GC-A-Rezeptoren interagiert, und dass die anderen Peptide, d. h. Angiotensin I, Substanz P und α-MSH nicht mit GC-A-Rezeptoren interagieren.
  • [Gewerbliche Anwendbarkeit]
  • Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann, wenn ein bekanntes Protein auf einer Zellmembran oder in Zellen vorhanden ist, die Zellen und eine unbekannte Testsubstanz in Kontakt gebracht werden, was die Testsubstanz veranlasst, mit den Zellen in irgendeiner Form zu interagieren, wie beispielsweise mittels Adsorption, Bindung oder Assoziierung. In diesem Zustand werden die Zellen oder Teile der Zelle (z. B. Zellmembranen) gereinigt, und die Menge an Testsubstanz, die vorhanden ist, wird durch die Verwendung von MALDI-TOF MS festgestellt. Durch dieses Verfahren kann beurteilt werden, ob die Testsubstanz mit dem bekannten Protein interagiert.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, welches das Gegenteil des obigen Verfahrens ist, und welches eine bekannte Substanz verwendet, z. B. einen Liganden für einen bestimmten Rezeptor, und das beurteilt, ob ein unbekanntes Protein auf einer Zellmembran oder in Zellen vorhanden ist oder nicht. In diesem Fall werden die Zellen mit dem unbekannten Protein mit der bekannten Substanz in Kontakt gebracht. Wenn die bekannte Substanz mit den Zellen in irgendeiner Form interagiert hat, wie beispielsweise durch Adsorption, Bindung oder Assoziierung, kann geurteilt werden, dass das Protein, auf welches die bekannte Substanz einwirkt, auf der Zellmembran oder in den Zellen vorhanden ist. Des Weiteren kann die Aminosäuresequenz des Proteins, dessen Vorhandensein bestätigt worden ist, durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden.
  • Diese Verfahren sind leicht durchzuführen und sind zu einer genauen und schnellen Beurteilung in der Lage. Auf diese Weise kann ein großer Bereich an Anwendungen derselben erwartet werden.

Claims (15)

  1. Verfahren zum Identifizieren oder Analysieren eines Proteins, das auf einer oberflächlichen Schicht von Zellen oder in Zellen vorhanden ist, oder einer Substanz, die mit diesem Protein interagiert, umfassend: (1) einen Schritt des Inkontaktbringens der Zellen mit diesem Protein und dieser Substanz, die mit diesem Protein interagiert, miteinander, um diese Substanz zu veranlassen, an das Protein zu binden; (2) einen Schritt des Reinigens der Zellen, wobei das Protein und diese Substanz in einem gebundenen Zustand sind; (3) einen Schritt des Bestrahlens der gereinigten Zellen mit einem Laser, wobei diese Substanz in einem gebundenen Zustand vorliegt, um diese Substanz direkt zu ionisieren; und (4) einen Schritt des Analysierens der ionisierten Substanz durch matrixassistierte Laserdesorption/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS).
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Protein, das auf der oberflächlichen Schicht von Zellen oder in den Zellen vorhanden ist, ein Protein ist, das eine physiologische Aktivität als Rezeptor oder Antikörper zeigt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Substanz, die mit diesem Protein interagiert, ein Ligand, ein Antigen oder ein Substrat dieses Proteins ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Substanz, die mit diesem Protein interagiert, eine Substanz ist, die in einem lebenden Organismus vorhanden ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Substanz, die in einem lebenden Organismus vorhanden ist, ein Molekulargewicht von 500 bis 3.000 hat.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Substanz, die mit dem Protein interagiert, eine Substanz ist, die nicht in einem lebenden Organismus vorhanden ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Massenspektrometrie ein Verfahren ist, das matrixassistierte Laserdesorption/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und ein Mikrosäulen-Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisierung-Vierfach-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometer (μ-Säule LC-ESI-QTOF-MS/MS) ist.
  8. Verfahren zum Durchmustern einer Substanz, die mit einem Protein interagiert, welches auf einer oberflächlichen Schicht von Zellen oder in Zellen vorhanden ist, wobei das Protein eine bekannte Aktivität hat und das Verfahren umfaßt: Vergleichen eines Massenspektrums, das gewonnen wurde durch (1) einen Schritt des Inkontaktbringens einer Testsubstanz mit Zellen, wobei das Protein bekanntermaßen vorhanden ist, um diese Testsubstanz an das Protein zu binden, (2) einen Schritt des Reinigens der Zellen mit den Zellen und der Testsubstanz in gebundenem Zustand, (3) einen Schritt des Bestrahlens der gereinigten Zellen mit einem Laser und dadurch das direkte Ionisieren dieser Substanz, die an die Zellen gebunden ist, und (4) einen Schritt des Analysierens der ionisierten Substanz durch matrixassistierte Laserdesorption/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), mit einem Massenspektrum, das durch Durchführen der Schritte (1) bis (4) gewonnen wurde, unter Verwendung von Zellen, in denen das Protein bekanntermaßen nicht vorhanden war, wobei das Vorhandensein dieser Substanz, welche an das Protein bindet, bestimmt wird.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei dieses bekannte Protein ein Rezeptorprotein ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei ein isolierter und etablierter Stamm als Zellen verwendet wird, in denen dieses Rezeptorprotein exprimiert wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Zellen, die künstlich dazu gezwungen werden dieses Rezeptorprotein zu exprimieren, als Zellen verwendet werden, in denen dieser Rezeptor exprimiert wird.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei Orphan-Rezeptor exprimierende Zellen als Zellen verwendet werden, in denen das Rezeptorprotein exprimiert wird.
  13. Verfahren zum Durchmustern von Zellen oder Gewebe, in denen ein Protein, das mit einer Substanz mit bekannter Aktivität interagiert, exprimiert wird, umfassend: Vergleichen eines Massenspektrums, das gewonnen wurde durch (1) einen Schritt des Inkontaktbringens dieser Substanz mit Zellen oder Gewebe, wobei das Vorhandensein oder die Abwesenheit dieses Proteins zu bestätigen ist, um diese Substanz an dieses Protein zu binden, (2) einen Schritt des Reinigens der Zellen oder des Gewebes, das diese Substanz bindet, (3) einen Schritt des Bestrahlens der gereinigten Zellen oder des Gewebes mit einem Laser und dadurch das direkte Ionisieren der vorhandenen Substanz, und (4) einen Schritt des Analysierens der ionisierten Substanz durch matrixassistierte Laserdesorption/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), mit einem Massenspektrum, das ohne Durchführung von Schritt (1) alleine durch Durchführen der Schritte (2) bis (4) gewonnen wurde, wobei der Ligand mit diesen Zellen oder Gewebe in Kontakt gebracht wird, wodurch das Vorhandensein dieses Proteins, das mit dieser Substanz interagiert, bestimmt wird.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Substanz ein Ligand ist.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das Protein ein Rezeptorprotein ist.
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