JP2001249125A - 組織または細胞における物質分析のための方法 - Google Patents
組織または細胞における物質分析のための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生物の組織または細胞に存在する物質の化
学構造を直接同定するための改善された方法が開示され
る。 【解決手段】 特に、多様な種類の生物の組織または
細胞に存在する物質の化学構造を直接同定するための該
方法は： （１）試料組織切片または細胞の特定の細胞内領域にレ
ーザーを照射し、そして生成するマスイオンを分析し、
該部位に存在する物質のマススペクトルを得る段階、
（２）該マススペクトルを分析し、試料組織切片または
細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロファイルを
得る段階、および（３）該マスプロファイル中に現れる
特定分子量に対応する物質の化学構造を決定する段階、
からなる。本発明の方法は、マトリックスアシスティド
レーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析計
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、およびオンラインキャ
ピラリー逆相ＨＰＬＣ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ
−Ｔｏｆ）−ＭＳを組み合わせた技術、並びに分子クロ
ーニングを利用することにより、行われる。
学構造を直接同定するための改善された方法が開示され
る。 【解決手段】 特に、多様な種類の生物の組織または
細胞に存在する物質の化学構造を直接同定するための該
方法は： （１）試料組織切片または細胞の特定の細胞内領域にレ
ーザーを照射し、そして生成するマスイオンを分析し、
該部位に存在する物質のマススペクトルを得る段階、
（２）該マススペクトルを分析し、試料組織切片または
細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロファイルを
得る段階、および（３）該マスプロファイル中に現れる
特定分子量に対応する物質の化学構造を決定する段階、
からなる。本発明の方法は、マトリックスアシスティド
レーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析計
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、およびオンラインキャ
ピラリー逆相ＨＰＬＣ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ
−Ｔｏｆ）−ＭＳを組み合わせた技術、並びに分子クロ
ーニングを利用することにより、行われる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物の組織または
細胞に存在する物質の化学構造を直接同定するための、
改善された方法に関する。特に、本発明は、多様な種類
の生物の組織または細胞に存在する物質の化学構造を直
接同定するための方法であって、（１）試料組織切片ま
たは細胞の特定の細胞内領域にレーザーを照射し、そし
て生成するマスイオンを分析し、該部位に存在する物質
のマススペクトルを得る段階、（２）該マススペクトル
を分析し、試料組織切片または細胞の細胞内領域に存在
する物質のマスプロファイルを得る段階、および（３）
該マスプロファイル中に現れる特定分子量に対応する物
質の化学構造を決定する段階、からなる方法に関する。
細胞に存在する物質の化学構造を直接同定するための、
改善された方法に関する。特に、本発明は、多様な種類
の生物の組織または細胞に存在する物質の化学構造を直
接同定するための方法であって、（１）試料組織切片ま
たは細胞の特定の細胞内領域にレーザーを照射し、そし
て生成するマスイオンを分析し、該部位に存在する物質
のマススペクトルを得る段階、（２）該マススペクトル
を分析し、試料組織切片または細胞の細胞内領域に存在
する物質のマスプロファイルを得る段階、および（３）
該マスプロファイル中に現れる特定分子量に対応する物
質の化学構造を決定する段階、からなる方法に関する。
【０００２】本発明の方法は、マトリックスアシスティ
ドレーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、およびオンラインキャ
ピラリー逆相ＨＰＬＣ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ
−Ｔｏｆ）−ＭＳを組み合わせた技術、並びに分子クロ
ーニングを利用することにより、行われる。
ドレーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、およびオンラインキャ
ピラリー逆相ＨＰＬＣ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ
−Ｔｏｆ）−ＭＳを組み合わせた技術、並びに分子クロ
ーニングを利用することにより、行われる。
【０００３】
【従来の技術】脳および神経系における神経ペプチド
は、複雑な生理学的過程および行動の統合に関与してい
る。したがって、神経ペプチドおよびそれらの活性の間
の関係を明確にすることは、甲殻類生理学の重要な目的
である。神経ペプチドを同定するため、精製法において
バイオアッセイが必須の手段であった。実際、甲殻類神
経ペプチド、例えば、赤色素濃縮ホルモン、色素拡散ホ
ルモン、血糖上昇ホルモン、脱皮阻害ホルモン、卵黄形
成阻害ホルモン、大顎器官（ｍａｎｄｉｂｕｌａｒｏｒ
ｇａｎ）阻害ホルモン、ＲＦアミド関連ペプチド、心臓
作用性ペプチドおよびオルコキニン（ｏｒｃｏｋｉｎｉ
ｎ）は、光順応性、血糖制御、脱皮阻害、心臓制御およ
び消化管収縮などの生理学的影響に基づくバイオアッセ
イを用い、単離されてきている（Ｆｅｒｎｌｕｎｄおよ
びＪｏｓｅｆｓｓｏｎ， １９７２；Ｆｅｒｎｌｕｎ
ｄ， １９７６；Ｍｅｒｃｉｅｒら， １９７１；Ｓｔ
ａｎｇｉｅｒら， １９８７；Ｓｔａｎｇｉｅｒら，
１９９２；Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら， １９９６；総説
は：Ｋｅｌｌｅｒ， １９９２；ＹａｓｕｄａおよびＮ
ａｙａ， １９９７を参照されたい）。しかし、こうし
たバイオアッセイを用いた精製には、少なくとも２つの
問題が含まれる。第一に、各精製段階のバイオアッセイ
で成分が消費されるため、配列決定のため十分なペプチ
ドを残すのには、比較的大量の出発成分が必要とされ
る。第二に、利用可能な標準的バイオアッセイでは、多
くの新規神経ペプチドが未検出のままになる可能性があ
る。
は、複雑な生理学的過程および行動の統合に関与してい
る。したがって、神経ペプチドおよびそれらの活性の間
の関係を明確にすることは、甲殻類生理学の重要な目的
である。神経ペプチドを同定するため、精製法において
バイオアッセイが必須の手段であった。実際、甲殻類神
経ペプチド、例えば、赤色素濃縮ホルモン、色素拡散ホ
ルモン、血糖上昇ホルモン、脱皮阻害ホルモン、卵黄形
成阻害ホルモン、大顎器官（ｍａｎｄｉｂｕｌａｒｏｒ
ｇａｎ）阻害ホルモン、ＲＦアミド関連ペプチド、心臓
作用性ペプチドおよびオルコキニン（ｏｒｃｏｋｉｎｉ
ｎ）は、光順応性、血糖制御、脱皮阻害、心臓制御およ
び消化管収縮などの生理学的影響に基づくバイオアッセ
イを用い、単離されてきている（Ｆｅｒｎｌｕｎｄおよ
びＪｏｓｅｆｓｓｏｎ， １９７２；Ｆｅｒｎｌｕｎ
ｄ， １９７６；Ｍｅｒｃｉｅｒら， １９７１；Ｓｔ
ａｎｇｉｅｒら， １９８７；Ｓｔａｎｇｉｅｒら，
１９９２；Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら， １９９６；総説
は：Ｋｅｌｌｅｒ， １９９２；ＹａｓｕｄａおよびＮ
ａｙａ， １９９７を参照されたい）。しかし、こうし
たバイオアッセイを用いた精製には、少なくとも２つの
問題が含まれる。第一に、各精製段階のバイオアッセイ
で成分が消費されるため、配列決定のため十分なペプチ
ドを残すのには、比較的大量の出発成分が必要とされ
る。第二に、利用可能な標準的バイオアッセイでは、多
くの新規神経ペプチドが未検出のままになる可能性があ
る。
【０００４】最近、マトリックスアシスティドレーザー
デソープションイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ）が、切断組織の小片からまたは単離
単一細胞からのペプチドプロファイルの直接分析に強力
な手段となってきている（Ｇａｒｄｅｎら， １９９
６；Ｄｅ Ｗｉｔｈら， １９９７；Ｇａｒｄｅｎら，
１９９８；Ｒｅｄｅｋｅｒら， １９９８）。これらの
実験において、試料の非常に小さい点を分析することが
可能であり、そして生じたペプチドフィンガープリンテ
ィングは、生物活性を持つペプチドの生合成および発現
を示す。甲殻類において、ザリガニ（ｃｒａｙｆｉｓ
ｈ）、オルコネクテス・リモスス（Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅ
ｓ ｌｉｍｏｓｕｓ）由来の単一細胞を用い、ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦＭＳアプローチにより、血糖上昇ホルモン前
駆体関連ペプチドの２つの分子型の性質決定に、成功し
てきている（Ｒｅｄｅｋｅｒら， １９９８）。
デソープションイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ）が、切断組織の小片からまたは単離
単一細胞からのペプチドプロファイルの直接分析に強力
な手段となってきている（Ｇａｒｄｅｎら， １９９
６；Ｄｅ Ｗｉｔｈら， １９９７；Ｇａｒｄｅｎら，
１９９８；Ｒｅｄｅｋｅｒら， １９９８）。これらの
実験において、試料の非常に小さい点を分析することが
可能であり、そして生じたペプチドフィンガープリンテ
ィングは、生物活性を持つペプチドの生合成および発現
を示す。甲殻類において、ザリガニ（ｃｒａｙｆｉｓ
ｈ）、オルコネクテス・リモスス（Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅ
ｓ ｌｉｍｏｓｕｓ）由来の単一細胞を用い、ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦＭＳアプローチにより、血糖上昇ホルモン前
駆体関連ペプチドの２つの分子型の性質決定に、成功し
てきている（Ｒｅｄｅｋｅｒら， １９９８）。
【０００５】一方、質量分析的検出を用いたオンライン
キャピラリー逆相高性能液体クロマトグラフィー（キャ
ピラリーＨＰＬＣ／ＭＳおよびキャピラリーＨＰＬＣ／
ＭＳ／ＭＳ）が現代の生物分析に利用可能である。本手
段は、脳抽出物中の神経ペプチドの分子量に対し優れた
情報を提供し、そしてＭＳ／ＭＳ様式は、ペプチドを断
片化し、産物イオンを生じ、そのアミノ酸配列を演繹す
るのを可能にする。本発明において、発明者は、ザリガ
ニ、プロキャンバルス・クラルキ（Ｐｒｏｃａｍｂａｒ
ｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ）の脳由来の新規神経ペプチド同
定のため、質量分析に基づくプロトコルを用い、ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、分子クローニングおよびオンライ
ンキャピラリーＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせたア
プローチを使用した。
キャピラリー逆相高性能液体クロマトグラフィー（キャ
ピラリーＨＰＬＣ／ＭＳおよびキャピラリーＨＰＬＣ／
ＭＳ／ＭＳ）が現代の生物分析に利用可能である。本手
段は、脳抽出物中の神経ペプチドの分子量に対し優れた
情報を提供し、そしてＭＳ／ＭＳ様式は、ペプチドを断
片化し、産物イオンを生じ、そのアミノ酸配列を演繹す
るのを可能にする。本発明において、発明者は、ザリガ
ニ、プロキャンバルス・クラルキ（Ｐｒｏｃａｍｂａｒ
ｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ）の脳由来の新規神経ペプチド同
定のため、質量分析に基づくプロトコルを用い、ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、分子クローニングおよびオンライ
ンキャピラリーＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせたア
プローチを使用した。
【０００６】発明者は、まず、アメリカザリガニ（ｒｅ
ｄ ｓｗａｍｐ ｃｒａｙｆｉｓｈ）、プロキャンバル
ス・クラルキ脳由来の多様な切片の、直接ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ分析を調べた。本研究の間、我々は、脳に
分子マス１５１７の特有なペプチドが存在することに注
目した。この分子量は、元来、ザリガニ、オルコネクテ
ス・リモススの腹神経索から単離された、オルコキニン
（ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＮ）（Ｓｔａｎｇｉｅｒ
ら， １９９２）のものと同一であった。該ペプチドの
生物学的効果は、ザリガニの単離後腸に対する強力な収
縮活性である。さらに、３つのオルコキニン関連ペプチ
ド、すなわち[Ｓｅｒ9]、[Ａｌａ13]、および[Ｖａ
ｌ13]オルコキニンが、イソガニ（ｓｈｏｒｅ ｃｒａ
ｂ）、カルキヌス・マイナス（Ｃａｒｃｉｎｕｓ ｍａ
ｅｎｕｓ）から単離され、そして配列決定されてきてい
る（Ｂｕｎｇａｒｔら， １９９５ａ）。発明者はま
た、脳切片の単一の点から得られた直接ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳデータに、オルコキニンと共に、[Ａｌａ13]
および[Ｖａｌ13]オルコキニンに対応する分子量を有す
るペプチドも見出した。したがって、発明者はまず、ザ
リガニ脳におけるオルコキニンおよびその関連ペプチド
の同定に重点を置いた。
ｄ ｓｗａｍｐ ｃｒａｙｆｉｓｈ）、プロキャンバル
ス・クラルキ脳由来の多様な切片の、直接ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ分析を調べた。本研究の間、我々は、脳に
分子マス１５１７の特有なペプチドが存在することに注
目した。この分子量は、元来、ザリガニ、オルコネクテ
ス・リモススの腹神経索から単離された、オルコキニン
（ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＮ）（Ｓｔａｎｇｉｅｒ
ら， １９９２）のものと同一であった。該ペプチドの
生物学的効果は、ザリガニの単離後腸に対する強力な収
縮活性である。さらに、３つのオルコキニン関連ペプチ
ド、すなわち[Ｓｅｒ9]、[Ａｌａ13]、および[Ｖａ
ｌ13]オルコキニンが、イソガニ（ｓｈｏｒｅ ｃｒａ
ｂ）、カルキヌス・マイナス（Ｃａｒｃｉｎｕｓ ｍａ
ｅｎｕｓ）から単離され、そして配列決定されてきてい
る（Ｂｕｎｇａｒｔら， １９９５ａ）。発明者はま
た、脳切片の単一の点から得られた直接ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ ＭＳデータに、オルコキニンと共に、[Ａｌａ13]
および[Ｖａｌ13]オルコキニンに対応する分子量を有す
るペプチドも見出した。したがって、発明者はまず、ザ
リガニ脳におけるオルコキニンおよびその関連ペプチド
の同定に重点を置いた。
【０００７】発明者は、本明細書に、オルコキニンおよ
びその関連ペプチドの性質決定およびアメリカザリガニ
脳の２つのオルコキニン前駆体タンパク質の分子クロー
ニングを開示する。さらに、バイオアッセイを使用しな
い、神経ペプチド同定のための新規戦略を提案する。
びその関連ペプチドの性質決定およびアメリカザリガニ
脳の２つのオルコキニン前駆体タンパク質の分子クロー
ニングを開示する。さらに、バイオアッセイを使用しな
い、神経ペプチド同定のための新規戦略を提案する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】発明者は、多様な生物
の組織または細胞における未知の物質を精査するための
戦略を開発した。より詳細には、発明者は、多様な生物
の組織または細胞における未知のペプチドを精査し、そ
して該ペプチドの化学構造を同定するための新規戦略に
成功した。
の組織または細胞における未知の物質を精査するための
戦略を開発した。より詳細には、発明者は、多様な生物
の組織または細胞における未知のペプチドを精査し、そ
して該ペプチドの化学構造を同定するための新規戦略に
成功した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】特に、発明者は、マトリ
ックスアシスティドレーザーデソープションイオン化飛
行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、分子
クローニングおよびオンラインキャピラリー逆相ＨＰＬ
Ｃ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）−ＭＳを
組み合わせた技術を利用し、アメリカザリガニ、プロキ
ャンバルス・クラルキの脳ペプチドの精査および／また
は同定を進展させた。発明者はまず、脳切片を用い、直
接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。嗅葉切片由
来のＭＳスペクトルは、本種でオルコキニン（ＮＦＤＥ
ＩＤＲＳＧＦＧＦＮ）が出現していることを示した。続
いて、その出現を、オルコキニンの前駆体タンパク質を
コードするｃＤＮＡの分子クローニングにより確認し
た。演繹されるアミノ酸配列は、プレプロオルコキニン
の２つの異なる種類があることを示した。プレプロオル
コキニンＡ（長さ２５１残基）は、オルコキニン７コピ
ーだけでなく、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶを２コピ
ー、およびＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＡ、ＮＦＤＥＩＤ
ＲＴＧＦＧＦＨおよびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳを各々１
コピー含む。前者の３つのペプチドは、以前、他のザリ
ガニ、オルコネクテス・リモススおよび／またはイソガ
ニ、カルキヌス・マイナスから単離され、そして後者の
２つは新規であった。プレプロオルコキニンＢ（２６
６）は、１つのさらなるオルコキニンを含む。該ペプチ
ドの配列にはすべて、プロセシングのコンセンサスシグ
ナルである、塩基性アミノ酸対が隣接している。さら
に、脳抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５に、そして続
いて、オンラインキャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏ
ｆ ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析から、オルコキ
ニン、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ、ＮＦＤＥＩＤＲＳ
ＧＦＧＦＡ、ＮＦＤＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ、およびＦＤ
ＡＦＴＴＧＦＧＨＳの分子量は、それぞれｍ／ｚ ７５
９．３７、７５１．９２、７３７．８６、７７８．９
０、および５９３．７８の２価イオンとして同定され
た。さらに、該配列を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におい
て、２価イオンを用いた衝突誘導解離スペクトルによ
り、特定した。これらのデータは、オルコキニンおよび
その関連ペプチドは、ザリガニ脳において、特に嗅葉に
豊富であり、そして２種のプレプロオルコキニンから合
成され、そしてプロセシングされることを示唆した。
ックスアシスティドレーザーデソープションイオン化飛
行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、分子
クローニングおよびオンラインキャピラリー逆相ＨＰＬ
Ｃ／四重極直交加速飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）−ＭＳを
組み合わせた技術を利用し、アメリカザリガニ、プロキ
ャンバルス・クラルキの脳ペプチドの精査および／また
は同定を進展させた。発明者はまず、脳切片を用い、直
接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。嗅葉切片由
来のＭＳスペクトルは、本種でオルコキニン（ＮＦＤＥ
ＩＤＲＳＧＦＧＦＮ）が出現していることを示した。続
いて、その出現を、オルコキニンの前駆体タンパク質を
コードするｃＤＮＡの分子クローニングにより確認し
た。演繹されるアミノ酸配列は、プレプロオルコキニン
の２つの異なる種類があることを示した。プレプロオル
コキニンＡ（長さ２５１残基）は、オルコキニン７コピ
ーだけでなく、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶを２コピ
ー、およびＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＡ、ＮＦＤＥＩＤ
ＲＴＧＦＧＦＨおよびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳを各々１
コピー含む。前者の３つのペプチドは、以前、他のザリ
ガニ、オルコネクテス・リモススおよび／またはイソガ
ニ、カルキヌス・マイナスから単離され、そして後者の
２つは新規であった。プレプロオルコキニンＢ（２６
６）は、１つのさらなるオルコキニンを含む。該ペプチ
ドの配列にはすべて、プロセシングのコンセンサスシグ
ナルである、塩基性アミノ酸対が隣接している。さら
に、脳抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５に、そして続
いて、オンラインキャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏ
ｆ ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析から、オルコキ
ニン、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ、ＮＦＤＥＩＤＲＳ
ＧＦＧＦＡ、ＮＦＤＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ、およびＦＤ
ＡＦＴＴＧＦＧＨＳの分子量は、それぞれｍ／ｚ ７５
９．３７、７５１．９２、７３７．８６、７７８．９
０、および５９３．７８の２価イオンとして同定され
た。さらに、該配列を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におい
て、２価イオンを用いた衝突誘導解離スペクトルによ
り、特定した。これらのデータは、オルコキニンおよび
その関連ペプチドは、ザリガニ脳において、特に嗅葉に
豊富であり、そして２種のプレプロオルコキニンから合
成され、そしてプロセシングされることを示唆した。
【００１０】微生物、植物、動物およびヒトなどの多様
な生物の組織または細胞におけるペプチドの精査のため
の新規戦略。本発明の該側面にしたがい、開発された戦
略は、方法の以下の態様に適用してもよい： １． 生物の組織または細胞に存在する物質の化学構造
を直接同定するための方法であって： （１）試料組織切片または細胞の特定の細胞内領域にレ
ーザーを照射し、そして生成するマスイオンを分析し、
該部位に存在する物質のマススペクトルを得る段階、
（２）該マススペクトルを分析し、試料組織切片または
細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロファイルを
得る段階、および（３）該マスプロファイル中に現れる
特定分子量に対応する物質の化学構造を決定する段階、
からなる方法。 ２． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１の方法であって、段階（１）お
よび段階（２）がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって行
われ、そして段階（３）がＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／ま
たはプロテイン・シークエンサーによって行われる方
法。 ３． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１または２の方法であって、組織
切片または細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロ
ファイルを得る段階（２）の後でそして該マスプロファ
イル中に現れる特定分子量に対応する物質の化学構造を
決定する段階（３）の前に、組織または細胞の抽出物か
ら、該物質の分子量をマーカーとして使用することによ
り、該物質を単離しそして精製する段階が付加された方
法。 ４． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１、２または３の方法であって、
該物質の化学構造が未知である場合に、該物質の化学構
造を決定する方法。 ５． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様４の方法であって、組織または細
胞に特定の生物学的活性を有する物質が存在すると推定
されていながら、該物質の化学構造が未知であった場合
に、態様１ないし３の方法により、該物質の化学構造を
推定し、そして該推定構造を有する物質を合成し、そし
て該合成物質の生物学的活性を調べることにより、該物
質の化学構造を確認する方法。 ６． 生物の組織または細胞に存在する未知の物質の化
学構造を同定するための方法であって、態様１ないし３
の１つの方法を行うことによる方法。 ７． 態様１ないし６いずれか１つの方法であって、物
質がタンパク質またはペプチドである場合、該物質のア
ミノ酸配列を決定する方法。 ８． タンパク質、ペプチドまたはそれらの前駆体のア
ミノ酸配列を決定するための、態様７の方法であって： （１）物質の部分的アミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するＤＮＡを化学的に合成し、（２）該試料組織切片
または細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築し、（３）
（１）で合成したＤＮＡをプローブとして用い（２）で
構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とにより、タンパク質、ペプチドまたはそれらの前駆体
をコードする遺伝子をクローニングし、そして（４）ク
ローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配
列からアミノ酸配列を演繹する段階からなる方法。 ９． 態様７または８の方法であって、物質が修飾ペプ
チドまたは修飾タンパク質である場合、修飾ペプチドま
たは修飾タンパク質の修飾アミノ酸残基の部位または修
飾アミノ酸を決定する方法。 １０． 態様１、２または３の方法であって、該方法が
細胞内の物質の存在部位を決定することに向けられる方
法。 １１． 態様７、８または９の方法であって、ペプチ
ド、タンパク質、修飾ペプチド、修飾タンパク質または
それらの前駆体の細胞内の存在部位を決定する方法。 １２． 態様１ないし１１のいずれか１つの方法であっ
て、検出されるべき物質の存在部位が細胞内顆粒である
方法。 １３． 態様１２の方法であって、前記細胞内顆粒が分
泌顆粒である方法。
な生物の組織または細胞におけるペプチドの精査のため
の新規戦略。本発明の該側面にしたがい、開発された戦
略は、方法の以下の態様に適用してもよい： １． 生物の組織または細胞に存在する物質の化学構造
を直接同定するための方法であって： （１）試料組織切片または細胞の特定の細胞内領域にレ
ーザーを照射し、そして生成するマスイオンを分析し、
該部位に存在する物質のマススペクトルを得る段階、
（２）該マススペクトルを分析し、試料組織切片または
細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロファイルを
得る段階、および（３）該マスプロファイル中に現れる
特定分子量に対応する物質の化学構造を決定する段階、
からなる方法。 ２． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１の方法であって、段階（１）お
よび段階（２）がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって行
われ、そして段階（３）がＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／ま
たはプロテイン・シークエンサーによって行われる方
法。 ３． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１または２の方法であって、組織
切片または細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロ
ファイルを得る段階（２）の後でそして該マスプロファ
イル中に現れる特定分子量に対応する物質の化学構造を
決定する段階（３）の前に、組織または細胞の抽出物か
ら、該物質の分子量をマーカーとして使用することによ
り、該物質を単離しそして精製する段階が付加された方
法。 ４． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様１、２または３の方法であって、
該物質の化学構造が未知である場合に、該物質の化学構
造を決定する方法。 ５． 組織または細胞に存在する物質の化学構造を直接
同定するための、態様４の方法であって、組織または細
胞に特定の生物学的活性を有する物質が存在すると推定
されていながら、該物質の化学構造が未知であった場合
に、態様１ないし３の方法により、該物質の化学構造を
推定し、そして該推定構造を有する物質を合成し、そし
て該合成物質の生物学的活性を調べることにより、該物
質の化学構造を確認する方法。 ６． 生物の組織または細胞に存在する未知の物質の化
学構造を同定するための方法であって、態様１ないし３
の１つの方法を行うことによる方法。 ７． 態様１ないし６いずれか１つの方法であって、物
質がタンパク質またはペプチドである場合、該物質のア
ミノ酸配列を決定する方法。 ８． タンパク質、ペプチドまたはそれらの前駆体のア
ミノ酸配列を決定するための、態様７の方法であって： （１）物質の部分的アミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するＤＮＡを化学的に合成し、（２）該試料組織切片
または細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築し、（３）
（１）で合成したＤＮＡをプローブとして用い（２）で
構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とにより、タンパク質、ペプチドまたはそれらの前駆体
をコードする遺伝子をクローニングし、そして（４）ク
ローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配
列からアミノ酸配列を演繹する段階からなる方法。 ９． 態様７または８の方法であって、物質が修飾ペプ
チドまたは修飾タンパク質である場合、修飾ペプチドま
たは修飾タンパク質の修飾アミノ酸残基の部位または修
飾アミノ酸を決定する方法。 １０． 態様１、２または３の方法であって、該方法が
細胞内の物質の存在部位を決定することに向けられる方
法。 １１． 態様７、８または９の方法であって、ペプチ
ド、タンパク質、修飾ペプチド、修飾タンパク質または
それらの前駆体の細胞内の存在部位を決定する方法。 １２． 態様１ないし１１のいずれか１つの方法であっ
て、検出されるべき物質の存在部位が細胞内顆粒である
方法。 １３． 態様１２の方法であって、前記細胞内顆粒が分
泌顆粒である方法。
【００１１】
【実施例】実施例および実験材料および方法 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ アメリカザリガニ、プロキャンバルス・クラルキは、日
本で商業的に得た。脳を切除し、そして直ちに凍結させ
た後、かみそりで切った。その後、小片をＭＡＬＤＩ試
料プレート上に置いた。α−シアノ４−ヒドロキシケイ
皮酸（α−ＣＨＣＡ）マトリックスを０．１％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、アセトニトリル／水５０：
５０（ｖ／ｖ）の溶液に飽和させた。試料に存在する過
剰な塩を除去するため、マトリックスのリンスを３回繰
り返した（Ｇａｒｄｅｎら， １９９６）。新鮮なマト
リックス溶液を試料に添加し、そして乾燥させた。ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、遅延型抽出源および
３３７ ｎｍパルス化窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇ
ｅｒ Ｅｌｉｔｅ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｐ
ｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサ
チューセッツ州フラミンガム）を用い、得た。直線様式
の加速電圧は、２０ ｋＶであり、グリッド電圧は９１
％でセットされた。遅延時間は５０ ｎｓであった。イ
ンスリンＢ鎖およびプロトン付加マトリックス二量体イ
オンを用い、外部較正を行った。ＲＮＡ調製およびｃＤＮＡライブラリー構築 脳および食道下神経節（２０動物）から、ＴＲＩｚｏｌ
試薬（総ＲＮＡ単離試薬、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用
い、総ＲＮＡを調製した。バッチ溶出法により、Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘTM−ｄＴ３０（Ｒｏｃｈｅ、日本）からポリ
（Ａ）+ＲＮＡを精製した。λＺＡＰ発現ｃＤＮＡ合成
キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を
用い、ｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをλＺＡＰ発現腕
内に連結し、パッケージング混合物（Ｇｉｇａｐａｃｋ
ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａ
ｃｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングした。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング １９２倍に縮重した２０量体オリゴヌクレオチド、 [５’−ＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）
ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ａ
／Ｃ）Ｇ−３’] を用いｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。こ
れらはオルコキニンのＮ末端アミノ酸配列（Ａｓｎ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ）にし
たがい合成した。標識化、ハイブリダイゼーションおよ
び検出は、洗浄溶液の組成を除き、ＥＣＬ ３’オリゴ
標識および検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）のプロト
コルにしたがい、行った。簡潔には、トランスファーさ
れたＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）
を４２℃で１時間プレハイブリダイズさせ、そしてその
後、ハイブリダイゼーション溶液中で標識プローブに４
２℃で一晩ハイブリダイズさせた。洗浄は、Ｊａｃｏｂ
ｓら（１９９８）に記載されるように、テトラメチルア
ンモニウムクロリドを含む洗浄溶液で、４９℃で３０分
間、３回行った。ｉｎ ｖｉｖｏ切除により、陽性プラ
ークからプラスミドを回収した。得られたクローンは続
いてＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０、Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カリフォルニア州）により分
析した。キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ ０．１Ｎ塩酸１００μｌ中で脳を８０℃で３分間加熱
し、迅速に４℃に冷却し、そしてホモジェナイズした。
遠心分離後、上清を凍結乾燥した。抽出物を、０．０５
Ｍ酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム
（スーパーファイン、４００ ｍｍ ｘ １ ｍｍ
ｉ．ｄ．）上のゲル濾過に供した。中間分画を、０．０
５％ ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配で、Ｈｅ
ｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ１１００液体クロマ
トグラフィー系において、自家製ＴＳＫゲル ＯＤＳ
１２０Ｔ（Ｔｏｓｏｈ、５μｍ粒子サイズ）を充填した
ＰＥＥＫチューブ（１００ ｍｍ ｘ ０．２５ ｍｍ
ｉ．ｄ．）を用いたキャピラリー逆相高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ポンプからの流
れ（１００μｌ／分）をＴコネクターで分割し、そして
ＨＰＬＣカラムに向かう流れを２μｌ／分に調整した。
試料（１μｌ、脳１つと同等）を、Ｔコネクターおよび
キャピラリーカラムの間に置かれたＶａｌｃｏ注入バル
ブを介し、系に導入した。Ｕ型セルを備えたＵＶ検出装
置（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、モデルＵＺ−ＨＰ１１−
ＣＡＰ）を用い、２２０ ｎｍで溶出液をモニターし
た。ＵＶ検出装置のアウトレットを、質量分析計のエレ
クトロスプレーインターフェースに連結した。Ｑ−Ｔｏ
ｆ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスタ
ー）を用い、溶出液のマススペクトルを検出した。典型
的には、スプレーキャピラリーに２８００ Ｖ、そして
試料円錐に５０ Ｖを適用した。供給源温度は５０℃に
維持した。総イオン電流の範囲は、ｍ／ｚ １００から
２０００だった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験には、前駆体イ
オンの強度が２０カウント／ｓを超えるほど増加した場
合、質量分析計が自動的にデータに依存してＭＳからＭ
Ｓ／ＭＳにスイッチングするようにセットした。衝突エ
ネルギーは、２価前駆体イオンに関し、３０ Ｖだっ
た。結果 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ザリガニ脳切片に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの直
接適用により、マスｍ／ｚ １５１８のペプチドがいく
つかの点で観察されることが明らかになった。これらの
中で、嗅葉由来切片のスペクトルは、図１に示されるよ
うに、ｍ／ｚ１５１８．１７のピーク強度が明確に目立
っていた。さらにマスｍ／ｚ １３７１．５５、１３８
２．６７、１４７５．１７、１５０３．２８、および１
５５５．５８で観察される５つのピークが、嗅葉に共に
検出された。既知の甲殻類ペプチドの分子量を用いたペ
プチド検索により、表１に要約されるように、平均マス
計算値１５１７．６のオルコキニン、マス１５０２．６
の[Ｖａｌ13]オルコキニンおよびマス１４７４．５の
[Ａｌａ13]オルコキニンが明らかになった。したがっ
て、本情報は、オルコキニンファミリーペプチドがアメ
リカザリガニ脳に出現することを暗示した。以下に記載
されるプレプロオルコキニンのクローニングおよびキャ
ピラリーＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の後、マスｍ／ｚ
１３７１．５５および１５５５．５８のピークは、それ
ぞれペプチドＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬＹおよび[Ｔｈｒ8、
Ｖａｌ13]オルコキニンと同定された。マスｍ／ｚ １
３８２．６７のピークは、他の未知の神経ペプチド由来
であるようだった。オルコキニン前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの
クローニング 分子生物学的研究により、アメリカザリガニにオルコキ
ニンが存在することをさらに確認した。ザリガニの脳お
よび食道下神経節由来のλＺＡＰ発現ｃＤＮＡライブラ
リーを構築し、そして配列ＮＦＤＥＩＤＲにしたがった
１９２倍縮重オリゴヌクレオチドから合成されたプロー
ブで、およそ５ ｘ １０5組換えファージをスクリー
ニングした。１４の陽性クローンを単離し、そして約
１．１から１．８ ｋｂの範囲の挿入物を含むことを見
出した。これらはすべて、３’−ＵＴＲに１つまたは２
つのｍＲＮＡポリアデニル化のためのＡＡＴＡＡＡコン
センサス配列を含み、そしてまた、３’末端に２０〜１
００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。配列分析によ
り、これらは２つの異なる種類のオルコキニン前駆体タ
ンパク質をコードすることが示された。該クローンの２
つの代表的なヌクレオチド配列は、寄託番号ＡＢ０２９
１６８（１６０２ ｂｐ）およびＡＢ０２９１６９（１
２４０ ｂｐ）でＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
データバンクに提出されている。ＡＢ０２９１６８およ
びＡＢ０２９１６９は、それぞれ、７５３ ｂｐおよび
７９８ ｂｐの最長読み枠と共に、４１ ｂｐおよび７
４ ｂｐの５’−ＵＴＲ、および８０８ ｂｐおよび３
６８ ｂｐのポリ（Ａ）テールを除く３’−ＵＴＲを有
した。ＡＢ０２９１６８（長さ２５１残基）およびＡＢ
０２９１６９（長さ２６６残基）に対応する演繹される
アミノ酸配列は、それぞれ、プレプロオルコキニンＡお
よびＢと名付けられた。図２は、ＡＢ０２９１６８のヌ
クレオチド配列およびプレプロオルコキニンＡの演繹さ
れるアミノ酸配列を示す。第一のＭｅｔに、最も疎水性
である領域（データは示されていない）でありそしてシ
グナル配列であると同定された、約２０の非荷電アミノ
酸が続く。プレプロオルコキニンＡはオルコキニン７コ
ピーだけでなく、他の４種類のオルコキニン様ペプチド
も含む。すなわち、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ（[Ｖ
ａｌ13]オルコキニン）を２コピー、およびＮＦＤＥＩ
ＤＲＳＧＦＧＦＡ（[Ａｌａ13]オルコキニン）、ＮＦＤ
ＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ（[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキ
ニン）およびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳを各々１コピー含
む。後者の２つは、新規オルコキニン様ペプチドであ
る。一方、プレプロオルコキニンＢは、１つのさらなる
オルコキニン配列を含む以外はプレプロオルコキニンＡ
のものと同一である（図３）。プレプロオルコキニン中
のオルコキニンおよびオルコキニン様ペプチドの配列に
はすべて、前駆体タンパク質中のＮおよびＣ末端にＫ
Ｒ、ＫＫまたはＲＲの塩基性アミノ酸対が隣接してい
た。キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ 図４は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上のザリガ
ニ脳（２動物）のＨＣｌ抽出物のキャピラリーゲル濾過
を示す。第二の分画はｍ／ｚ １５１８のペプチドを含
み、そしてさらにオンラインキャピラリー逆相ＨＰＬＣ
／Ｑ−ＴｏｆＭＳに供した。図５は、キャピラリーＴＳ
ＫゲルＯＤＳ １２０Ｔカラム上の第二の分画の１動物
同等物に関する溶出プロファイルを示す。オルコキニン
およびその関連ペプチドの同定のため計算された分子量
を表１に要約する。得られたＬＣ−ＭＳデータを、図５
に示されるように、ペプチドの２価イオンにより選択的
にモニターした。２価イオンは、クロマトグラムのｍ／
ｚ ７５９．３７、７５１．９２、７３７．８６、７７
７．９０、および５９３．７８に観察され、そしてその
後、それぞれ、オルコキニン、[Ｖａｌ13]オルコキニ
ン、[Ａｌａ13]オルコキニン、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オ
ルコキニンおよびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳの単荷電マス
に対応する、１５１６．７４、１５０１．８４、１４７
３．７２、１５５３．８０、および１１８５．５６のマ
スに転換した。さらに、クロマトグラムに存在するｍ／
ｚ ６８５．９１の２価イオンは、転換マス１３６９．
８２であり、プロオルコキニンの配列ＶＹＶＰＲＹＩＡ
ＮＬＹに対応した。図６は、Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ上のオル
コキニン遺伝子関連ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペク
トルを示す。ｍ／ｚ ７５９、７５２、７３８、７７
８、５９３および６８６の２価イオンから生成されるこ
れらの衝突誘導解離スペクトルは、図６に例示されるよ
うに、オルコキニン、[Ｖａｌ13]オルコキニン、[Ａｌ
ａ13]オルコキニン、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニ
ン、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ、およびＶＹＶＰＲＹＩＡ
ＮＬＹの配列に関する断片化パターンを示した。考察 本研究は、甲殻類神経ペプチド研究において、ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ、分子クローニングおよびオンライン
キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳを組み合
わせたアプローチを適用した最初の報告である。本戦略
の１つの利点は、既定のバイオアッセイに関係なく神経
ペプチドが同定されることである。したがって、本方法
は、神経ペプチドを単離するのに必要とされる試料数の
数および実験時間を減少させることが可能である。第一
に、脳における嗅葉のペプチドプロファイルの直接ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、ｍ／ｚ １３７１．５５、
１３８２．６７、１４７５．１７、１５０３．２８、１
５１８．１７、および１５５５．５８の[Ｍ＋Ｈ]+に特
異的に含まれる一組のペプチドが明らかになった。この
場合、以前イソガニ（Ｂｕｎｇａｒｔら， １９９５
ａ）および／または他のザリガニ（Ｂｕｒｄｚｉｋら，
１９９３；Ｓｔａｎｇｉｅｒら， １９９２）から単
離されたオルコキニン、[Ｖａｌ13]、および[Ａｌａ13]
オルコキニンの分子量が、該マスプロファイルに一致し
た。したがって、発明者は、オルコキニン前駆体のクロ
ーニングを検討した。クローンされたプロオルコキニン
構造に基づき、推定上の成熟ペプチドの分子量および配
列を要約した。最後に、キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｍ
Ｓ／ＭＳを用い、プロオルコキニンから生成される成熟
ペプチドの出現を明確にし、そしてこれらのペプチドの
構造を決定した。
本で商業的に得た。脳を切除し、そして直ちに凍結させ
た後、かみそりで切った。その後、小片をＭＡＬＤＩ試
料プレート上に置いた。α−シアノ４−ヒドロキシケイ
皮酸（α−ＣＨＣＡ）マトリックスを０．１％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、アセトニトリル／水５０：
５０（ｖ／ｖ）の溶液に飽和させた。試料に存在する過
剰な塩を除去するため、マトリックスのリンスを３回繰
り返した（Ｇａｒｄｅｎら， １９９６）。新鮮なマト
リックス溶液を試料に添加し、そして乾燥させた。ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、遅延型抽出源および
３３７ ｎｍパルス化窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇ
ｅｒ Ｅｌｉｔｅ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｐ
ｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサ
チューセッツ州フラミンガム）を用い、得た。直線様式
の加速電圧は、２０ ｋＶであり、グリッド電圧は９１
％でセットされた。遅延時間は５０ ｎｓであった。イ
ンスリンＢ鎖およびプロトン付加マトリックス二量体イ
オンを用い、外部較正を行った。ＲＮＡ調製およびｃＤＮＡライブラリー構築 脳および食道下神経節（２０動物）から、ＴＲＩｚｏｌ
試薬（総ＲＮＡ単離試薬、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用
い、総ＲＮＡを調製した。バッチ溶出法により、Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘTM−ｄＴ３０（Ｒｏｃｈｅ、日本）からポリ
（Ａ）+ＲＮＡを精製した。λＺＡＰ発現ｃＤＮＡ合成
キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を
用い、ｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをλＺＡＰ発現腕
内に連結し、パッケージング混合物（Ｇｉｇａｐａｃｋ
ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａ
ｃｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でパッケージングした。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング １９２倍に縮重した２０量体オリゴヌクレオチド、 [５’−ＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）
ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ａ
／Ｃ）Ｇ−３’] を用いｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。こ
れらはオルコキニンのＮ末端アミノ酸配列（Ａｓｎ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ）にし
たがい合成した。標識化、ハイブリダイゼーションおよ
び検出は、洗浄溶液の組成を除き、ＥＣＬ ３’オリゴ
標識および検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）のプロト
コルにしたがい、行った。簡潔には、トランスファーさ
れたＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）
を４２℃で１時間プレハイブリダイズさせ、そしてその
後、ハイブリダイゼーション溶液中で標識プローブに４
２℃で一晩ハイブリダイズさせた。洗浄は、Ｊａｃｏｂ
ｓら（１９９８）に記載されるように、テトラメチルア
ンモニウムクロリドを含む洗浄溶液で、４９℃で３０分
間、３回行った。ｉｎ ｖｉｖｏ切除により、陽性プラ
ークからプラスミドを回収した。得られたクローンは続
いてＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０、Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カリフォルニア州）により分
析した。キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ ０．１Ｎ塩酸１００μｌ中で脳を８０℃で３分間加熱
し、迅速に４℃に冷却し、そしてホモジェナイズした。
遠心分離後、上清を凍結乾燥した。抽出物を、０．０５
Ｍ酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム
（スーパーファイン、４００ ｍｍ ｘ １ ｍｍ
ｉ．ｄ．）上のゲル濾過に供した。中間分画を、０．０
５％ ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配で、Ｈｅ
ｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ１１００液体クロマ
トグラフィー系において、自家製ＴＳＫゲル ＯＤＳ
１２０Ｔ（Ｔｏｓｏｈ、５μｍ粒子サイズ）を充填した
ＰＥＥＫチューブ（１００ ｍｍ ｘ ０．２５ ｍｍ
ｉ．ｄ．）を用いたキャピラリー逆相高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ポンプからの流
れ（１００μｌ／分）をＴコネクターで分割し、そして
ＨＰＬＣカラムに向かう流れを２μｌ／分に調整した。
試料（１μｌ、脳１つと同等）を、Ｔコネクターおよび
キャピラリーカラムの間に置かれたＶａｌｃｏ注入バル
ブを介し、系に導入した。Ｕ型セルを備えたＵＶ検出装
置（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、モデルＵＺ−ＨＰ１１−
ＣＡＰ）を用い、２２０ ｎｍで溶出液をモニターし
た。ＵＶ検出装置のアウトレットを、質量分析計のエレ
クトロスプレーインターフェースに連結した。Ｑ−Ｔｏ
ｆ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスタ
ー）を用い、溶出液のマススペクトルを検出した。典型
的には、スプレーキャピラリーに２８００ Ｖ、そして
試料円錐に５０ Ｖを適用した。供給源温度は５０℃に
維持した。総イオン電流の範囲は、ｍ／ｚ １００から
２０００だった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験には、前駆体イ
オンの強度が２０カウント／ｓを超えるほど増加した場
合、質量分析計が自動的にデータに依存してＭＳからＭ
Ｓ／ＭＳにスイッチングするようにセットした。衝突エ
ネルギーは、２価前駆体イオンに関し、３０ Ｖだっ
た。結果 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ザリガニ脳切片に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの直
接適用により、マスｍ／ｚ １５１８のペプチドがいく
つかの点で観察されることが明らかになった。これらの
中で、嗅葉由来切片のスペクトルは、図１に示されるよ
うに、ｍ／ｚ１５１８．１７のピーク強度が明確に目立
っていた。さらにマスｍ／ｚ １３７１．５５、１３８
２．６７、１４７５．１７、１５０３．２８、および１
５５５．５８で観察される５つのピークが、嗅葉に共に
検出された。既知の甲殻類ペプチドの分子量を用いたペ
プチド検索により、表１に要約されるように、平均マス
計算値１５１７．６のオルコキニン、マス１５０２．６
の[Ｖａｌ13]オルコキニンおよびマス１４７４．５の
[Ａｌａ13]オルコキニンが明らかになった。したがっ
て、本情報は、オルコキニンファミリーペプチドがアメ
リカザリガニ脳に出現することを暗示した。以下に記載
されるプレプロオルコキニンのクローニングおよびキャ
ピラリーＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の後、マスｍ／ｚ
１３７１．５５および１５５５．５８のピークは、それ
ぞれペプチドＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬＹおよび[Ｔｈｒ8、
Ｖａｌ13]オルコキニンと同定された。マスｍ／ｚ １
３８２．６７のピークは、他の未知の神経ペプチド由来
であるようだった。オルコキニン前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの
クローニング 分子生物学的研究により、アメリカザリガニにオルコキ
ニンが存在することをさらに確認した。ザリガニの脳お
よび食道下神経節由来のλＺＡＰ発現ｃＤＮＡライブラ
リーを構築し、そして配列ＮＦＤＥＩＤＲにしたがった
１９２倍縮重オリゴヌクレオチドから合成されたプロー
ブで、およそ５ ｘ １０5組換えファージをスクリー
ニングした。１４の陽性クローンを単離し、そして約
１．１から１．８ ｋｂの範囲の挿入物を含むことを見
出した。これらはすべて、３’−ＵＴＲに１つまたは２
つのｍＲＮＡポリアデニル化のためのＡＡＴＡＡＡコン
センサス配列を含み、そしてまた、３’末端に２０〜１
００ヌクレオチドのポリＡテールを含む。配列分析によ
り、これらは２つの異なる種類のオルコキニン前駆体タ
ンパク質をコードすることが示された。該クローンの２
つの代表的なヌクレオチド配列は、寄託番号ＡＢ０２９
１６８（１６０２ ｂｐ）およびＡＢ０２９１６９（１
２４０ ｂｐ）でＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
データバンクに提出されている。ＡＢ０２９１６８およ
びＡＢ０２９１６９は、それぞれ、７５３ ｂｐおよび
７９８ ｂｐの最長読み枠と共に、４１ ｂｐおよび７
４ ｂｐの５’−ＵＴＲ、および８０８ ｂｐおよび３
６８ ｂｐのポリ（Ａ）テールを除く３’−ＵＴＲを有
した。ＡＢ０２９１６８（長さ２５１残基）およびＡＢ
０２９１６９（長さ２６６残基）に対応する演繹される
アミノ酸配列は、それぞれ、プレプロオルコキニンＡお
よびＢと名付けられた。図２は、ＡＢ０２９１６８のヌ
クレオチド配列およびプレプロオルコキニンＡの演繹さ
れるアミノ酸配列を示す。第一のＭｅｔに、最も疎水性
である領域（データは示されていない）でありそしてシ
グナル配列であると同定された、約２０の非荷電アミノ
酸が続く。プレプロオルコキニンＡはオルコキニン７コ
ピーだけでなく、他の４種類のオルコキニン様ペプチド
も含む。すなわち、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ（[Ｖ
ａｌ13]オルコキニン）を２コピー、およびＮＦＤＥＩ
ＤＲＳＧＦＧＦＡ（[Ａｌａ13]オルコキニン）、ＮＦＤ
ＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ（[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキ
ニン）およびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳを各々１コピー含
む。後者の２つは、新規オルコキニン様ペプチドであ
る。一方、プレプロオルコキニンＢは、１つのさらなる
オルコキニン配列を含む以外はプレプロオルコキニンＡ
のものと同一である（図３）。プレプロオルコキニン中
のオルコキニンおよびオルコキニン様ペプチドの配列に
はすべて、前駆体タンパク質中のＮおよびＣ末端にＫ
Ｒ、ＫＫまたはＲＲの塩基性アミノ酸対が隣接してい
た。キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ 図４は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上のザリガ
ニ脳（２動物）のＨＣｌ抽出物のキャピラリーゲル濾過
を示す。第二の分画はｍ／ｚ １５１８のペプチドを含
み、そしてさらにオンラインキャピラリー逆相ＨＰＬＣ
／Ｑ−ＴｏｆＭＳに供した。図５は、キャピラリーＴＳ
ＫゲルＯＤＳ １２０Ｔカラム上の第二の分画の１動物
同等物に関する溶出プロファイルを示す。オルコキニン
およびその関連ペプチドの同定のため計算された分子量
を表１に要約する。得られたＬＣ−ＭＳデータを、図５
に示されるように、ペプチドの２価イオンにより選択的
にモニターした。２価イオンは、クロマトグラムのｍ／
ｚ ７５９．３７、７５１．９２、７３７．８６、７７
７．９０、および５９３．７８に観察され、そしてその
後、それぞれ、オルコキニン、[Ｖａｌ13]オルコキニ
ン、[Ａｌａ13]オルコキニン、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オ
ルコキニンおよびＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳの単荷電マス
に対応する、１５１６．７４、１５０１．８４、１４７
３．７２、１５５３．８０、および１１８５．５６のマ
スに転換した。さらに、クロマトグラムに存在するｍ／
ｚ ６８５．９１の２価イオンは、転換マス１３６９．
８２であり、プロオルコキニンの配列ＶＹＶＰＲＹＩＡ
ＮＬＹに対応した。図６は、Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳ上のオル
コキニン遺伝子関連ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペク
トルを示す。ｍ／ｚ ７５９、７５２、７３８、７７
８、５９３および６８６の２価イオンから生成されるこ
れらの衝突誘導解離スペクトルは、図６に例示されるよ
うに、オルコキニン、[Ｖａｌ13]オルコキニン、[Ａｌ
ａ13]オルコキニン、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニ
ン、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ、およびＶＹＶＰＲＹＩＡ
ＮＬＹの配列に関する断片化パターンを示した。考察 本研究は、甲殻類神経ペプチド研究において、ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ、分子クローニングおよびオンライン
キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ ＭＳを組み合
わせたアプローチを適用した最初の報告である。本戦略
の１つの利点は、既定のバイオアッセイに関係なく神経
ペプチドが同定されることである。したがって、本方法
は、神経ペプチドを単離するのに必要とされる試料数の
数および実験時間を減少させることが可能である。第一
に、脳における嗅葉のペプチドプロファイルの直接ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、ｍ／ｚ １３７１．５５、
１３８２．６７、１４７５．１７、１５０３．２８、１
５１８．１７、および１５５５．５８の[Ｍ＋Ｈ]+に特
異的に含まれる一組のペプチドが明らかになった。この
場合、以前イソガニ（Ｂｕｎｇａｒｔら， １９９５
ａ）および／または他のザリガニ（Ｂｕｒｄｚｉｋら，
１９９３；Ｓｔａｎｇｉｅｒら， １９９２）から単
離されたオルコキニン、[Ｖａｌ13]、および[Ａｌａ13]
オルコキニンの分子量が、該マスプロファイルに一致し
た。したがって、発明者は、オルコキニン前駆体のクロ
ーニングを検討した。クローンされたプロオルコキニン
構造に基づき、推定上の成熟ペプチドの分子量および配
列を要約した。最後に、キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｍ
Ｓ／ＭＳを用い、プロオルコキニンから生成される成熟
ペプチドの出現を明確にし、そしてこれらのペプチドの
構造を決定した。
【００１２】クローニング後、直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ分析から得られたペプチドプロファイルを再考す
ると、オルコキニン、[Ａｌａ13]および[Ｖａｌ13]オル
コキニンに加え、マスｍ／ｚ １３７１．５５のピーク
が関連するペプチドの１つであるＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬ
Ｙと同定され，そしてｍ／ｚ １５５５．５８は[Ｔｈ
ｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニンと同定された。ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ ＭＳにおけるペプチドイオンの強度は、必ず
しも試料混合物中のペプチド含量に対し定量的でないた
め、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳの短いペプチドは、ＭＳ分
析では検出されなかった（図１）。しかし、直接ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を脳切片に適用することで、単
点から得られるスペクトルにより前駆体タンパク質の特
定のプロセシングが確認されるため、神経ペプチド研究
において多くの細胞の予備的でそして迅速なスクリーニ
ングが可能になる。
ＭＳ分析から得られたペプチドプロファイルを再考す
ると、オルコキニン、[Ａｌａ13]および[Ｖａｌ13]オル
コキニンに加え、マスｍ／ｚ １３７１．５５のピーク
が関連するペプチドの１つであるＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬ
Ｙと同定され，そしてｍ／ｚ １５５５．５８は[Ｔｈ
ｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニンと同定された。ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ ＭＳにおけるペプチドイオンの強度は、必ず
しも試料混合物中のペプチド含量に対し定量的でないた
め、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳの短いペプチドは、ＭＳ分
析では検出されなかった（図１）。しかし、直接ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を脳切片に適用することで、単
点から得られるスペクトルにより前駆体タンパク質の特
定のプロセシングが確認されるため、神経ペプチド研究
において多くの細胞の予備的でそして迅速なスクリーニ
ングが可能になる。
【００１３】キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ
ＭＳは、ペプチドおよびタンパク質性質決定のための強
力な手段である。ペプチド検出感度亢進に関してのキャ
ピラリーカラムの利点は、図５に示されるように、ＬＣ
−ＭＳを用い、フェントモルレベルで内因性神経ペプチ
ドを同定することが可能であることであり、そしてコン
ピューター技術が、より高いレベルの検出特異性を提供
する。したがって、１動物に同等である脳抽出物が、神
経ペプチドの同定および配列決定に完全に適当である。
その結果、我々の研究プログラムに基づき、発明者は、
甲殻類の脳ペプチド性質決定のための新規標準的方法と
して以下を提案する。第一の段階は、直接ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ分析による神経分泌顆粒の部位特異的分子
マスプロファイリングである。第二の段階は、既定の分
泌物質の分子量をモニターし、そしてその後、該物質の
配列を決定することによる、該物質の精製である。構造
決定に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／またはプロテイン・
シークエンサーを両方用いてもよい。第三の段階は、ペ
プチドのアミノ酸配列に基づく、既定のペプチドの前駆
体の分子クローニングである。最終段階は、脳抽出物の
キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ分析である。抽
出物は分泌物質を含み、該物質をＨＰＬＣにより個々の
構成要素に分画し、そしてその後ＭＳ様式により検出す
る。コンピュータープロセシングにより元来のＬＣ−Ｍ
Ｓデータから各１つのマスを選択してもよく、そしてそ
れらの配列をＭＳ／ＭＳ様式により決定する。これらの
方法は、神経ペプチド発現部位、前駆体構造およびプロ
セシングの経路を含む、ザリガニ脳における新規神経ペ
プチドの微量性質決定のための優れた手段を提供するで
あろう。
ＭＳは、ペプチドおよびタンパク質性質決定のための強
力な手段である。ペプチド検出感度亢進に関してのキャ
ピラリーカラムの利点は、図５に示されるように、ＬＣ
−ＭＳを用い、フェントモルレベルで内因性神経ペプチ
ドを同定することが可能であることであり、そしてコン
ピューター技術が、より高いレベルの検出特異性を提供
する。したがって、１動物に同等である脳抽出物が、神
経ペプチドの同定および配列決定に完全に適当である。
その結果、我々の研究プログラムに基づき、発明者は、
甲殻類の脳ペプチド性質決定のための新規標準的方法と
して以下を提案する。第一の段階は、直接ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ ＭＳ分析による神経分泌顆粒の部位特異的分子
マスプロファイリングである。第二の段階は、既定の分
泌物質の分子量をモニターし、そしてその後、該物質の
配列を決定することによる、該物質の精製である。構造
決定に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／またはプロテイン・
シークエンサーを両方用いてもよい。第三の段階は、ペ
プチドのアミノ酸配列に基づく、既定のペプチドの前駆
体の分子クローニングである。最終段階は、脳抽出物の
キャピラリー逆相ＨＰＬＣ／Ｑ−Ｔｏｆ分析である。抽
出物は分泌物質を含み、該物質をＨＰＬＣにより個々の
構成要素に分画し、そしてその後ＭＳ様式により検出す
る。コンピュータープロセシングにより元来のＬＣ−Ｍ
Ｓデータから各１つのマスを選択してもよく、そしてそ
れらの配列をＭＳ／ＭＳ様式により決定する。これらの
方法は、神経ペプチド発現部位、前駆体構造およびプロ
セシングの経路を含む、ザリガニ脳における新規神経ペ
プチドの微量性質決定のための優れた手段を提供するで
あろう。
【００１４】本研究はまた，オルコキニン関連ペプチド
の前駆体タンパク質クローニングに対する最初の報告で
もある。前駆体タンパク質において、オルコキニン関連
ペプチドは、直列で出現し、そして塩基性アミノ酸対が
隣接していた。その特徴は、アカチン（ａｃｈａｔｉ
ｎ）−Ｉ（Ｓａｔａｋｅら， １９９９）、フリシン
（ｆｕｌｉｃｉｎ）（Ｙａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａｎｉ
ら， １９９５）、ミオモジュリン（Ｌｏｐｅｚら，
１９９３）およびＦＭＲＦアミド（例えばＬｉｎａｃｒ
ｅら， １９９０；Ｎａｍｂｕら， １９８８；Ｒｏｓ
ｏｆｆら， １９９２）などの、軟体動物（ｍｏｌｌｕ
ｓｃ）、昆虫および／または線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）
由来の小神経ペプチドの前駆体タンパク質のものと同様
である。甲殻類では、血糖上昇ホルモンおよび脱皮阻害
ホルモンなどの、より長い神経ペプチドの前駆体タンパ
ク質ｃＤＮＡがいくつかの種から明らかになってきてい
る（例えばＷｅｉｄｅｍａｎｎら， １９８９；Ｔｅｎ
ｓｅｎら， １９９１；Ｋｌｅｉｎら， １９９３）
が、これらのタンパク質は、１コピーの神経ペプチドし
か含まない。我々の知る限り、アメリカザリガニ由来の
オルコキニン前駆体タンパク質は、多数の神経ペプチド
コピーをコードする、甲殻類での最初の例である。さら
に、ｃＤＮＡの分子クローニングにより、アメリカザリ
ガニには少なくとも２種類のオルコキニン前駆体タンパ
ク質があることが明らかになった。これらは、さらに１
つのオルコキニンコピーがあること以外、同一である。
なぜこうした類似のタンパク質がプロセシングされなく
てはならないのかは不明である。しかし、逆転写酵素Ｐ
ＣＲから得られた予備的結果により、脳に２種類の転写
物が存在することが示された（データは示していな
い）。該転写物が単一の遺伝子から選択的スプライシン
グにより生成されるのか、または２つまたはそれ以上の
異なる遺伝子から由来するのかを明確にするためには、
ゲノムクローンのサザンブロットおよびクローニングを
行わなければならない。さらに、Ｂｕｎｇａｒｔら（１
９９５ａ）は、オルコキニン関連ペプチドは、甲殻類お
よびあるいは節足動物においてオルコキニンの新規神経
ペプチドファミリーを確立する可能性があることを示唆
した。ザリガニ脳におけるオルコキニン類似体出現は、
この考えを支持し、そして該前駆体タンパク質のヌクレ
オチド配列に関する情報は、節足動物、軟体動物および
他の無脊椎動物の間のオルコキニンファミリー分布に対
する研究のための有用な手段であることが証明されるで
あろう。
の前駆体タンパク質クローニングに対する最初の報告で
もある。前駆体タンパク質において、オルコキニン関連
ペプチドは、直列で出現し、そして塩基性アミノ酸対が
隣接していた。その特徴は、アカチン（ａｃｈａｔｉ
ｎ）−Ｉ（Ｓａｔａｋｅら， １９９９）、フリシン
（ｆｕｌｉｃｉｎ）（Ｙａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａｎｉ
ら， １９９５）、ミオモジュリン（Ｌｏｐｅｚら，
１９９３）およびＦＭＲＦアミド（例えばＬｉｎａｃｒ
ｅら， １９９０；Ｎａｍｂｕら， １９８８；Ｒｏｓ
ｏｆｆら， １９９２）などの、軟体動物（ｍｏｌｌｕ
ｓｃ）、昆虫および／または線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）
由来の小神経ペプチドの前駆体タンパク質のものと同様
である。甲殻類では、血糖上昇ホルモンおよび脱皮阻害
ホルモンなどの、より長い神経ペプチドの前駆体タンパ
ク質ｃＤＮＡがいくつかの種から明らかになってきてい
る（例えばＷｅｉｄｅｍａｎｎら， １９８９；Ｔｅｎ
ｓｅｎら， １９９１；Ｋｌｅｉｎら， １９９３）
が、これらのタンパク質は、１コピーの神経ペプチドし
か含まない。我々の知る限り、アメリカザリガニ由来の
オルコキニン前駆体タンパク質は、多数の神経ペプチド
コピーをコードする、甲殻類での最初の例である。さら
に、ｃＤＮＡの分子クローニングにより、アメリカザリ
ガニには少なくとも２種類のオルコキニン前駆体タンパ
ク質があることが明らかになった。これらは、さらに１
つのオルコキニンコピーがあること以外、同一である。
なぜこうした類似のタンパク質がプロセシングされなく
てはならないのかは不明である。しかし、逆転写酵素Ｐ
ＣＲから得られた予備的結果により、脳に２種類の転写
物が存在することが示された（データは示していな
い）。該転写物が単一の遺伝子から選択的スプライシン
グにより生成されるのか、または２つまたはそれ以上の
異なる遺伝子から由来するのかを明確にするためには、
ゲノムクローンのサザンブロットおよびクローニングを
行わなければならない。さらに、Ｂｕｎｇａｒｔら（１
９９５ａ）は、オルコキニン関連ペプチドは、甲殻類お
よびあるいは節足動物においてオルコキニンの新規神経
ペプチドファミリーを確立する可能性があることを示唆
した。ザリガニ脳におけるオルコキニン類似体出現は、
この考えを支持し、そして該前駆体タンパク質のヌクレ
オチド配列に関する情報は、節足動物、軟体動物および
他の無脊椎動物の間のオルコキニンファミリー分布に対
する研究のための有用な手段であることが証明されるで
あろう。
【００１５】生物学的活性に関し、短い類似体が最も興
味深い。ペプチドＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ以外の、３つ
の種から同定された５つのペプチドは互いに構造的に非
常に類似であり、そして相違は８、９、および１３位に
限定されている（表１）。
味深い。ペプチドＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ以外の、３つ
の種から同定された５つのペプチドは互いに構造的に非
常に類似であり、そして相違は８、９、および１３位に
限定されている（表１）。
【００１６】
【表１】
【００１７】Ｂｕｎｇａｒｔら（１９９５ｂ）は、Ｃ末
端でのオルコキニンの変化は、Ｎ末端修飾より、後腸に
対する活性への干渉がより少ないことを報告した。した
がって、新規ペプチドの１つ、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オ
ルコキニンが、他のオルコキニン類似体のように、ザリ
ガニ後腸に対するこうした活性を持つことを推測するこ
とが可能である。逆に、他の新規ペプチド、ＦＤＡＦＴ
ＴＧＦＧＨＳの構造は、オルコキニンおよびその関連ペ
プチドのものとまったく異なっている。したがって、そ
の生物学的活性は、後腸に対してと共にいくつかの可能
性がある標的、例えば心臓または神経に対し、調べなけ
ればならない。一方、小触覚突起上の嗅覚受容体ニュー
ロンからの軸索は、すべてザリガニ脳中の嗅葉のニュー
ロパイル（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｅ）中の嗅葉糸球体に入
るため、嗅葉はその総入力を第一触覚上の化学受容器か
ら受けると見なされる（Ｓａｎｄｅｍａｎら， １９９
２）。しかし、オルコキニンおよびその遺伝子関連ペプ
チドの脳における生理学的役割は、現時点でまだ明らか
にされていない。オルコキニンは言うまでもなく、脳ペ
プチドの発見および役割の解明は、甲殻類生理学におい
てさらに興味深い研究課題となるであろう。
端でのオルコキニンの変化は、Ｎ末端修飾より、後腸に
対する活性への干渉がより少ないことを報告した。した
がって、新規ペプチドの１つ、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オ
ルコキニンが、他のオルコキニン類似体のように、ザリ
ガニ後腸に対するこうした活性を持つことを推測するこ
とが可能である。逆に、他の新規ペプチド、ＦＤＡＦＴ
ＴＧＦＧＨＳの構造は、オルコキニンおよびその関連ペ
プチドのものとまったく異なっている。したがって、そ
の生物学的活性は、後腸に対してと共にいくつかの可能
性がある標的、例えば心臓または神経に対し、調べなけ
ればならない。一方、小触覚突起上の嗅覚受容体ニュー
ロンからの軸索は、すべてザリガニ脳中の嗅葉のニュー
ロパイル（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｅ）中の嗅葉糸球体に入
るため、嗅葉はその総入力を第一触覚上の化学受容器か
ら受けると見なされる（Ｓａｎｄｅｍａｎら， １９９
２）。しかし、オルコキニンおよびその遺伝子関連ペプ
チドの脳における生理学的役割は、現時点でまだ明らか
にされていない。オルコキニンは言うまでもなく、脳ペ
プチドの発見および役割の解明は、甲殻類生理学におい
てさらに興味深い研究課題となるであろう。
【００１８】結論として、ザリガニ脳由来のオルコキニ
ンおよびその遺伝子関連ペプチドを、バイオアッセイの
代替物として、物理化学的規準でモニターすることによ
り、性質決定した。実施において、脳ペプチドの同定の
ため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、キャピラリー逆相ＨＰ
ＬＣ／ＭＳ、および分子クローニングを使用するのが好
都合である。本研究はまた、脳において、特定のプロセ
シングにより産生されるオルコキニン前駆体およびその
遺伝子関連ペプチドの構造的構成に関する最初の証拠も
提供する。参考文献 Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ．（１９９２）． Ｍａｓｓ ｓ
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Ｄｉｒｃｋｓｅｎ，Ｈ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，
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ｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ
ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｓｈｏｒｅ ｃｒａｂ，Ｃａｒｃｉｎｕｓ
ｍａｅｎａｓ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎ
ｏｖｅｌ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆａｍｉｌｙ．
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ｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒ
ｕｓｔａｃｅａｎ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ｎｅｕｒｏｐ
ｅｐｔｉｄｅ ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
１６， １９９−２０４． Ｂｕｒｄｚｉｋ， Ｓ．， Ｓａｕｔｅｒ， Ａ．，
Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，
Ｒ．（１９９３）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒｃｏｋｉ
ｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｉｎｄｇｕｔ ｏｆ
ｔｈｅ ｃｒａｙｆｉｓｈ， Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅｓ
ｌｉｍｏｓｕｓ． Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ２１ｔｈ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｎｅｕｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（Ｅｌｓｎｅ
ｒ， Ｎ． ａｎｄ Ｈｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．，
ｅｄｓ．）ｐｐ． ５９８， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，
Ｔｈｉｅｍｅ．Ｄｅ Ｗｉｔｈ， Ｎ．Ｄ．， Ｌｉ，
Ｋ．Ｗ．， Ｊｉｍｅｎｅｓ， Ｃ．Ｒ．， Ｖｏｎ
ｋ， Ｋ．， Ｄｒｅｉｓｅｗｅｒｄ， Ｋ．， Ｈｉ
ｌｌｅｎｋａｍｐ， Ｆ．， Ｋａｒａｓ， Ｍ．，
ａｎｄ Ｇｅｒａｅｒｔｓ， Ｗ．Ｐ．Ｍ．（１９９
７）． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｏｌ
ｌｕｓｃａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８， ７６５−７７０． Ｆｅｒｎｌｕｎｄ， Ｐ． ａｎｄ Ｊｏｓｅｆｓｓｏ
ｎ， Ｌ．（１９７２）． Ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｃ
ｏｌｏｒ−ｃｈａｎｇｅ ｈｏｒｍｏｎｅ： Ａｍｉｎ
ｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １７
７， １７３−１７４． Ｆｅｒｎｌｕｎｄ， Ｐ．（１９７２）． Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｌｉｇｈｔ−ａｄａｐｔｉｎｇ
ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｈｒｉｍｐ，
Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ４３９， １７−
２５． Ｇａｒｄｅｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｍｏｒｏｚ， Ｌ．
Ｌ．， Ｍｏｒｏｚ， Ｔ．Ｐ．， Ｓｈｉｐｐｙ，
Ｓ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｗｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ｖ．（１
９９６）． Ｅｘｃｅｓｓ ｓａｌｔ ｒｅｍｏｖａｌ
ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｒｉｎｓｉｎｇ： ｄｉｒ
ｅｃｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆ ｎ
ｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔ
ｅｂｒａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉ
ｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａ
ｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｍａｓｓ．
Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ３１，１１２６−１１３０． Ｇａｒｄｅｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｓｈｉｐｐｙ， Ｓ．
Ａ．， Ｌｉ， Ｌ．，Ｍｏｒｏｚ， Ｔ．Ｐ．， ａ
ｎｄ Ｓｗｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ｖ．（１９９８）． Ｐ
ｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｐｌｙｓｉａ ｅｇｇ−ｌａｙｉｎｇ ｈｏ
ｒｍｏｎｅ ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９５，
３９７２−３９７７． Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９９２）． Ｃｒｕｓｔａｃ
ｅａｎ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ， ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａ
ｒａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ． Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ ４８， ４３９−４４８． Ｋｌｅｉｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｍａｎｇｅｒｉｃｈ，
Ｓ．， ｄｅ Ｋｌｅｉｊｎ， Ｄ．Ｐ．Ｖ．， Ｋｅ
ｌｌｅｒ， Ｒ．， ａｎｄ Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ，
Ｗ．（１９９３）． Ｍｏｃｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｏｆ ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｍｏｌｔ−ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ （ＭＩＨ） ｐｒｅ
ｃｕｒｓｏｒ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３４， １
３９−１４２． Ｌｉｎａｃｒｅ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｔｔ， Ｅ．，
Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｓ．， Ｂｒｉｇｈｔ， Ｋ．，
Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｐ．Ｒ．， ａｎｄＢｕｒｋ
ｅ， Ｊ．Ｆ．（１９９０）． Ｃａｒｄｉｏａｃｔｉ
ｖｅ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＦＭＲＦａｍｉｄｅ） ａｎｄ
ｎｏｖｅｌ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａ
ｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏ
ｐｉｅｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｓｎａｉｌ Ｌｙｍｎａｅａ ｓｔａｇｎａｌ
ｉｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０， ４１２−
４１９． Ｌｏｐｅｚ， Ｖ．， Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｌ．， ａ
ｎｄ Ｄｅｓｇｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ， Ｌ．（１９９
３）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ ｍ
ｙｏｍｏｄｕｌｉｎ ｃＤＮＡ， ａ ｎｅｕｒｏｐｅ
ｐｔｉｄｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎ Ｌ１０ ｏｆ Ａｐ
ｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ． ＤＮＡ ａｎ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２， ５３−６１． Ｍｅｒｃｉｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｏｒｃｈａｒｄ，
Ｉ．， Ｓｋｅｒｒｅｔｔ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔｅ
Ｂｒｕｇｇｅ， Ｖ．（１９７１）． ＦＭＲＦａｍｉ
ｄｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｒａｙｆｉｓｈｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｏｒｇａｎ
ｓ Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ａｂｓｔｒ． ８
５， ２００． Ｎａｍｂｕ， Ｊ．Ｒ．， Ｍｕｒｐｈｙ−Ｅｒｄｏｓ
ｈ， Ｃ．， Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｐ．Ｃ．， Ｆｅｉ
ｓｔｎｅｒ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅ
ｒ， Ｒ．Ｈ．（１９８８）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｇｅｎｅ． Ｎｅｕｒｏｎ １， ５５−６１． Ｒｅｄｅｋｅｒ， Ｖ．， Ｔｏｕｌｌｅｃ， Ｊ．−
Ｙ．， Ｖｉｎｈ， Ｊ．， Ｒｏｓｓｉｅｒ，
Ｊ．， ａｎｄ Ｓｏｙｅｚ， Ｄ．（１９８８）．Ｃ
ｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏ
ｆｉｌｉｎｇ ｂｙｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉ
ｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐ
ｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅｇｌａｎｄｓ ｏｒ
ｃｅｌｌｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０， １８
０５−１８１１． Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｂｕｇｌｉｎ， Ｔ．， ａ
ｎｄ Ｌｉ， Ｃ．（１９９２）． Ａｌｔｅｒｎａｔ
ｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｐ−１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅ
ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＦＭＲＦａｍｉｄｅ−ｌｉｋｅ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉ
ｓ ｅｌｅｇａｎｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １
２， ２３５６−２３６１． Ｓａｎｄｅｍａｎ， Ｄ．， Ｓａｎｄｅｍａｎ，
Ｒ．， Ｄｅｒｂｙ， Ｃ．， ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ， Ｍ．（１９９２）． Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆ
ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｃｒａｙｆｉｓｈ， ｃ
ｒａｂｓ， ａｎｄ ｓｐｉｎｙ ｌｏｂｓｔｅｒｓ：
ａ ｃｏｍｍｏｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏ
ｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．
Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ． １８３， ３０４−３２６． Ｓａｔａｋｅ， Ｈ．， Ｙａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａ
ｎｉ Ｙ．， Ｔａｋｕｗａ， Ｋ．， Ｎｏｍｏｔ
ｏ， Ｋ．， Ｍｉｎａｋａｔａ， Ｈ．， Ｎａｇａ
ｈａｍａ， Ｔ．， Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，
Ｋ．， ａｎｄ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｏ．（１９
９９）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ａ
ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏ
ｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ａ Ｄ−ａｍｉｎ
ｏ ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ，
ａｃｈａｔｉｎ−Ｉ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｈａｔｉｎ
−Ｉ ａｎｄ ｆｕｌｉｃｉｎｇｅｎｅｓ． Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １３０−１３
６． Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， Ｈｉｌｂｉｃｈ，
Ｃ．， Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ， Ｋ．， ａｎｄ Ｋ
ｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９８７）． Ｕｎｕｓｕａｌｃ
ａｒｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ （ＣＣＡ
Ｐ） ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｏｒｇａｎ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｅ ｃｒａｂ，Ｃａｒｃｉ
ｎｕｓ ｍａｅｎａｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ５７５−５８
０． Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， Ｈｉｌｂｉｃｈ，
Ｃ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９９２）．
Ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ： ａ ｎｏｖｅｌ ｍｙｏｔｒ
ｏｐｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｒ
ｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒａｙｆｉ
ｓｈ， Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅｓ ｌｉｍｏｓｕｓ． Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ １３， ８５９−８６４． Ｔｅｎｓｅｎ， Ｃ．Ｐ．， Ｄｅ Ｋｌｅｉｊｉｎ，
Ｄ．Ｐ．Ｖ．， ａｎｄ Ｖａｎ Ｈｅｒｐ， Ｆ．
（１９９１）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏ
ｄｉｎｇ ｔｗｏｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｈｙｐｅｒｇ
ｌｙｃｅｍｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｌｏｂｓｔｅｒ， Ｈｏｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａ
ｎｕｓ．Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００，
１０３−１０６． Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ， Ｇ．， Ｗｅｂｓｔｅｒ，
Ｓ．Ｇ．， Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｍ．Ｃ．， Ｃｈ
ｕｎｇ， Ｊ．Ｓ．， ａｎｄ Ｒｅｅｓ， Ｈ．Ｈ．
（１９９６）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｏ
ｒｇａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｃｒａｂ， Ｃａｎｃｅｒ ｐａｇｕｒｕ
ｓ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｈｏ
ｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗ
ｔｈ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １２７４９−１２７
５４． Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ， Ｗ．， Ｇｒｏｍｏｌｌ，
Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９８９）．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓ
ｏｒ ｏｆ ａ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｈｏｒ
ｍｏｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５７， ３１−
３４． Ｙａｓｕｄａ， Ａ． ａｎｄ Ｎａｙａ， Ｙ．（１
９９７）． Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄ
ｓｗａｍｐ ｃｒａｙｆｉｓｈ． Ｉｎ Ｓｔｕｄｉ
ｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．１９， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｐａｒｔ Ｅ）（Ａ
ｔｔａ−Ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ， Ｅｄ．）ｐｐ．６２７
−６８７， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｙ
ａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａｎｉ， Ｙ．， Ｎａｋａｍ
ｕｒａ， Ｍ．， Ｍｉｎａｋａｔａ， Ｈ．， Ｎｏ
ｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓａｋｉｙａｍａ，
Ｆ．（１９９５）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｃＤＮＡ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕ
ｒｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｉｄ−ｃ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆｕ
ｌｉｃｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ α−ａｍｉｄ
ａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａ
ｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ． ６４， ２２４８−２２５５． 上に引用される特許、特許出願および刊行物はすべて、
完全に本明細書に援用される。
ンおよびその遺伝子関連ペプチドを、バイオアッセイの
代替物として、物理化学的規準でモニターすることによ
り、性質決定した。実施において、脳ペプチドの同定の
ため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、キャピラリー逆相ＨＰ
ＬＣ／ＭＳ、および分子クローニングを使用するのが好
都合である。本研究はまた、脳において、特定のプロセ
シングにより産生されるオルコキニン前駆体およびその
遺伝子関連ペプチドの構造的構成に関する最初の証拠も
提供する。参考文献 Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ．（１９９２）． Ｍａｓｓ ｓ
ｐｅｃｔｏｒｍｅｔｒｙｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎ
ｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． ６１， ９７７−１０１０． Ｂｕｎｇａｒｔ， Ｄ．， Ｈｉｌｂｉｃｈ， Ｃ．，
Ｄｉｒｃｋｓｅｎ，Ｈ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，
Ｒ．（１９９５ａ）． Ｏｃｃｕｒｅｎｃｅｏｆ ａ
ｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ
ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｓｈｏｒｅ ｃｒａｂ，Ｃａｒｃｉｎｕｓ
ｍａｅｎａｓ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎ
ｏｖｅｌ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆａｍｉｌｙ．
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １６，６７−７２． Ｂｕｎｇａｒｔ， Ｄ．， Ｋｅｇｅｌ， Ｇ．， Ｂ
ｕｒｄｚｉｋ， Ｓ．，ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．
（１９９５ｂ）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒ
ｕｓｔａｃｅａｎ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ｎｅｕｒｏｐ
ｅｐｔｉｄｅ ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
１６， １９９−２０４． Ｂｕｒｄｚｉｋ， Ｓ．， Ｓａｕｔｅｒ， Ａ．，
Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，
Ｒ．（１９９３）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒｃｏｋｉ
ｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｉｎｄｇｕｔ ｏｆ
ｔｈｅ ｃｒａｙｆｉｓｈ， Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅｓ
ｌｉｍｏｓｕｓ． Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ２１ｔｈ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｎｅｕｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（Ｅｌｓｎｅ
ｒ， Ｎ． ａｎｄ Ｈｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．，
ｅｄｓ．）ｐｐ． ５９８， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，
Ｔｈｉｅｍｅ．Ｄｅ Ｗｉｔｈ， Ｎ．Ｄ．， Ｌｉ，
Ｋ．Ｗ．， Ｊｉｍｅｎｅｓ， Ｃ．Ｒ．， Ｖｏｎ
ｋ， Ｋ．， Ｄｒｅｉｓｅｗｅｒｄ， Ｋ．， Ｈｉ
ｌｌｅｎｋａｍｐ， Ｆ．， Ｋａｒａｓ， Ｍ．，
ａｎｄ Ｇｅｒａｅｒｔｓ， Ｗ．Ｐ．Ｍ．（１９９
７）． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｏｌ
ｌｕｓｃａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８， ７６５−７７０． Ｆｅｒｎｌｕｎｄ， Ｐ． ａｎｄ Ｊｏｓｅｆｓｓｏ
ｎ， Ｌ．（１９７２）． Ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｃ
ｏｌｏｒ−ｃｈａｎｇｅ ｈｏｒｍｏｎｅ： Ａｍｉｎ
ｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １７
７， １７３−１７４． Ｆｅｒｎｌｕｎｄ， Ｐ．（１９７２）． Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｌｉｇｈｔ−ａｄａｐｔｉｎｇ
ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｈｒｉｍｐ，
Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ４３９， １７−
２５． Ｇａｒｄｅｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｍｏｒｏｚ， Ｌ．
Ｌ．， Ｍｏｒｏｚ， Ｔ．Ｐ．， Ｓｈｉｐｐｙ，
Ｓ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｗｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ｖ．（１
９９６）． Ｅｘｃｅｓｓ ｓａｌｔ ｒｅｍｏｖａｌ
ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｒｉｎｓｉｎｇ： ｄｉｒ
ｅｃｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆ ｎ
ｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｉｎｖｅｒｔ
ｅｂｒａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉ
ｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａ
ｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｍａｓｓ．
Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ３１，１１２６−１１３０． Ｇａｒｄｅｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｓｈｉｐｐｙ， Ｓ．
Ａ．， Ｌｉ， Ｌ．，Ｍｏｒｏｚ， Ｔ．Ｐ．， ａ
ｎｄ Ｓｗｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ｖ．（１９９８）． Ｐ
ｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｐｌｙｓｉａ ｅｇｇ−ｌａｙｉｎｇ ｈｏ
ｒｍｏｎｅ ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９５，
３９７２−３９７７． Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９９２）． Ｃｒｕｓｔａｃ
ｅａｎ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ， ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａ
ｒａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ． Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ ４８， ４３９−４４８． Ｋｌｅｉｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｍａｎｇｅｒｉｃｈ，
Ｓ．， ｄｅ Ｋｌｅｉｊｎ， Ｄ．Ｐ．Ｖ．， Ｋｅ
ｌｌｅｒ， Ｒ．， ａｎｄ Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ，
Ｗ．（１９９３）． Ｍｏｃｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｏｆ ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｍｏｌｔ−ｉｎｈ
ｉｂｉｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ （ＭＩＨ） ｐｒｅ
ｃｕｒｓｏｒ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３４， １
３９−１４２． Ｌｉｎａｃｒｅ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｔｔ， Ｅ．，
Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｓ．， Ｂｒｉｇｈｔ， Ｋ．，
Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｐ．Ｒ．， ａｎｄＢｕｒｋ
ｅ， Ｊ．Ｆ．（１９９０）． Ｃａｒｄｉｏａｃｔｉ
ｖｅ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＦＭＲＦａｍｉｄｅ） ａｎｄ
ｎｏｖｅｌ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａ
ｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏ
ｐｉｅｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｓｎａｉｌ Ｌｙｍｎａｅａ ｓｔａｇｎａｌ
ｉｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０， ４１２−
４１９． Ｌｏｐｅｚ， Ｖ．， Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｌ．， ａ
ｎｄ Ｄｅｓｇｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ， Ｌ．（１９９
３）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ ｍ
ｙｏｍｏｄｕｌｉｎ ｃＤＮＡ， ａ ｎｅｕｒｏｐｅ
ｐｔｉｄｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎ Ｌ１０ ｏｆ Ａｐ
ｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ． ＤＮＡ ａｎ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２， ５３−６１． Ｍｅｒｃｉｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｏｒｃｈａｒｄ，
Ｉ．， Ｓｋｅｒｒｅｔｔ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔｅ
Ｂｒｕｇｇｅ， Ｖ．（１９７１）． ＦＭＲＦａｍｉ
ｄｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｒａｙｆｉｓｈｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｏｒｇａｎ
ｓ Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ａｂｓｔｒ． ８
５， ２００． Ｎａｍｂｕ， Ｊ．Ｒ．， Ｍｕｒｐｈｙ−Ｅｒｄｏｓ
ｈ， Ｃ．， Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｐ．Ｃ．， Ｆｅｉ
ｓｔｎｅｒ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅ
ｒ， Ｒ．Ｈ．（１９８８）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｇｅｎｅ． Ｎｅｕｒｏｎ １， ５５−６１． Ｒｅｄｅｋｅｒ， Ｖ．， Ｔｏｕｌｌｅｃ， Ｊ．−
Ｙ．， Ｖｉｎｈ， Ｊ．， Ｒｏｓｓｉｅｒ，
Ｊ．， ａｎｄ Ｓｏｙｅｚ， Ｄ．（１９８８）．Ｃ
ｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏ
ｆｉｌｉｎｇ ｂｙｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉ
ｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐ
ｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅｇｌａｎｄｓ ｏｒ
ｃｅｌｌｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０， １８
０５−１８１１． Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｂｕｇｌｉｎ， Ｔ．， ａ
ｎｄ Ｌｉ， Ｃ．（１９９２）． Ａｌｔｅｒｎａｔ
ｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｐ−１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅ
ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＦＭＲＦａｍｉｄｅ−ｌｉｋｅ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉ
ｓ ｅｌｅｇａｎｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １
２， ２３５６−２３６１． Ｓａｎｄｅｍａｎ， Ｄ．， Ｓａｎｄｅｍａｎ，
Ｒ．， Ｄｅｒｂｙ， Ｃ．， ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ， Ｍ．（１９９２）． Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆ
ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｃｒａｙｆｉｓｈ， ｃ
ｒａｂｓ， ａｎｄ ｓｐｉｎｙ ｌｏｂｓｔｅｒｓ：
ａ ｃｏｍｍｏｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏ
ｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．
Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ． １８３， ３０４−３２６． Ｓａｔａｋｅ， Ｈ．， Ｙａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａ
ｎｉ Ｙ．， Ｔａｋｕｗａ， Ｋ．， Ｎｏｍｏｔ
ｏ， Ｋ．， Ｍｉｎａｋａｔａ， Ｈ．， Ｎａｇａ
ｈａｍａ， Ｔ．， Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，
Ｋ．， ａｎｄ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｏ．（１９
９９）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ａ
ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｅｃｕｒｓｏ
ｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ａ Ｄ−ａｍｉｎ
ｏ ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ，
ａｃｈａｔｉｎ−Ｉ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｈａｔｉｎ
−Ｉ ａｎｄ ｆｕｌｉｃｉｎｇｅｎｅｓ． Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １３０−１３
６． Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， Ｈｉｌｂｉｃｈ，
Ｃ．， Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ， Ｋ．， ａｎｄ Ｋ
ｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９８７）． Ｕｎｕｓｕａｌｃ
ａｒｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ （ＣＣＡ
Ｐ） ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｏｒｇａｎ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｅ ｃｒａｂ，Ｃａｒｃｉ
ｎｕｓ ｍａｅｎａｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ５７５−５８
０． Ｓｔａｎｇｉｅｒ， Ｊ．， Ｈｉｌｂｉｃｈ，
Ｃ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９９２）．
Ｏｒｃｏｋｉｎｉｎ： ａ ｎｏｖｅｌ ｍｙｏｔｒ
ｏｐｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｒ
ｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒａｙｆｉ
ｓｈ， Ｏｒｃｏｎｅｃｔｅｓ ｌｉｍｏｓｕｓ． Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ １３， ８５９−８６４． Ｔｅｎｓｅｎ， Ｃ．Ｐ．， Ｄｅ Ｋｌｅｉｊｉｎ，
Ｄ．Ｐ．Ｖ．， ａｎｄ Ｖａｎ Ｈｅｒｐ， Ｆ．
（１９９１）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏ
ｄｉｎｇ ｔｗｏｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ｈｙｐｅｒｇ
ｌｙｃｅｍｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｌｏｂｓｔｅｒ， Ｈｏｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａ
ｎｕｓ．Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００，
１０３−１０６． Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ， Ｇ．， Ｗｅｂｓｔｅｒ，
Ｓ．Ｇ．， Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｍ．Ｃ．， Ｃｈ
ｕｎｇ， Ｊ．Ｓ．， ａｎｄ Ｒｅｅｓ， Ｈ．Ｈ．
（１９９６）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｏ
ｒｇａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｃｒａｂ， Ｃａｎｃｅｒ ｐａｇｕｒｕ
ｓ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｈｏ
ｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗ
ｔｈ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １２７４９−１２７
５４． Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ， Ｗ．， Ｇｒｏｍｏｌｌ，
Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ．（１９８９）．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓ
ｏｒ ｏｆ ａ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｈｏｒ
ｍｏｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５７， ３１−
３４． Ｙａｓｕｄａ， Ａ． ａｎｄ Ｎａｙａ， Ｙ．（１
９９７）． Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄ
ｓｗａｍｐ ｃｒａｙｆｉｓｈ． Ｉｎ Ｓｔｕｄｉ
ｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．１９， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｐａｒｔ Ｅ）（Ａ
ｔｔａ−Ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ， Ｅｄ．）ｐｐ．６２７
−６８７， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｙ
ａｓｕｄａ−Ｋａｍａｔａｎｉ， Ｙ．， Ｎａｋａｍ
ｕｒａ， Ｍ．， Ｍｉｎａｋａｔａ， Ｈ．， Ｎｏ
ｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓａｋｉｙａｍａ，
Ｆ．（１９９５）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｃＤＮＡ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕ
ｒｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｉｄ−ｃ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆｕ
ｌｉｃｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ α−ａｍｉｄ
ａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａ
ｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ． ６４， ２２４８−２２５５． 上に引用される特許、特許出願および刊行物はすべて、
完全に本明細書に援用される。
【００１９】本発明は、本発明の個々の側面の単一の例
示として意図される、記載される特定の態様により、範
囲を限定されない。実際、本明細書に示されそして記載
されたものに加え、当業者には、前述の説明から、本発
明の多様な修飾が明らかになるであろう。こうした修飾
は、付随する請求項の範囲内に属するものと意図され
る。
示として意図される、記載される特定の態様により、範
囲を限定されない。実際、本明細書に示されそして記載
されたものに加え、当業者には、前述の説明から、本発
明の多様な修飾が明らかになるであろう。こうした修飾
は、付随する請求項の範囲内に属するものと意図され
る。
【図１】 アメリカザリガニ脳の嗅葉由来切片の直接Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル。ｘ軸はｍ／ｚ、マス
対荷電比を示し；ｙ軸は分子イオン強度を示す。
ＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル。ｘ軸はｍ／ｚ、マス
対荷電比を示し；ｙ軸は分子イオン強度を示す。
【図２】 アメリカザリガニ由来の対応するプレプロオ
ルコキニンＡのヌクレオチド（ＡＢ０２９１６８）およ
び演繹されるアミノ酸配列。オルコキニンおよびその関
連ペプチド配列を太字で示している。対形成した塩基性
アミノ酸残基を囲みで示している。ポリアデニル化シグ
ナルを下線で表示している。
ルコキニンＡのヌクレオチド（ＡＢ０２９１６８）およ
び演繹されるアミノ酸配列。オルコキニンおよびその関
連ペプチド配列を太字で示している。対形成した塩基性
アミノ酸残基を囲みで示している。ポリアデニル化シグ
ナルを下線で表示している。
【図３】 プレプロオルコキニンＡおよびＢの図式的表
示。各前駆体中の推定上の疎水性シグナル配列を、
「Ｓ」と示している。両前駆体に存在するオルコキニン
およびその関連神経ペプチド配列を、同一のパターンお
よび数で標識している：１、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ；
２、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＡ（[Ａｌａ13]オルコキ
ニン）；３、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＮ（オルコキニ
ン）；４、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ（[Ｖａｌ13]オ
ルコキニン）；５、ＮＦＤＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ（[Ｔ
ｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニン）。
示。各前駆体中の推定上の疎水性シグナル配列を、
「Ｓ」と示している。両前駆体に存在するオルコキニン
およびその関連神経ペプチド配列を、同一のパターンお
よび数で標識している：１、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨＳ；
２、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＡ（[Ａｌａ13]オルコキ
ニン）；３、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＮ（オルコキニ
ン）；４、ＮＦＤＥＩＤＲＳＧＦＧＦＶ（[Ｖａｌ13]オ
ルコキニン）；５、ＮＦＤＥＩＤＲＴＧＦＧＦＨ（[Ｔ
ｈｒ8、Ｈｉｓ13]オルコキニン）。
【図４】 ０．０５Ｎ酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５カラム（スーパーファイン、１ ｘ ４０
０ ｍｍ）上のアメリカザリガニ脳の酸抽出物の溶出プ
ロファイル。流速は２０μｌ／分だった。影で示してい
る分画２中のオルコキニンおよびその関連ペプチドを濃
縮した。
ｘ Ｇ−２５カラム（スーパーファイン、１ ｘ ４０
０ ｍｍ）上のアメリカザリガニ脳の酸抽出物の溶出プ
ロファイル。流速は２０μｌ／分だった。影で示してい
る分画２中のオルコキニンおよびその関連ペプチドを濃
縮した。
【図５】 ＴＳＫゲルＯＤＳ １２０Ｔカラム（０．２
５ ｘ １００ ｍｍ、５μｍ）上のＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５分画２のキャピラリー逆相高性能液体クロマ
トグラフィー。溶出は、０．０５％ ＴＦＡ中の６０分
間で１０％から７０％のアセトニトリル直線勾配を用
い、行った。詳細な実験は本文中に記載される。オルコ
キニン遺伝子関連ペプチドの選択イオンクロマトグラム
は、オルコキニンに関しｍ／ｚ ７９１、[Ｖａｌ13]オ
ルコキニンに関しｍ／ｚ ７５２、[Ａｌａ13]オルコキ
ニンに関しｍ／ｚ ７３８、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オル
コキニンに関しｍ／ｚ ７７８、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨ
Ｓに関しｍ／ｚ ５９４、およびＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬ
Ｙに関しｍ／ｚ ６８６の２価イオンをモニターするこ
とにより、得た。
５ ｘ １００ ｍｍ、５μｍ）上のＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５分画２のキャピラリー逆相高性能液体クロマ
トグラフィー。溶出は、０．０５％ ＴＦＡ中の６０分
間で１０％から７０％のアセトニトリル直線勾配を用
い、行った。詳細な実験は本文中に記載される。オルコ
キニン遺伝子関連ペプチドの選択イオンクロマトグラム
は、オルコキニンに関しｍ／ｚ ７９１、[Ｖａｌ13]オ
ルコキニンに関しｍ／ｚ ７５２、[Ａｌａ13]オルコキ
ニンに関しｍ／ｚ ７３８、[Ｔｈｒ8、Ｈｉｓ13]オル
コキニンに関しｍ／ｚ ７７８、ＦＤＡＦＴＴＧＦＧＨ
Ｓに関しｍ／ｚ ５９４、およびＶＹＶＰＲＹＩＡＮＬ
Ｙに関しｍ／ｚ ６８６の２価イオンをモニターするこ
とにより、得た。
【図６】 図５に対応する脳抽出物由来のキャピラリー
ＨＰＬＣ調製における、ｍ／ｚ ７５９、７５２、７３
８、７７８、５９４、および６８６の２価イオンの衝突
誘導解離ＭＳ／ＭＳスペクトル。該ペプチドのアミノ酸
配列は、一連のｙnイオンから特定した（Ｂｉｅｍａｎ
ｎ， １９９２）。
ＨＰＬＣ調製における、ｍ／ｚ ７５９、７５２、７３
８、７７８、５９４、および６８６の２価イオンの衝突
誘導解離ＭＳ／ＭＳスペクトル。該ペプチドのアミノ酸
配列は、一連のｙnイオンから特定した（Ｂｉｅｍａｎ
ｎ， １９９２）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/62 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB26 DA12 DA13 DA36 FA11 FA12 FA27 FA40 GC10 4B024 AA20 HA19 4B063 QA13 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QS34 QX01
Claims (13)
- 【請求項１】 生物の組織または細胞に存在する物質
の化学構造を直接同定するための方法であって： （１）試料組織切片または細胞の特定の細胞内領域にレ
ーザーを照射し、そして生成するマスイオンを分析し、
該部位に存在する物質のマススペクトルを得る段階、
（２）該マススペクトルを分析し、試料組織切片または
細胞の細胞内領域に存在する物質のマスプロファイルを
得る段階、および（３）該マスプロファイル中に現れる
特定分子量に対応する物質の化学構造を決定する段階、
からなる方法。 - 【請求項２】 組織または細胞に存在する物質の化学
構造を直接同定するための、請求項１の方法であって、
段階（１）および段階（２）がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍ
Ｓによって行われ、そして段階（３）がＬＣ−ＭＳ／Ｍ
Ｓおよび／またはプロテイン・シークエンサーによって
行われる方法。 - 【請求項３】 組織または細胞に存在する物質の化学
構造を直接同定するための、請求項１または２の方法で
あって、組織切片または細胞の細胞内領域に存在する物
質のマスプロファイルを得る段階（２）の後でそして該
マスプロファイル中に現れる特定分子量に対応する物質
の化学構造を決定する段階（３）の前に、組織または細
胞の抽出物から、該物質の分子量をマーカーとして使用
することにより、該物質を単離しそして精製する段階が
付加された方法。 - 【請求項４】 組織または細胞に存在する物質の化学
構造を直接同定するための、請求項１、２または３の方
法であって、該物質の化学構造が未知である場合に、該
物質の化学構造を決定する方法。 - 【請求項５】 組織または細胞に存在する物質の化学
構造を直接同定するための、請求項４の方法であって、
組織または細胞に特定の生物学的活性を有する物質が存
在すると推定されていながら、該物質の化学構造が未知
であった場合に、請求項１ないし３の方法により、該物
質の化学構造を推定し、そして該推定構造を有する物質
を合成し、そして該合成物質の生物学的活性を調べるこ
とにより、該物質の化学構造を確認する方法。 - 【請求項６】 生物の組織または細胞に存在する未知
の物質の化学構造を同定するための方法であって、請求
項１ないし３の１つの方法を行うことによる方法。 - 【請求項７】 請求項１ないし６いずれか１つの方法
であって、物質がタンパク質またはペプチドである場
合、該物質のアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項８】 タンパク質、ペプチドまたはそれらの
前駆体のアミノ酸配列を決定するための、請求項７の方
法であって： （１）物質の部分的アミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するＤＮＡを化学的に合成し、（２）該試料組織切片
または細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築し、（３）
（１）で合成したＤＮＡをプローブとして用い（２）で
構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とにより、タンパク質、ペプチドまたはそれらの前駆体
をコードする遺伝子をクローニングし、そして（４）ク
ローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配
列からアミノ酸配列を演繹する段階からなる方法。 - 【請求項９】 請求項７または８の方法であって、物
質が修飾ペプチドまたは修飾タンパク質である場合、修
飾ペプチドまたは修飾タンパク質の修飾アミノ酸残基の
部位または修飾アミノ酸を決定する方法。 - 【請求項１０】 請求項１、２または３の方法であっ
て、該方法が細胞内の物質の存在部位を決定することに
向けられる方法。 - 【請求項１１】 請求項７、８または９の方法であっ
て、ペプチド、タンパク質、修飾ペプチド、修飾タンパ
ク質またはそれらの前駆体の細胞内の存在部位を決定す
る方法。 - 【請求項１２】 請求項１ないし１１のいずれか１つ
の方法であって、検出されるべき物質の存在部位が細胞
内顆粒である方法。 - 【請求項１３】 請求項１２の方法であって、前記細
胞内顆粒が分泌顆粒である方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000060754A JP2001249125A (ja) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | 組織または細胞における物質分析のための方法 |
| US10/220,345 US20040137420A1 (en) | 2000-03-06 | 2001-03-02 | Method for analysis of substances in tissue or in cells |
| PCT/JP2001/001640 WO2001065254A2 (en) | 2000-03-03 | 2001-03-02 | Method for analysis of substances in tissue or in cells |
| AU2001236064A AU2001236064A1 (en) | 2000-03-03 | 2001-03-02 | Method for analysis of substances in tissue or in cells |
| EP01908267A EP1259820A2 (en) | 2000-03-03 | 2001-03-02 | Method for analysis of substances in tissue or in cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000060754A JP2001249125A (ja) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | 組織または細胞における物質分析のための方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001249125A true JP2001249125A (ja) | 2001-09-14 |
Family
ID=18581011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000060754A Pending JP2001249125A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-06 | 組織または細胞における物質分析のための方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040137420A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001249125A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103360A1 (fr) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Suntory Limited | Methode d'analyse d'une proteine apparaissant dans une cellule ou d'une substance interagissant avec la proteine |
| EA009326B1 (ru) * | 2007-04-06 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ определения качества клеточной культуры |
| JP2013515965A (ja) * | 2009-12-29 | 2013-05-09 | コリア ベーシック サイエンス インスティテュート | 高分解能質量分析法と薬理活性検査を利用した天然物の薬理活性物質発掘方法 |
| US9086404B2 (en) | 2006-10-11 | 2015-07-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for treating living samples and analyzing the same |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070138385A1 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-21 | The Regents Of The University Of California | Time-of-flight secondary ion mass spectrometer mapping of cells and tissue |
| WO2007139989A2 (en) | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Brandeis University | Tissue sample preparation, and maldi ms imaging thereof |
| US7728287B2 (en) * | 2007-03-01 | 2010-06-01 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Imaging mass spectrometer with mass tags |
| CN104198572A (zh) * | 2014-08-26 | 2014-12-10 | 宜昌捷诺威医药科技有限公司 | 用于检测脂类组合物c18：2ce和sm22：0含量的方法 |
| WO2017087852A1 (en) * | 2015-11-19 | 2017-05-26 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Stress biomarkers and related non-invasive detection methods |
-
2000
- 2000-03-06 JP JP2000060754A patent/JP2001249125A/ja active Pending
-
2001
- 2001-03-02 US US10/220,345 patent/US20040137420A1/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103360A1 (fr) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Suntory Limited | Methode d'analyse d'une proteine apparaissant dans une cellule ou d'une substance interagissant avec la proteine |
| US9086404B2 (en) | 2006-10-11 | 2015-07-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for treating living samples and analyzing the same |
| EA009326B1 (ru) * | 2007-04-06 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ определения качества клеточной культуры |
| JP2013515965A (ja) * | 2009-12-29 | 2013-05-09 | コリア ベーシック サイエンス インスティテュート | 高分解能質量分析法と薬理活性検査を利用した天然物の薬理活性物質発掘方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040137420A1 (en) | 2004-07-15 |
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