CN104198572A - 用于检测脂类组合物c18：2ce和sm22：0含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用ESI-MS进行脂类组合物C18：2CE和SM 22：0含量检测的方法，包括硬件试剂盒、电脑、和软件自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统：试剂盒内试剂包括CE、SM标准品、样品溶剂，本申请的有益之处在于，利用本申请检测组合物C18：2CE和SM22：0在血浆中的含量，可以增加其检测的灵敏度和准确率；本申请的检测用时少，无需等待过长时间才能得到报告；对于脂类代谢异常人群，对组合物C18：2CE和SM22：0进行检测，比单独检测一种物质具有更高的灵敏度和准确率。

Description

用于检测脂类组合物C18:2CE和SM22:0含量的方法

技术领域

本发明属于物质含量检测领域，涉及脂类组合物含量检测领域. 

背景技术

肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，在美国，每年肺癌占新增癌症病例的13％和因癌症死亡的29％(Siegel R,Naishadham D,Jemal A:CA Cancer J Clin 62:10-29,2012)。肺癌是一种异质性疾病，有多个组织学和分子亚型，通常根据与肿瘤行为和预后相关的组织学类型进行分类(Beadsmoore CJ,Screaton NJ:Classification,staging and prognosis of lung cancer.Eur J Radiol 45:8–17,2003)。绝大多数类型肺癌是由上皮细胞引起的癌恶性肿瘤，肺癌的最常见的两种亚型为腺癌和鳞状细胞肺癌(SqCC)。SqCC起源于肺中心部分的大气道，在欧洲后代的吸烟者之间，这是肺癌的最常见的组织学亚型(Papi A,Casoni G,Caramori G,et al:COPD increases the risk of squamous histological subtype in smokers who develop non-small cell lung carcinoma.Thorax 59:679–681,2004；Janssen-Heijnen ML,Coebergh JW:Trends in incidence and prognosis of the histological subtypes of lung cancer in North America,Australia,New Zealand and Europe.Lung Cancer 31:123–137,2001)。如果能在检测出肺癌的早期阶段检测出，能够降低10-50倍死亡率(Edwards BK,Brown ML,Wingo PA,et al:Annual report to the nation on the status of cancer,1975-2002,featuring population-based trends in cancer treatment.J Natl Cancer Inst 97:1407-1427,2005)。然而，这种病往往在确诊时已是晚期，大约三分之二的患者在诊断时有转移瘤。当前的低剂量计算机断层扫描(LDCT)方法为肿瘤早期阶段检测提供了一种非侵入性的方法，但是有时结果不准确(Henschke CI,Yankelevitz DF,Libby DM,et al:International Early Lung Cancer Action Program Investigators.Survival of patients with stage I lung cancer detected on CT screening.N Engl J Med 355:1763-1771,2006；Bach PB,Jett JR,Pastorino U,et al:Computed tomography screening and lung cancer outcomes.JAMA 297:953-961,2007)。 

脂类包括不同类别的分子，它在细胞能量储存，膜结构和信号中有众多重要的生物学功能。在正常人体的各个部分，脂类水平在空间和时间上被严格调控。获得脂类代谢的失调数据，有助于多种人类疾病发病病理和进展的研究，如糖尿病(Sleeman MW,Wortley KE,Lai KM,et al:Absence of the lipid phosphatase SHIP2 confers resistance to dietary obesity. Nature Med 11:199–205,2005)，Alzheimer’s阿尔茨海默氏(Cutler RG,Kelly J,Storie K,et al:Involvement of oxidative stress-induced abnormalities in ceramide and cholesterol metabolism in brain aging and Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci USA 101:2070–2075,2004)，Alzheimer’s阿尔茨海默氏(Cutler RG,Kelly J,Storie K,et al:Involvement of oxidative stress-induced abnormalities in ceramide and cholesterol metabolism in brain aging and Alzheimer’s disease.Proc Natl Acad Sci USA 101:2070–2075,2004)，高血压(Nguyen NT,Magno CP,Lane KT,et al:Association of hypertension,diabetes,dyslipidemia,and metabolic syndrome with obesity:findings from the National Health and Nutrition Examination Survey,1999 to 2004.J Am Coll Surg 207:928–934,2008)和人类癌症(1Pendaries C,Tronchere H,Plantavid M,et al:Phosphoinositide signaling disorders in human diseases.FEBS Lett 546:25–31,2003；Ogretmen B,Hannun YA:Biologically active sphingolipids in cancerpathogenesis and treatment.Nature Rev Cancer 4:604–616,2004；A,Wagner D,et al:Determining and interpreting correlations in lipidomic networks found in glioblastoma cells.BMC Syst Biol 4:126,2010；Lee GK,Lee HS,Park YS,et al:Lipid MALDI profile classifies non-small cell lung cancers according to the histologic type.Lung Cancer76:197-203,2012)，在脂类代谢中均出现异常。肺癌中异常脂类代谢，在以往的研究中已被证明，这个研究完成了21对冷冻切除非小细胞肺癌标本及癌旁正常组织标本的脂类分析(Lee GK,Lee HS,Park YS,et al:Lipid MALDI profile classifies non-small cell lung cancers according to the histologic type.Lung Cancer 76:197-203,2012)。 

在人类疾病中，血脂异常的介入，这使脂类有成为各种人类疾病的生物标志物的潜力。脂质组学是一种相对较新的技术领域，该技术可一次定量地评估一系列(数百个)脂肪(脂质)种类，并且可用于绘制任何给定的病理生理状态的脂类分布。然而，由于脂类测量技术的限制，因此，迄今仅有限数量的研究对脂类进行了分析。，这些有限数量的研究对肺癌标记并不适用。 

发明内容

本研究的目的是开发一种血脂标记试剂盒，用于检测血液中两个脂类标记组合(C18：2CE和SM22：0)的含量。CE:cholesteryl ester,SM:Sphingomyelin.CE，SM都是一个class。C18：2CE是一个具体的单一脂类物质C18指有18个碳原子，2是两个共价键. 

技术方案；一种利用ESI-MS进行脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量检测的方法，包括硬件试剂盒、电脑、和软件自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统：试剂盒内试剂包括CE、 SM标准品、样品溶剂，步骤如下： 

A：将含有脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0溶液与试剂盒中标准品混合并溶于样品溶剂，混合液离心后加入ESI-MS进样瓶，然后利用自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统来检测标记组合物C18：2CE和SM22：0的含量 

B：连续的前体和空档丢失提取物的扫描获得光谱，将每个光谱的背景去除后，所获得的数据成平滑曲线，峰面积使用自定义设置和应用生物系统公司Analyst软件集成， 

C：数据被校正后用于样本片段分析，并标准化样品体积使其以nmol/μl为单位产生数据； 

D：根据标准化后的数据，对任何人的血液中脂类C18:2 CE和SM 22:0含量进行检测，得出具体数值。 

试剂盒CE浓度为1μmol，SM标准品浓度0.24μmol；样品溶剂物质及其体积比为氯仿：甲醇：乙酸铵＝300：665：35。 

有益效果： 

1、利用本申请检测组合物C18：2CE和SM22：0在血浆中的含量，可以增加其检测的灵敏度和准确率； 

2、本申请的检测用时少，无需等待过长时间才能得到报告； 

3、对于脂类代谢异常人群，对组合物C18：2CE和SM22：0进行检测，比单独检测一种物质具有更高的灵敏度和准确率。 

附图说明

图1.训练阶鳞状细胞肺癌组和高风险正常对照组中C18:2 CE和SM 22:0浓度柱形图； 

图2A.在高风险正常对照组与鳞状细胞肺癌组中C18:2 CE和SM 22:0的质量谱图； 

图2B:在典型高风险正常对照组中SM 22:0光谱强度级别为3.5e7 cps，鳞状细胞肺癌组中SM22:0； 

图3.训练队列中C18:2 CE和SM 22:0对鳞状细胞肺癌预测的曲线下面积(AUC)值； 

图4.验证样品中C18:2 CE和SM 22:0水平的柱形图； 

图5.验证队列中C18:2 CE和SM 22:0对鳞状细胞肺癌预测的曲线下面积(AUC)值； 

图6.训练和验证队列所有样本中C18:2 CE和SM 22:0分层聚类分析；GeneSpring 12.6程序被用于进行分层聚类分析。左边绿色表示SqCC组，右边黄色表示高风险对照组。蓝色低值(-2.37)至红色高值(2.37)表示18:2 CE和SM 22:0水平范围； 

图7.SqCC组和高风险正常对照组样本变异来源显示特征区别。 

具体实施方式

对于不同人血浆中两个脂质种类C18:2 CE和SM 22:0浓度不一样，用本发明方法可以准确检测。 

实施例一： 

一、试剂盒的制备 

1试剂盒中物质主要包括CE和SM标准品，样品溶剂。 

2试剂盒中的标准品从Sigma公司购得，并于室温稀释至浓度分别为1μmol，0.24μmol；样品溶剂按氯仿：甲醇：乙酸铵＝300：665：35体积比室温下配制，其中氯仿，甲醇，乙酸铵均为色谱级，试剂配制中使用的水为抽滤双蒸水。 

二、检测步骤：将含有脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0l溶液与试剂盒中3μl标准品混合并溶于样品溶剂，保证最终体积为1.2mL，混合液12000g离心15min后加入ESI-MS进样瓶，然后利用自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统来检测标记组合物C18：2CE和SM22：0的含量。鉴定通过对脂类头部总酰基碳原子数的水平—获得该试验中总双键来完成，同时建立与量化大量精确的内部标准。连续的前体和空档丢失提取物的扫描，这产生了一系列的光谱，每个光谱的背景被去除，数据成平滑曲线，峰面积使用自定义设置和应用生物系统公司Analyst软件集成，最后，数据被校正后用于样本片段分析，并标准化样品体积使其以nmol/μl为单位产生数据。 

实施例二，对于SqCC患者和正常患者而言，血液中脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量是不同的。利用ESI-MS进行脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量检测的方法用途，应用于检测离体人血液中脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量。 

一.样本 

2004年—2010年间我们登记了44例SqCC患者和44例高危人群正常患者，并把他们分成以下组：(a)病理诊断SqCC患者(n＝22)，(b)训练阶段采用的配对高危人群(n＝22)，(c)独立SqCC患者(n＝22)，(d)验证阶段采用的随机高危对照组(n＝22)。早期SqCC患者入选标准，包括只局限于无远处转移证据的胸部疾病，原始血液样本在1年内无术前化疗或放疗及至少2年的临床跟踪资料。在这项研究中，高危患者被定义为55岁—75岁，具有超过30包/年的吸烟史，并且在随机分组前已经戒烟少于15年。所有高风险人群每年进行LDCT并保持最少2年的无癌随访。在训练阶段，SqCC患者和高风险受试者在种族，性 别，年龄和吸烟状况方面需相匹配。这些患者和对照组的人口统计信息见表1。所有病人数据获得需经书面正式同意并绝对遵守伦理审查委员会的规定。 

表1.在训练和验证阶段使用的所有样本的特征 

二.对照组与病人组血浆样本准备：抽10mL全血于EDTA抗凝采血管中，并在4小时内迅速离心，3μl每小份-80℃贮存备用。 

三.样品进样前处理：3μl标准品与3μl待测样品混合并溶于氯仿：甲醇：乙酸铵＝300：665：35，最终总体积1.2mL，混合液12000g离心15min后加入进样瓶。 

四.ESI-MS(API4000)参数设置：自动进样器(LC Mini PAL,CTC Analytics)设置为30μl/min，CE；SM电离喷射设置分别为阳离子模式Pre369.3，阳离子模式Pre184.1；碰撞气压设置为2(任意单位)，细胞在氮气中的碰撞能量CE，SM分别设为+30V，+40 V；析散电位CE，SM分别设为+225V，+100V；进入电位CE，SM分别设为+10V，+14V；退出电位CE，SM分别设为+10V，+14V；质谱分辨率设为半高0.7u全宽；对每一个光谱，在多通道分析仪(MCA)模式平均进行9-150连续扫描；源温度为100℃，接口加热器打开，电喷射毛细管设为+5.5kV或-4.5Kv，窗帘气压设为20(任意单位)，两个离子源气压设为45(任意单位)。 

五.在22个SqCC患者中，C18:2 CE平均浓度被检测为12.71nmol/μl，与人口统计学匹配的对照组(18.42nmol/μl)相比，下调了31.02％(p＝0.0001)(图1A).同样地，鞘磷脂SM22:0在SqCC血浆样本中平均浓度(平均浓度95pmol/μl)与对照组样本相比(平均浓度137pmol/μl)也下调了30.66％(p＝0.0013)(图1B)。图2分别显示，在一个对照样本和一个SqCC样本中，C18:2 CE(图2 A)和SM 22:0(图2B)脂质水平的示例。C18:2 CE在SqCC早期诊断中的预测能力：敏感性(86.4％)，特异性(54.5％)和曲线下面积(AUC，72.5％)，SM22:0上述预测值：敏感性90.9％，特异性77.3％和AUC 84.1％，C18:2 CE，SM 22:0组合产 生了最强的预测能力：更高的敏感性(95.5％)，更高的特异性(90.9％)和较高的准确性(AUC，95.2％)，(图3)。在验证中，患者随机选择，对照组与SqCC组年龄，性别和民族没有匹配，柱形图表明验证组两种脂类物质水平(图4A和图4B)，与训练组样本(图1A和1B)之间两种脂类物质水平相似。在验证样本中，我们观测到C18:2 CE与SM 22:0有相似的预测能力。C18:2 CE的敏感性、特异性及准确性分别为62.5％，78.6％，及77.7％，而SM 22:0分别为93.8％，89.3％及91.5％。两种脂类物质的组合有最强的预测能力，这个组合具有更高的敏感性(93.89％)，特异性(92.9％)及准确性(98.7％)(图5)。HCA分析表明，这两个明显脂质种类C18:2 CE和SM 22:0，从右(浓度较高，红色)到左(低浓度，蓝色)，平均血浆脂质浓度有逐渐减小的倾向(图6)。这一结果进一步证实，C18:2 CE和SM 22:0脂质种类在样品血浆中的浓度与SqCC病情有相关性，它们在SqCC患者中呈减少的趋势。为了评估我们在训练和验证阶段使用的样本量的功效，我们对训练和验证阶段中所有88个不配对的样本之间进行变异来源分析，包括年龄，性别，种族和疾病状态(高风险人群正常对照与SqCC)。图7，我们观察到所有88个未配对样本最显著的区别是年龄的平均方差比为6.06，远高于疾病状态样本的平均方差比2.71(图7A)。然而，在44个配对的训练样本中最显著因素是的疾病状态样本均值方差比为8.71(图7B)。这一观察结果表明，样本疾病状态(高风险对照与SqCC)的显著差异有助于两个脂类物质在血浆中的差异化水平。由于我们在这个研究中使用的患者70％(31/44)为SqCC I期或II期。 

Claims (3)

1.一种利用ESI-MS进行脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量检测的方法，包括硬件试剂盒、电脑、和软件自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统：试剂盒内试剂包括CE、SM标准品、样品溶剂，其特征在于：

A：将含有脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0的溶液与试剂盒中标准品混合并溶于样品溶剂，混合液离心后加入ESI-MS进样瓶，然后利用自动化电喷雾串联质谱(ESI-MS)系统来检测标记组合物C18：2CE和SM22：0的含量

B：连续的前体和空档丢失提取物的扫描获得光谱，将每个光谱的背景去除后，所获得的数据成平滑曲线，峰面积使用自定义设置和应用生物系统公司Analyst软件集成，

C：数据被校正后用于样本片段分析，并标准化样品体积使其以nmol/μl为单位产生数据；

D：根据标准化后的数据，对任何人的溶液中脂类C18:2 CE和SM 22:0含量进行检测，得出具体数值。

2.根据权利要求1所述的一种利用ESI-MS进行脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量检测的方法，其特征在于试剂盒CE浓度为2.5nmol，SM标准品浓度0.6nmol；样品溶剂物质及其体积比为氯仿：甲醇：乙酸铵＝300：665：35。

3.权利要求1所述的一种利用ESI-MS进行脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量检测的方法的用途，其特征在于，应用于检测离体人血液中脂类组合物C18:2 CE和SM 22:0含量。