CN108680745A - 血清脂质生物标志物在nsclc早期诊断中的应用方法 - Google Patents

血清脂质生物标志物在nsclc早期诊断中的应用方法 Download PDF

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Abstract

血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，包括：收集NSCLC患者、肺良性病变患者和正常人的血清样本；对血清样本预处理，并采用超高效液相‑四级杆‑飞行时间质谱的方法检测各血清样本中脂质代谢标志物；通过多元变量模式识别分析的方法进行NSCLC相关差异脂质代谢标志物的筛选；通过NSCLC差异脂质代谢物的KEGG分析和代谢通路分析，筛选出与脂质代谢物相关性最高的关键代谢通路；进行NSCLC差异脂质代谢物的“基因‑酶‑反应‑代谢物”网络分析，获得NSCLC差异脂质代谢物网络图；综合NSCLC差异脂质代谢标志物筛选及代谢通路分析结果，筛选获得NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物。

Description

血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法
技术领域
本发明涉及血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞型肺癌(NSCLC)包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。传统的影像学和痰液脱落细胞学仍是目前筛查早期肺癌的主要手段，但存在一定漏诊和误诊，病理学检查虽然能够诊断肺癌，但会对人体造成很大创伤。因此，早期筛查已成为肺癌防治的关键，探索和建立一种简单、快速、敏感性高和特异性强的早期诊断技术等已是临床医学上的迫切需要。
脂质组学是对整体脂质进行系统分析的一门新兴学科，通过比较不同生理状态下脂代谢网络的变化，进而识别代谢调控中关键的脂生物标志物，最终揭示脂质在各种生命活动中的作用机制。
脂代谢物谱的分析要求高灵敏度、高通量和无偏向性的分析方法。由于脂代谢物和生物体系的复杂性，至今为止，尚无一种能满足上述所有要求的代谢组学分析技术。现有的核磁共振技术(NMR)具备快速和无偏向性的特点，但其灵敏度太低。色谱/质谱联用技术将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定性定量分析，也简化了样品的前处理过程。气相色谱/质谱联用(GC-MS)灵敏度较高，但其研究范围仅限于分析挥发性的物质，无法分析热不稳定性和分子量较大的代谢产物。这一缺陷正好可由液相色谱/质谱联用(LC-MS)技术来弥补。因此，LC-MS使得快速发现、灵敏检测和证实新的和不寻常的脂族化合物和脂肪酸(包括生物膜主要组分、脂类信号分子)的效率明显提高。超高效液相色谱(UPLC)耦合四级杆串联飞行时间质谱(Q-TOF)，两者的联用适合于复杂体系的分离分析和未知物的结构鉴定。
发明内容
本发明提出了一种血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，该方法具有简单、快速、敏感性高和特异性强的优点。
本发明采用的技术方案是：
血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，包括：
(1)收集NSCLC患者、肺良性病变患者和正常人的血清样本；
(2)对血清样本预处理，并采用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)的方法检测各血清样本中脂质代谢标志物，获得脂质代谢指纹图谱；
(3)通过多元变量模式识别分析的方法进行NSCLC相关差异脂质代谢标志物的筛选；
(4)通过NSCLC差异脂质代谢物的KEGG(京都基因与基因组百科全书，KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)分析和代谢通路分析，筛选出与脂质代谢物相关性最高的关键代谢通路；
(5)进行NSCLC差异脂质代谢物的“基因-酶-反应-代谢物”网络分析，获得NSCLC差异脂质代谢物网络图；
(6)综合NSCLC差异脂质代谢标志物筛选及代谢通路分析结果，筛选获得NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物；
(7)对筛选出的NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物重复步骤(1)-(6)进行靶标定量验证和确认。
进一步，所述步骤(1)中的样本收集具体为：空腹采集NSCLC患者、肺良性病变患者和正常人肘部静脉血5mL于无菌促凝真空采血管中，2500r/min，4℃离心5min，取上层血清，保存于-80℃冰箱中待用。
进一步，步骤(2)中血清样本预处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100μL的样本加入480μL甲基叔丁基醚-甲醇提取液(VMTBE∶Vmethanol＝5∶1)，涡漩震荡30s，静置1h；3000r/min离心15min，取400μL甲基叔丁基醚层蒸干，100μL二氯甲烷∶甲醇(1∶1)复溶，进行UPLC-Q-TOF/MS检测分析；同时每个样本各取10μL混合成质控(QC)样本，与样本同批次检测。
进一步，超高效液相-四级杆-飞行时间质谱采用Agilent 1290超高效液相色谱仪和AB Sciex 6600三重飞行时间质谱仪。
进一步，步骤(2)中液相色谱-质谱条件为：Phenomenex Kinetex C18100A柱(1.7μm 2.1×100mm)(100×2.1mm)，流速0.3ml/min，柱温为25℃；进样量为2μL，自动进样器温度4℃；流动相：A：10mmol/L甲酸铵-40％水-60％乙腈，B：10mmol/L甲酸铵-10％水-90％异丙醇；雾化气压力(GS1)60psi，辅助气压力(GS2)60psi，气帘气压力(CUR)30psi，离子源温度(TEM)550℃，喷雾电压(ISVF)5000V(正离子模式)/-4500(负离子模式)，去簇电压(DP)100V，碰撞电压(CE)10eV。
进一步，步骤(2)中采集的液相质谱数据包括一级质谱数据和二级质谱数据，其中在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。
进一步，步骤(2)和步骤(3)之间还设有数据处理步骤，该步骤为：采用AB SCIEXAnalyst TF 1.7.1数据采集软件记录每个血清样本的总离子流色谱图(TIC)进行可视化检查；数据首先使用MSconventer转换为mzXML格式；使用XCMS做峰寻找、峰对齐数据处理(XCMS版本号：1.41.0)。
进一步，步骤(3)中进行多元变量模式识别分析前需要进行数据预处理，具体为：对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补；数据标准化处理，利用每个样本的总离子流(TIC)进行归一化。
进一步，步骤(3)中的多元变量模式识别分析的方法使用SIMCA V14.1软件(MKSData Analytics Solutions，Umea，Sweden)，选用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、OPLS-DA置换检验建立OPLS-DA模型，采用OPLS-DA模型第一主成份变量投影重要度(Variable Importance in the Projection，VIP)值(阈值＞1)，并结合学生t检验(Student’s t-test)的P值(阈值＜0.05)来寻找NSCLC差异脂质代谢标志物。
进一步，步骤(4)中代谢通路的分析包括富集分析和拓扑分析。
本发明的有益效果：
(1)采用UHPLC-Q-TOF/MS方法，精确度高，耗时短，并能够对脂质进行高通量的定性定量分析，这将会大大缩短血清脂质生物标志物筛选的时间，增强结果的可靠性，为脂质生物标志物的研究提供更科学的方法。
(2)采用非靶标脂质组学分析方法挖掘和确认NSCLC的早期诊断脂质生物标志物，并通过靶标脂质组学分析方法定量验证NSCLC的早期诊断脂质生物标志物，为发展脂质生物标志物的分子诊断策略奠定基础，具有鲜明的创新性。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为肺腺癌(A)、肺鳞癌(B)、肺良性病变(C)及正常对照人群(D)超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF/MS)脂质代谢指纹图谱示意图。
图3为肺腺癌、肺鳞癌、肺良性病变及正常对照人群的主成分分析(PCA)得分图，其中A：所有样本(包括质控)B：所有样本C：肺腺癌组-正常对照组D：肺鳞癌组-正常对照组E：肺腺癌组-肺良性病变组F：肺鳞癌组-肺良性病变组G：肺腺癌组-肺鳞癌组H：肺良性病变组-正常对照组I：非小细胞肺癌组-肺良性病变组J：非小细胞肺癌组-正常对照组。
图4为肺腺癌、肺鳞癌、肺良性病变及正常对照人群的的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)得分图，其中A：肺腺癌组-正常对照组B：肺鳞癌组-正常对照组C：肺腺癌组-肺良性病变组D：肺鳞癌组-肺良性病变组E：肺腺癌组-肺鳞癌组F：肺良性病变组-正常对照组G：非小细胞肺癌组-肺良性病变组H：非小细胞肺癌组-正常对照组。
图5为肺腺癌、肺鳞癌、肺良性病变及正常对照人群OPLS-DA模型的置换检验结果，其中A：肺腺癌组-正常对照组B：肺鳞癌组-正常对照组C：肺腺癌组-肺良性病变组D：肺鳞癌组-肺良性病变组E：肺腺癌组-肺鳞癌组F：肺良性病变组-正常对照组G：非小细胞肺癌组-肺良性病变组H：非小细胞肺癌组-正常对照组。
图6为肺腺癌、肺鳞癌、肺良性病变及正常对照人群的差异脂质代谢物火山图，其中A：肺腺癌组-正常对照组B：肺鳞癌组-正常对照组C：肺腺癌组-肺良性病变组D：肺鳞癌组-肺良性病变组E：肺腺癌组-肺鳞癌组F：肺良性病变组-正常对照组G：非小细胞肺癌组-肺良性病变组H：非小细胞肺癌组-正常对照组。
图7为肺腺癌组与正常对照组的通路分析图。
图8为肺鳞癌组与正常对照组的通路分析图。
图9为非小细胞肺癌组与正常对照组的通路分析图。
图10为非小细胞肺癌组与肺良性病变组的通路分析图。
图11为肺鳞癌组与肺良性病变组的通路分析图。
图12为肺腺癌组与肺鳞癌组的通路分析图。
图13为肺良性病变组与正常对照组的通路分析图。
图14为与甘油磷脂代谢相关的NSCLC差异脂质代谢物网络图。
图15为非小细胞肺癌组(NSCLC)、肺良性病变组(LBD)和正常对照组(HC)磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)的血清水平散点图(黑色水平线为中值)。
图16为肺腺癌组(ADC)和肺鳞癌组(SqCC)磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱(PC)的血清水平散点图(黑色水平线为中值)。
图17为非小细胞肺癌组(NSCLC)、肺良性疾病组(LBD)和正常对照组(HC)血清差异脂质生物标志物多指标联合的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。
参见图1，本发明血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法包括两块内容，具体如下：
1、基于UHPLC-Q-TOF/MS技术的非靶标NSCLC脂质组学检测分析
(1)仪器与试剂
①仪器
超高效液相-四级杆-飞行时间质谱，包括Agilent 1290超高效液相色谱仪和ABSciex 6600三重飞行时间质谱仪(AB Sciex，美国)，Phenomenex Kinetex C18100A色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，Phenomenex，美国)，Heal Force Neofuge 23R低温高速离心机(力新，中国)，-80℃超低温冰箱(海尔，中国)。
②试剂
色谱级甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷购自美国默克公司，超纯水由美国Milli-Q超纯水系统制备。
(2)研究对象
从湖州市中心医院肿瘤生物样本库中选取66例经病理或细胞学确证的NSCLC患者，所有病例均为初诊未治疗患者。整理患者的临床病理资料，其中腺癌35例，平均年龄59.7±9.0岁，男9例，女26例；鳞癌31例，平均年龄63.6±6.7岁，男29例，女2例；肺良性病变患者40例，平均59.2±10.0岁，男21例，女19例，具体数据见表1。正常对照组40例，均为湖州市内健康正常体者，平均年龄54.0±7.3岁，其中男24例，女16例。
表1非小细胞肺癌患者和肺良性病变患者的临床特征
(3)样品采集
确诊的NSCLC患者、肺良性病变患者和健康志愿者血液样品由本院按照规范(医院伦理委员会批准，且患者和志愿者签署知情同意书)及合理流程采集：于清晨(空腹8小时以上)采集肘部静脉血5mL于无菌促凝真空采血管中，2500r/min，4℃离心5min，取上层血清，保存于-80℃冰箱中待用。
(4)UHPLC-Q-TOF/MS检测方法的建立
①UHPLC-Q-TOF/MS血清样本预处理
将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100μL的样本加入480μL甲基叔丁基醚-甲醇提取液(VMTBE：Vmethanol＝5∶1)，涡漩震荡30s，静置1h；3000r/min离心15min，取400μL甲基叔丁基醚层蒸干，100μL二氯甲烷∶甲醇(1∶1)复溶，进行UPLC-Q-TOF/MS检测分析。每个样本各取10μL混合成质控(QC)样本，与样本同批次检测。
②UHPLC-Q-TOF/MS分析条件
采用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱(Agilent 1290Infinity LC，AB SciexTriple TOF 6600)技术分析NSCLC患者、肺良性病变患者和健康正常体检者血清脂质代谢图谱。
色谱条件：
Phenomenex Kinetex C18100A柱(1.7μm 2.1×100mm)(100×2.1mm)，流速0.3ml/min，柱温为25℃。进样量为2μL，自动进样器温度4℃。
流动相：A：10mmol/L甲酸铵-40％水-60％乙腈，
B：10mmol/L甲酸铵-10％水-90％异丙醇
梯度洗脱程序见表2。
表2色谱梯度洗脱程序
质谱条件：
雾化气压力(GS1)60psi，辅助气压力(GS2)60psi，气帘气压力(CUR)30psi，离子源温度(TEM)550℃，喷雾电压(ISVF)5000V(正离子模式)/-4500(负离子模式)，去簇电压(DP)100V，碰撞电压(CE)10eV。在控制软件(Analyst TF 1.7.1，AB Sciex)控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。
(5)数据处理
采用AB SCIEX Analyst TF 1.7.1数据采集软件记录每个血清样本的总离子流色谱图(TIC)进行可视化检查。数据首先使用MSconventer转换为mzXML格式。使用XCMS做峰寻找、峰对齐等数据处理(XCMS版本号：1.41.0)。使用本实验室基于XCMS开发的xcms4lipid程序及自建库进行物质鉴定的数据处理及匹配，minfrac设为0.5，cutoff设为0.8。首先对二级数据进行筛选，也就是筛选出来那些鉴定出来的离子峰。筛选原则为forward和reverse只要其中有一个鉴定出来就保留该离子峰。其次对一级和二级数据的离子峰进行匹配，也就是寻找一级数据中的离子峰在二级数据中对应的离子峰。按照mz tolerance±25ppm进行匹配。
(6)NSCLC相关差异脂质代谢标志物的筛选
①UHPLC-Q-TOF/MS数据预处理
对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补；数据标准化处理，利用每个样本的总离子流(TIC)进行归一化。
②多元变量模式识别分析
a.主成分分析(PCA)
PCA可以揭示数据的内部结构，从而更好的解释数据变量。使用SIMCA V14.1软件(MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden)对数据进行对数(LOG)转换加中心化(Ctr)格式化处理，然后进行自动建模分析。
b.正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)
使用SIMCA V14.1软件对数据进行LOG转换加UV格式化处理，首先对第一主成分进行OPLS-DA建模分析，模型的质量用7折交叉验证(7-fold cross validation)进行检验；然后用交叉验证后得到的R2Y(模型对分类变量Y的可解释性)和Q2(模型的可预测性)对模型有效性进行评判；最后通过置换检验(permutation test)，随机多次改变分类变量Y的排列顺序得到不同的随机Q2值，对模型有效性做进一步的检验。
c.OPLS-DA置换检验
置换检验通过随机改变分类变量Y的排列顺序，多次(次数n＝200)建立对应的OPLS-DA模型以获取随机模型的R2和Q2值，在避免检验模型的过拟合以及评估模型的统计显著性上有重要作用。
③NSCLC差异脂质代谢物的筛选
采用OPLS-DA模型第一主成份变量投影重要度(Variable Importance in theProjection，VIP)值(阈值＞1)，并结合学生t检验(Student’s t-test)的P值(阈值＜0.05)来寻找NSCLC差异脂质代谢物。
(7)NSCLC差异脂质代谢物的KEGG分析和代谢通路分析
通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)Pathway数据库整理NSCLC差异脂质代谢标志物参与的所有代谢通路，综合分析这些代谢通路(包括富集分析和拓扑分析)，对代谢通路进行进一步的筛选，找到与脂质代谢物相关性最高的关键通路。
(8)NSCLC差异脂质代谢物的“基因-酶-反应-代谢物”网络分析
将所有NSCLC差异脂质代谢物的倍值(Fold change)和P值输入CytoScape的MetScape插件(http://metscape.ncibi.org/)，得到“基因-酶-生化反应-代谢物”的总网络及差异代谢物参与的所有子网络。
(9)NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物的确认
综合NSCLC差异脂质代谢物筛选及代谢通路分析结果，获得候选NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物。
(2)基于UHPLC-Q-TOF/MS技术的靶标NSCLC脂质组学检测分析
(1)仪器与试剂
①仪器
超高效液相-四级杆-飞行时间质谱，包括Agilent 1290超高效液相色谱仪和ABSciex 6600三重飞行时间质谱仪(AB Sciex，美国)；Phenomenex Kinetex C18100A色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，Phenomenex，美国)，Heal Force Neofuge 23R低温高速离心机(力新，中国)，-80℃超低温冰箱(海尔，中国)。
②试剂
色谱级甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(MTBE)和二氯甲烷购自美国默克公司，脂质质谱标准品(货号：No.330707，含160μg/mL磷脂酰胆碱(15∶0/18∶1)(d7)和5μg/mL磷脂酰乙醇胺(15∶0/18∶1)(d7))购自美国Avanti极性脂质公司，超纯水由美国Milli-Q超纯水系统制备。
(2)研究对象
从湖州市中心医院院肿瘤生物样本库中选取30例经病理或细胞学确证的NSCLC患者，所有病例均为初诊未治疗患者，整理患者的临床病理资料。平均年龄62.1±6.7岁，其中男21例，女9例；腺癌15例，鳞癌15例；I期15例，II期15例。肺良性病变患者30例，平均年龄53.9±11.2岁，男18例，女12例。正常对照组30例，均为湖州市内健康正常体者，平均年龄51.7±7.1岁；其中男19例，女11例。本研究经湖州市中心医院伦理委员会批准，所有受检者均知情同意参加此项研究。
(3)样品采集
确诊的NSCLC患者、肺良性病变患者和健康志愿者血液样品由本院按照规范(医院伦理委员会批准，且患者和志愿者签署知情同意书)及合理流程采集：于清晨(空腹8小时以上)采集肘部静脉血5mL于无菌促凝真空采血管中，2500r/min，4℃离心5min，取上层血清，保存于-80℃冰箱中待用。
(4)UHPLC-Q-TOF/MS定量检测方法的建立
①UHPLC-Q-TOF/MS血清样本预处理
将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取样本40μL，加入160μL水，加480μL提取液(VMTBE∶Vmethanol＝5∶1)，内含10μL脂质质谱标准品(含160μg/mL磷脂酰胆碱(15∶0/18∶1)(d7)和5μg/mL磷脂酰乙醇胺(15∶0/18∶1)(d7))，每个样本中取出6μL混合成质控(QC)样本，QC样本操作同实验样本，制备4个；涡旋60秒，超声10min；将样本4℃，3000rpm离心15min，取上清液200μL；重新加入200μL MTBE，涡旋60s，超声10min；4℃，3000rpm离心15min，取上清液200μL；再次加入200μL MTBE，涡旋60s，超声10min；4℃，3000rpm离心15min，取上清液200μL；合并三次上清液，旋干，80μL的1∶1的二氯甲烷/甲醇复溶，QC样本与样本同批次上机检测。
②UHPLC-Q-TOF/MS定量分析条件
采用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱(Agilent 1290Infinity LC和AB SciexTriple TOF 6600)技术定量检测NSCLC患者、肺良性病变患者和健康正常体检者血清中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的浓度水平。
色谱条件：
Phenomenex Kinetex C18 100A色谱柱(2.1×100mm，Phenomenex，1.7μm)，流速0.3mL/min，柱温为25℃。进样量为1μL，自动进样器温度4℃。
流动相：A：10mmol/L甲酸铵+40％水+60％乙腈
B：10mmol/L甲酸铵+10％乙腈+90％正丙醇
梯度洗脱程序见表3。
表3色谱梯度洗脱程序
质谱条件：
雾化气压力(GS1)60psi，辅助气压力(GS2)60psi，气帘气压力(CUR)30psi，离子源温度(TEM)600℃，喷雾电压(ISVF)-4500V(负离子模式)，碰撞电压(CE)45±25eV。
(5)数据处理
采用AB SCIEX Analyst TF 1.7.1数据采集软件进行数据采集和处理。MS原始数据文件使用MSconventer转换为mzXML格式，并由R软件包XCMS(版本1.41.0)处理。预处理结果产生了由保留时间(RT)，质荷比(m/z)和峰强度组成的数据矩阵。匹配得分的截止值设定为0.8，并且minfrac设定为0.5。所有的m/z误差都小于30ppm，所有RT误差小于60s。所有QC样品中检测到的代谢特征少于50％被丢弃。通过将获得的MS/MS数据与内部开发的数据库中的MS/MS数据匹配来进行脂质鉴定。根据样品中鉴定的PC和PE峰面积和对应于样品内标PC(15∶0/18∶1)和PE(15∶0/18∶1)峰面积计算每个PC和PE的绝对浓度(ng/ml)。
(6)验证NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物
计算各PC和PE在各样本血清中的绝对浓度，通过单因素方差分析比较NSCLC组、肺良性疾病组与正常对照组PC和PE差异，运用LSD检验进行两两比较，当P值小于0.05并且倍数变化大于1.5时，认为该PC和PE为血清差异脂质生物标志物。
(7)确认NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物
通过SPSS19.0软件对本研究筛选获得的血清差异PC和PE脂质生物标志物进行单个指标的ROC曲线绘制并计算指标联合作用的灵敏度和特异性，分析多指标联合作用的诊断效能，确认NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物。
采用本发明的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法后得到的结果如下：
(1)基于UHPLC-Q-TOF/MS技术的非靶标NSCLC脂质组学研究
①NSCLC、肺良性病变患者及正常对照人群代谢指纹图谱的建立
血清脂质代谢物成分复杂，UHPLC-Q-TOF/MS检测时采用了正离子模式和负离子模式两种电离方式，检测获得的脂质代谢物质经筛选，正离子模式共2757个离子峰，负离子模式共1375个离子峰。UHPLC-Q-TOF/MS检测获得的肺腺癌组、肺鳞癌组、肺良性病变组和正常对照组的脂质代谢指纹图谱见图2，由图可知NSCLC患者、肺良性病变患者和正常对照血清中的脂质代谢物质及其离子强度有一定的差别。
②UHPLC-Q-TOF/MS多变量数据分析
a主成分分析(PCA)
主成分分析是将一组观测的可能相关变量，通过正交变换转换为线性不相关变量(即主成分)的统计方法。PCA可以揭示数据的内部结构，从而更好的解释数据变量。使用SIMCA V14.1软件对肺腺癌、肺鳞癌、肺良性病变及正常对照人群UHPLC-Q-TOF/MS正离子模式下检测获得的数据进行对数(LOG)转换加中心化(CTR)格式化处理，然后进行自动建模分析，各组PCA模型的相关参数见表4，PCA得分散点图如图3。
表4 PCA模型参数表
b正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)
使用SIMCA V14.1软件对肺腺癌组、肺鳞癌组、肺良性病变组及正常对照人群NSCLC组和正常对照组UHPLC-Q-TOF/MS正离子模式下检测获得的数据进行LOG转换加UV格式化处理，首先对第一主成分进行OPLS-DA建模分析，模型的质量用7折交叉验证(7-foldCross validation)进行检验；然后用交叉验证后得到的R2Y(模型对分类变量Y的可解释性)和Q2(模型的可预测性)对模型有效性进行评判；最后通过置换检验(permutationtest)，随机多次改变分类变量Y的排列顺序得到不同的随机Q2值，对模型有效性做进一步的检验。结果得到1个主成分和1个正交成分，各组OPLS-DA模型的相关参数见表5，其得分图如图4所示。图中横坐标t[1]P表示第一主成分的预测主成分得分，纵坐标t[1]O表示正交主成分得分，散点形状和颜色表示不同的实验分组。可见各组样本区分非常显著，样本基本处于95％置信区间内。
表5 OPLS-DA模型参数表
c OPLS-DA置换检验
OPLS-DA模型的置换检验结果如图5所示，图中横坐标表示置换检验的置换保留度(与原模型Y变量顺序一致的比例，置换保留度等于1处的点即为原模型的R2和Q2值)，纵坐标表示R2或Q2的取值，绿色圆点表示置换检验得到的R2值，蓝色方点表示置换检验得到的Q2值，两条虚线分别表示R2和Q2的回归线。可见原模型R2接近1，说明建立的模型符合样本数据的真实情况；Q2接近1，说明如果有新样本加入模型，会得到近似的分布情况，总的来说原模型可以很好地解释两组样本之间的差异。同时随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性良好。
④NSCLC差异脂质代谢物的筛选
采用OPLS-DA模型第一主成份变量投影重要度(Variable Importance in theProjection，VIP)值(阈值＞1)，并结合t检验(Student’s t-test)的P值(阈值＜0.05)来寻找NSCLC差异脂质代谢物，各组差异脂质代谢物见表6-表9。共获得NSCLC组和正常对照组的差异性脂质代谢物60种(倍值＞1.5)，NSCLC组和肺良性病变组的差异性脂质代谢物8种(倍值＞1.5)，肺良性病变组和正常对照组的差异性脂质代谢物44种(倍值＞1.5)，肺腺癌组和肺鳞癌组的差异性脂质代谢物14种(倍值＞1.3)。差异脂质代谢物的火山图如图6所示，火山图中每个点代表一个代谢物，横坐标代表该组对比各物质的倍数变化(取以2为底的对数)，纵坐标表示t检验的P-value(取以10为底的对数)，散点大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散点越大VIP值越大。散点颜色代表最终的筛选结果，显著上调的脂质代谢物以红色表示，显著下调的脂质代谢物以蓝色表示，非显著差异的脂质代谢物为灰色。
表6非小细胞肺癌组和正常对照组的差异脂质代谢物列表
*：“+”正离子模式，“-”负离子模式
表7非小细胞肺癌组和肺良性病变组的差异脂质代谢物列表
*：“+”正离子模式，“-”负离子模式
表8肺良性病变组和正常对照组的差异脂质代谢物列表
*：“+”正离子模式，“-”负离子模式
表9肺腺癌组和肺鳞癌组的差异脂质代谢物列表
*：“+”正离子模式，“-”负离子模式
⑤NSCLC差异脂质代谢物的KEGG分析和代谢通路分析
通过KEGG Pathway数据库整理各组差异脂质代谢物映射的通路见表10-表16，表中代谢通路列为差异脂质代谢物映射的KEGG通路，括号内数字代表该通路包含的差异脂质代谢物个数，代谢物列为映射到该通路的差异脂质代谢物的信息。肺腺癌组与肺良性病变组经分析未获得差异的KEGG通路。
表10肺腺癌组与正常对照组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
表11肺鳞癌组与正常对照组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信患表
表12肺鳞癌组与肺良性病变组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
表13肺腺癌组与肺鳞癌组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
表14肺良性病变组与正常对照组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
表15非小细胞肺癌组与肺良性病变组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
表16非小细胞肺癌组与正常对照组的差异脂质代谢物KEGG通路注释信息表
综合分析这些代谢通路(包括富集分析和拓扑分析)，对代谢通路进行进一步的筛选，找到与脂质代谢物相关性最高的关键通路，得到以下的代谢通路详细结果见表17-表21。Pathway为代谢通路名称，Total为该通路中所有代谢物的个数；Hits为差异脂质代谢物命中该通路的个数为Raw p：富集分析得到的P值，-log(p)为P值取负常用对数，FDR为经错误发现率(false discovery rate，FDR)方法进行多重假设检验校正后的P值，Impact为拓扑分析得到的影响因子。代谢通路分析的结果以气泡图表示，见图7-13。气泡图中每一个气泡代表一个代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小，大小越大影响因子越大；气泡所在纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P值(取负常用对数，即-log10 P-value)，颜色越深P值越小，富集程度越显著。综合分析，非小细胞肺癌组/肺腺癌组/肺鳞癌组与正常对照组相比，甘油磷脂代谢在拓扑分析中的影响因子最大，在富集分析中的富集程度最显著；非小细胞肺癌组与肺良性病变组相比，甘油磷脂代谢在拓扑分析中的影响因子最大，亚油酸代谢在富集分析中的富集程度最显著；肺鳞癌组与肺良性病变组相比，甘油磷脂代谢在拓扑分析中的影响因子最大，在富集分析中的富集程度最显著；肺腺癌组与肺鳞癌组相比，甘油磷脂代谢在拓扑分析中的影响因子最大，在富集分析中的富集程度最显著。
表17非小细胞肺癌组/肺腺癌组/肺鳞癌组与正常对照组血清差异脂质代谢物代谢通路归属汇总表
表18非小细胞肺癌组与肺良性病变组血清差异脂质代谢物代谢通路归属汇总表
表19肺鳞癌组与肺良性病变组血清差异脂质代谢物代谢通路归属汇总表
表20肺良性病变组与正常对照组血清差异脂质代谢物代谢通路归属汇总表
表21肺腺癌组与肺鳞癌组血清差异脂质代谢物代谢通路归属汇总表
⑥NSCLC差异脂质代谢物的“基因-酶-反应-代谢物”网络分析
将所有NSCLC差异脂质代谢物的倍值(Fold change)和P值输入CytoScape的MetScape插件(http://metscape.ncibi.org/)，得到“基因-酶-生化反应-代谢物”的总网络及差异脂质代谢物参与的所有子网络，与甘油磷脂代谢相关的NSCLC差异脂质代谢物网络图如图14所示。
⑦NSCLC血清脂质早期诊断生物标志物的确认
综合NSCLC差异脂质代谢物筛选及代谢通路分析结果，与肺良性病变组和正常对照组相比，早期NSCLC患者血清中的磷脂酰胆碱(PCs)和磷脂酰乙醇胺(PEs)显著上调，应通过靶向脂质组学分析进一步进行验证。
(2)基于UPLC-Q-TOF/MS技术的靶标NSCLC脂质组学检测分析
①验证NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物
采用UHPLC-Q-TOF/MS定量分析了各PC和PE在NSCLC组、肺良性病变组和正常对照组中各样本血清中的绝对浓度，共检测到85个PC和53个PE浓度的变化。通过单因素方差分析比较NSCLC组、肺良性疾病组与正常对照组PC和PE差异。运用LSD检验进行两两比较，根据p＜0.05和倍值＞1.5，选择11个PE和3个PC作为区分NSCLC和正常对照人群的早期诊断脂质生物标志物，8个PE和2个PC作为区分肺良性病变和正常对照人群的差异脂质生物标志物；根据p＜0.05和倍值＞1.0，选择1个PE和1个PC作为区分NSCLC和肺良性病变的早期诊断脂质生物标志物。如图15所示，NSCLC组血清中的PE(16∶0/16∶1)、PE(16∶0/18∶3)、PE(16∶0/18∶2)、PE(18∶0/16∶0)、PE(17∶0/18∶2)、PE(18∶0/17∶1)、PE(17∶0/18∶1)、PE(20∶5/16∶0)、PE(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/20∶4)、PE(18∶0/20∶3)、PC(15∶0/18∶1)、PC(16∶1/20∶5)和PC(18∶0/20∶1)的含量与正常对照组比显著增加(P＜0.05)，PE(18∶0/18∶2)和PC(15∶0/18∶1)的含量与肺良性疾病组比显著增加(P＜0.05))；肺良性疾病组血清中的PE(16∶0/18∶3)、PE(18∶0/16∶0)、PE(17∶0/18∶2)、PE(17∶0/18∶1)、PE(18∶2/18∶2)、PE(18∶1/18∶2)、PE(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/20∶4)、PC(16∶1/20∶5)和PC(18∶0/20∶1)的含量与正常对照组比显著增加(P＜0.05)。
通过t检验比较肺腺癌组和肺鳞癌组PC和PE差异，根据p＜0.05和倍值＞1.5，选择10个PE和9个PC作为区分肺腺癌和肺鳞癌的差异脂质生物标志物。如图16所示，肺鳞癌组血清中的PE(16∶0/16∶0)、PE(16∶0/18∶2)、PE(16∶0/18∶1)、PE(17∶0/18∶2)、PE(17∶0/18∶1)、PE(16∶0/20∶4)、PE(18∶1/18∶1)、PE(18∶0/18∶1)、PE(18∶0/20∶4)、PE(20∶2/18∶1)、PC(1S∶0/20∶4)、PC(18∶2/18∶2)、PC(16∶0/20∶3)、PC(18∶2/20∶4)、PC(18∶0/20∶2)、PC(18∶0/20∶1)、PC(22∶1/18∶1)、PC(26∶1/16∶1)和PC(24∶0/18∶1)的含量与肺腺癌组比显著增加(P＜0.05)。
②确认NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物
通过SPSS19.0软件对NSCLC组、肺良性疾病组和正常对照组筛选获得的血清差异脂质生物标志物进行单个指标及多个指标的ROC曲线绘制并计算灵敏度和特异性，各脂质生物标志物和脂质生物标志物组合的灵敏度、特异性和AUC见表22和表23，ROC曲线如图17所示。发现单个脂质生物标志物在区分NSCLC、肺良性病变和正常对照人群方面没有良好的诊断性能。然而，分析多指标联合作用的诊断效能，发现14个PE和PC组合(组合a)用于区分NSCLC组和正常对照组具有最好的诊断效能，AUC＝0.963；10个PE和PC组合(组合b)用于区分肺良性疾病组和正常对照组具有最好的诊断效能，AUC＝0.879；2个PC和PE组合(组合c)用于区分NSCLC和肺良性疾病具有较好的诊断效能，AUC＝0.784。确认组合a、组合b和组合c作为区分NSCLC、肺良性疾病和正常对照人群的血清早期诊断脂质生物标志物。
表22非小细胞肺癌组(NSCLC)、肺良性疾病组(LBD)和正常对照组(HC)血清差异脂质生物标志物单个指标和多个指标曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性
表23肺腺癌组(ADC)和肺鳞癌组(sqCC)血清差异脂质生物标志物单个指标和多个指标曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性
本发明(1)采用超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱联用(UHPLC-Q-TOF/MS)分析技术，对非小细胞肺癌(NSCLC)组、肺良性病变组和正常对照组患者血清中的脂质代谢物进行非靶标脂质组学分析，采用多变量统计方法，比较NSCLC组、肺良性病变组和正常对照组的脂质代谢指纹图谱变化。结果显示NSCLC患者、肺良性病变患者和正常对照人群血清中的脂质代谢物质及其离子强度有一定的差别。
(2)通过比较NSCLC患者、肺良性病变患者和正常对照人群血清中的脂质代谢物变化，对目标性差异脂质代谢标志物进行代谢通路归属分析，确认磷脂酰胆碱(PCs)和磷脂酰乙醇胺(PEs)为NSCLC早期诊断相关的差异性脂质生物标志物，NSCLC与甘油磷脂代谢通路异常密切相关。
(3)采用UHPLC-Q-TOF/MS技术，建立NSCLC血清磷脂酰胆碱(PCs)和磷脂酰乙醇胺(PEs)的定量检测方法，分析多指标联合作用的诊断效能，发现14个PE和PC组合(组合a)用于区分NSCLC组和正常对照组具有最好的诊断效能，AUC＝0.963；10个PE和PC组合(组合b)用于区分肺良性疾病组和正常对照组具有最好的诊断效能，AUC＝0.879；2个PC和PE组合(组合c)用于区分NSCLC和肺良性疾病具有较好的诊断效能，AUC＝0.784。确认组合a、组合b和组合c作为区分NSCLC、肺良性疾病和正常对照人群的血清早期诊断脂质生物标志物。

Claims (10)

1.血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，包括：
(1)收集NSCLC患者、肺良性病变患者和正常人的血清样本；
(2)对血清样本预处理，并采用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱的方法检测各血清样本中脂质代谢标志物，获得脂质代谢指纹图谱；
(3)通过多元变量模式识别分析的方法进行NSCLC相关差异脂质代谢标志物的筛选；
(4)通过NSCLC差异脂质代谢物的KEGG分析和代谢通路分析，筛选出与脂质代谢物相关性最高的关键代谢通路；
(5)进行NSCLC差异脂质代谢物的“基因-酶-反应-代谢物”网络分析，获得NSCLC差异脂质代谢物网络图；
(6)综合NSCLC差异脂质代谢标志物筛选及代谢通路分析结果，筛选获得NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物；
(7)对筛选出的NSCLC血清早期诊断脂质生物标志物重复步骤(1)-(6)进行靶标定量验证和确认。
2.根据权利要求1所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的样本收集具体为：空腹采集NSCLC患者、肺良性病变患者和正常人肘部静脉血5mL于无菌促凝真空采血管中，2500r/min，4℃离心5min，取上层血清，保存于-80℃冰箱中待用。
3.根据权利要求1所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(2)中血清样本预处理为：将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100μL的样本加入480μL甲基叔丁基醚-甲醇提取液，涡漩震荡30s，静置1h；3000r/min离心15min，取400μL甲基叔丁基醚层蒸干，100μL二氯甲烷：甲醇复溶，进行UPLC-Q-TOF/MS检测分析；同时每个样本各取10μL混合成质控样本，与样本同批次检测。
4.根据权利要求1所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：超高效液相-四级杆-飞行时间质谱采用Agilent 1290超高效液相色谱仪和AB Sciex6600三重飞行时间质谱仪。
5.根据权利要求4所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(2)中液相色谱-质谱条件为：Phenomenex Kinetex C18 100A柱(1.7μm 2.1×100mm)(100×2.1mm)，流速0.3ml/min，柱温为25℃；进样量为2μL，自动进样器温度4℃；流动相：A：10mmol/L甲酸铵-40％水-60％乙腈，B：10mmol/L甲酸铵-10％水-90％异丙醇；雾化气压力60psi，辅助气压力60psi，气帘气压力30psi，离子源温度550℃，喷雾电压5000V/-4500，去簇电压100V，碰撞电压10eV。
6.根据权利要求5所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(2)中采集的液相质谱数据包括一级质谱数据和二级质谱数据，其中在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。
7.根据权利要求4所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)之间还设有数据处理步骤，该步骤为：采用AB SCIEX Analyst TF1.7.1数据采集软件记录每个血清样本的总离子流色谱图进行可视化检查；数据首先使用MSconventer转换为mzXML格式；使用XCMS做峰寻找、峰对齐数据处理。
8.根据权利要求1～7之一所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(3)中进行多元变量模式识别分析前需要进行数据预处理，具体为：对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补；数据标准化处理，利用每个样本的总离子流进行归一化。
9.根据权利要求8所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(3)中的多元变量模式识别分析的方法使用SIMCA V14.1软件，选用主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析、OPLS-DA置换检验建立OPLS-DA模型，采用OPLS-DA模型第一主成份变量投影重要度值，并结合学生t检验的P值来寻找NSCLC差异脂质代谢标志物。
10.根据权利要求1所述的血清脂质生物标志物在NSCLC早期诊断中的应用方法，其特征在于：步骤(4)中代谢通路的分析包括富集分析和拓扑分析。
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