CN112782403B - 一种组合物及应用和诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组织样本中小分子代谢物葡萄糖‑6‑磷酸、赤藓糖‑4‑磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33:1)作为联合型代谢标志物在制备用于诊断受试者中的肺癌和肺部良性结节患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的肺癌和肺部良性结节患者的试剂盒，通过检测来自受试者组织样本中上述联合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P值，再基于确定的截点值(cutoff)，诊断肺癌和肺部良性结节患者。此外，该联合标志物对早期肺癌和肺部良性结节患者也有较好的诊断能力。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，具有检测成本低，重复性好的特点。

Description

一种组合物及应用和诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新的组合标志物在制备诊断肺癌和肺癌良性结节的试剂盒中的用途。属于分析化学，生物化学以及临床医学领域。
背景技术
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤。早期肺癌症状不明显以及其他肺部良性结节的干扰是肺癌临床诊断的难题。尽管对肺癌的研究一直是肿瘤学和临床医学的研究热点，但是其致病机制尚未明确，它涉及多基因遗传，环境因素以及生活方式的共同作用。目前血清肿瘤标志物、影像学检查是肺癌筛查的主要方法。然而，血清肿瘤标志物癌胚抗原在诊断肺癌过程中存在特异性和灵敏度低的问题。影像学检查包括X线胸部摄片、CT(计算机断层扫描)检查和低剂量胸部CT检查等。其中低剂量胸部CT由于辐射小，检测灵敏度高受到国内外广泛关注和使用，但其缺点是假阳性率高，经常把肺部良性结节误诊为肺癌(文献1：Team，T.N.L.S.T.R.，Reduced Lung-Cancer Mortality with Low-Dose ComputedTomographic Screening.N Engl.J.Med.2011，Vol.365No.5.)，从而引起患者不必要的恐慌，也会导致医生采取不当的治疗方案。因此开发一种新方法用于诊断肺癌和肺部良性结节，尤其是区分早期肺癌和肺部良性结节对指导临床治疗方案以及降低肺癌死亡率具有非常重要的现实意义。
肿瘤被广泛认为是一种代谢性疾病，肿瘤细胞存在着代谢重编程过程。肿瘤细胞中糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、脂质代谢等多种代谢过程发生异常改变以支持肿瘤细胞的大量增殖。近年来代谢组学作为一个新的有利工具广泛应用于肿瘤诊断中。色谱-质谱联用技术是代谢组学研究的主要手段，基于色谱-质谱联用的代谢组学手段发现重要小分子代谢物在癌症诊断中已有许多成功的应用，包括检测苯丙酰色氨酸和甘氨胆酸作为联合标志物应用于肝癌诊断(文献2：Luo，P.；Yin，P.；Hua，R.；Tan，Y.；Li，Z.；Qiu，G.；Yin，Z.；Xie，X.；Wang，X.；Chen，W.；Zhou，L.；Wang，X.；Li，Y.；Chen，H.；Gao，L.；Lu，X.；Wu，T.；Wang，H.；Niu，J.；Xu，G.，A Large-scale，multicenter serum metabolite biomarkeridentification study for the early detection of hepatocellularcarcinoma.Hepatology 2018，67(2)，662-675.)，检测鞘氨醇作为前列腺癌判别标志物(文献3：Shancheng
Figure BDA0002262010650000011
Y.S.，Integration of metabolomics and transcriptomicsreveals major metabolic pathways and potential biomarker involved in prostatecancer.Molecular&cellular proteomics 2015.)等。由于单一代谢物受环境影响很大，因此可以在差异代谢物中选用几个小分子代谢物组成“联合型代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P值(Probability)，此方法可以有效改善代谢物对疾病诊断的灵敏度和特异性。值得一提的是，相对于体液而言组织可以更直观的反应疾病引起的原始代谢变化，这在寻找疾病标志物中至关重要(文献4：4.Moreno，P.；Jimenez-Jimenez，C.；Garrido-Rodriguez，M.；Calderon-Santiago，M.；Molina，S.；Lara-Chica，M.；Priego-Capote，F.；Salvatierra，A.；Munoz，E.；Calzado，M.A.，Metabolomic profiling of human lungtumor tissues-nucleotide metabolism as a candidate for therapeuticinterventions and biomarkers.Mol Oncol 2018，12(10)，1778-1796.)。所以基于组织的代谢组学正受到越来越多的关注。
本发明利用高效液相色谱-质谱联用技术获取肺癌和肺部良性结节患者肺肿瘤组织代谢谱。经过多次优选，确定了基于葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)的联合标志物，用于区分肺癌和肺部良性结节患者，辅助肺癌的临床诊断。葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)分别是糖酵解、磷酸戊糖途径、嘌呤合成和脂质代谢中重要的中间体。糖酵解、磷酸戊糖途径都是与能量代谢密切相关的代谢途径。肿瘤细胞表现出异常活跃的糖酵解过程，即使在氧气充足的条件下依然利用糖酵解这种产能效率低的方式为细胞大量增殖供能，这一现象被称为瓦伯格效应(文献5：Warburg，O.，Wind，F.，and Negelein，E.，The metabolism of tumors in thebody.J.Gen.Physiol 1927.)，随后大量实验进一步证实了该观点。肿瘤细胞增殖除了需要利用大量能量外还需要合成大量的核苷和细胞膜，具体表现为嘌呤合成和细胞膜主要成分甘油磷脂代谢的增加。本研究发现肺部良性结节和肺癌患者的病灶组织中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)的浓度有很大差异，目前没有一种将该四种代谢物联合用于诊断肺癌和肺部良性结节的报道。
发明内容
本发明的目的是针对肺癌尤其是早期肺癌和肺部良性结节难以区分的临床实际问题，提供一种组合型小分子生物标志物在肺癌和肺部良性结节患者诊断中的应用，并提供可用于上述组合的小分子代谢物的分析检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)利用高效液相色谱-质谱联用的代谢组学技术对肺癌和肺部良性结节患者的肺组织进行了代谢组学指纹分析。发现并定性340种小分子代谢物，其中22种代谢物在肺癌患者和肺部良性结节患者中存在显著性差异。
(2)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归的分析方法，在22个差异代谢物中随机组合，确定联合标志物变量。随后用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线来评价联合标志物的灵敏度和特异性。综合考虑高灵敏度和高特异性，确定最终的联合标志物为葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)。
(3)联合标志物在诊断肺癌和肺部良性结节中的使用：相比于肺部良性结节患者，肺癌患者的葡萄糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸浓度降低，而黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)浓度升高(见图1)。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归方法将这4种代谢物回归为联合标志物变量P，优选地，二元逻辑回归方程如下：
方程：
P＝1/(1+e-(-0.232*a+9.301*b+0.1360.43*c+0.216d-5.443))
其中a为组织样品种葡萄糖-6-磷酸的相对浓度，b为组织样品中赤藓糖-4-磷酸的相对浓度，c为组织样品中黄嘌呤的相对浓度，d为组织样本中磷脂酰胆碱PC(33：1)的相对浓度(相对浓度指相对于内标和组织质量的代谢物浓度值，具体数值见表1)。
所得变量P在肺癌病人中增高，该变量的值可用于辅助诊断肺癌和肺部良性结节患者。在此，基于试验所涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最佳原则，该联合标志物变量的截点值设为0.626，高于截点值则有可能为肺癌。
(4)联合标志物在早期肺癌和良性肺结节中的使用：早期肺癌也是恶性肺肿瘤，与肺部良性结节患者相比，早期肺癌患者也表现为葡萄糖-6-磷酸浓度降低，黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)浓度升高(见图2)。因此，该组联合标志物在早期肺癌和良性肺结节的区分中也表现出良好的诊断能力，将早期肺癌患者这四种代谢物浓度代到上述回归方程中，同样用截点值0.626对其判别，诊断准确率可达85％。
(5)所建模型对肺癌和肺部良性结节具有良好的判别能力(见图3和表2)。对于肺癌和肺部良性结节的区分，组合标志物的AUC＝0.947、灵敏度＝0.936、特异性＝0.889，传统肺癌诊断标志物癌胚抗原诊断的AUC＝0.866、灵敏度＝0.806、特异性＝0.875；与传统肺癌标志物癌胚抗原相比，本发明所述联合标志物在诊断肺部良性结节和肺癌的诊断中表现出更高的AUC、灵敏度和特异性。此外，在癌胚抗原假阴性(CEA＜5μg/L)的肺癌患者中，该联合标志物在最佳截点值条件下对于肺癌和肺部良性结节的诊断正确率可达92.3％，而单独用癌胚抗原诊断正确率为73.1％。若将联合标志物与癌胚抗原联合使用诊断正确率可达96.2％(见图4)。说明本发明所述联合标志物与传统肺癌标志物有良好的互补性。该组联合标志物在早期肺癌和良性肺结节的区分中也表现出良好的诊断能力。诊断准确率可达85％。综上，优异的ROC曲线结果、诊断准确率和传统肺癌标志物良好的互补性表明该组标志物具有区分肺癌和肺部良性结节的良好诊断潜力，也可以用于诊断早期肺癌和肺部良性结节。
(6)本发明具有的效果是：组织样品中代谢物小分子葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)可以联合用于诊断肺癌和肺部良性结节，对早期肺癌和肺部良性结节也有很好的诊断效果。通过本发明涉及的组合标志物，对肺癌和肺部良性结节的诊断具有高特异性，高灵敏度的特征。该组合标志物还可以与传统的肺癌诊断标志物癌胚抗原进行互补，同时，结合低剂量胸部螺线CT进行广泛的肺部筛查，最终用于肺癌和其他肺部良性结节的诊断，对指导临床治疗以及降低肺癌死亡率具有非常重要的现实意义。
所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可应用于辅助肺癌和肺部良性结节的临床诊断，具有诊断灵敏度高，区分肺癌与肺部良性结节效果好的特点。同时可以与传统的临床标志物癌胚抗原以及临床影像学如X线，计算机断层扫描，Low does-CT等诊断方式相互补充，具有较好的应用前景。此外，本发明有助于研究肺癌和肺部良性结节生物学本质，对肺癌和肺部良性结节规范分型有重要意义。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更突出，其中：
图1.葡萄糖-6-磷酸(A)、赤藓糖-4-磷酸(B)、黄嘌呤(C)和磷脂酰胆碱PC(33：1)(D)在肺部良性结节组织、肺癌组织样本中的含量变化(均值±标准偏差)。*代表p＜0.05，**代表p＜0.01。
图2.葡萄糖-6-磷酸(A)、赤藓糖-4-磷酸(B)、黄嘌呤(C)和磷脂酰胆碱PC(33：1)(D)在肺部良性结节组织、早期肺癌组织样本中的含量变化(均值±标准偏差)。*代表p＜0.05，**代表p＜0.01。
图3.(A)表示联合标志物诊断肺部良性结节和肺癌组织样本的ROC曲线，(B)表示癌胚抗原诊断肺部良性结节和肺癌组织样本的ROC曲线。
图4.基于组合标志物对癌胚抗原假阴性(CEA浓度＜5μg/mL)的肺癌患者的判别正确率。
具体实施方式
实施例1
1.组织样本的收集
在采样前，所有纳入研究的志愿者均签署了知情同意书。
在相同条件下收集85例肺部肿瘤患者肿瘤病灶区组织，其中包括18例肺部良性结节患者和47例肺癌患者，在47例肺癌患者中有17例属于早期肺癌患者。所有患者在行肺部肿瘤切除术之前一天要进行灌肠或服泻药，术前禁饮食8小时以上，吸烟者术前至少戒烟2-3周。分别采集的组织样品先通过纱布蘸取表面的血液，随后迅速转移至液氮中短期保存，最后转移至-80℃冰箱中长期保存。
2.分析方法
2.1组织样本分别预处理
组织样本分别在室温下冰上解冻，称取10mg组织样本于2ml离心管中，并加入研磨磁珠，然后加入600μL含内标的提取液(即含：D3-亮氨酸(2.00μg/mL)、D3-棕榈酰肉碱(0.12μg/mL)和D5-色氨酸(3.40μg/mL)的甲醇/水溶液(8/2vol/vol))沉淀蛋白。在28HZ的振动频率下，研磨2分钟，充分将组织打碎以提取其中代谢物。组织匀浆后，在13000g，4℃条件下离心10分钟。每份组织样本平行取两份200μL上清液分别冷冻干燥，保存在-80℃冰箱中。进样前，用80μL乙腈/水(1/1vol/vol)复溶，涡旋1分钟充分复溶冻干样品后，再以13000g，4℃条件下离心10分钟，取上清进行仪器分析，进样体积5μL。
2.2超高效液相色谱-质谱分析
每份组织样本的两份平行样品一份进行正离子模式下检测，另一份进行负离子模式下检测；
(1)液相条件：
采用Wasters超高效液相色谱系统实现组织上清液中代谢物的分离。正离子模式下色谱柱为Waters BEH C8柱(规格：50mm×2.1mm，1.7μm)(Waters，Milford，MA)，柱温为60℃，流速为0.4ml/min。流动相为水添加终体积浓度0.1％甲酸(A相)和乙腈添加终体积浓度0.1％甲酸(B相)。洗脱(v/v)起始梯度为5％B，维持0.5min，随后在1.5min内线性增至40％B，在6min内线性增至100％B并维持2min，随后线性地至10.1min处降回初始梯度5％B，平衡1.9min。负离子模式下色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(规格：50mm×2.1mm，1.8μm)(Waters，Milford，MA)，柱温为60℃，流速为0.4ml/min。流动相A相为水添加终浓度6.5mMNH4HCO3，B相为含6.5mM NH4HCO3的95％甲醇-水溶液(v/v)。洗脱起始梯度为2％B(v/v)，维持0.5min，在1.5min内线性增至40％B，随后在6min内线性增加到100％B并维持5min，随后线性地至13.1min处降回初始梯度2％B，平衡1.9min。
(2)质谱条件
质谱系统采用TripleTOFTM5600+质谱仪(AB SCIEX)。气帘气(CUR)、雾化气(GS1)和辅助气(GS2)压力分别为35、55和55psi。去簇电压为100V，碰撞能为10V。扫描范围80-1000Da。采用电喷雾电离，在正离子模式下喷雾电压为5500V，温度为550℃。负离子模式下喷雾电压为4500V，温度为450℃。二级采用信息依赖采集模式，选择响应较高的前15个离子自动进行二级碎片扫描，二级碰撞能分别15V，30V，45V以及30±15V。
2.2组织测试结果及辅助诊断方法
用各代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积并校正到每克组织得到每种代谢物的相对浓度值。各组人群中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)的相对浓度值如表1所示。
表1.各组人群中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)的相对浓度值
Figure BDA0002262010650000041
Figure BDA0002262010650000051
Figure BDA0002262010650000061
定量分析葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)在肺部良性结节和肺癌患者中的相对浓度见图1。与肺部良性结节相比，肺癌者表现为葡萄糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸浓度显著下降、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)浓度显著上升。
使用数据处理软件SPSS进一步将葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)进行二元逻辑回归，在肺部良性结节与肺癌中回归为联合标志物变量P。回归方程如下：
P＝1/(1+e-(-0.232*a+9.301*b+0.1360.43*c+0.216d-5.443))
其中a、b、c、d分别为葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)相对于内标和组织质量的浓度值(相对于内标和组织质量，即用各代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积并除以组织质量(单位为g)得到每种代谢物的相对浓度值。)。
图3A中，该联合标志物通过判别变量P用于区分肺部良性结节和肺癌病人时，得到ROC曲线的曲线下面积为0.947，具有较高的灵敏度与特异性。最佳截点值下的灵敏度值为0.936，特异性值为0.889。当组合标志物的概率大于截点值0.626时则认为是肺癌。
图3B是用临床标志物癌胚抗原诊断肺部良性结节和肺癌的ROC曲线其灵敏度为0.806，特异性为0.875，曲线下面积AUC为0.866。
图4表明，在癌胚抗原假阴性(CEA＜5μg/L)的肺癌患者中，该联合标志物在最佳截点值条件下对于肺癌和肺部良性结节的诊断正确率可达92.3％，而单独用癌胚抗原诊断正确率为73.1％。若将联合标志物与癌胚抗原联合使用诊断正确率可达96.2％。
表2中具体列出各组比较中的AUC，置信区间，灵敏度和特异性值。以上结果表明该组联合标志物具有良好的诊断肺癌和肺部良性结节的能力，同时与临床使用的癌胚抗原具有较好的互补性。
表2.联合标志物和癌胚抗原在区分肺癌和肺部良性结节中相应的AUC，置信区间，灵敏度和特异性。
Figure BDA0002262010650000062
实施例2
为了验证组合标志物对早期肺癌患者也有很好的诊断效果，加入20例早期肺癌样本进行验证。此实验所用的分析方法、仪器和试剂都和实施例1完全一致。
1.组织样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。
相同条件下采用20例早期肺癌组织样本按实施例1所述方法采集、保存、备检。
2.组织测试及辅助诊断结果
相对于肺部良性结节组织，葡萄糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸在早期肺癌中浓度显著下降、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC(33：1)在早期肺癌中浓度显著上升(见图2)。同时，将各标志物在早期肺癌组织中的相对浓度(同实施例1相对浓度表示相对于内标和组织质量的代谢物浓度值，见表3)带入回归方程P中计算出概率，采用截点值0.626，该判别方程对早期肺癌的正确诊断率为85％。可见该组标志物对于区分早期肺癌和肺部良性结节也有较好的诊断效果。
表3.早期肺癌患者中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱33：1的相对浓度值
Figure BDA0002262010650000071
本发明所述试剂盒在肺癌和肺部良性结节患者的诊断中具有检测成本低，稳定性好的特点。并与传统的临床标志物癌胚抗原相互补充。同时，本发明还可以应用于早期肺癌和肺部良性结节的临床诊断，诊断准确率高。综上，本发明具有较高的开发价值。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权力要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (8)

1.一组区分早期肺癌与肺部良性结节患者的联合标志物，其由葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC (33: 1) 组成。
2.权利要求1所述的联合标志物在制备区分早期肺癌与肺部良性结节诊断试剂盒中的应用，其中所述试剂盒包含标准品、提取溶液、检测所述联合标志物浓度所需的内标和洗脱色谱柱的洗脱液。
3.按照权利要求2所述的应用，其中诊断步骤包括：
（1）通过检测肺癌和肺部良性结节患者组织样品中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC (33: 1)的相对浓度，根据上述四种标志物的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量概率P值，再基于确定的截点值，区分肺癌和肺部良性结节患者，所述二元逻辑回归方程为：
P=1/（1+e-(-0.232*a+9.301*b+0.1360.43*c+0.216*d-5.443)），
其中a为组织样品中葡萄糖-6-磷酸的相对浓度，b为组织样品中赤藓糖-4-磷酸的相对浓度，c为组织样品中黄嘌呤的相对浓度，d为组织样本中磷脂酰胆碱PC (33: 1)的相对浓度；
其中截点值为0.626，大于该截点值的P值指示受试者患有肺癌，否则表明受试者未患有肺癌，为肺部良性结节患者；
并且
（2）通过检测早期肺癌患者组织样品中葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC (33: 1)的相对浓度，根据上述四种标志物的相对浓度值，代入上述方程中求算P值，再基于上述确定的截点值诊断早期肺癌患者。
4.根据权利要求2所述的应用，其中检测联合标志物的内标为D5-色氨酸、D3-亮氨酸和D3-棕榈酰肉碱。
5.一种区分肺癌和肺部良性结节的诊断试剂盒，所述试剂盒包含标准品、检测组织样品中权利要求1中所述的联合标志物的浓度的提取液试剂和内标，以及洗脱色谱柱的洗脱液，
标准品包括：葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、黄嘌呤和磷脂酰胆碱PC (33:1)。
6.按照权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于：
（1）所述提取液含有内标，含内标的提取液为包含D5-色氨酸、D3-亮氨酸、D3-棕榈酰肉碱的甲醇/水溶液，甲醇/水体积比为1/9-8/2；
（2）洗脱色谱柱的洗脱液包括：
质谱正离子模式下：
流动相A：体积浓度0.1%-0.5%甲酸/水；
流动相B：体积浓度0.1%-0.5%甲酸/乙腈；
质谱负离子模式下：
流动相A：含6-7 mM碳酸氢铵的水溶液；
流动相B：含6-7 mM碳酸氢铵的体积比为95/5的甲醇/水溶液。
7.按照权利要求5或6所述的诊断试剂盒，
所述标准品质量浓度范围为：1-7μg/ml的葡萄糖-6-磷酸、0.3-1.5μg/ml的赤藓糖-4-磷酸、0.3-1.5μg/ml的黄嘌呤和0.3-1.5μg/ml的磷脂酰胆碱PC (33: 1)。
8.按照权利要求6所述的诊断试剂盒，
所述内标的浓度为：1-5μg/ml稳定同位素标记的D5-色氨酸、1-5μg/ml稳定同位素标记的D3-亮氨酸和0.1-0.2μg/ml稳定同位素标记的D3-棕榈酰肉碱。
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