CN113138275B - 血清脂质代谢物组合物及试剂盒和应用 - Google Patents

血清脂质代谢物组合物及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的血清脂质代谢物组合及其作为标志物在制备非吸烟女性肺癌诊断试剂盒中的用途。所述血清脂质代谢物组合包括：二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4。该血清脂质代谢物的组合可用于非吸烟女性肺癌的辅助诊断，具有检测成本低，重复性好，较高的灵敏度和特异性的特点。同时，该脂质代谢物组合对非吸烟女性早期肺癌的诊断也有良好的效果。

Description

血清脂质代谢物组合物及试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种新的血清联合标志物在非吸烟女性肺癌诊断中的应用。它属于分析化学、临床医学和医学领域。
背景技术
肺癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一(文献1：Yu et al.,Globallipidomics reveals two plasma lipids as novel biomarkers for the detection ofsquamous cell lung cancer:A pilot study,oncol.lett.16(2018)761-768.)。近年来，女性肺癌的发病率有所上升，尽管大部分女性不吸烟。肺癌是一种异质性疾病，有多种亚型，具有不同的组织学和分子生物学特征。此外，女性肺癌在环境危险因素和组织学类型方面似乎与男性有所不同。而不吸烟人群中的肺癌具有明显的性别偏见，女性比男性更容易患上非吸烟肺癌，尤其是腺癌(文献2：Sun et al.,Lung cancer in never smokers-adifferent disease,Nat.Rev.Cancer 7(2007)778-90.)。非吸烟型肺癌与吸烟型肺癌的特征不同，导致其发病特征存在显著差异。以往的研究表明，遗传变异、环境影响和病毒感染是导致非吸烟肺癌的原因。然而，非吸烟女性肺癌的发病机制尚不清楚。由于肺癌的症状不明显，目前筛查效果不太好。另一方面，虽然肺癌的早期检测是提高5年生存率的一个重要途径，但目前还没有一种适用于临床的血液生物标志物用于肺癌的早期检测(文献3：Collins et al.,Lung cancer:diagnosis and management,Am.Fam.Physician 75(2007)56-63.)。临床迫切需要应用代谢生物标志物对高危人群早期肺癌进行检测(文献4：Zaugget al.,Carnitine palmitoyltransferase 1C promotes cell survival and tumorgrowth under conditions of metabolic stress,Genes&Development 25(2011)1041-1051.)。脂质代谢紊乱是肿瘤发生的特征之一，脂质组学是研究病理变化和筛选疾病诊断生物标志物的一个有前途的工具。前人研究表明，肺癌患者也存在一定的脂质代谢紊乱。研究表明鞘磷脂、神经酰胺、甘油磷脂、胆固醇酯和脂肪酸等脂质类别在肺癌中有显著变化(文献5：Lv et al.,Heterogeneity of lipidomic profiles among lung cancersubtypes of patients,J.Cell Mol.Med.22(2018)5155-5159；文献6；Dong et al.,Lysophosphatidylcholine profiling of plasma:discrimination of isomers anddiscovery of lung cancer biomarkers,Metabolomics 6(2010)478-488；文献7：Liu etal.,Serum free fatty acid biomarkers of lung cancer,Chest 146(2014)670-679.)。然而，很少有研究发现合适的生物标志物可用于肺癌诊断的临床试验。对非吸烟女性肺癌患者的脂质组学研究和标志物筛查的研究不足，仍需进行全面深入的研究。
本发明利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对非吸烟女性肺癌患者，其中包括非吸烟女性的早期肺癌及女性健康对照的血清进行非靶向脂质组学分析。应用二元逻辑回归的分析方法，筛选出区分非吸烟女性肺癌与健康对照的潜在组合生物标志物，包括二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4，该标志物可以有效诊断受试者中非吸烟女性肺癌，且对非吸烟女性早期肺癌诊断也有较好的效果。
发明内容
本发明的目的是针对肺癌，尤其是非吸烟女性肺癌，包括早期肺癌诊断的临床实际问题，提供一种可用于非吸烟女性肺癌诊断的新型脂质代谢物联合生物标志物，并提供可用于上述组合的脂质代谢物的分析检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)利用高效液相色谱-质谱联用的脂质组学技术对非吸烟女性肺癌患者，其中包括非吸烟女性的早期肺癌及女性健康对照的血清进行了脂质组学分析。
基于超高效液相色谱质谱的脂质组学分析方法如下：
液相色谱条件：脂质分离系统为Waters ACQUITY超高效液相色谱系统(UPLC)(Waters，Milford，MA)，采用反相BEH-C8色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters，Milford，m A，U S.A.)。流速设定为0.26mL/min。柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃。洗脱溶液为：流动相A：乙腈/水＝6:4(v/v)；流动相B：异丙醇/水＝9:1(v/v)，流动相A、B中皆含10mmol/L乙酸铵。
质谱条件：质谱仪为AB SCIEX Triple TOF 5600系统(AB SCIEX，Framingham，MA)。采用电喷雾电离负离子模式检测，扫描范围：m/z150-1600。质谱仪的工作参数如下：离子喷射电压5500v(ESI-)；去聚电压-100v(ESI-)；碰撞能-10v(ESI-)；界面加热器温度500℃(ESI-)。脂质代谢物的定量：用各脂质代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积得到每种代谢物的相对浓度值。其中二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4对应的内标是棕榈酸-16,16,16-d 3，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4对应的内标是磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0。
(2)利用SPSS数据统计软件，采用二元逻辑回归的分析方法，在候选差异脂质中随机组合，确定联合标志物变量组合。用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线来评价联合标志物的灵敏度和特异性。综合考虑高灵敏度和高特异性，确定联合标志物为二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4。
(3)联合标志物在非吸烟女性肺癌诊断中的使用：相比于健康对照，非吸烟女性肺癌患者的磷脂酰肌醇PI18:0/20:5降低，而二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4浓度升高。利用SPSS数据统计软件，通过二元逻辑回归方法将这六种代谢物回归为联合标志物变量P，优选地，二元逻辑回归方程如下：
P＝1/(1+e-(-1.599-13.594*a-11.626*b+304.987*c+226.46*d-0.62*f+64.864*g))，
其中a为血清样品中磷脂酰肌醇PI 18:0/20:5的相对浓度，b为血清样品中二十碳二稀酸FA C20:2的相对浓度，c为血清样品中二十四碳四烯酸FA C24:4的相对浓度，d为血清样品中磷脂酰胆碱PC 20:1/22:6的相对浓度，f为血清样品中二十碳四烯酸FA C20:4的相对浓度，g为血清样本中磷脂酰乙醇胺PE 18:0p/22:4的相对浓度，其中*代表相乘关系。
所得变量P在非吸烟女性肺癌病人中增高，该变量的值可用于辅助诊断非吸烟女性肺癌。基于试验所涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最佳原则，该联合标志物变量的截点值设为0.51，高于截点值的非吸烟女性受试者则有可能为肺癌，ROC分析显示出该标志物具有良好的判别效能。
(4)联合标志物在非吸烟女性早期肺癌诊断中的使用：早期肺癌属于恶性肺肿瘤，与健康对照相比，早期肺癌患者也表现为磷脂酰肌醇PI18:0/20:5降低，二十碳二稀酸FAC20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4浓度升高。因此，该组联合标志物在早期肺癌和健康对照的区分中也表现出良好的诊断能力，将早期肺癌患者这六种脂质的浓度代到上述回归方程中，同样用截点值0.51对其判别，ROC分析显示具有良好的判别能力。
(5)本发明具有的效果是：血清样品中脂质分子二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4可以联合用于区分非吸烟女性肺癌与健康对照，对非吸烟女性早期肺癌和健康对照也有很好的区分效果，且具有较高特异性，较高灵敏度的特征。对指导临床治疗以及降低肺癌死亡率具有非常重要的现实意义。
所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的六种脂质代谢物，具有检测成本低，重复性好，较高的灵敏度和特异性的的特点。本发明可应用于辅助非吸烟女性肺癌的临床诊断，同时也对非吸烟女性的早期肺癌具有良好的诊断效能，具有较好的应用前景。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更突出，其中：
图1.健康对照及非吸烟女性肺癌患者中脂质分子二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4的含量变化(均值±标准误差)。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
图2.联合标志物区分非吸烟女性肺癌与健康对照的ROC曲线。
图3.在健康对照及非吸烟女性早期肺癌患者脂质分子二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4的含量变化(均值±标准误差)。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
图4.联合标志物区分非吸烟女性早期肺癌与健康对照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1
1.血清样本的收集
在采样前，所有纳入研究的志愿者均签署了知情同意书。采集63例女性健康对照和64例肺癌患者(包括非吸烟女性0期、I期、II期及III-IV肺癌)的空腹血清。所有人均禁食8小时以上，采集空腹血。采血后，分离血清，并冻存于-80℃冰箱保存。
2.分析方法
2.1血清样本的预处理
血样在4℃下解冻，取40μL血清样本，加入300μL含内标6.7μg/mL棕榈酸-16,16,16-d 3和3.3μg/mL磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0的甲醇溶液，然后旋转1分钟，再加入1mL甲基叔丁基醚，以充分提取脂质。之后加入300μL水进行相分离。将混合物在10000g，4℃条件下离心10分钟。然后移取上清液，并分成两等份(每份400μL)，冷冻干燥。在LC-MS脂质组分分析之前，冻干样品在CH2Cl2/MeOH(2:1，v/v)的混合溶剂中重新溶解，并进一步用含有5mM醋酸铵的ACN/IPA/H2O(65:30:5，v/v/v)稀释后进样分析。
2.2超高效液相色谱质谱分析
(1)液相色谱条件：脂质分离系统为Waters ACQUITY超高效液相色谱系统(UPLC)(Waters，Milford，MA)，采用反相BEH-C8色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters，Milford，m A，U S.A.)。流速设定为0.26mL/min。柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃。洗脱溶液为：流动相A，乙腈/水＝6:4(v/v)；流动相B，异丙醇/水＝9:1(v/v)，流动相A、B中皆含10mM乙酸铵。具体洗脱程序为：洗脱梯度起始于32％B，维持1.5分钟后在14分钟内线性升至85％B，在0.1分钟内线性升至97％B，维持2.5分钟然后回到初始比例平衡2分钟。
(2)质谱条件：质谱仪为AB SCIEX Triple TOF 5600系统(AB SCIEX，Framingham，MA)。采用电喷雾电离负离子模式检测，扫描范围：m/z150-1600。质谱仪的工作参数如下：离子喷射电压5500v(ESI-)；去聚电压-100v(ESI-)；碰撞能-10v(ESI-)；界面加热器温度500℃(ESI-)。
2.3血清测试结果及辅助诊断方法
利用上述高效液相色谱-质谱联用技术的分析条件对非吸烟女性肺癌患者(其中包括非吸烟女性的早期肺癌)及女性健康对照的血清进行了脂质组学分析。发现并定性多种类别的脂质代谢物，如鞘磷脂、甘油磷脂、脂肪酸和甘油酯等。其中69个脂质分子有差异。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归的分析方法，在69个差异代谢物中随机组合，确定联合脂质标志物变量，即二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4。
用各脂质代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积得到每种代谢物的相对浓度值。二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4对应的内标是棕榈酸-16,16,16-d3，除以内标之后三个脂质代谢物在女性健康对照组的相对浓度值范围分别是：0.25-0.28，0.9-0.99，0.006-0.007，在非吸烟女性肺癌组的相对浓度值范围分别是：0.28-0.99，0.9-7.2，0.01-0.018。磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4对应的内标是磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0，除以内标之后三个脂质代谢物在女性健康对照组的相对浓度值范围分别是：0.001-0.009，0.126-0.143，0.03-0.04，在非吸烟女性肺癌组的相对浓度值范围分别是：0.01-0.015，0.096-0.11，0.04-0.11。定量分析二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4在健康对照和非吸烟女性肺癌患者中的相对浓度见图1。与健康对照相比，非吸烟女性肺癌患者的磷脂酰肌醇PI18:0/20:5降低，而二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FAC20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4浓度升高。利用SPSS数据统计软件，通过二元逻辑回归方法将这六种代谢物回归为联合标志物变量P，优选地，二元逻辑回归方程如下：
方程：P＝1/(1+e-(-1.599-13.594*a-11.626*b+304.987*c+226.46*d-0.62*f+64.864*g))，
其中a为血清样品中磷脂酰肌醇PI(18:0/20:5)的相对浓度，b为血清样品中二十碳二稀酸FA C20:2的相对浓度，c为血清样品中二十四碳四烯酸FA C24:4的相对浓度，d为血清样品中磷脂酰胆碱PC 20:1/22:6的相对浓度，f为血清样品中二十碳四烯酸FA C20:4的相对浓度，g为血清样本中磷脂酰乙醇胺PE 18:0p/22:4的相对浓度，e是自然对数函数的底数。有时称它为欧拉数(Euler number)，其中*代表相邻数字与字母间相乘关系。
图2中，该联合标志物通过判别分析所得变量P在非吸烟女性肺癌病人中增高，将P变量用于区分非吸烟女性肺癌与健康对照时，该联合标志物变量的截点值设为0.51。ROC曲线下面积为0.85，灵敏度和特异性均达到75％(见图2)，显示出良好的分离效能。
另外，对该联合标志物对非吸烟女性早期肺癌患者的诊断效果也进行分析。上述非吸烟女性肺癌患者中包含了0期、I期、II期早期肺癌共30例，定量分析组合脂质标志物的在健康对照和非吸烟女性早期肺癌中的相对浓度。与健康对照相比，早期肺癌患者也表现为磷脂酰肌醇PI18:0/20:5降低，二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4浓度升高(见图3)。将早期肺癌患者这六种脂质的浓度代到回归方程中计算概率，同样用截点值0.51对其判别，ROC分析的曲线下面积为0.88，敏感度和特异性分别为80％和86％，结果显示该标志物组合对非吸烟女性早期肺癌具有良好的判别能力(见图4)，且具有较好的灵敏度和特异性。
本发明所述试剂盒在非吸烟女性肺癌的诊断中具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明还可以应用于非吸烟女性早期肺癌的临床诊断，灵敏度和特异性好。综上，本发明具有较高的开发价值。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权力要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (7)

1.一种用于诊断非吸烟女性肺癌的联合生物标志物，包括：二十碳二烯酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4。
2.一种权利要求1所述的联合生物标志物在制备用于诊断受试者或患者中的非吸烟女性肺癌的试剂盒或检测试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述非吸烟女性肺癌是指不吸烟的女性且患有肺癌的受试者。
4.根据权利要求2所述的应用，所述试剂盒或检测试剂，包括标准品、血清样品提取溶液、甲基叔丁基醚、超纯水、检测所述联合生物标志物的浓度所需的内标、色谱柱和洗脱液：
（1）标准品：包含二十碳二稀酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FAC24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4，用于定性；
（2）所述提取溶液是包含内标4-7 μg/mL棕榈酸-16,16,16-d3 和2-5 μg/mL磷脂酰乙醇胺PE 15:0/15:0的甲醇溶液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
色谱柱为：Waters BEH C8柱, 2.1 mm × 100 mm, 1.7µm；洗脱溶液：流动A相为体积比为7:3-5:5的乙腈/水溶液，流动B相为体积比为9:1-8:2的异丙醇/乙腈溶液，流动A相和流动B相中均含终浓度5-12 mmol/L乙酸铵作为流动相添加剂。
6.一种诊断受试者或患者中非吸烟女性肺癌的诊断试剂盒，
所述试剂盒包含标准品，标准品为：二十碳二烯酸FA C20:2，二十碳四烯酸FA C20:4，二十四碳四烯酸FA C24:4，磷脂酰胆碱PC20:1/22:6，磷脂酰肌醇PI18:0/20:5和磷脂酰乙醇胺PE18:0p/22:4。
7.按照权利要求6所述的诊断试剂盒，还包括含内标的提取溶液、甲基叔丁基醚及超纯水：所述提取溶液是包含内标4-7 μg/mL棕榈酸-16,16,16-d3 和2-5 μg/mL磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0的甲醇溶液。
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