CN114544848B - 一种用于诊断卵巢上皮癌的血清脂质标志物组合物及试剂盒和其与应用 - Google Patents
一种用于诊断卵巢上皮癌的血清脂质标志物组合物及试剂盒和其与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的血清脂质代谢物组合及其作为标志物在制备卵巢上皮癌诊断试剂盒中的用途。所述血清脂质代谢物组合包括:神经酰胺Cerd18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51。该血清脂质代谢物的组合可用于卵巢上皮性癌患者的辅助诊断,具有检测成本低,重复性好,较高的灵敏度和特异性的特点。同时,该脂质代谢物组合对早期卵巢上皮性癌的诊断也有良好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的血清联合标志物在上皮性卵巢癌诊断中的应用。它属于分析化学、临床医学和医学领域。
背景技术
卵巢癌是世界上发病率仅次于宫颈癌,子宫内膜癌和子宫体癌的妇科恶性肿瘤,但其死亡率却居于第一位(文献1:Amilcar Bet al.,Endometriosis-associated ovariancancer,International Journal of Gynecological Cancer 28.7(2018)1251-1257.)。近年来,卵巢癌的发病率逐年提升,并且发病年龄有年轻化的趋势。卵巢癌具有多种亚型,其中卵巢上皮性癌占卵巢恶性肿瘤85%~90%(文献2:Williams et al.,DiseaseEtiology,Treatment,Detection,and Investigational Gene,Metabolite,and ProteinBiomarkers,Journal of Proteome Research 6.8(2007)2936-2962.)。卵巢上皮性癌的发病机制至今尚未完全明确,且疾病早期特异性症状缺乏,导致大部分卵巢上皮癌患者首次诊断时已处于晚期。研究表明,Ⅲ,Ⅳ期EOC患者5年相对生存率仅为15%~45%,而Ⅰ期卵巢癌的5年相对生存率可达90%(文献3:Hensleyet al.,A step forward for two-stepscreening for ovarian cancer,Journal of Clinical Oncology 28.13(2010)2128-2130.),因此,寻找早期诊断卵巢癌的方法或标记物,确定肿瘤分型、分期及预后评估是提高卵巢上皮癌患者五年生存率的研究重点。然而,目前基于阴道超声和血清癌抗原125水平的肿瘤筛查仍具有较高的误诊率(文献4:Screening for Ovarian Cancer:U.S.Preventive Services Task Force Reaffirmation Recommendation Statement,Annals of Internal Medicine 157.12(2012)),而其他报道的包括抗原抗体类,激素类,酶类和肽类等潜在卵巢癌生物标志物缺乏大规模样本验证,尚不能应用于临床卵巢上皮性癌的早期检测。临床迫切需要应用代谢生物标志物对高危人群早期卵巢上皮性癌进行检测。
脂质代谢紊乱是肿瘤发生的特征之一,脂质组学是研究病理变化和筛选疾病诊断生物标志物的一个有前途的工具。前人研究表明,卵巢癌患者也存在一定的脂质代谢紊乱。研究表明甘油磷脂、鞘磷脂、神经酰胺和三酰甘油酯等脂质类别在卵巢癌中有显著变化(文献5:Yan Houetal.,Differential plasma lipids profiling and lipid signatures asbiomarkers in the early diagnosis of ovarian carcinoma using UPLC-MS,Metabolomics 12.2(2016)18;文献6;Braicu et al.,High-grade ovarian serouscarcinoma patients exhibit profound alterations in lipid metabolism,Oncotarget 8.61(2017)102912-102922.;文献7:Zhaoetal.,High resolution massspectrometry coupled with multivariate data analysis revealing plasmalipidomic alteration in ovarian cancer in Asian women,Talanta theInternational Journal of Pure&Applied Analytical Chemistry(2016))。然而,很少有研究发现合适的生物标志物可用于卵巢癌诊断的临床试验。对卵巢上皮性癌患者的脂质组学研究和标志物筛查的研究不足,仍需进行全面深入的研究。
本发明利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对卵巢上皮性癌患者,其中包括女性健康对照,良性卵巢癌患者及卵巢上皮癌患者(含早期卵巢上皮癌患者)的血清进行非靶向脂质组学分析。应用二元逻辑回归的分析方法,筛选出区分卵巢上皮性癌与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)的潜在组合生物标志物,包括神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.5074,该组合标志物可以有效诊断受试者中卵巢上皮性癌,且对早期卵巢上皮性癌诊断也有较好的效果。
发明内容
本发明的目的是针对卵巢癌,尤其是卵巢上皮性癌,包括早期卵巢上皮性癌诊断的临床实际问题,提供一种可用于卵巢上皮性癌诊断的新型脂质代谢物联合生物标志物,并提供可用于上述组合的脂质代谢物的分析检测方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
(1)利用高效液相色谱-质谱联用的脂质组学技术对卵巢上皮性癌患者,其中包括女性健康对照,良性卵巢癌患者及卵巢上皮癌患者(含早期卵巢上皮癌患者)的血清进行了脂质组学分析。
基于超高效液相色谱质谱的脂质组学分析方法如下:
液相色谱条件:脂质分离系统为Waters ACQUITY超高效液相色谱系统(UPLC)(Waters,Milford,MA),采用反相BEH-C8色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters,Milford,m A,U S.A.)。流速设定为0.30mL/min。柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃。洗脱溶液为:流动相A:乙腈/水=6:4(v/v);流动相B:异丙醇/水=9:1(v/v),流动相A、B中皆含10mmol/L乙酸铵。
质谱条件:质谱仪为AB SCIEX Triple TOF 5600系统(AB SCIEX,Framingham,MA)。分别采用电喷雾电离正负离子模式检测,扫描范围:m/z150-1600。质谱仪的工作参数如下:离子喷射电压5500v(ESI±);去聚电压100v(ESI±);碰撞能10v(ESI±);界面加热器温度500℃(ESI±)。脂质代谢物的定量:用各脂质代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积得到每种代谢物的相对浓度值。其中神经酰胺Cer d18:1/16:0对应的内标是神经酰胺Cer d18:1/17:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1对应的内标是磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0,未知代谢物m/z=633.51对应的内标是溶血磷脂酰胆碱19:0。
(2)利用SPSS数据统计软件,采用二元逻辑回归的分析方法,在候选差异脂质中随机组合,确定联合标志物变量组合。用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线来评价联合标志物的灵敏度和特异性。综合考虑高灵敏度和高特异性,确定联合标志物为神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51。
(3)联合标志物在卵巢上皮性癌诊断中的使用:相比于非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照),卵巢上皮性癌患者的磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1降低,而神经酰胺Cer d18:1/16:0和未知代谢物m/z=633.51浓度升高。利用SPSS数据统计软件,通过二元逻辑回归方法将这三种代谢物回归为联合标志物变量P,优选地,二元逻辑回归方程如下:
P=1/(1+e-(2.578-26.36*a-9.452*b+27.647*c)),
其中a为血清样品中神经酰胺Cer d18:1/16:0的相对浓度,b为血清样品中磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1的相对浓度,c为血清样品中未知代谢物m/z=633.51的相对浓度,其中*代表相乘关系。
所得变量P在卵巢上皮性癌病人中降低,该变量的值可用于辅助诊断卵巢上皮性癌。基于试验所涉及的样本,根据诊断灵敏度和特异性最佳原则,该联合标志物变量的截点值设为0.53,低于截点值的女性受试者则有可能为卵巢上皮性癌,ROC分析显示出该标志物具有良好的判别效能。
(4)联合标志物在早期卵巢上皮性癌诊断中的使用:早期卵巢上皮性癌属于恶性卵巢肿瘤,与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)相比,早期卵巢上皮性癌患者也表现为磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1降低,神经酰胺Cer d18:1/16:0和未知代谢物m/z=633.51浓度升高。因此,该组联合标志物在早期卵巢上皮性癌和非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)的区分中也表现出良好的诊断能力,将早期卵巢上皮性癌患者这三种脂质的浓度代到上述回归方程中,同样用截点值0.53对其判别,ROC分析显示具有良好的判别能力。
(5)本发明具有的效果是:血清样品中脂质分子神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51可以联合用于区分卵巢上皮性癌与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照),对早期卵巢上皮性癌和非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)也有很好的区分效果,且具有较高特异性,较高灵敏度的特征。对指导临床治疗以及降低卵巢癌癌死亡率具有非常重要的现实意义。
所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的三种脂质代谢物,具有检测成本低,重复性好,较高的灵敏度和特异性的的特点。本发明可应用于辅助卵巢上皮性癌的临床诊断,同时也对早期卵巢上皮性癌具有良好的诊断效能,具有较好的应用前景。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更突出,其中:
图1.在非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)及卵巢上皮性癌患者中脂质分子神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51的含量变化(均值±标准误差)。在女性健康对照与卵巢上皮性癌患者的对比中,*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001;在良性卵巢癌患者与卵巢上皮性癌患者的对比中,#代表p<0.05,##代表p<0.01,###代表p<0.001。
图2.联合标志物区分卵巢上皮性癌患者与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)的ROC曲线。
图3.在非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)及早期卵巢上皮性癌患者中脂质分子神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51的含量变化(均值±标准误差)。在女性健康对照与卵巢上皮性癌患者的对比中,*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001;在良性卵巢癌患者与卵巢上皮性癌患者的对比中,#代表p<0.05,##代表p<0.01,###代表p<0.001。
图4.联合标志物区分早期卵巢上皮性癌患者与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)的ROC曲线。
图5.质量控制样本中收集的未知代谢物m/z=633.51的提取色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.血清样本的收集
在采样前,所有纳入研究的志愿者均签署了知情同意书。采集50例女性健康对照,41例良性卵巢癌和62例卵巢上皮癌患者(包括I期、II期及III-IV期卵巢上皮性癌)的空腹血清。所有人均禁食8小时以上,采集空腹血。采血后,分离血清,并冻存于-80℃冰箱保存。
2.分析方法
2.1血清样本的预处理
血样在4℃下解冻,取40μL血清样本,加入300μL含内标0.17μg/mL神经酰胺Cerd18:1/17:0,0.67μg/mL磷脂酰乙醇胺PE 15:0/15:0和0.33μg/mL溶血磷脂酰胆碱19:0的甲醇溶液,然后旋转1分钟,再加入1mL甲基叔丁基醚,以充分提取脂质。之后加入300μL水,获得混合物,进行相分离,将混合物在10000g,4℃条件下离心10分钟。然后移取上清液,并分成两等份(每份400μL),冷冻干燥。在LC-MS脂质组分分析之前,冻干样品在40μL的CH2Cl2/MeOH(2:1,v/v)的混合溶剂中重新溶解,并进一步用160μL含有5mM醋酸铵的ACN/IPA/H2O(65:30:5,v/v/v)稀释后在负离子模式下进样分析。然后取80μL负离子模式下的进样溶液,再加入80μL的含有5mM醋酸铵的ACN/IPA/H2O(65:30:5,v/v/v)的稀释剂,然后再在正离子模式下进样分析。
2.2超高效液相色谱质谱分析
(1)液相色谱条件:脂质分离系统为Waters ACQUITY超高效液相色谱系统(UPLC)(Waters,Milford,MA),采用反相BEH-C8色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters,Milford,m A,U S.A.)。流速设定为0.26mL/min。柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃。洗脱溶液为:流动相A,乙腈/水=6:4(v/v);流动相B,异丙醇/水=9:1(v/v),流动相A、B中皆含终浓度10mM乙酸铵。具体洗脱程序为:洗脱梯度起始于50%B(v/v),维持1.5分钟后在7.5分钟内线性升至85%B,在0.1分钟内线性升至100%B,维持2分钟然后回到初始比例50%B平衡2分钟。
(2)质谱条件:质谱仪为AB SCIEX Triple TOF 5600系统(AB SCIEX,Framingham,MA)。分别采用电喷雾电离正负离子模式检测,扫描范围:m/z150-1600。质谱仪的工作参数如下:离子喷射电压5500v(ESI±);去聚电压100v(ESI±);碰撞能10v(ESI±);界面加热器温度500℃(ESI±)。
2.3血清测试结果及辅助诊断方法
利用上述高效液相色谱-质谱联用技术的分析条件对卵巢上皮性癌患者(其中包括早期卵巢上皮性癌),良性卵巢癌患者及女性健康对照的血清进行了脂质组学分析。在正负离子模式下应用80%规则,共匹配967个正离子特征和950个负离子特征。根据保留时间,和一级二级质谱信息,发现并定性了436个如鞘磷脂,甘油磷脂,脂肪酸,神经酰胺和甘油酯等类别的脂质代谢物。对967个正离子特征和950个负离子特征在卵巢上皮性癌患者和非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)进行非参数检验,选择前80个P值最低的差异代谢物作为潜在的卵巢上皮性癌的诊断生物标志物。然后计算差异倍数(卵巢上皮性癌患者/非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)),保留差异倍数小于0.7或大于1.1的代谢物,共46个。然后分别计算该46个代谢物用于区分卵巢上皮性癌患者和非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)的AUC值,保留AUC值超过0.75的代谢物,共22个。使用数据统计软件SPSS,通过二元逻辑回归的分析方法,在22个差异代谢物中随机组合,选择AUC值最大的组合,确定联合脂质标志物变量,即神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51。
用各脂质代谢物在色谱中的峰面积除以相应内标的峰面积得到每种代谢物的相对浓度值。
神经酰胺Cer d18:1/16:0对应的内标是神经酰胺Cer d18:1/17:0,除以内标之后在女性健康对照组的相对浓度值范围是:大于0.14且小于等于0.15,在良性卵巢癌组的相对浓度值范围是:大于0.15且小于等于0.16,在卵巢上皮性癌组的相对浓度值范围是:大于0.16且小于等于0.17。
磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1对应的内标是磷脂酰乙醇胺PE15:0/15:0,除以内标之后在女性健康对照组的相对浓度值范围是:0.37-0.40,在良性卵巢癌组的相对浓度值范围是:0.31-0.33,在卵巢上皮性癌组的相对浓度值范围是:0.23-0.26。
未知代谢物m/z=633.51对应的内标是溶血磷脂酰胆碱19:0,除以内标之后在女性健康对照组的相对浓度值范围是:0.015-0.019,在良性卵巢癌组的相对浓度值范围是:0.026-0.038,在卵巢上皮性癌组的相对浓度值范围是:0.047-0.064。
定量分析神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1和未知代谢物m/z=633.51在健康对照和卵巢上皮性癌患者中的相对浓度见图1。与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)相比,卵巢上皮性癌患者的磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1降低,而神经酰胺Cer d18:1/16:0和未知代谢物m/z=633.51浓度升高。
利用SPSS数据统计软件,通过二元逻辑回归方法将这三种代谢物回归为联合标志物变量P,优选地,二元逻辑回归方程如下:
P=1/(1+e-(2.578-26.36*a-9.452*b+27.647*c)),
其中a为血清样品中神经酰胺Cer d18:1/16:0的相对浓度,b为血清样品中磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1的相对浓度,c为血清样品中未知代谢物m/z=633.51的相对浓度,其中*代表相乘关系。
图2中,该联合标志物通过判别分析所得变量P在卵巢上皮性癌病人中降低,将P变量用于区分卵巢上皮性癌与健康对照时,该联合标志物变量的截点值设为0.53。ROC曲线下面积为0.83,灵敏度和特异性均达到75%(见图2),显示出良好的分离效能。随机抽取三个卵巢上皮性癌样本计算P值,得到的结果分别为0.50,0.23,0.07,都小于截点值0.53,显示出该联合标志物对卵巢上皮性癌良好的诊断效果。
另外,对该联合标志物对早期卵巢上皮性癌患者的诊断效果也进行分析。上述卵巢上皮性癌患者中包含了I期、II期早期肺癌共25例,定量分析组合脂质标志物的在非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)和早期卵巢上皮性癌中的相对浓度。与非卵巢上皮性癌患者(良性卵巢癌患者+女性健康对照)相比,早期卵巢上皮癌患者也表现为磷脂酰乙醇胺PE 16:0p_18:1降低,神经酰胺Cer d18:1/16:0和未知代谢物m/z=633.51浓度升高(见图3)。将早期卵巢上皮性癌患者这三种脂质的浓度代到回归方程中计算概率,同样用截点值0.53对其判别,ROC分析的曲线下面积为0.949,敏感度和特异性分别为92%和80%。随机抽取三个早期卵巢上皮性癌样本计算P值,得到的结果分别为0.21,0.40,0.14,都小于截点值0.53,结果显示该标志物组合对早期卵巢上皮性癌具有良好的判别能力(见图4),且具有较好的灵敏度和特异性。
实施例2
1.质量控制样本的制备
取实施例1中50例女性健康对照,41例良性卵巢癌和62例卵巢上皮癌患者(包括I期、II期及III-IV期卵巢上皮性癌)的空腹血清各10μL,混匀,制备成为质量控制样本并冻存于-80℃冰箱保存。
2.未知代谢物m/z=633.51的获取
2.1人血清样本预处理
取40μL质量控制血清样本,加入300μL的甲醇溶液,然后涡旋1分钟,再加入1mL甲基叔丁基醚,以充分提取脂质;之后加入300μL水,获得混合物,进行相分离,将混合物在10000g,4℃条件下离心10分钟;然后移取400μL上清液,冷冻干燥;在LC-MS脂质组分分析之前,冻干样品在40μL的CH2Cl2/MeOH(2:1,v/v)的混合溶剂中重新溶解,并进一步用160μL含有5mM醋酸铵的ACN/IPA/H2O(65:30:5,v/v/v)稀释后在负离子模式下进样分析;
2.2液相色谱分离
采用反相BEH-C8色谱柱,流速设定为0.30mL/min;柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃;洗脱溶液为:流动相A,乙腈/水=6:4(v/v);流动相B,异丙醇/水=9:1(v/v),流动相A、B中皆含终浓度为10mmol/L的乙酸铵;具体洗脱程序为:洗脱梯度起始于50%B(v/v),维持1.5分钟后在7.5分钟内线性升至85%B,在0.1分钟内线性升至100%B,维持2分钟然后回到初始比例50%B平衡2分钟;收集1.15-1.30分钟的色谱流出组分,即为未知代谢物m/z=633.51,冷冻干燥。在下一步LC-MS分析前,冻干样品在40μL的CH2Cl2/MeOH(2:1,v/v)的混合溶剂中重新溶解,并进一步用160μL含有5mM醋酸铵的ACN/IPA/H2O(65:30:5,v/v/v)稀释后在负离子模式下进样分析;
3.未知代谢物m/z=633.51的色谱质谱行为分析
3.1液相色谱分析条件
用反相BEH-C8色谱柱,流速设定为0.30mL/min;柱温和样品室温度分别设定为55℃和10℃;洗脱溶液为:流动相A,乙腈/水=6:4(v/v);流动相B,异丙醇/水=9:1(v/v),流动相A、B中皆含终浓度为10mmol/L的乙酸铵;具体洗脱程序为:洗脱梯度起始于50%B(v/v),维持1.5分钟后在7.5分钟内线性升至85%B,在0.1分钟内线性升至100%B,维持2分钟然后回到初始比例50%B平衡2分钟;
3.2质谱条件
质谱仪为AB SCIEX Triple TOF 5600系统(AB SCIEX,Framingham,MA)。采用电喷雾电离负离子模式检测,扫描范围:m/z150-1600。质谱仪的工作参数如下:离子喷射电压5500v(ESI-);去聚电压100v(ESI-);碰撞能10v(ESI-);界面加热器温度500℃(ESI-)。
4.未知代谢物m/z=633.51的色谱馏分分析结果
利用上述高效液相色谱分离条件对卵巢上皮性癌患者(其中包括早期卵巢上皮性癌),良性卵巢癌患者及女性健康对照的血清质量控制样本进行了未知代谢物m/z=633.51的馏分获取。在LC-MS上重新检测获取的未知代谢物m/z=633.51,提取核质比m/z=633.51的提取色谱图(图5),保留时间为1.213分钟,精确质量数m/z=633.5074.
本发明所述试剂盒在卵巢上皮性癌的诊断中具有检测成本低,稳定性好的特点。同时,本发明还可以应用于早期卵巢上皮性癌癌的临床诊断,灵敏度和特异性好。综上,本发明具有较高的开发价值。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权力要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (5)
1.血清脂质代谢物组合物,其中所述血清脂质代谢物组合包括:神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE P-16:0/18:1和未知代谢物m/z=633.51;
未知代谢物m/z=633.51的获取过程为,
(1)人血清样本的预处理:取40μL血清样本,加入300 μL含内标0.17μg/mL神经酰胺Cerd18:1/17:0,0.67μg/mL磷脂酰乙醇胺PE 15:0/15:0和0.33μg/mL溶血磷脂酰胆碱19:0的甲醇溶液,然后旋转1分钟,再加入1 mL甲基叔丁基醚,以充分提取脂质;之后加入300 μL水,获得混合物,进行相分离,将混合物在10000 g,4℃条件下离心10分钟; 然后移取上清液,并分成两等份,冷冻干燥;在LC-MS脂质组分分析之前,冻干样品在40µL的体积比2:1的CH2Cl2/MeOH的混合溶剂中重新溶解,并进一步用160µL含有5 mM醋酸铵的体积比为65:30:5的ACN/IPA/H2O稀释后在负离子模式下进样分析,然后取80µL负离子模式下的进样溶液,再加入80µL的含有5 mM醋酸铵的体积比为65:30:5的ACN/IPA/H2O的稀释剂,然后再在正离子模式下进样分析;
(2)液相色谱条件:采用反相BEH-C8色谱柱,流速设定为0.30 mL/min;柱温和样品室温度分别设定为55°C和10°C;洗脱溶液为:流动相A,乙腈/水v/v=6:4 ;流动相B,异丙醇/水v/v=9:1,流动相A、B中皆含终浓度为10mmol/L的乙酸铵;具体洗脱程序为:洗脱梯度起始于体积比50%B,维持1.5分钟后在7.5分钟内线性升至85%B,在0.1分钟内线性升至100%B,维持2分钟然后回到初始比例50%B平衡2分钟;收集1.15-1.30分钟的色谱流出组分,即为未知代谢物m/z=633.51。
2.一种权利要求1所述的血清脂质代谢物组合物在制备用于诊断受试者或患者中的早期卵巢上皮性癌的试剂盒或在制备用于诊断受试者或患者中的早期卵巢上皮性癌的诊断试剂中的应用,所述血清脂质代谢物组合包括:神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE16:0/18:1和未知代谢物m/z=633.51;
所述试剂盒或诊断试剂包括含有内标的提取溶液:提取溶液是包含内标0.17 μg/mL神经酰胺Cer d18:1/17:0,0.67 μg/mL磷脂酰乙醇胺PE 15:0/15:0和0.33 μg/mL溶血磷脂酰胆碱19:0的甲醇溶液,甲基叔丁基醚及超纯水;
采用所述诊断试剂或试剂盒对权利要求1所述的各种血清脂质代谢物检测,步骤包括:
(1)通过检测待检女性的血清样本中神经酰胺Cer d18:1/16:0,磷脂酰乙醇胺PE(P-16:0/18:1)和未知代谢物m/z=633.51的相对浓度,根据上述三种代谢物的相对浓度值,代入方程中求算P值,再基于上述确定的截点值诊断卵巢上皮性癌患者;
早期卵巢上皮性癌为I期及II期卵巢上皮性癌其中一种;
区分卵巢上皮性癌患者及非卵巢上皮性癌患者即良性卵巢癌患者+女性健康对照的逻辑回归判别公式为:
P=1/(1+e-(2.578-26.36*a-9.452*b+27.647*c)),
其中a为血清样品中神经酰胺Cer d18:1/16:0的相对浓度,b为血清样品中磷脂酰乙醇胺PE 16:0/18:1的相对浓度,c为血清样品中未知代谢物m/z=633.51的相对浓度;其中*代表相乘关系;
其中截点值为0.53,小于该截点值的P值指示所述受试者患有上皮性卵巢癌,大于或等于表明受试者未患有上皮性卵巢癌。
3.根据权利要求2所述的应用,还包括洗脱液,为:流动A相体积比为7:3-5:5乙腈/水溶液,流动B相体积比为9:1-8:2的异丙醇/乙腈溶液,流动A相和流动B相中均含终浓度10mmol/L乙酸铵作为流动相添加剂。
4.根据权利要求2所述的应用,所述诊断试剂或试剂盒中的试剂,包括血清样品提取溶液和洗脱液;所述提取溶液是包含内标0.17μg/mL神经酰胺Cer d18:1/17:0,0.67μg/mL磷脂酰乙醇胺PE 15:0/15:0和0.33μg/mL溶血磷脂酰胆碱19:0的甲醇溶液,甲基叔丁基醚及超纯水;
洗脱液,为:流动A相体积比为7:3-5:5乙腈/水溶液,流动B相体积比为9:1-8:2的异丙醇/乙腈溶液,流动A相和流动B相中均含终浓度10 mmol/L乙酸铵作为流动相添加剂。
5.根据权利要求2所述的应用,
首先用血清样品提取溶液处理来自受试者的血清样本,沉淀蛋白后,进一步采用甲基叔丁基醚提取脂质代谢物,加水相分离,随后进行冻干,复溶后进行基于液相色谱-质谱的脂质组学分析;
采用洗脱液进行色谱洗脱,色谱柱:Waters BEH C8柱, 2.1 mm × 100 mm, 1.7µm。
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