CN112903885B - 一种筛查糖尿病的联合型代谢标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及空腹血清中代谢物：半乳糖，1,5‑脱水山梨糖醇，N‑乙酰葡糖胺，2‑羟基丁酸作为组合标志物在制备用于快速诊断受试者中糖尿病患者的试剂盒中的新应用。通过检测来自受试者空腹血清样本中的上述四种代谢物的浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量P，以及判断截点值，判断受试者是否患有糖尿病。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测，本发明涉及的几种小分子代谢物，具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可应用于辅助快速筛查糖尿病人群中得到应用，且可与传统临床指标空腹血糖相互补充的特点，具有较好的应用前景。

Description

一种筛查糖尿病的联合型代谢标志物的应用及其试剂盒
技术领域
本发明涉及已知代谢物的新用途。本发明涉及血清中的半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸组合用作为诊断糖尿病的组合标志物，并涉及检测筛查受试人群中糖尿病患者的试剂盒。
背景技术
糖尿病是一个全球性的健康问题，其发病率呈现逐年上升的趋势而诊断率却不足50％。糖尿病患者由于胰岛素功能或分泌异常，从而引发各种各样的并发症。中国是全世界糖尿病患者最多的国家，若不能及时对其进行干预和治疗则会加大国家公共卫生健康系统的负担。目前，空腹血糖和口服75g葡萄糖耐量(OGTT)测试是诊断糖尿病的金标准。但是由于OGTT测试需要在2小时内每隔15-30分钟进行一次血样的采集、检测，所以整个测试耗时较长，过程繁琐，不适合于大基数人群中糖尿病患者的快速筛查和诊断。因此开发一种快速、简便的临床诊断新方法对于提高患者生存质量和降低并发症、死亡率具有重要意义。
代谢组学是继基因组学与蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新兴学科，旨在对生物体内所有小分子代谢物进行定性、定量分析，寻找代谢物与生理、病理变化的相对关系。代谢组学作为一个新兴的工具，已经被广泛运用在不同的疾病研究中，如糖尿病，肝病，肾病，心血管病等。由于单一代谢物受到外界的干扰和影响较大，所以从血清代谢物中筛选多种代谢物组合成联合型标志物能够增加判断稳定性和准确率。
本发明利用液相色谱串联三重四级杆质谱检测糖尿病患者和正常人的空腹血清样本中代谢谱，筛选出半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸组合，作为一种联合型代谢标志物判别受试者中的糖尿病患者。目前尚无将这四种血清代谢物联合作为糖尿病诊断的报道。
发明内容
本发明的目的是针对糖尿病人群快速筛查困难的临床实际问题，提供了一种代谢物组合用于糖尿病诊断中的应用，可提供用于上述代谢物组合的检测方法如下。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
(1)试剂盒组成：
a.标准品：半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，所述标准品分别用于对应的空腹血清中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定性和定量标准曲线；
b.用于预处理来受试者的空腹血清样本的提取液：含内标浓度为0.1-0.5μg/mL马尿酸-D5，1.0-2.0μg/mL谷氨酰胺-D5，0.1-1.0μg/mL苯丙氨酸-D5，0.1-0.5μg/mL胆碱-D4的甲醇/乙腈溶液。
c.洗脱液：流动相A为含体积百分比0.01-1.0％乙酸和5-15mM乙酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积百分比为80:20-95:5，流动相B为含体积百分比0.01-1.0％乙酸的5-15mM乙酸铵水溶液。(2)标准品预处理方法：
将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸标准品配成一系列100μg/mL-0.1ng/mL浓度的混标，可以设置10-20个不同浓度点；混标溶液加入200-400μL提取液，离心后吸取200-400μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥，然后用体积百分比为1:4-2:1的乙腈/水复溶。
(3)血样预处理方法：
血样在4℃解冻，取50-100μL血样样本加入1.5mL Eppendorf管中，加入200-400μL含内标的甲醇或乙腈溶液，涡旋30-90s混合均匀，沉淀蛋白。采用离心机过滤，转速为14000rpm，离心时间为5-15min去除蛋白。离心之后吸取200-400μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥。然后用体积百分比为1:4-2:1的乙腈/水复溶。
(4)分离系统：
超高液相色谱系统，柱温25-60℃；柱流量0.22-1.0mL/min，进样室温度为4-10℃；进样体积为1-10μL。对于半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的分离，色谱柱为Merck ZIC-cHilic色谱柱。
(5)检测系统：
检测器采用三重四级杆质谱质谱。负离子质谱模式下检测的离子对：半乳糖为179.1-59.0，1,5-脱水山梨糖醇为163.1-100.8，2-羟基丁酸为103.0-56.9，谷氨酰胺-D5为150.1-131.1，苯丙氨酸-D5为169.1-108.1，马尿酸-D5为183.1-82.0；正离子质谱模式下检测的离子对：N-乙酰葡糖胺为222.1-137.9，胆碱-D4为108.1-60.2。
(6)代谢物浓度计算：
将复溶后的不同浓度的标准品混合标样和血样样本直接转移到液相色谱的自动进样器中进行液相色谱质谱联用的检测分析。其中谷氨酰胺-D5为半乳糖的内标，苯丙氨酸-D5为1,5-脱水山梨糖醇的内标，胆碱-D4为N-乙酰葡糖胺的内标，马尿酸-D5为2-羟基丁酸的内标。采用内标定量法得到各个代谢物的定量标准曲线。实际血样样本根据标准品的保留时间，特征离子鉴定出样本其中的半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，并提取其洗脱峰强度，经内标校正后代入到定量标准曲线中计算得到血清样本中各代谢物的定量浓度。
(7)代谢物二元逻辑回归分析：
将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸在SPSS软件进行进行二元逻辑回归得到方程1如下：
P1＝1/(1+e–(0.034a-0.011b+2.666c+0.068d-14.448))
其中a、b、c、d别为半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的浓度(μg/mL)，e为欧拉数，自然对数函数的底数。所得变量P1在有糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。本发明确定的该联合标志物的对受试者人群中是否有糖尿病的最佳截点值(cut-off值)设为0.553。对于受试者人群，P值高于等于该截点值则判断可能为糖尿病，低于该截点值则表明暂无糖尿病。也可以根据实验者的实验结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据联合标志物变量P1值作受试者工作曲线(ROC曲线)。ROC曲线的纵坐标为敏感度，横坐标为(1-特异性)，计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的P1值即为最佳截点值。该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。
(8)代谢物结合临床空腹血糖二元逻辑回归分析：
将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸和空腹血糖进行二元逻辑回归得到方程2如下：
P2＝1/(1+e–(0.019a-0.026b+2.972c+0.059d+1.824e-19.064))
其中a、b、c、d、e别为半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定量浓度(μg/mL)和空腹血糖的浓度(mmol/L)，e为欧拉数，自然对数函数的底数。所得变量P2在有糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。本发明确定的该联合标志物的对受试者人群中是否有糖尿病的最佳截点值(cut-off值)设为0.743。对于受试者人群，P2值高于等于该截点值的则判断可能为糖尿病，而低于该截点值则表明目前暂无糖尿病。也可以根据实验者的实验结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据联合标志物变量P2值作受试者工作曲线(ROC曲线)。ROC曲线的纵坐标为敏感度，横坐标为(1-特异性)，计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的P2值即为最佳截点值。该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。
所建立组合代谢标志物可与空腹血糖互补(见表1)。第一组测试集样本的组合代谢标志物的AUC＝0.882，敏感度为0.923，特异性为0.708。组合代谢物标志物结合空腹血糖的AUC＝0.916，敏感度为0.842，特异性为0.877。第二组验证集样本的组合代谢标志物的AUC＝0.883，敏感度为0.923，特异性为0.710。组合代谢物标志物结合空腹血糖的AUC＝0.931，敏感度为0.855，特异性为0.871。
本发明涉及试剂盒通过检测来自受试者的空腹血清样本中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸联合标志物的定量浓度，基于二元逻辑回归计算所述联合标志物变量P1，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有糖尿病。也可将代谢标志物定量浓度与空腹血糖结合，基于二元逻辑回归计算代谢标志物和空腹血糖联合标志物变量P2，在基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有糖尿病。
所述试剂盒具有检测成本低，特异性和敏感度高的特点。上述四种小分子代谢物的联合使用，可以在辅助诊断受试者人群中糖尿病得到应用，且与空腹血糖指标相互补，若与之结合将进一步提升诊断效果。
附图说明：
图1.测试集中健康对照组和糖尿病患病组(包含糖尿病前期和糖尿病)中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸在组间的定量浓度变化(均值±标准偏差)。*表示两组间进行非参数比较具有显著性差异，即p<0.05。
图2.联合标志物以及联合标志物结合空腹血糖在判别第一批受试人群中有无糖尿病的ROC曲线。
图3.验证集中健康对照组和糖尿病患病组(包含糖尿病前期和糖尿病)中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸在组间的定量浓度变化(均值±标准偏差)。*表示两组间进行非参数比较具有显著性差异，即p<0.05。
图4.联合标志物以及联合标志物结合空腹血糖在判别验证集中受试人群有无糖尿病的ROC曲线。
具体实施方式
(1)试剂盒组成：
a.标准品：半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，所述标准品分别用于对应的空腹血清中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定性和定量标准曲线；
b.用于预处理来受试者的空腹血清样本的提取液：含内标浓度为0.19μg/mL马尿酸-D5，1.56μg/mL谷氨酰胺-D5，0.47μg/mL苯丙氨酸-D5，0.31μg/mL胆碱-D4的甲醇溶液。
c.洗脱液：流动相A为含体积百分比0.02％乙酸和10mM乙酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积百分比为95:5，流动相B为含体积百分比0.02％乙酸的10mM乙酸铵水溶液。
(2)标准品预处理方法：
将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸标准品配成一系列50μg/mL-0.1ng/mL浓度的混标，具体浓度点设置为50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2ng/mL，1ng/mL，0.5ng/mL，0.2ng/mL，0.1ng/mL；混标溶液加入200μL提取液，离心后吸取200μL上清于1.5mLEppendorf管中进行冷冻干燥，然后用体积百分比为1:1的乙腈/水复溶。
(3)血样预处理方法：
血样在4℃解冻，取50μL血样样本加入1.5mL Eppendorf管中，加入200μL含内标的甲醇溶液，涡旋60s混合均匀，沉淀蛋白。采用离心机过滤，转速为14000rpm，离心时间为15min去除蛋白。离心之后吸取200μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥。然后用体积百分比为1:1的乙腈/水复溶。
(4)分离系统：
超高液相色谱系统，柱温40℃；柱流量0.3mL/min，进样室温度为6℃；进样体积为1μL。对于半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的分离，色谱柱为MerckZIC-cHilic色谱柱。
(5)检测系统：
检测器采用三重四级杆质谱质谱。负离子质谱模式下检测的离子对：半乳糖179.1-59.0，1,5-脱水山梨糖醇163.1-100.8，2-羟基丁酸103.0-56.9，谷氨酰胺-D5150.1-131.1，苯丙氨酸-D5169.1-108.1，马尿酸-D5183.1-82.0；正离子质谱模式下检测的离子对：N-乙酰葡糖胺为222.1-137.9，胆碱-D4为108.1-60.2。
(6)代谢物浓度计算：
将复溶后的不同浓度的标准品混合标样和血样样本直接转移到液相色谱的自动进样器中进行液相色谱质谱联用的检测分析。其中谷氨酰胺-D5为半乳糖的内标，苯丙氨酸-D5为1,5-脱水山梨糖醇的内标，胆碱-D4为N-乙酰葡糖胺的内标，马尿酸-D5为2-羟基丁酸的内标。采用内标定量法得到各个代谢物的定量标准曲线。实际血样样本根据标准品的保留时间，特征离子鉴定出样本其中的半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，并提取其洗脱峰强度，经内标校正后代入到定量标准曲线中计算得到血清样本中各代谢物的定量浓度。
实施例1
1.血清样品收集
所有纳入研究的志愿者在血样收集前签署知情同意书。相同条件下采集一批血清样本作为测试集，包括65例健康人和221例糖尿病患者(其中，糖尿病前期113例，糖尿病108例)的空腹血清样本，置于-80℃冰箱保存备检。
2.分析方法
2.1血清样本预处理：
血清在4℃解冻，取50μL血清样本加入1.5mL Eppendorf管中，加入200μL含内标的甲醇提取液(含内标浓度为0.19μg/mL马尿酸-D5，1.56μg/mL谷氨酰胺-D5，0.47μg/mL苯丙氨酸-D5，0.31μg/mL胆碱-D4)，涡旋30s混合均匀，沉淀蛋白。采用离心机过滤(转速为14000rpm，时间为15min)的方式去除蛋白。离心之后吸取200μL上清于1.5mL Eppendorf管中进行冷冻干燥。然后用50μL乙腈:水＝1:1(v/v)复溶。
2.2超高液相色谱质谱分析
(1)液相色谱：色谱仪为岛津超高液相色谱(Shimadzu,Japan)；柱温40℃；流速0.3mL/min；分离检测时间为11min；进样室温度为6℃；Merck ZIC-cHilic色谱柱2.1mm×50mm,3.5μm，进样体积为1μL。流动相：A相为0.02％(v/v)乙酸的10mM乙酸铵95％(v/v)乙腈水溶液，B相为0.02％(v/v)乙酸的10mM乙酸铵水溶液；洗脱梯度为：0～6.0min，从95％A(v/v)梯度线性减少至45％A(v/v)，6.0～7.0min，保持45％A(v/v)，7.0～7.1min,从45％A(v/v)线性增加至95％A(v/v)，7.1～11min，维持95％A(v/v)的梯度平衡系统；
(2)质谱条件：AB SCIEX Q-trap 6500质谱正负离子模式下的喷雾电压分别为5.5kV和-4.5kV，离子源温度为500℃，鞘气流速为40(in arbitrary units)，辅助气1和2流速为50(in arbitrary units)，靶向扫描时间为0.8s，离子对检测窗口为1min。
3.血清测试结果及辅助诊断分析
定量分析半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸在正常对照和糖尿病患病组的血清中的定量浓度，结果如图1所示。与健康对照组相比，在糖尿病患者(包含糖尿病前期和糖尿病)的血清中半乳糖，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸含量显著上升，而血清中1,5-脱水山梨糖醇的含量显著下降。
使用数据统计软件SPSS，将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸输入到SPSS软件进行二元逻辑回归得到方程1如下：
P1＝1/(1+e–(0.034a-0.011b+2.666c+0.068d-14.448))
其中a、b、c、d别为半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的浓度(μg/mL)，e为欧拉数，自然对数函数的底数。所得变量P1在有糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病患者。
图2中，该联合标志物通过判断变量P1用于诊断糖尿病患者(糖尿病前期和糖尿病)与健康人时，得到ROC曲线的曲线下面积AUC值为AUC＝0.882。当灵敏度和特异性之和最大时，可获得当前最佳截点值，即0.553。敏感度为0.923，特异性为0.708。
将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸和空腹血糖进行二元逻辑回归得到方程2如下：
P2＝1/(1+e–(0.019a-0.026b+2.972c+0.059d+1.824e-19.064))
其中a、b、c、d、e别为半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定量浓度(μg/mL)和空腹血糖的浓度(mmol/L)，e为欧拉数，自然对数函数的底数。所得变量P2在有糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断受试者人群中的糖尿病。
图2中，该联合标志物通过判断变量P2用于诊断糖尿病患者(糖尿病前期和糖尿病)与健康人时，得到ROC曲线的曲线下面积AUC值为AUC＝0.916。当灵敏度和特异性之和最大时，可获得当前最佳截点值，即0.743。敏感度为0.842，特异性为0.877。该结果表明代谢标志物可与空腹血糖互补，增加诊断的特异性。
实施例2
1.血清样品收集，
所有纳入研究的志愿者在血样收集前签署知情同意书。相同条件下采集第二批血清样本作为验证集，包括31例健康人和117例糖尿病患者(其中，糖尿病前期58例，糖尿病59例)的空腹血清样本，置于-80℃冰箱保存备检。
2.分析方法
同实施例1
3.血清测试结果及辅助诊断方法
实施例2验证集的结果与实例1测试集结果一致。验证集结果如图3所示，采用实施例1中测试集构建的二元逻辑回归方程P1和P2，将半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定量浓度(μg/mL)和空腹血糖的浓度(mmol/L)分别代入对应的回归方程，其结果如图4和表1所示，其AUC、灵敏度及特异性均较高，组间判别效果较好。且测试集中该组合标志物和空腹血糖具有很好的互补性，联合使用时有助于提高诊断糖尿病的能力。
在测试集和验证集受试人群中ROC曲线结果显示组合标志物具有辅助诊断糖尿病的潜力，且与空腹血糖互补，其与空腹血糖进行联合诊断更有助于提高糖尿病的检测能力。
本发明涉及检测受试者中的糖尿病患者的试剂盒，通过检测来自受试者的空腹血清样品中上述联合标志物的定量浓度，基于SPSS软件得到的二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P值，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有糖尿病。所述试剂盒可实现高灵敏度，高通量快速检测本发明涉及的四种代谢标志物，具有检测成本低，重复性好等特点。本发明可应用于辅助快速筛查受试人群中糖尿病患者以及和传统的临床指标空腹血糖互补，具有较好的应用前景。
表1
Figure BDA0002300182100000091

Claims (2)

1.联合标志物在制备用于诊断糖尿病试剂盒中的用途，其中所述联合标志物包括半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸；所述试剂盒包括：
（1）标准品：半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，所述标准品分别用于血清中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定性和定量标准曲线；
（2）含内标的提取液：用于预处理来自受试者的空腹血清样本，为包含内标的甲醇溶液，其中内标的浓度为0.1-0.5μg/mL马尿酸-D5，1.0-2.0μg/mL谷氨酰胺-D5，0.1-1.0μg/mL苯丙氨酸-D5，0.1-0.5μg/mL胆碱-D4；
（3）洗脱液：用于洗脱色谱柱的洗脱液；
其中所述用于色谱柱的洗脱液是用于洗脱Merck ZIC-cHilic色谱柱的洗脱液；
其中包括的洗脱液包括：
流动相A：含体积百分比0.01-1.0%乙酸和5-15mM乙酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积百分比为80:20-95:5；和流动相B: 含体积百分比0.01-1.0%乙酸的5-15mM乙酸铵水溶液。
2.一种筛查糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括：
（1）标准品：半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸，所述标准品分别用于血清中半乳糖，1,5-脱水山梨糖醇，N-乙酰葡糖胺，2-羟基丁酸的定性和定量标准曲线；
（2）含内标的提取液：用于预处理来自受试者的空腹血清样本，为包含内标的甲醇溶液，其中内标的浓度为0.1-0.5μg/mL马尿酸-D5，1.0-2.0μg/mL谷氨酰胺-D5，0.1-1.0μg/mL苯丙氨酸-D5，0.1-0.5μg/mL胆碱-D4；
（3）洗脱液：用于洗脱色谱柱的洗脱液；
其中所述用于色谱柱的洗脱液是用于洗脱Merck ZIC-cHilic色谱柱的洗脱液；
其中包括的洗脱液包括：
流动相A：含体积百分比0.01-1.0%乙酸和5-15mM乙酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积百分比为80:20-95:5；和
流动相B: 含体积百分比0.01-1.0%乙酸的5-15mM乙酸铵水溶液。
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