CN108885220A - 用于诊断癌症的脂质生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供来自胸腔积液样品的脂质生物标志物，以及其在用于确定罹患胸腔积液的患者是否患有癌症的方法中或在用于治疗罹患胸腔积液的患者中的癌症的方法中的用途。本文还公开了来自胸腔积液样品的脂质生物标志物在用于确定罹患胸腔积液的患者是否患有具有EGFR突变的癌症的方法中以及在用于治疗具有EGFR突变的患者中的癌症的方法中的用途。

Description

用于诊断癌症的脂质生物标志物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月10日提交的新加坡临时申请号10201601873S的优先权的权益，该新加坡临时申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。
技术领域
本发明涉及生物化学，特别是生物标志物。特别地，本发明涉及与癌症、特别是肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌相关的生物标志物，以及使用所述生物标志物来确定罹患胸腔积液的患者是否患有癌症、特别是具有EGFR突变的癌症的方法。
背景技术
癌症是全球第二大死亡原因，2012年导致820万人死亡。如果早期检测到并治疗，可显著降低癌症死亡率。用于可靠地检测癌症的方法主要涉及使用内窥镜检查、放射性扫描和组织活检，这些是对患者构成某些健康风险的昂贵且有侵袭性的程序。因此，需要提供用于有效检测患者中的癌症的非侵袭入性方法。
胸腔积液是胸膜腔中的流体积聚物，胸膜腔是内衬于肺的组织层和胸腔之间的区域。胸腔积液可能与各种癌症(例如肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌)相关，因此可作为其指征。然而，胸腔积液也可以是良性炎症病况的表现，包括肺炎、结核病和肺病症。因此，肺胸腔积液中恶性细胞的细胞学检测形成了罹患胸腔积液的患者中的癌症诊断的基础。然而，细胞学的诊断性能取决于肿瘤类型、胸膜腔中的肿瘤负荷和细胞学家的专门知识。在具有低细胞产量的胸腔积液样品中，诊断准确度可能会受到影响，导致超过30％的假阴性率。
因此，需要提供独立于细胞数的生物标志物，以补充和改善罹患胸腔积液的患者中的癌症诊断的准确度。
除了癌症的诊断之外，基于特定基因突变将癌症病例分类为亚型的能力对于药理学干预也是至关重要的，因为适当的治疗涉及癌症的驱动(driver)突变。特别地，表皮生长因子受体(EGFR)中的特定突变已被报道是癌症中最主要的驱动致癌基因之一。具有EGFR突变的癌症已显示对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib))的敏感性增加，使此类药物成为比标准化学疗法更有效的治疗选择。尽管已提议将从恶性胸腔积液上清液提取的DNA作为潜在的替代样品，但目前，EGFR突变最常见的是基于从肿瘤组织样品获得的DNA提取物来检测。使用恶性胸腔积液进行EGFR检测的一个关键挑战是此类样品中存在的DNA在数量和质量上的巨大变化，这可导致与组织样品相比较低的敏感性。因此，选择靶向EGFR突变的癌症治疗的病例需要指示EGFR突变的恶性胸腔积液中的替代生物标志物。
发明内容
在一个方面，提供了针对罹患胸腔积液的患者的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在另一方面，提供了确定罹患胸腔积液的患者是否患有癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量本发明的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者患有癌症，其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在另一方面，提供了治疗罹患胸腔积液的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量本发明的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者；以及(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用至少一种抗癌治疗；其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在另一方面，提供了用于检测具有EGFR突变的癌症的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、磷脂酰胆碱(41:6)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(36:5)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(23:0)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、三酰基甘油54:8和Gb3(42:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在另一方面，提供了确定罹患癌症的患者是否具有EGFR突变的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量本发明的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者具有EGFR突变，其中所述对照组包含罹患癌症但无EGFR突变的患者，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在另一方面，提供了治疗具有EGFR突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量本发明的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较；以及(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用针对具有EGFR突变的癌症的至少一种抗癌治疗；其中所述对照组包含罹患癌症但无EGFR突变的患者，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
附图简单说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：
图1A显示良性肺胸腔积液(n＝30)和恶性肺胸腔积液(n＝36)的主要组分分析(PCA)评分图。浅灰色圆圈、黑色圆圈和深灰色圆圈分别表示良性胸腔积液、无EGFR突变的恶性胸腔积液和有EGFR突变的恶性胸腔积液。胸腔积液脂质组(lipidome)的PCA分析揭示了良性病例和恶性病例的独特聚类(clustering)，指示这两组之间存在代谢差异。图1B显示了有EGFR突变(n＝19)和无EGFR突变(n＝17)的恶性胸腔积液的PCA评分图。黑色圆圈和深灰色圆圈分别表示无EGFR突变的恶性胸腔积液和有EGFR突变的恶性胸腔积液。PCA分析揭示有EGFR突变的恶性胸腔积液病例和无EGFR突变的恶性胸腔积液病例之间脂质组的进一步组成差异。图1C显示不同脂质代谢物(根据其脂质类别分组)的热图，该不同脂质代谢物来源于无EGFR突变的良性、恶性胸腔积液和有EGFR突变的恶性胸腔积液之间的单独成对比较。结果显示，对于至少一个成对比较，全部代表的物质均为统计学显著的(VIP>1，p值<0.05，倍数变化(FC)≥1.5)。与无EGFR突变的胸腔积液样品相比，有EGFR突变的胸腔积液样品中候选恶性肿瘤标志物的丰度显著更高。
图2A显示恶性受试者相对于良性受试者的针对所述类别的脂肪酸、特别是不饱和脂肪酸中的单个脂质标志物的接受者操作特征(receiver operating characteristic)(ROC)曲线，所述单个脂质标志物例如FA(14:2)、FA(18:1)、FA(18:2)、FA(18:3)、FA(20:5)、FA(22:4)、FA(22:5)、FA(22:6)和羟基FA(16:0)。结果显示，这些脂肪酸中的每一种均可用于区分恶性胸腔积液和良性胸腔积液，AUC值在0.74到0.87的范围。图2B显示恶性受试者相对于良性受试者的针对所述类别的鞘脂中的单个脂质标志物(例如GalCer(40:1)/GlcCer(40:1)、SM(44:1)和SM(42:2))的ROC曲线。结果显示，这些鞘脂中的每一种均可用于区分恶性胸腔积液和良性胸腔积液，AUC值在0.66到0.73的范围。图2C显示恶性受试者相对于良性受试者的关于从SVM建模获得的四种脂质恶性肿瘤标志物(FA(22:6)、FA(22:5)、FA(23:0)和Gb3(42:2))的最佳组合的ROC曲线。结果显示，四种脂质标志物的这一组合可用于区分恶性胸腔积液和良性胸腔积液，AUC值为0.94。
图3A显示良性胸腔积液、无EGFR突变的恶性胸腔积液和有EGFR突变的恶性胸腔积液中FA(22:6)的相对水平的点图。使用良性胸腔积液样品中FA(22:6)的表达水平作为参考点。基于曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)计算p值，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。结果证实，有EGFR突变的恶性胸腔积液样品中多不饱和脂肪酸FA(22:6)的丰度显著更高。图3B显示良性胸腔积液、无EGFR突变的恶性胸腔积液和有EGFR突变的恶性胸腔积液中FA(20:5)的相对水平的点图。使用良性胸腔积液样品中FA(20:5)的表达水平作为参考点。基于曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)计算p值，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。结果证实，有EGFR突变的恶性胸腔积液样品中多不饱和脂肪酸FA(20:5)的丰度显著更高。图3C显示在所述类别的脂肪酸(示例性脂肪酸FA(20:3)、FA(20:5)、FA(22:5)和FA(22:6))中无EGFR突变的恶性胸腔积液相对于有EGFR突变的恶性胸腔积液的ROC曲线。结果证实，示例性脂肪酸中的每一种均可用于区分有EGFR突变的恶性胸腔积液和无EGFR突变的恶性胸腔积液，AUC在0.68到0.78的范围(参见表14)。图3D显示在所述类别的磷脂(示例性磷脂LysoPEtn(P-16:0)、PC(41:6)和PEtn(P-36:5))中无EGFR突变的恶性胸腔积液相对于有EGFR突变的恶性胸腔积液的ROC曲线。结果证实，示例性磷脂中的每一种均可用于区分有EGFR突变的恶性胸腔积液和无EGFR突变的恶性胸腔积液，AUC在0.67到0.70的范围(参见表14)。图3E显示使用从SVM建模获得的七种脂质标志物的组合，无EGFR突变的恶性胸腔积液相对于有EGFR突变的恶性胸腔积液的ROC曲线。七种脂质标志物是：FA(20:5)、FA(22:4)、FA(22:5)、FA(23:0)、PC(41:6)、PEtn(38:4)和Gb3(42:2)。结果证实，这7种脂质标志物的组合可用于区分有EGFR突变的恶性胸腔积液和无EGFR突变的恶性胸腔积液，AUC为0.86(具有0.73-1.00的95％置信区间)。
图4A显示小组标志物亚组在区分恶性胸腔积液与良性胸腔积液(总n＝128)中的准确度和AUC的点图。标志物组合来源于SMV模型。每个小组标志物亚组中脂质标志物的特性列于表1中。图4B显示恶性胸腔积液受试者相对于良性胸腔积液受试者的针对来源于SMV模型的四种小组标志物(FA(22:6)、羟基FA(16:0)、FA(20:1)和FA(18:2))的示例性组合的ROC曲线。AUC为0.88(具有0.82-0.95的95％置信区间)。图4C显示图4B的相应点图。
图5A显示小组标志物亚组在区分恶性胸腔积液与良性胸腔积液(总n＝149)中的准确度和AUC的点图。标志物组合来源于SMV模型。每个小组标志物亚组中脂质标志物的特性列于表2中。图5B显示恶性胸腔积液受试者相对于良性胸腔积液受试者的针对来源于SMV模型的四种小组标志物(FA(22:6)、羟基FA(16:0)、FA(18:2)和FA(18:1))的示例性组合的ROC曲线。AUC为0.89(具有0.83-0.95的95％置信区间)。图5C显示图5B的相应点图。
具体实施方式
本公开的发明人已计划提供用于在罹患胸腔积液的患者中检测癌症、特别是肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌的替代生物标志物。脂质组学用于鉴别可用于检测癌症的生物标志物和脂质指纹图谱(fingerprint)。因此，在一个方面，提供了针对罹患胸腔积液的患者的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。在一些示例中，第一方面的癌症生物标志物包含至少一种脂肪酸，优选一种不饱和脂肪酸，更优选一种多不饱和脂肪酸。在一些示例中，第一方面的癌症生物标志物包含至少FA(22:6)和另一种脂肪酸。在一些示例中，第一方面的癌症生物标志物包含至少FA(22:6)和羟基脂肪酸(16:0)。在一些其他示例中，第一方面的癌症生物标志物可进一步包含脂肪酸FA(23:0)和/或FA(18:3)。第一方面的一些示例性癌症生物标志物列于表1中。
表1.能够区分恶性受试者的胸腔积液与良性受试者的胸腔积液的示例性标志物组合(来源于SVM模型)。
除脂肪酸外，第一方面的癌症生物标志物可包含其他类别的脂质，包括但不限于神经酰胺、溶血磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和三酰基甘油(TAG)。这些其他类别的脂质的示例列于表6到9中。含有脂肪酸和上述其他类别的脂质的组合的示例性癌症生物标志物列于表2中。
表2.能够区分恶性受试者的胸腔积液与良性受试者的胸腔积液的标志物组合(来源于SVM模型)。
如本文所用的可互换使用的术语“患者”或“受试者”或“个体”涉及动物，例如哺乳动物，包括牛、马、非人灵长类动物、狗、猫和人。本公开的患者可能罹患胸腔积液，并且可能被怀疑罹患或可能先前罹患癌症，例如肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。例如，可将本发明的方法应用于怀疑罹患肺癌的具有胸腔积液的受试者。在另一示例中，可将本公开的方法应用于怀疑有癌症复发的受试者。如本文所用的术语“复发”是指在已被认为没有癌症的患者中再现或重新检测到癌症。
如本文可互换使用的术语“肺癌(lung cancer)”或“肺癌(lung carcinoma)”是指特征在于肺组织中不受控制的细胞生长的恶性肺肿瘤。如果不予治疗，则这种生长可通过转移到附近组织或身体其他部位的过程而扩散到肺部以外。大多数始于肺中的癌症(cancer)(被称为原发性肺癌)都是癌(carcinoma)。继发性肺癌是其他原发癌(例如乳腺癌、胃癌)转移的结果。两种主要类型是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC通常呈现于中央气道中并浸润粘膜下层，导致支气管气道变窄。与NSCLC相比，SCLC具有更短的倍增时间、更高的生长分数和更早的转移发展。NSCLC是除SCLC以外的任何类型的上皮性肺癌。NSCLC的示例包括鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌和肺腺癌。
可用于检测NSCLC的第一方面的癌症生物标志物的一些特定示例列于表3中。
表3.能够区分NSCLC患者的胸腔积液与良性受试者的胸腔积液的示例性标志物组合(来源于SVM模型)。
如本文所用的术语“乳腺癌”是指在乳腺组织中形成的癌症。乳腺癌通常从乳导管的内衬或向它们提供乳的小叶开始。起源于小叶的乳腺癌被称为小叶癌，而起源于导管的乳腺癌被称为导管癌。乳腺癌细胞可通过转移过程扩散到肺中，导致继发性肺癌。
如本文所用的术语“胃癌”是指源自胃内粘膜层衬里的细胞的癌症。胃癌细胞可扩散通过胃的肌肉层和浆膜层，然后转移到淋巴结和远端器官，例如肝和肺，导致这些远端器官中的继发性癌症。
如本文中可互换使用的术语“鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)”和“鳞状细胞癌(squamous cell cancer)”是指来源于鳞状细胞的癌症，所述鳞状细胞是在形成皮肤表面的组织、身体空心器官的衬里以及呼吸道和消化道的衬里中发现的呈现鱼鳞形状的薄的扁平细胞。一个特定的示例是鳞状细胞肺癌，它是非小细胞肺癌的组织学亚型。
如本文所用的术语“生物标志物”是指可用于确定特定疾病或病况的存在或不存在和/或严重性的特定生物学性质、生物化学特征或方面的分子指示物。在本公开中，术语“生物标志物”是指一组与癌症、特别是肺癌、乳腺癌以及胃癌和鳞状细胞癌相关的至少两种或至少三种脂质、其衍生物或代谢物。
如本文所用的术语“脂质”是指通过它们在非极性有机溶剂(例如醚、氯仿、丙酮和苯)中的溶解性和在水中的一般不溶性而相关的一组不同的天然存在的有机化合物。脂质的主要类别包括脂肪酸、神经酰胺、溶血磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和三酰基甘油(TAG)。
如本文所用的术语“脂肪酸”是指一组不同的分子，通常是具有脂族(或烃)链的羧酸，其通过例如具有丙二酰辅酶A(丙二酰-CoA)或甲基丙二酰-CoA基团的乙酰基-CoA引物分子在称为脂肪酸合成的过程中的链延伸而形成。它们由以羧酸基团终止的烃链构成。碳链可以是饱和的或不饱和的，并且可连接到含有但不限于氧、卤素、氮和硫的官能团。脂肪酸在烃链的长度、不饱和度(其为烃链中存在的碳-碳双键的数量)以及烃链内的双键的位置方面彼此不同。在一些示例中，脂肪酸的烃链中的碳原子数为4到26、或6到24、或8到22、或10到20、或12到18、或14到16、或4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或更多。由于脂肪酸合成的性质，因此链中的碳原子数通常是偶数，即不饱和脂肪酸中的碳原子数是2个碳原子的倍数。存在于脂族链中的双键数在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10之间。存在于不饱和脂肪酸的脂族链中的双键数目的确定取决于剩余碳原子的化合价和脂族链的实际长度。本领域技术人员将理解，不饱和度(其为脂肪酸的脂族链内的双键数)取决于脂族链的长度。例如，在其脂族链中具有6个碳原子的不饱和脂肪酸可在其脂族链中存在化合价允许的最多2个双键。因此，具有6个碳原子的脂族链可具有0个双键、1个双键或2个双键。基于可用于命名脂肪酸的不同命名法，命名可提供或可不提供关于脂族链内双键位置的信息。脂肪酸的三种常用命名法是脂质数(lipidnumber)(“C:D”)命名法、δ-x(ΔX)命名法和Ω-x(ω-x)命名法。例如，在脂质数命名法中，“C”表示脂族链中存在的碳原子数，并且“D”表示存在的碳-碳双键(C＝C)的数目。在该表示中，命名法并未指示脂族链内双键的确切位置。例如，具有脂质数18:3(链上18个碳原子，存在3个双键)的不饱和脂肪酸包括α-亚麻酸和γ-亚麻酸。使用相同的示例，α-亚麻酸的δ-x(Δx)命名法是Δ9,12,15，并且γ-亚麻酸是Δ6,9,12，“x”因此表示从羧酸端计数的双键的位置。δ-x命名法可包括或可不包括分子的构型信息，例如，如果双键导致不饱和脂肪酸的顺式或反式构象。ω-x命名法通过从脂族链的甲基端(ω端)计数来指示双键的位置。除非另有说明，否则本文的命名法是脂质数命名法。
可用作本公开的生物标志物的脂肪酸包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。术语“饱和脂肪酸”是指仅具有单键(即无碳双键，n＝0)的脂肪酸。术语“不饱和脂肪酸”是指具有至少一个碳双键(即n>1)的脂肪酸。在人胸腔积液中鉴别的脂肪酸和衍生物的示例、其结构和名称列于表4中。
表4.在人胸腔积液中鉴别的脂肪酸和脂肪酸衍生物的示例
如本文所用的术语“神经酰胺”是指蜡质脂质分子家族。神经酰胺由鞘氨醇和脂肪酸构成。神经酰胺以高浓度发现于细胞的细胞膜内，因为它们是构成鞘磷脂的组成脂质，鞘磷脂是脂质双层中的主要脂质之一。神经酰胺可参与多种细胞信号传导：示例包括调控细胞的分化、增殖和程序性细胞死亡(PCD)。神经酰胺可由下面的通式表示，其中R表示脂肪酸的烷基：
在人胸腔积液中鉴别的神经酰胺的示例、其结构和名称列于表5中。
脂质名称 通用名称 分子式
GalCer(40:1) 半乳糖苷基神经酰胺(d18:1/22:0) C46H89NO8
GlcCer(40:1) 葡糖基神经酰胺(d18:1/22:0) C46H89NO8
Gb3(34:1) 三己糖基神经酰胺(d18:1/16:0) C52H97NO18
Gb3(42:2) 三己糖基神经酰胺(d18:1/24:1) C60H111NO18
SM(42:2) 鞘磷脂(42:2) C47H93N2O6P
SM(44:1) 鞘磷脂(44:1) C49H100N2O6P+
表5.在人胸腔积液中鉴别的神经酰胺的示例
如本文所用的术语“半乳糖苷基神经酰胺(GalCer)”是指非酸性单糖鞘脂，即具有连接到神经酰胺单元的一个碳水化合物部分的鞘脂。GalCer通过酶UDP-半乳糖神经酰胺半乳糖基转移酶从神经酰胺产生。
如本文所用的术语“三己糖基神经酰胺”是指含有三糖(半乳糖-半乳糖-葡萄糖)部分的鞘糖脂，所述部分以糖苷键结合至神经酰胺的作为极性头基的羟基。
如本文所用的术语“鞘磷脂”是指在动物细胞膜中、尤其是在围绕一些神经细胞轴突的膜髓鞘中发现的一类鞘脂。它通常由磷酸胆碱和神经酰胺、或磷酸乙醇胺头基组成；因此，鞘磷脂还可被归类为神经鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)。
如本文所用的术语“溶血磷脂”是指已通过水解去除一种或两种酰基衍生物的磷脂衍生物。在人胸腔积液中鉴别的溶血磷脂的示例、其结构和名称列于表6中。
脂质名称 通用名称 分子式
LysoPC(P-16:0) 溶血磷脂酰胆碱(P-16:0) C24H50NO7P
LysoPC(22:6) 溶血磷脂酰胆碱(22:6) C30H50NO7P
LysoPE(P-16:0) 溶血磷脂酰乙醇胺(P-16:0) C21H44NO7P
LysoPE(P-18:0) 溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0) C23H48NO7P
表6.在人胸腔积液中鉴别的溶血磷脂的示例
如本文所用的术语“溶血磷脂酰胆碱”是指通过去除一个脂肪酸部分的部分水解获得的磷脂酰胆碱衍生物。
如本文所用的术语“溶血磷脂酰乙醇胺”是指通过去除一个脂肪酸部分的部分水解而获得的磷脂酰乙醇胺的衍生物。
术语“磷脂酰胆碱”或缩写形式的“PC”在本文中用于指由胆碱头基团和甘油磷酸与多种脂肪酸(包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸)构成的一类磷脂。如本文所用的术语“胆碱”是指由以下通式表示的含有N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子的季铵盐类，其中右侧的X-表示未定义的抗衡阴离子：
在人胸腔积液中鉴别的磷脂酰胆碱的示例、其结构和名称列于表7中。
表7.在人胸腔积液中鉴别的磷脂酰胆碱的示例
术语“磷脂酰乙醇胺”或缩写形式的“PE”在本文中用于指由用两种脂肪酸和磷酸酯化的甘油的组合组成的一类磷脂。将磷酸酯基团与乙醇胺组合。两种脂肪酸可相同或不同，并且通常在1,2位，且有时在1,3位。在人胸腔积液中鉴别的磷脂酰乙醇胺的示例、它们的结构和名称列于表8中。
脂质名称 通用名称 分子式
PE(34:1) 磷脂酰乙醇胺(34:1) C39H76NO8P
PE(36:4) 磷脂酰乙醇胺(36:4) C41H74NO8P
PE(38:4) 磷脂酰乙醇胺(38:4) C43H78NO8P
PE(P-36:5) 磷脂酰乙醇胺(P-36:5) C41H72NO7P
PE(P-38:5) 磷脂酰乙醇胺(P-38:5) C43H76NO7P
表8.在人胸腔积液中鉴别的磷脂酰乙醇胺的示例
术语“三酰基甘油”或缩写形式的“TAG”或“TG”在本文中用于指衍生自甘油和三种脂肪酸的酯。在一些示例中，三种脂肪酸彼此不同。在一些其他示例中，三种脂肪酸中的至少两种是相同的。在一些其他示例中，所有三种脂肪酸都是相同的。三酰基甘油可以是饱和的或不饱和的。在人积液中鉴别的三酰基甘油的示例、它们的结构和名称列于表9中。
脂质名称 通用名称 分子式
TG(53:7) 三酰基甘油(53:7) C57H96O6
TG(54:6) 三酰基甘油(54:6) C57H98O6
TG(54:7) 三酰基甘油(54:7) C57H96O6
TG(54:8) 三酰基甘油(54:8) C57H94O6
TG(56:8) 三酰基甘油(56:8) C59H98O6
TG(56:9) 三酰基甘油(56:9) C59H96O6
TG(58:0) 三酰基甘油(58:0) C61H118O6
表9.在人胸腔积液中鉴别的三酰基甘油的示例。
如本公开的实验部分中所说明的，本公开的发明人发现第一方面的生物标志物可以是任何2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、或11-15种、或16-20种、或21-25种、26-30种或所有33种以下脂质的组合：羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(14:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:3)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(22:6)、脂肪酸(20:3)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(23:0)、三羟基脂肪酸(18:1)、半乳糖苷基神经酰胺(40:1)/葡糖基神经酰胺(40:1)、鞘磷脂(44:1)、鞘磷脂(42:2)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、磷脂酰胆碱(P-38:6)、磷脂酰胆碱(P-32:1)、溶血磷脂酰胆碱(P-16:0)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(41:6)、磷脂酰胆碱(o-44:4)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(34:1)、AcylCar18:2和Gb3(42:2)。这些脂质生物标志物的组合的各种示例例示于下面的实验部分中。在一个特定的示例中，第一方面的生物标志物包括以下四种脂质的组合：脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和Gb3(42:2)。组合脂质作为本公开的生物标记物的可能性是有利的，因为它将确保检测各种类型的癌症，包括肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌，这些癌症因个体受试者之间具有显著的遗传异质性和复杂的体细胞突变而众所周知。
在一些示例中，第一方面的生物标志物包含选自由以下组成的组中的至少三种：羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(22:6)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:1)和脂肪酸(20:2)。如本公开的实验部分中所说明的，在一些示例中，生物标志物可以是任何2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或所有上述脂质的组合。在一些示例中，第一方面的生物标志物包含至少一种不饱和脂肪酸，优选多不饱和脂肪酸。在一些示例中，不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸具有20或22个碳的链长。
在一个示例中，第一方面的生物标志物可以是两种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)和羟基脂肪酸(16:0)。在一些其他示例中，生物标志物可以是三种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)和脂肪酸(18:2)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(23:0)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)和脂肪酸(20:1)。在一些其他示例中，生物标志物可以是四种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)和脂肪酸(18:1)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和Gb3(42:2)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)和脂肪酸(18:2)。在一些其他示例中，生物标志物可以是五种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)和脂肪酸(22:5)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)和脂肪酸(18:2)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)和脂肪酸(18:1)。在一些其他示例中，生物标志物可以是六种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(20:4)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)和羟基脂肪酸(16:0)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)和脂肪酸(16:1)。在一些其他示例中，生物标志物可以是七种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)和溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)和脂肪酸(20:5)。在一些其他示例中，生物标志物可以是八种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)和脂肪酸(20:1)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)和磷脂酰胆碱(o-36:1)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(22:4)。在一些其他示例中，生物标志物可以是九种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)和脂肪酸(20:5)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)和溶血磷脂酰胆碱(22:6)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)和脂肪酸(22:5)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(22:4)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)和磷脂酰乙醇胺(38:4)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(20:4)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十一种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)和脂肪酸(16:1)；脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)和脂肪酸(18:3)；或脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十二种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)和Gb3(34:1)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十三种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)和AcylCar(18:2)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十四种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)、AcylCar(18:2)和鞘磷脂(42:2)。在一些其他示例中，生物标志物可以是十五种脂质的组合，例如：脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)、AcylCar(18:2)、鞘磷脂(42:2)和GalCer(40:1)/GlcCer(40:1)。
因为第一方面的生物标志物可用于癌症的检测，因此在第二方面，提供了确定罹患胸腔积液的患者是否患有癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量第一方面的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较；其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者患有癌症；其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者；并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
如本文所用的术语“样品”是指生物样品，或包含至少一些生物材料(例如体液)的样品。在一些示例中，生物样品不是组织样品或不是从组织活检获得的样品。在一些示例中，生物样品是液体样品。在一个特定的示例中，生物样品是胸膜液样品或含有胸膜液的样品。
如本文所用的术语“胸膜液”是指来源于肺中毛细管中的血液的液体。它被少量发现于覆盖胸腔的胸膜层和每个肺的外部之间。它用作用于肺在呼吸期间运动的润滑剂。各种病况和疾病可引起胸膜炎症和/或胸膜液的过度积聚。
可使用称为胸腔穿刺术的程序收集胸膜液样品。如本文所用的术语“胸腔穿刺术”是指将插管或空心针插入肺和胸壁之间的胸膜腔中的程序。完成该程序以从胸膜腔去除过量的液体，即胸腔积液，从而允许罹患胸腔积液的患者更好地呼吸。尽管它被认为是侵袭性程序，但因为它是作为常规治疗的一部分来完成的，没有出于收集用于诊断的样品的目的而进行额外的侵袭性程序，因此与其他样品收集程序(例如组织活检)相比，它更为有利。
可使用液相色谱-质谱(LC-MS)测量样品中生物标志物的浓度，液相色谱-质谱是组合了液相色谱的物理分离能力与质谱的质量分析能力的分析化学技术。
LC-MS是具有极高灵敏度的强大技术，使其可用于在其他化学品存在下(即在复杂混合物中)对特定质量化学品进行分离、一般性检测和可能的鉴别。LC-MS包括靶向LC-MS和非靶向LC-MS。当目标分析物的定量所需的标准品可商购时，可进行靶向LC-MS。或者，如果目标分析物的标准品不可商购，则替代分析物可用于促进目标分析物的定量。替代分析物的示例包括但不限于目标分析物的稳定同位素标记标准物品，例如棕榈油酸(U-13C16)、亚油酸(U-13C18)、油酸(U-13C18)、EPA-d5和DHA(U-13C22)。当LC-MS用于检测和分析样品中的生物标志物时，仅需要少量样品。例如、所需样品的体积可少到200μL、或150μL、或100μL、或90μL、或80μL、或70μL、或60μL、或50μL、或40μL、或30μL、或20μL、或10μL。
在第三方面，提供了治疗罹患胸腔积液的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量第一方面的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者；以及(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用至少一种抗癌治疗；其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或终止与疾病或病症相关的病况的进展或严重性。术语“治疗(treating)”包括减少或减轻与恶性病况或癌症相关的病况、疾病或病症的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还可包括停止或至少减慢在不存在治疗的情况下会预计到的症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于恶性疾病的一种或多种症状的缓解、恶性疾病程度的减小、恶性疾病的稳定化(即，不恶化)状态、恶性疾病进展的延迟或减慢、恶性疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供从疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)。术语“抗癌治疗”应当被相应地解释。抗癌治疗的示例包括但不限于化学疗法、放射疗法、手术治疗、免疫疗法和其组合。在一个特定的示例中，抗癌治疗包括使用抗癌药物。
本公开的发明人设想如本文所公开的一些脂质标志物可用于检测患者的癌细胞中是否存在某些突变，例如表皮生长因子受体(EGFR)中的突变。因此，在第四方面，提供了用于检测具有EGFR突变的癌症的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、磷脂酰胆碱(41:6)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(36:5)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(23:0)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、三酰基甘油54:8和Gb3(42:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。在一些示例中，第四方面的癌症生物标志物包含至少一种脂肪酸，优选一种不饱和脂肪酸，更优选一种多不饱和脂肪酸。在一些示例中，第四方面的癌症生物标志物包含至少PC(41:6)和FA(22:5)。在一些其他示例中，第四方面的癌症生物标志物可进一步包含选自由以下组成的组中的脂质：脂肪酸(20:3)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(22:6)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-16:0)、磷脂酰乙醇胺(P-38:5)、脂肪酸(16:2)和磷脂酰胆碱(P-32:1)。第四方面的一些示例性癌症生物标志物列于表10中。
表10.能够区分有EGFR突变的恶性胸腔积液和无EGFR突变的恶性胸腔积液的示例性标志物组合(来源于SVM模型)
如表10中所示，在一个示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是两种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)和脂肪酸(22:5)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是三种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(23:0)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是四种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和脂肪酸(22:4)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是五种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)和磷脂酰乙醇胺(38:4)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是六种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)和Gb3(42:2)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是七种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)和脂肪酸(20:5)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是八种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(18:1)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是九种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)和磷脂酰胆碱(P-36:5)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)和脂肪酸(18:3)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十一种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)和磷脂酰乙醇胺(P-36:5)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十二种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)和磷脂酰胆碱(38:8)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十三种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)和磷脂酰胆碱(40:8)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十四种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)和三酰基甘油(54:8)。在另一示例中，第四方面的癌症生物标志物可以是十五种脂质的组合，例如：磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、三酰基甘油(54:8)和磷脂酰胆碱(36:5)。
术语“表皮生长因子受体”或缩写“EGFR”是细胞外蛋白质配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的细胞表面受体。它是ErbB家族受体的成员，该家族是四个密切相关的受体酪氨酸激酶亚家族：EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。导致EGFR过表达或过度活性的突变与许多癌症相关。特别地，EGFR中的特定突变已被报道是NSCLC中最主要的驱动致癌基因之一，流行率为9-23％。具有EGFR突变的NSCLC病例已显示对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼(afatinib)和奧希替尼(osimertinib))的敏感性增加，使此类药物成为比标准化学疗法更有效的治疗选择。目前，EGFR突变最常见的是基于从肿瘤组织样品获得的DNA提取物来检测。使用胸腔积液进行EGFRDNA检测的一个关键挑战是胸腔积液样品中存在的DNA的数量和质量上巨大的变化，与组织样品相比，这可导致较低的敏感性。
如本公开的实验部分中所说明的，本公开的发明人发现第四方面的生物标志物可以是任何2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种以下脂质的组合：脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、磷脂酰胆碱(41:6)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(36:5)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(23:0)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、三酰基甘油54:8和Gb3(42:2)。这些脂质生物标志物的组合的各种示例例示于下面的实验部分中。在一些示例中，第四方面的生物标志物包含至少一种不饱和脂肪酸，优选多不饱和脂肪酸。在一些示例中，不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸具有20或22个碳的链长。在一个示例中，第四方面的生物标志物包括以下7种脂质的组合：脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、磷脂酰胆碱(41:6)、PE(38:4)和Gb3(42:2)。
因为第四方面的生物标志物可用于癌症中的EGFR突变的检测，因此在第五方面，提供了确定罹患癌症的患者是否具有EGFR突变的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量第五方面的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较；其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者具有EGFR突变；其中所述对照组包含罹患癌症但无EGFR突变的患者，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
在第六方面，提供了治疗有EGFR突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)在从所述患者获得的样品中测量第四方面的癌症生物标志物的浓度；(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，并且(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用针对有EGFR突变的癌症的至少一种抗癌治疗；其中所述对照组包含罹患癌症而无EGFR突变的患者，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
具有EGFR突变的癌症的抗癌治疗的示例包括但不限于化学疗法、放射疗法、手术治疗、免疫疗法和其组合。在一个特定的示例中，抗癌治疗是化学疗法。在另一特定的示例中，化学疗法包括使用酪氨酸激酶抑制剂，例如阿法替尼、埃罗替尼、奧希替尼和吉非替尼。
本领域技术人员应当能够了解，当已鉴别罹患癌症的患者具有EGFR时，可使用超过一种的抗癌治疗来治疗该患者，其中至少一种抗癌治疗针对具有EGFR突变的癌症。可将这些治疗同时或依序给予患者。当依序施用不同的抗癌治疗或药物时，它们可在彼此之后立即施用、在彼此之间有时间差地施用、或者在不同的治疗周期中施用。每次抗癌治疗之间的时间差可以是1小时、或2小时、或3小时、或4小时、或5小时、或6小时、或7小时、或8小时、或9小时、或10小时、或11小时、或12小时、或15小时、或18小时、或21小时、或24小时、或1天、或2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天。当在不同的治疗周期中使用不同的抗癌治疗时，它们之间的时间差可以是1个治疗周期、或2个治疗周期、或3个治疗周期、或4个治疗周期、或5个治疗周期、或6个治疗周期、或7个治疗周期、或8个治疗周期、或9个治疗周期、或10个治疗周期、或11个治疗周期、或12个治疗周期。在一些示例中，仅在完成用第一次抗癌治疗对患者的治疗后施用第二次抗癌治疗。
如本申请的实验部分中所说明的，本申请的生物标志物提供大于75％的敏感性和/或特异性、大于80％的接受者操作特征曲线下面积(AUC)和大于75％的总体准确度，这些高于目前可用的生物标志物。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“引物”包括多种引物，包括其混合物。
如本文所用的术语“约”在制剂的组分的浓度的背景下，通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，且甚至更通常所述值的+/-0.5％。
在本公开通篇内，某些实施例可以范围形式被公开。应当理解，呈范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁且不应当被解释为对所公开范围的范畴的不可改变的限制。因此，对一个范围的描述应当被认为已经具体地公开了所述范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，对一个范围(例如1到6)的描述应当被认为已经公开了子范围(例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等)以及所述范围内的单个数字(例如，1、2、3、4、5和6)。不管所述范围的宽度如何，这都是适用的。不管所述范围的宽度如何，这都是适用的。
本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保持的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的本发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。
本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开的每个较窄的类和次一般的组合也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。
其它实施方案在以下权利要求书和非限制性实施例内。另外，在用马库什组(Markush group)描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述本发明。
实验性实施例
以下实施例说明可实施本发明的各方面或者可制备适于实施本发明某些实施方案的材料的方法。
实施例1-肺胸腔积液样品的脂质组学谱分析(profiling)
研究患者和样品收集
从2012年12月到2014年12月准入新加坡中央医院(Singapore GeneralHospital)和新加坡国立癌症中心(National Cancer Centre Singapore)的71名患者获得肺胸腔积液样品。通过胸腔穿刺术收集的这些胸腔积液样品在收集后在4℃以805g离心10分钟。基于临床诊断、从胸腔积液分离的细胞的细胞学和肿瘤组织的组织学评估非小细胞肺癌(NSCLC)恶性病例。组织学检查未显示任何恶性肿瘤的患者被归类为良性受试者。患者的人口统计数据和特征(包括年龄、性别、细胞学和组织学)提供于表11中。在我们的研究中，有30例良性病例和41例恶性病例。在恶性病例中，19例被确认具有EGFR突变(EGFR突变型)，17例不具有EGFR突变(非EGFR突变型)，而其余5例恶性病例的分子状态未知，原因是在细胞学和组织学检查后用于进行突变测试的样品不足。针对19例有EGFR突变的病例检测到的特定EGFR突变的信息示于表12中。在基于LC-MS的脂质组学分析之前，将所有胸腔积液上清液储存在-80℃。所招募的所有患者都给出了知情同意书，且本研究由新加坡卫生服务集中机构审查委员会(Singapore Health Services centralized institutional reviewboard)(CIRB 2010/516/B)批准并根据该委员会的指导方针进行。良性患者和恶性患者之间在年龄(p值＝0.09)、性别(p值＝0.15)、吸烟状态(p值＝0.46)和种族(p值＝0.25)方面未鉴别出统计学显著差异。
n，病例数；EGFR，表皮生长因子受体
表11.良性受试者(n＝30)和恶性非小细胞肺癌患者(n＝41)的临床特征。
表12.在19名有EGFR突变的NSCLC患者中检测到的特定EGFR突变的信息
试剂和材料
如下获得试剂：Optima级甲醇、异丙醇：Fisher Scientific(Loughborough,UK)；三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)：Sigma-Aldrich(St Louis,MO)；氨溶液“AnalaR”25％：VWR(Poole,UK)；乙腈、氯仿、乙酸、甲酸、13C标记的同位素脂肪酸标准品(棕榈油酸-13C16、棕榈酸-1,2,3,4-13C4、亚油酸-13C18、硬脂酸-13C18)：Merck(Whitehouse Station,NJ)；奇链脂质标准品：磷脂酰胆碱、PC(9:0/9:0)；PC(17:0/17:0)；PC(21:0/21:0)；磷脂酰乙醇胺，PEtn(15:0/15:0)；PEtn(17:0/17:0)：Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)。13C标记的同位素和奇数链脂质标准品构成脂质参考标准混合物。
脂质提取
将50μL的每个胸腔积液样品等分，并在两相的经改良的Bligh和Dyer脂质提取方案之前，将10μL脂质参考标准混合物作为保留时间参考添加到样品中。通过依序添加甲醇、氯仿和3.8mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(1:1:0.5v/v/v，总共2mL)来提取每个样品，每次添加后将样品涡旋1min。然后将样品在4℃以12,000g离心20min，之后将每个样品分成两个级分——顶部甲醇层含有极性代谢物，而底部氯仿层含有脂质物质。收集富集脂质物质的底部氯仿级分，且在分析之前，将其储存在-80℃。通过混合等量的所有胸腔积液样品来制备质量控制(QC)样品，并如上所述提取每个QC样品。将所有样品随机化以进行提取。
使用LC-MS进行脂质组学谱分析
利用与Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher Scientific,MA)介接的超高效液相色谱(UHPLC)系统(Ultimate 3000,ThermoFisher Scientific,MA)进行脂质组学分析。在每个分析批次之前，进行仪器维护(源清洁和质量校准)。将反相LC柱(Acquity CSH，1.0×50mm，1.7μm粒径，Waters公司)与以下两种溶剂用于分离：包含乙腈、甲醇和水(2:2:1)与0.1％乙酸和0.1％氨溶液的‘A’以及包含异丙醇与0.1％乙酸和0.1％氨溶液的‘B’。使用样品浓缩器(Bio-techne，Minneapolis，MN)干燥所有样品，在溶剂A和B的50:50(v/v)混合物中重构。将UHPLC自动取样器温度设定为4℃，并且每个样品的注入体积为2μL。在LC-MS系统上以技术性三次重复处理所有样品。LC程序如下：首先将柱于1％B以0.1ml/min的流速平衡1分钟。经9min将梯度从1％B增加到82.5％B，然后将B增加到99％用于以0.15ml/min的流速进行5min洗涤。将柱于1％B再平衡2.2min。将柱温维持在45℃。将来自LC系统的洗脱液导入质谱仪(MS)中。以完全扫描的正模式和负模式两者进行MS中的电喷雾电离(ESI)，其中质量范围为120到1800m/z，分辨率为70,000，自动增益控制(AGC)目标为1×106个离子(ESI+)或3×106个离子(ESI-)，最大注入时间(IT)为100ms(ESI+)或200ms(ESI-)。使用加热的电喷雾电离(HESI)源，喷雾电压为3.75kV(ESI+)和3.25kV(ESI-)，毛细管温度为350℃(ESI+和ESI-)，鞘气流量为25(ESI+和ESI-)且辅助气流量的10个任意单位(ESI+和ESI-)。
在每批分析中以规则间隔分析QC样品以监测LC-MS的可再现性。将提取的样品重新随机化以进行LC-MS分析，使得注入顺序与样品制备的顺序无关，以使系统偏差最小化。
数据预处理和统计分析
然后使用XCMS峰值查找算法对所获得的原始LC-MS数据进行预处理和分析。加标脂质参考标准品在所有样品中的相对标准偏差均小于20％，证实我们的提取和LC-MS方法的高可再现性。QC混合物用于每批次分析之间和之内的信号校正。QC样品内可重复性差(变异系数大于30％)的质量峰被去除。将总面积归一化(基于每个质量峰的面积相对于每个样品内的峰面积之和的比率)应用于数据集中的其余特征，以校正样品制备和分析中的微小变化。将归一化数据输出到SIMCA-P+(13.0.3版，Umetrics，Umea，Sweden)进行多变量数据分析以鉴别可能的PE生物标志物。在SIMCA-P+中对数据进行均值中心化和Pareto缩放。随后，利用无监督式主成分分析(PCA)来确定基于QC样品的紧密聚类获得的LC-MS数据的质量，并得出各个胸腔积液样品之间的相似性和差异的概况。之后进行监督式正交投影潜在结构判别分析(orthogonal projection to latent structures-discriminantanalysis)(OPLS-DA)，其中建立模型以成对方式在(1)良性病例、(2)EGFR突变型恶性病例和(3)非EGFG突变型恶性病例之间鉴别明显不同的单个脂质组分。这些脂质组分是基于它们的变量投影重要性(variable importance for projection)(VIP)值来鉴别的。具有较高VIP(VIP>1)的脂质物质对于区别OPLS-DA模型中的比较物组起到更大的作用，并且被认为是可能的生物标志物。使用曼-惠特尼U检验(p值<0.05)进行单变量分析以验证这些可能生物标志物的统计学显著性。通过获取两个比较物组的脂质物质所贡献的峰面积的比率来计算倍数变化。使用Stata/MP 14.0统计程序包(Stata公司，LP)进行这些统计分析。
支持向量机建模
支持向量机(SVM)模型是用于模式识别的机器学习技术。SVM构建将每个样品的指定类别(例如，样品是“良性”还是“恶性”)之间的距离最大化的边界。然后定义分隔样品类别的最佳边界。在本研究中，我们使用具有线性核函数的流行libSVM程序包来进行分类，其中涉及的参数由贝叶斯优化(Bayesian Optimization)自动选择。基于后向依序选择策略的递归特征消除(RFE)方法用于选择SVM分类器的最佳特征。以恶性肿瘤脂质标志物的完整候选组开始，依序去除特征(脂质标志物)，使得分离边界的变化最小化并且直到达到期望数量的特征。评估不同的期望数量的特征以确定各种特征组合的性能。
在实模式分类系统的构建中，可用数据通常是有限的，使得需要验证技术来估计分类系统将实际上如何表现。在目前的工作中，使用k折交叉验证来估计分类性能。在单轮k折交叉验证中，数据集首先被随机分成k个子集(折)，所述子集具有大致相等的大小并且是互斥的。然后将SVM分类器训练并测试k次，并且每次将一个子集留作测试数据，而将剩余的k-1个子集设置为训练数据。目前，使用留一法交叉验证(leave-one-out crossvalidation)(即k＝71)。
然后对能够区分(i)良性患者和恶性患者以及(ii)非EGFR突变型和EGFR突变型之间的PE的脂质标志物的两种最佳组合进行ROC分析。还对所鉴别的脂质物质(VIP>1，p值<0.05，倍数变化≥1.5)进行ROC分析。基于来自训练的SVM模型的每个样品的预测实际值，使用Stata/MP 14.0统计程序包(Stata公司，LP)绘制ROC。
代谢物鉴别
首先基于与来自京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genome)(www.genome.jp/kegg)和人代谢组数据库(Human Metabolome Database)(www.hmdb.ca)的条目的质量比较(小于5ppm误差)推定地鉴别质量峰。随后，在可能的情况下，通过与市售标准品的MS2谱比较，或者通过与在线可用质谱数据库的比较，验证目标脂质物质的特性。
胸腔积液脂质组
根据良性和恶性胸腔积液样品的脂质组学分析，在人胸腔积液中检测到不同范围的脂质物质(表4到9)。基于可信标准品或相应脂质类别的特征MS2谱与在线质谱数据库的比较来鉴别这些物质。所鉴别的脂质的列表包括长链脂肪酸、神经酰胺、磷脂和三酰基甘油。
脂质组学分析突出了良性胸腔积液和恶性胸腔积液的关键差异
为了在良性患者和恶性患者之间比较脂质组的组成，进行PCA分析以鉴别胸腔积液样品的任何内在聚类模式。胸腔积液脂质组(lipidome)的PCA分析揭示了良性病例和恶性病例的独特聚类(clustering)，指示这两组之间存在代谢差异(图1A)。有趣的是，对恶性胸腔积液的PCA评分图的更仔细审查揭示了恶性类别内EGFR突变型组和非EGFR突变型组之间脂质组的进一步组成差异(图1B)。
鉴于非EGFR突变型和EGFR突变型之间的恶性脂质组的异质性，为了确保可选择恶性肿瘤的可靠指示物，随后使用OPLS-DA进行两个单独的成对监督式多变量分析以建立模型，以在以下之间确定VIP>1的可能脂质区分者：(i)良性相对于EGFR突变型和(ii)良性相对于非EGFR突变型。只有满足两组成对比较的统计选择准则的脂质物质才被决选为用于恶性肿瘤的候选标志物。另外，通过使用单变量统计工具(曼-惠特尼U检验、倍数变化分析)补充每个成对多变量分析。根据这些分析，在成对比较分析中的至少一个中，鉴别出满足以下准则的46种脂质物质：VIP>1，p值<0.05且平均倍数变化≥1.5(图1C)。
不饱和脂肪酸、磷脂和鞘脂构成区分恶性胸腔积液样品和良性胸腔积液样品的一些主要脂质类别(图1C)。在良性患者内，对于热图中所示的标志物，在良性传染性(肺炎和结核病)胸腔积液样品和良性非传染性(心肺充血)胸腔积液样品之间没有观察到这些脂质标志物的丰度的明显区别。然而，与良性胸腔积液病例相比，这些脂质物质在NSCLC患者的恶性胸腔积液中显著升高。与对异质性恶性脂质组学谱的早先观察结果一致，热图分析进一步说明了恶性肺胸腔积液中与其基因型相关的的代谢差异(EGFR突变的存在/不存在)(图1C)。例如，发现醚连接的磷脂(例如PC(P-36:5)和PE(P-38:5))在良性胸腔积液样品和EGFR突变型胸腔积液样品之间有统计学差异，但在良性病例和非EGFR突变型病例之间没有统计学差异。相反，发现包括Gb3(42:2)和Gb3(34:1)在内的糖基化神经酰胺物质在非EGFR突变型病例中显著升高，但在有EGFR突变的病例中并未显著升高。
为了解释依赖于NSCLC的驱动突变的独特代谢型，只有满足针对“良性相对于EGFR突变型”和“良性相对于非EGFR突变型”比较的上述两个准则的脂质物质被决选为候选恶性肿瘤标志物(表13)。除了特定的神经酰胺和鞘磷脂物质之外，决选的候选物还包括大量不饱和脂肪酸。随后，使用ROC曲线分析评估该小组12种恶性肿瘤脂质物质的诊断性能(图2A和2B，表13)。这些脂质恶性肿瘤标志物中的每一种都能够区分恶性组和良性组，AUC值在0.66–0.87范围，敏感性(SN)为63.3–82.9％，特异性(SP)为60.0–83.3％且准确度(ACC)为64.8–83.1％。对每个候选物进行的单个ROC分析指示多不饱和脂肪酸(例如FA(22:5)、FA(22:6))产生作为恶性肿瘤标志物的最佳性能。将包含FA(22:6)、FA(22:5)、FA(23:0)和Gb3(42:2)的许多四种恶性肿瘤标志物组合成单一小组产生与单独使用生物标志物时相当的性能(AUC＝0.94；SN＝82.9％；SP＝90.0％；ACC＝85.9％)(图2C)。
与非EGFR突变型相比，EGFR突变型展现出更大的代谢紊乱
根据早先的分析，值得注意的是，与无EGFR突变的那些病例相比，几乎所有决选的恶性肿瘤标志物在有EGFR突变的病例中的丰度都显著更高(图1C)。最突出的观察结果是在有EGFR突变的情况下包含20和22个碳的多不饱和脂肪酸，以及醚连接的PEtn和其相应的lysoPEtn物质的水平的增加。这些趋势针对FA(22:6)和FA(20:5)例示于图3A到B中，说明与无EGFR突变的患者相比，来自有EGFR突变患者的胸腔积液样品在脂质代谢方面展现出更大的紊乱。为了进一步理解NSCLC驱动突变(EGFR/非EGFR)对脂质组学谱的影响，进行了曼-惠特尼U检验、OPLS-DA分析、ROC分析的组合，以鉴别区分有EGFR突变的癌症病例与无EGFR突变的那些的脂质物质(表14)。有趣的是，本发明人观察到，与无EGFR突变的病例相比，包含20和22个碳的多不饱和脂肪酸和PEtn物质在有EGFR突变的病例中显著升高了1.6到2.6倍(表14)。这些脂质物种中的每一种能够区分有EGFR突变的病例和无EGFR突变的病例，AUC在0.67-0.78范围，SN为63.2–89.5％，SP为58.8–82.4％且ACC为66.7–75.0％(表14、图3C和图3D)。与使用单独的生物标志物相比，包含FA(20:5)、FA(22:4)、FA(22:5)、FA(23:0)、PC(41:6)、PE(38:4)、Gb3(42.2)的7种脂质物质的组合产生更优异的性能(AUC＝0.86；SN＝84.2％；SP＝82.4％；ACC＝83.3％)(图3E)。
实施例2–靶向LC-MS测定
研究患者和样品收集
良性受试者(n＝50)、恶性NSCLC患者(n＝92)和其他癌症的恶性患者(n＝21)的临床人口统计数据示于表15中。使用与实施例1相同的样品收集方法。
表15.良性受试者(n＝50)、恶性NSCLC患者(n＝92)和其他癌症的恶性患者(n＝21)的临床人口统计数据
NA：不适用
*包括乳腺癌、输卵管癌、卵巢乳头状浆液性癌、子宫癌、卵巢癌
使用与三重四极杆质谱仪(Xevo TQ-S，Waters公司)介接的超高效液相色谱(UHPLC)系统(Acquity，Waters公司)进行靶向LC-MS-MS分析。
首先使用液-液提取法提取50μl样品，并在UHPLC-MS分析之前，将脂质提取物储存在-80℃。随后将样品提取物干燥并在溶剂'A'和'B'的50:50混合物中重构，如下所述。
使用反相Acquity CSH柱(1.0×50mm，1.7μm粒径，Waters公司)与以下两种溶剂进行色谱分离：包含乙腈、甲醇和水(2:2:1)与0.1％乙酸和0.1％氨溶液的‘A’以及包含异丙醇与0.1％乙酸和0.1％氨溶液的‘B’。使用样品浓缩器(Bio-techne，Minneapolis，MN)干燥所有样品，并在溶剂A和B的50:50(v/v)混合物中重构。
使用如表10中所述的洗脱梯度以ESI阴性模式进行多重反应监测(MRM)和单离子监测(SIM)实验。将柱温维持在45℃，并将来自LC系统的洗脱液导入MS中。将UHPLC自动取样器温度设定为4℃，并且将每个样品的注入体积为2μL。在LC-MS系统上以技术性三次重复处理所有样品。将源温和去溶剂化温度分别设定在150℃和500℃。锥孔气流量(cone gasflow)为150L/h，且去溶剂化气流量为800L/h。毛细管电压为1.00kV。分析物的化合物依赖性MS参数示于表16a和16b中。使用TargetLynx软件(Waters公司)进行色谱峰积分。
表16：用于LC-MS-MS分析的洗脱条件
表17a：使用Xevo TQ-S MS(SIM)的优化的化合物依赖性MS参数
表17b：使用Xevo TQ-S MS(MRM)的优化的化合物依赖性MS参数
随后，将化合物浓度进给到多变量模型，例如SVM和PLS-DA，其中通过留一法交叉验证，确定这些化合物中的3种或更多种的组合可用于区分“良性”非小细胞肺癌胸膜样品和“恶性”非小细胞肺癌胸膜样品，平均AUC大于0.85，SN和SP为80％和以上(图4)。
另外，还确定以上表16、17a和17b中的3种或更多种化合物的组合也可用于区分“良性”胸腔积液样品以及归因于NSCLC和其他癌症(包括鳞状细胞癌、乳腺癌和胃癌)的恶性胸腔积液样品，AUC大于0.80，SN和SP为80％和以上(图5)。

Claims (20)

1.一种针对罹患胸腔积液的患者的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
2.根据权利要求1所述的癌症生物标志物，其中所述生物标志物选自由以下组成的组：(1)脂肪酸(22:6)和羟基脂肪酸(16:0)；(2)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)和脂肪酸(18:2)；(3)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)和脂肪酸(18:1)；(4)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)和脂肪酸(22:5)；(5)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(20:4)；(6)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)和脂肪酸(20:2)；(7)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)和脂肪酸(20:1)；(8)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)和脂肪酸(20:5)；(9)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(22:4)；(10)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(20:2)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)和脂肪酸(16:1)；(11)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)和脂肪酸(20:1)；(12)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)和脂肪酸(18:2)；(13)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)和脂肪酸(18:1)；(14)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)和脂肪酸(16:1)；(15)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)和脂肪酸(20:5)；(16)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(22:4)；(17)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)和脂肪酸(22:5)；以及(18)脂肪酸(22:6)、羟基脂肪酸(16:0)、脂肪酸(20:1)、脂肪酸(18:2)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(16:1)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(20:4)。
3.根据权利要求1所述的癌症生物标志物，其进一步包含FA(23:0)和/或FA(18:3)。
4.根据权利要求1或3所述的癌症生物标志物，其进一步包含选自由以下组成的组中的至少一种：Gb3(42:2)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(34:1)、AcylCar18:2、鞘磷脂(42:2)和GalCer(40:1)/GlcCer(40:1)。
5.根据权利要求4所述的癌症生物标志物，其中所述生物标志物选自由以下组成的组：(1)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(23:0)；(2)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和Gb3(42:2)；(3)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)和脂肪酸(18:2)；(4)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)和羟基脂肪酸(16:0)；(5)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)和溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)；(6)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)和磷脂酰胆碱(o-36:1)；(7)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)和溶血磷脂酰胆碱(22:6)；(8)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)和磷脂酰乙醇胺(38:4)；(9)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)和脂肪酸(18:3)；(10)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)和Gb3(34:1)；(11)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)和AcylCar(18:2)；(12)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)、AcylCar(18:2)和鞘磷脂(42:2)；以及(13)脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、Gb3(42:2)、脂肪酸(18:2)、羟基脂肪酸(16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、磷脂酰胆碱(o-36:1)、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、脂肪酸(18:3)、Gb3(34:1)、AcylCar(18:2)、鞘磷脂(42:2)和GalCer(40:1)/GlcCer(40:1)。
6.根据权利要求5所述的癌症生物标志物，其中所述生物标志物包含脂肪酸(22:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和Gb3(42:2)。
7.一种确定罹患胸腔积液的患者是否患有癌症的方法，所述方法包括：
(i)在从所述患者获得的样品中测量根据前述权利要求中任一项所述的癌症生物标志物的浓度；
(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，
其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者患有癌症，
其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者，并且
其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
8.一种治疗罹患胸腔积液的患者中的癌症的方法，所述方法包括：
(i)在从所述患者获得的样品中测量根据权利要求1到6中任一项所述的癌症生物标志物的浓度；
(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，其中所述对照组包含罹患胸腔积液但无癌症的患者；以及
(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用至少一种抗癌治疗；
其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
9.一种用于检测具有EGFR突变的癌症的癌症生物标志物，其中所述生物标志物是选自由以下组成的组中的至少两种：脂肪酸(20:5)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(18:1)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、磷脂酰胆碱(41:6)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(36:5)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(22:4)、脂肪酸(23:0)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、三酰基甘油54:8和Gb3(42:2)，并且其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
10.根据权利要求7所述的癌症生物标志物，其中所述生物标志物选自由以下组成的组：(1)磷脂酰胆碱(41:6)和脂肪酸(22:5)；(2)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)和脂肪酸(23:0)；(3)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)和脂肪酸(22:4)；(4)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)和磷脂酰乙醇胺(38:4)；(5)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)和Gb3(42:2)；(6)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)和脂肪酸(20:5)；(7)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)和脂肪酸(18:1)；(8)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)和磷脂酰胆碱(P-36:5)；(9)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)和脂肪酸(18:3)；(10)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)和磷脂酰乙醇胺(P-36:5)；(11)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)和磷脂酰胆碱(38:8)；(12)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)和磷脂酰胆碱(40:8)；(13)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)和三酰基甘油(54:8)；以及(14)磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)、脂肪酸(20:5)、脂肪酸(18:1)、磷脂酰胆碱(P-36:5)、脂肪酸(18:3)、磷脂酰乙醇胺(P-36:5)、磷脂酰胆碱(38:8)、磷脂酰胆碱(40:8)、三酰基甘油(54:8)和磷脂酰胆碱(36:5)。
11.根据权利要求7所述的癌症生物标志物，其进一步包含选自由以下组成的组中的至少一种：脂肪酸(20:3)、脂肪酸(20:4)、脂肪酸(22:6)、溶血磷脂酰乙醇胺(P-16:0)、磷脂酰乙醇胺(P-38:5)、脂肪酸(16:2)和磷脂酰胆碱(P-32:1)。
12.根据权利要求10所述的癌症生物标志物，其中所述生物标志物包含磷脂酰胆碱(41:6)、脂肪酸(22:5)、脂肪酸(23:0)、脂肪酸(22:4)、磷脂酰乙醇胺(38:4)、Gb3(42:2)和脂肪酸(20:5)。
13.一种确定罹患癌症的患者是否具有EGFR突变的方法，所述方法包括：
(i)在从所述患者获得的样品中测量根据权利要求9到13中任一项所述的癌症生物标志物的浓度；
(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较，
其中与所述对照组相比，(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加指示所述患者具有EGFR突变，
其中所述对照组包含罹患癌症而无EGFR突变的患者，并且
其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
14.一种治疗具有EGFR突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括：
(i)在从所述患者获得的样品中测量根据权利要求9到13中任一项所述的癌症生物标志物的浓度；
(ii)将(i)中的所述癌症生物标志物的浓度与从对照组获得的样品中的相同癌症生物标志物的浓度进行比较；以及
(iii)如果与所述对照组相比，存在(i)中的所述癌症生物标志物的浓度增加，则向所述患者施用针对具有EGFR突变的癌症的至少一种抗癌治疗；
其中所述对照组包含罹患癌症但无EGFR突变的患者，并且
其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌和鳞状细胞癌。
15.根据权利要求1到6和9到12中任一项所述的生物标志物、或根据权利要求7、8、13和14中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
16.根据权利要求15所述的生物标志物或方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
17.根据权利要求16所述的生物标志物或方法，其中所述非小细胞肺癌是非小细胞肺腺癌。
18.根据权利要求7、8和13到17中任一项所述的方法，其中通过靶向液相色谱质谱测量所述生物标志物的浓度。
19.根据权利要求7、8和13到18中任一项所述的方法，其中所述样品是液体样品。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述液体样品包括胸膜液。
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