CN111208223A - 一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢物组合及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物，由葡萄糖醛酸、神经节苷脂、苦蘵甾醇和苯硫酚4种代谢物中的一种或一种以上组成。本发明还公开了一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，本发明筛选的得到的代谢组合物中，葡萄糖醛酸、神经节苷脂的结合指示率为0.885，苦蘵甾醇和苯硫酚的结合指示率为0.953。

Description

一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代 谢物组合及其筛选方法
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一种用于心脏死亡后捐献受术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物及筛选方法。
背景技术
移植肾延迟复功(delayed graft function,DGF)是肾移植术后一周内无法恢复生理功能，需要透析过渡的临床现象，是影响移植肾存活的独立危险因素[P.N.C.D.S.M.etal.,Delayed graft function in kidney transplantation.Lancet,2004. 364(9447)]。近年来，随着公民心脏死亡后捐献(donation after cardiac death，DCD) 的推广，DGF的发生率显著增高。一方面，DCD肾脏的获取需供体心脏功能停止后方可进行，因此供肾会经历比活体供肾更长的热缺血时间，肾微血管血流应变力改变和肾小管损伤增加；另一方面，为解决器官短缺危机，越来越多的扩大标准的器官捐献者(expanded criteria donor,ECD)被纳入DCD肾移植供体名单，使得DGF发生率进一步增加，且预后的肾功能完整性不明。在一些医疗中心DCD 肾脏DGF发生率甚至可高达30-50％[S.G.Yarlagadda,S.G.C.,A.X.Garg,M. Doshi,E.Poggio,R.J.Marcus,et al.,Marked variation in thedefinition and diagnosis of delayed graft function:a systematicreview.Nephrol Dial Transplant,2008.23:p. 2995-3003]，极大加剧患者医疗负担，也分流了诸多医疗资源来应对DGF处置。
代谢组学是后基因时代出现的一门新兴技术研究领域，是关于定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。它利用高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，对生命活动终端的小分子代谢物进行动态跟踪分析，并借助多元统计分析方法、模式识别技术等信息处理手段，从分子层面上观察机体对疾病等内外界因素干扰的响应规律，可用于揭示疾病的病理机制，或疾病的早期筛查。肾脏作为处理代谢产物的重要器官，几乎每个细胞都布满对各类代谢物质的感受器，用于对体液状态做出精确实时的感知，同时还储备着丰富的线粒体和内质网用于及时有效的调控，因此肾脏既对所处的代谢环境敏感又对其有重大的反作用。目前基于代谢组学技术的肾移植延迟复功事件分析均来自于受体术后的样本，对受体术前的差异性分析尚未见报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物及筛选方法。利用本发明的筛选方法得到的代谢组合物可以方便、高效地对移植肾延迟复功进行术前初步筛查。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物，由葡萄糖醛酸、神经节苷脂、苦蘵甾醇和苯硫酚4种代谢物中的一种或一种以上组成。
一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，该方法用于筛选以上所述的代谢组合物，包括以下步骤：
(1)在进行肾移植手术前，收集受体血液样品，进行预处理；
(2)应用超高效液相色谱系统UHPLC对预处理后的样品进行分离；
(3)对经步骤(2)分离后的样品进行质谱分析；
(4)对步骤(3)得到的原始数据进行处理，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据；
(5)从数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，得到可识别的代谢物；
(6)选择每个样品中均测到的代谢物做进一步分析，先进行归一化处理，再进行单因素统计分析，根据student t检验p值<0.05为筛选标准，进行筛选；
(7)应用Simca软件和MetaboAnalyst网站进行多维统计分析，构建统计分析模型，多维统计学分析包括主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析 OPLS-DA；在PCA的得分图中，DGF受体(R-DGF)组与稳定对照组(R-Stable) 的代谢物信息分别位于模型的不同位置，分类趋势明显，记对照样品组的坐落区域为阴性区域，DGF受体组的坐落区域为阳性区域。
(8)根据OPLS-DA模型得到变量权重值VIP，以VIP>1.5为标准筛选，得到初筛代谢物；
(9)采用HMDB数据库对初筛代谢物进行检索比对，得到用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物。
进一步地，步骤(1)具体为：在进行肾移植术前取受体全血3～5mL，置于不加抗凝剂的EP管中，0～5℃下6000～12000rpm离心5～12min，取上清液，经液氮速冻后，置于-85～-75℃保存待用；
预处理方法：样品于4℃环境下解冻后，与预冷甲醇按照1：3体积比混合均匀，静置30s，振荡30s，13500rpm离心20min，取上清，作为分析样品。
进一步地，步骤(2)中采用HILIC色谱柱，柱温45℃，进样量5μL，流动相组成：流动相A为0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B为0.1％甲酸/甲醇(v/v)；整个分析过程中将样品置于10℃自动进样器中。
进一步地，步骤(3)中分别采用电喷雾电离ESI正离子和负离子模式进行检测。
进一步地，步骤(4)中，处理步骤为：
a)进行谱峰对齐，以降低谱峰漂移的影响；
b)移除残余水峰和基线区域，并按谱峰对谱数据进行分段积分，降低数据的维数；
c)利用概率商归一化(PQN)方法进行数据归一化，减小稀释效应的影响；最后得到每行为分析样品，每列为代谢物谱峰信息的二维CSV数据矩阵。
进一步地，步骤(5)中，设定匹配因子在80％之上的化合物为可识别。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首次利用代谢组学方法筛选肾移植术前受体血清中预警移植肾延迟复功的代谢物组合。本发明对发生延迟复功的受体和术后肾功能稳定的受体血清进行检测得到相应的代谢轮廓图谱，构建OPLS-DA模型，这些模型能辨别血清的代谢物情况，其代谢轮廓能够初步判断受体术前是否具有发生延迟复功的风险。利用本发明方法可以对肾移植受体进行术前筛查，对延迟复功的高危受体进行代谢配型，尽可能减少延迟复功的发生概率。
(2)本发明筛选得到的代谢物组合中，正离子模式下：葡萄糖醛酸、神经节苷脂构成的组合预测延迟复功的ROC曲线下面积为0.885，公式为Score＝X(葡萄糖醛酸)*0.01+X(神经节苷脂)*0.001-6.182，当得分＞3.97时模型敏感性为75.17％，特异性为90.35％；负离子模式下：苦蘵甾醇和苯硫酚构成的组合预测延迟复功的ROC曲线下面积为0.953，公式为Score＝X(苦蘵甾醇)*46.060+X (苯硫酚)*-119.082+3.290，当得分≥1.17时模型敏感性为80.82％，特异性为 99.25％。移植肾延迟复功组和肾功能恢复稳定组存在显著差异，代谢物的单独指示率为0.821～0.935。
(3)利用本发明的方法可对病例样本进行全代谢组检测，获取一系列鉴别高危受体相关的差异性标志物，为后续研发代谢干预方案构建一套DCD肾移植管理、预警、干预的临床处置决策系统，推动移植医学朝更精准化、更个性化方向发展。
附图说明
图1是Receptor-DGF(DGF)组和Receptor-Stable(Stable)组血清样本的单因素统计分析结果。
图2是Receptor-DGF(DGF)组和Receptor-Stable(Stable)组血清样本的 OPLS-DA分析结果图。
图3是正负离子模式下的代谢组合物对延迟复功的单独指示率和受体术后 DGF(Receptor-DGF)组和术后稳定(Receptor-Stable)组的组间比较。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。
实施例1
肾移植术后DGF是常见的临床不良事件，以术后1周内尿量偏少，需要透析过渡为诊断标准。来源于同一供体的两个肾脏在不同受体内会出现功能恢复的差异，根据受体术后肾功能恢复的情况，对DCD肾移植受体进行分组：术后发生DGF的受体为Receptor-DGF(DGF)组，肾功能恢复稳定的受体为 Receptor-Stable(Stable)组，从以上2组中获取术前血液样本。
肾功能恢复稳定的定义为术后血肌酐稳定在基线值20％波动范围内，术后未出现急性排异、淋巴漏、尿瘘、肾周血肿、多瘤病毒感染等并发症。急性排异的诊断由科室移植病理医生根据Banff 2003标准作诊断。
样品收集
对于符合入选标准且已提供知情同意受体，在肾移植手术前，取受体的全血 3～5mL，置于不加抗凝剂的EP管中，0～5℃下6000～12000rpm离心5～12min，取上清液1ml于2ml eppendorf管，分装成两份，经液氮速冻后，置于-85～-75℃超低温冰箱保存待用。样品储存和运输置于干冰环境。
样品预处理
样本于4℃环境下缓慢解冻后，与-20℃的预冷甲醇按照1：3体积比涡旋混合均匀，-20℃静置30s，振荡30s，13500rpm离心20min，取上清作为分析样品。样品检测
(1)仪器：样品应用Dionex UltiMate 3000UHPLC-Bruker Impact Ⅱ Q-TOF 进行分离。柱温45℃，进样量5μL；HILIC色谱柱的流动相组成：流动相A：0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B：0.1％甲酸/甲醇(v/v)；梯度洗脱程序如下：0～5min为5％流动相B；5～10min流动相B从5％线性变化到60％；10～20min流动相B从60％线性变化到98％；20～20.5min流动相B维持在98％；20.5～22.5min流动相B 从98％线性变化到100％；22.5～23min流动相B维持在100％，23～30min流动相B从100％线性变化到5％，以上所述的百分数均为体积分数。整个分析过程中将样品置于10℃自动进样器中。
(2)为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中随机插入质控(Quality Control,QC)样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可行性。QC样品的预处理流程与样品相同。
(3)质谱条件：分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。质谱参数：Mass Range:50-1000m/z，Spectra Rate:2.00Hz，Capillary:Positive mode 4500V,Negative mode 3500V，End Plate Offset:500V，Nebulizer:2.0Bar， Dry Gas:8.0L/min，Dry Temperature:200℃，Funnel 1RF:200Vpp，Funnel 2RF: 200Vpp，Quadrupole IonEnergy:5.0Ev，Pre Pulse Storage:5.0μs，Collision Energy: for MS 5.0eV,for MS/MS20-50eV，Circle Time:1.0s。
数据处理
将原始数据按质量数生成离子流提取数据，经Proteo Wizard转换成.mzML 格式，采用XCMS进行峰匹配，去噪音，去卷积等操作，生成MHD数据；将 MHD数据导入工具包，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据。然后从实验室自建数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，设定匹配因子在80％之上的化合物为可识别，这样可以排除非内源性代谢物(药物、试剂的代谢物)的影响，提高准确率。CSV数据经取对数，总体信号值做归一化处理。
为尽量减少缺失值的误差，筛选每个样本中均测到的化合物做进一步分析。对潜在代谢物先进行归一化处理，再进行单因素统计分析，根据student t检验p 值<0.1(经FDR校正)的原则筛选具有统计学意义的差异性代谢物。单因素统计分析方法包括t检验和变异倍数分析，以及综合以上两种方法的利用R软件绘制散点图。然后应用Simca软件和MetaboAnalyst网站(www.metaboanalyst.ca) 进行多维统计分析，构建统计分析模型。多维统计分析包括无监督的主成分分析 (PCA)和有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。根据不同模型 (OPLS-DA)中的S载荷图获得对分类有贡献的特征性变量及其贡献大小，并通过S载荷图和变量在投影中的重要性(Variable Importance in the Projection,VIP>1.5)找到潜在生物标记物(即潜在代谢物)。对经过单因素统计分析、多维统计分析筛选后的初筛代谢物采用HMDB数据库(www.hmdb.ca)检索比对。
统计学方法
临床资料分析：所有连续变量用均数±标准差(X±SD)表示，计数资料以频数及百分数表示。非匹配计量资料的比较，若符合正态分布，采用t检验；如不符合正态分布，进行对数变换并进行正态性检验。对数变换后如符合正态分布，采用t检验，如仍不符合正态分布，则采用Mann-Whitney分析。所有数据用SPSS 11.5统计软件分析，假设检验中，P<0.05表示差异有统计学意义。
代谢特征分析：代谢物信号值与外标信号值相比去除系统误差，用t检验分析组间代谢物含量的统计学差异，利用VB 6.0自编程序对数据进行降维和特征提取，进行正交偏最小二乘法(OPLS)统计分析；利用留一法(leave-one-out) 建立预测模型，对鉴定出的差异性代谢物的预测敏感性和特异性进行验证。
结果
对Receptor-DGF组和Receptor-Stable组血清样本数据分别进行正、负离子模式代谢产物分析。将Receptor-DGF组和Receptor-Stable组所得的数据经归一化处理后，呈正态分布，在此基础上进行t检验。图1A为两组相比较时， Receptor-DGF组相对于Receptor-Stable组的变化倍数，FC表示Fold change，图中虚线为变化等于2倍(即Log2(FC)＝1)的临界线，黑色圆点表示变化大于等于2倍(即Log2(FC)≥1)的化合物，灰色圆点表示变化小于2倍(即Log2 (FC)<1)的化合物；倍数改变大于2倍的化合物进行下一步筛选；图1B为Receptor-DGF组相对Receptor-Stable组的火山图，其中，黑色圆点为有差异显著性的化合物，灰色圆点为无显著差异的化合物，经t检验后，满足p<0.05(FDR 修正)的化合物被筛选出来如图1B所示。
OPLS-DA模式下不同化合物指标组合以及综合Receptor-DGF(DGF)组和Receptor-Stable(Stable)组血清样本样本分布图，显示通过所选择的化合物作为分组标准后，Receptor-DGF组和Receptor-Stable组显著分为两个群落如图2所示，图2为二维OPLS-DA scores plot图，其中，横坐标为特征系数，纵坐标为每个维度中解释的物质信号强度(Y)的变化量。由OPLS-DA的模型验证permutation test图可以得到OPLS-DA模型的预测率、解释率分别用为0.737和0.956。
根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(Variable Importance for theProjection, VIP)来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异代谢物。
本方法以VIP>1.5且单因素统计分析(包括t检验和变异系数分析)p值<0.05 为筛选标准，分别获得Receptor-DGF和Receptor-Stable组差异代谢物组合，最终筛选出葡萄糖醛酸、神经节苷脂、苦蘵甾醇和苯硫酚4种代谢物，如表1所示。 4种代谢物中的一种或一种以上组成的组合可以预警移植肾延迟复功的发生。每种代谢物在Receptor-DGF组的含量相比于Receptor-Stable组用Fold Change(FC) 表示。FC>1表示该代谢物在延迟复功受体含量增高，且含量越高FC值越大；同理，FC<1表示该代谢物在延迟复功受体含量降低，且含量越低FC值越小。其中葡萄糖醛酸、神经节苷脂构成的代谢组合评分Score＝X(葡萄糖醛酸)*0.01+X(神经节苷脂)*0.001-6.182，其中，X为括号内物质的质谱峰面积检测值，当评分Score≥3.97时预测延迟复功的敏感性为75.17％，特异性为90.35％；苦蘵甾醇和苯硫酚构成的代谢物组合评分Score＝X(苦蘵甾醇)*46.060+X(苯硫酚)*-119.082+3.290，其中，X为括号内物质的质谱峰面积检测值，当评分 Score≥1.17时模型敏感性为80.82％，特异性为99.25％。
表1筛选后的预警DGF代谢物组合
Figure BDA0002364076610000081
4种代谢物对DGF的单独指示率如图3(A-D)所示，具体地，代谢物的单独指示率范围为0.821～0.935。正离子模式下：葡萄糖醛酸、神经节苷脂构成的组合预测延迟复功的ROC曲线下面积为0.885，当得分Score≥3.97时模型敏感性(即纵坐标)为75.17％，特异性(即横坐标)为90.35％，如图3E所示，图 3E为葡萄糖醛酸、神经节苷脂构成的代谢物组合预测延迟复功的ROC曲线。负离子模式下：苦蘵甾醇和苯硫酚构成的代谢组合物预测延迟复功的ROC曲线下面积为0.953，当得分Score≥1.17时模型敏感性(即纵坐标)为80.00％，特异性(即横坐标)为71.43％，如图3F所示，图3F为苦蘵甾醇和苯硫酚构成的代谢组合物预测延迟复功的ROC曲线。ROC曲线指的是受试者工作特征曲线，ROC 曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。图3(A-1)、图3(B-1)、图 3(C-1)、图3(D-1)中，纵坐标表示：物质丰度的高低所显示的质谱峰面积，横坐标表示：受体术后DGF(Receptor-DGF)组和受体术后稳定(Receptor-Stable) 组；图中的黑点表示Receptor-DGF组或者Receptor-Stable组中样本；图3(A-1) 为Receptor-DGF组，Receptor-Stable组对于葡萄糖醛酸各个样本的分布，通过该物质的丰度高低，可以区分两组差异性；同样地，图3(B-1)为Receptor-DGF 组，Receptor-Stable组对于神经节苷脂各个样本的分布，通过该物质的丰度高低，可以区分两组差异性；图3(C-1)为Receptor-DGF组，Receptor-Stable组对于苦蘵甾醇各个样本的分布，通过该物质的丰度高低，可以区分两组差异性；图3 (D-1)为Receptor-DGF组，Receptor-Stable组对于苯硫酚各个样本的分布，通过该物质的丰度高低，可以区分两组差异性。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物，其特征是，由葡萄糖醛酸、神经节苷脂、苦蘵甾醇和苯硫酚4种代谢物中的一种或一种以上组成。
2.一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，其特征是，该方法用于筛选权利要求1所述的代谢组合物，包括以下步骤：
(1)在进行肾移植手术前，收集受体血液样品，进行预处理；
(2)应用超高效液相色谱系统UHPLC对预处理后的样品进行分离；
(3)对经步骤(2)分离后的样品进行质谱分析；
(4)对步骤(3)得到的原始数据进行处理，每个样品生成包含核质比、保留时间、峰面积三维信息的CSV数据；
(5)从数据库中搜索，根据匹配因子推测识别代谢物，得到可识别的代谢物；
(6)选择每个样品中均测到的代谢物做进一步分析，先进行归一化处理，再进行单因素统计分析，根据student t检验p值<0.05为筛选标准，进行筛选；
(7)应用Simca软件和MetaboAnalyst网站进行多维统计分析，构建统计分析模型，多维统计学分析包括主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA；
(8)根据OPLS-DA模型得到变量权重值VIP，以VIP>1.5为标准筛选，得到初筛代谢物；
(9)采用HMDB数据库对初筛代谢物进行检索比对，得到用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物。
3.根据权利要求2所述的一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，其特征是，步骤(1)具体为：在进行肾移植术前取受体全血3～5mL，置于不加抗凝剂的EP管中，0～5℃下6000～12000rpm离心5～12min，取上清液，经液氮速冻后，置于-85～-75℃保存待用；
预处理方法：样品于4℃环境下解冻后，与预冷甲醇按照1：3体积比混合均匀，静置30s，振荡30s，13500rpm离心20min，取上清，作为分析样品。
4.根据权利要求2所述的一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，其特征是，步骤(2)中采用HILIC色谱柱，柱温45℃，进样量5μL，流动相组成：流动相A为0.1％甲酸/水(v/v)，流动相B为0.1％甲酸/甲醇(v/v)；整个分析过程中将样品置于10℃自动进样器中。
5.根据权利要求2所述的一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，其特征是，步骤(3)中分别采用电喷雾电离ESI正离子和负离子模式进行检测。
6.根据权利要求2所述的一种用于心脏死亡后捐献受体术前预警移植肾延迟复功的代谢组合物的筛选方法，其特征是，步骤(5)中，设定匹配因子在80％之上的化合物为可识别。
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