CN108414635A - 一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法,涉及一种天然植物药有效成分作用机制的研究方法。本发明要解决现有的单一的药理学方法不能系统、全面地评价天然植物药有效成分作用机制的问题。通过以下步骤实现:(1)采用超高液相色谱‑串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物;(2)筛选出12个潜在脂毒性相关差异代谢物并进行鉴定;(3)筛选出甜茶素抗脂毒性的4个代谢通路和通路上相关酶和基因并进行分析。本发明可更全面、高效、快速的从细胞水平无偏向性的综合评价甜茶素抗脂毒性作用机制,为天然植物药有效成分的细胞代谢组学及作用机制的阐明提供示范性依据。
Description
技术领域
本发明属医药领域。具体是一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,已成为严重危害人类健康的第三大慢性病,其中2型糖尿病占90%以上,由此引发的心血管和微血管并发症成为致死、致残的主要原因。因此,寻找能够预防和干预2型糖尿病发病过程的药物并阐明其作用机制,对于提高我国人民健康水平具有非常重要的意义和紧迫性。
长久以来,医药研究者一直致力于2型糖尿病发病机制及治疗药物的研究。糖尿病发病机制复杂,包括胰岛细胞凋亡、胰岛素抵抗、炎症、肠道菌群及环境等。其发展过程伴随着糖、脂肪、蛋白质等诸多物质代谢,是一个涉及多环节、多因素、多网络的动态过程,脂毒性是引起胰岛细胞凋亡的重要原因,然而,脂毒性引起胰岛细胞凋亡的作用机制未得以阐明。
当下的口服化学降糖药物多针对糖尿病发病机制中某个单一环节和靶点,在治疗上存在较大的局限性,不仅降糖效果欠佳,而且还存在低血糖、心血管事件、肝损伤、体重增加等副作用。天然植物药的应用在祖国传统医学包括中医药及民族医药中均有悠久的历史,在中华民族五千年生生不息的历史长河中为本民族的健康繁衍起着保驾护航的作用。天然植物药经过几千年的实践,在防治糖尿病方面积累了大量的宝贵经验,而且药物疗效确切,副作用较小。广西瑶山甜茶(Rubus suavissimus S.Lee),是广西壮族自治区民间壮、瑶族人民用于治疗糖尿病、肥胖症的民族常用药,疗效确切,被喻为瑶药中的“神茶”,在广西民间已有几百年的使用历史。甜茶素为民族药广西瑶山甜茶的主要成分之一,是由斯替维醇和葡萄糖结合而成的四环二萜苷,也是甜茶降低血糖和血脂的主要有效成分。目前对甜茶素药理作用及作用机制开展了一定程度的研究,但常规单一的药理学方法观察组织或器官中的一个或几个典型指标以评价甜茶素的药效,并不能系统全面地阐述甜茶素的作用机制,制约了它的开发利用。
代谢组学(metabonomics)是关于生物体系受刺激或扰动后其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学的全局、动态观念与植物药多成分作用于多靶点的整体观研究思路不谋而合,它基于系统和整体对植物药的作用机制来进行研究将有助于客观科学的反映在药物作用过程中对系统的动态调控及影响。细胞代谢组学研究胞内和细胞膜所有小分子代谢物,能定量分析单个细胞或单一类型细胞株的代谢调控,通过监控正常细胞和特定时间和条件下所有小分子代谢物质的波动情况,揭示活细胞中各种不同代谢通路之间的联系,是揭示药物作用机制的重要工具。代谢组学研究流程通常包括生物样本采集、预处理、样品分析、数据处理、标志物的鉴定及生物学意义阐释等过程。其技术主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GS/MS)联用技术、液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术等。通过多变量统计手段进行数据处理和模式识别,以此获得生物样品中全部小分子化合物的定量化学信息,然后采用化学计量学/生物信息学方法从海量的数据中总结规律,识别起效生物标志物,阐明起效所调控的代谢网络与靶点群。在代谢组学的各种分析手段中,超高液相色谱-串联质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术作为一种先进的分离分析技术,已被广泛应用于代谢组学领域的研究当中,其强大的分析能力被公认为是复杂样品最好的分析技术之一。
目前已有报道利用代谢组学技术研究天然植物药的作用机制。Zhao X等运用超高液相色谱-质谱联用技术研究了苗药灯盏细辛治疗血瘀证的作用机制,发现胆酸、苯基丙氨酸、犬尿喹啉酸在治疗后的代谢网络调控中起了重大的作用。哈木拉提·吾甫尔应用代谢组学技术发现异常黑胆质成熟剂通过调节异常黑胆质型肝癌模型的氨基酸代谢、糖代谢等能量代谢紊乱和异常黑胆质型支气管哮喘大鼠体内氨基酸代谢与能量代谢途径发挥预防和治疗的作用。天然植物药广西瑶山甜茶主要有效成分甜茶素抗脂毒性的细胞代谢组学研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释甜茶素发挥抗脂毒性的作用机制的难点,提供一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法,为甜茶素进一步开发利用提供依据。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法,采用基于超高液相色谱-串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物,获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出十二个潜在脂毒性相关的生物标志物并进行鉴定,通过metaboanalyst在线分析软件筛选出甜茶素抗脂毒性的四个代谢通路和代谢通路上相关酶和基因。
所述获得代谢指纹图谱的具体实现步骤如下:
1.所需细胞样品的采集:收集细胞放入离心管,置于液氮和37℃水浴箱中反复冻融五个周期(每个周期为液氮5min,37℃水浴5min),进行猝灭。
2.细胞样品的预处理和保存:在离心管中加入1mL乙腈,4℃离心10min(离心转速为13000g·min-1)进行细胞代谢物的提取。
3.样品质谱分析:对收集的各组大鼠胰岛素瘤细胞样品进行方法学考察,建立超高液相色谱-串联质谱技术检测分析大鼠胰岛素瘤细胞样品指纹图谱分析方法,对细胞样品依次进行超高液相色谱-质谱分析。
超高液相色谱分析条件:采用Waters公司超高压液相色谱系统进行检测,HSS T3色谱柱,色谱柱规格为100mm×2.1mm,固定相粒径1.8μm,柱温37℃,流动相A乙腈,B 0.1%甲酸水。梯度洗脱:0~3min,3%A;3~8min,3~13%A;8~12min,13~20%A;12~17min,20~35%A;17~22min,35~60%A;22~30min,60~95%A;30~32min,95%A;32~34min,95~3%A;34~36min,3%A。流速为0.4mL·min-1,进样量3μL。
质谱条件:应用Waters公司高精度的三重四级杆质谱进行检测,其条件为电喷雾离子ESI源,正离子模式下扫描:毛细管电压3.0kV,离子源温度120℃,脱溶剂气温度350℃,锥孔电压40V,离子能量1.0V锥孔气流量50L·h-1,脱溶剂流量600L·h-1,在碰撞能量为4eV情况下扫描时间为0.5s,间隔扫描时间0.02s;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液;扫描范围m/z 50~1000,以Centriod模式进行数据采集。对九个样品重复进样六针,考察重现性,确保获得可靠数据。
(4)数据预处理:采用Waters公司的Masslynx软件进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理,得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间等数据。
(5)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物:在获得超高液相色谱-串联质谱数据后,采用SIMCA-P12.0软件对导入的数据对对照组、棕榈酸模型组、甜茶素干预组三组样本进行主成分分析和偏最小方差判别分析;主成分分析作为无监督式学习方法,可以真实反映样本的聚类情况,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用;进一步采用有监督式方法进行建模分析,所建模型变量的拟合能力指数R2Y为0.974,模型的预测指数Q2cum为0.955,模型的参数R2Y表示模型的解释率,Q2cum表示模型的预测率;空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛素瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图中的每一个点代表一个变量,变量对分类的重要程度由变量重要性投影的大小来衡量,并依据其对变量进行筛选;采用SPSS16.0软件进行统计学处理,选择变量重要性投影值>1且具有统计学意义的变量作为潜在生物标志物;基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图表示主成分分析PCA得分图,图中每一个点代表一个样品,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用;按基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图的结果,使用SPSS统计软件进行偏最小方差分析PLS-DA得到空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛细胞瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图,能够突显出空白组和棕榈酸诱导组差异的最大化合物,可被认为是与脂毒性相关的潜在标志物。
(6)潜在生物标志物的鉴定:根据变量对应的保留时间和分子量,检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定,并与文献进行比较,最终鉴定了十二个与脂毒性相关的差异代谢产物:溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、神经酰胺、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂,其中溶血卵磷脂、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2和磷脂酰乙醇胺上调,磷脂酰丝氨酸、心磷脂、神经酰胺、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂下调。
(7)差异代谢物的分析:将筛选鉴定出的差异代谢产物上传到metaboanalyst在线分析软件,采用细胞代谢物数据库进行代谢物匹配,对甜茶素干预后的大鼠胰岛细胞瘤细胞受影响显著的代谢通路进行富集分析和拓扑分析,构建分析代谢通路图;在构建的代谢通路图中,四条代谢通路上的基因和酶形成相互交错的网络,通过代谢通路分析后所得影响值,当影响值大于0.5时,该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响,在使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图中,依据代谢通路的p值和通路重要值确定甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路和花生四烯酸代谢通路和磷脂酶D通路均与脂毒性相关,甜茶素干预大鼠胰岛细胞瘤细胞后起效最为相关的是甘油磷脂代谢通路;在四个代谢通路中所涉及的酶和基因网络联系图中,有二十三个酶和二十八个基因参与了脂毒性的形成。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
(1)本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对大鼠胰岛细胞瘤细胞样品内代谢产物进行分析,发现细胞脂毒性相关差异代谢物。
(2)进一步通过该技术分析发现甜茶素抗脂毒性的标志物的含量变化,对差异细胞代谢物进行代谢通路分析,得到甜茶素抗脂毒性的代谢通路。
(3)发现代谢通路中相关酶和基因,有可能是甜茶素抗脂毒性的潜在靶点。
(4)从整体水平全面、快速、高效综合评价甜茶素抗脂毒性的作用机制,为天然植物药有效成分的细胞代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
附图说明
图1是正离子模式下基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞代谢指纹图谱。
图中,A为对照组,B为棕榈酸诱导组,C为甜茶素干预组。
图2基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图。
图中,正方形代表对照组,圆形代表棕榈酸诱导组,三角形代表甜茶素干预组。模型变量的拟合能力指数(R2Y)为0.974,模型的预测指数Q2cum为0.955。
图3是空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛细胞瘤细胞的PLS-DA载荷图。
图4是把鉴定的内源性代谢物输入metaboanalyst平台进行在线分析,构建的代谢通路图。
图5是使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图。
图中,A为甘油磷脂代谢通路、B为鞘脂代谢通路、C为磷脂酶D代谢通路、D为花生四烯酸代谢通路。
图6是四个代谢通路中所涉及的基因网络联系图。
图中,长方形表示所涉及的酶,椭圆形表示所涉及的基因。
具体实施方式:
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明方法的具体实现过程如下:
一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法,采用基于超高液相色谱-串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物,获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出十二个潜在脂毒性相关的生物标志物并进行鉴定,通过metaboanalyst在线分析软件筛选出甜茶素抗脂毒性的四个代谢通路和代谢通路上相关酶和基因。
所述获得代谢指纹图谱的具体实现步骤如下:
1.所需细胞样品的采集:取生长状态良好的大鼠胰岛素瘤细胞接种于96孔培养板,按随机原则分为对照组、棕榈酸模型组和甜茶素干预组,每组三个样品,把收集到细胞的离心管放到液氮和37℃水浴箱中反复冻融五个周期,每个周期为液氮5min,37℃水浴5min,进行淬灭。
2.细胞样品的预处理和保存:在离心管中加入1mL乙腈,在温度4℃条件下离心10min,离心转速为13000g·min-1,进行细胞代谢物的提取。
3.样品质谱分析:对收集的各组大鼠胰岛素瘤细胞样品进行方法学考察,建立超高液相色谱-串联质谱技术检测分析大鼠胰岛素瘤细胞样品指纹图谱分析方法,对细胞样品依次进行超高液相色谱-质谱分析。
超高液相色谱分析条件:采用Waters公司超高压液相色谱系统进行检测,HSS T3色谱柱,色谱柱规格为100mm×2.1mm,固定相粒径1.8μm,柱温37℃,流动相A乙腈,B 0.1%甲酸水。梯度洗脱:0~3min,3%A;3~8min,3~13%A;8~12min,13~20%A;12~17min,20~35%A;17~22min,35~60%A;22~30min,60~95%A;30~32min,95%A;32~34min,95~3%A;34~36min,3%A。流速为0.4mL·min-1,进样量3μL。
质谱条件:应用Waters MS公司高精度的三重四级杆质谱进行检测,其条件为电喷雾离子ESI源,正离子模式下扫描:毛细管电压3.0kV,离子源温度120℃,脱溶剂气温度350℃,锥孔电压40V,离子能量1.0V锥孔气流量50L·h-1,脱溶剂流量600L·h-1,在碰撞能量为4eV情况下扫描时间为0.5s,间隔扫描时间0.02s;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液;扫描范围m/z 50~1000,以Centriod模式进行数据采集。对九个样品重复进样6针,考察重现性,确保获得可靠数据。
4.数据预处理:采用Waters公司的Masslynx软件进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理,得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间等数据,如图1所示。
5.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物:在获得超高液相色谱-串联质谱数据后,采用SIMCA-P12.0软件对导入的数据对对照组、棕榈酸模型组、甜茶素干预组三组样本进行主成分分析和偏最小方差判别分析。主成分分析作为无监督式学习方法,可以真实反映样本的聚类情况,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用。进一步采用有监督式方法PLS-DA进行建模分析,所建模型变量的拟合能力指数R2Y为0.974,模型的预测指数Q2cum为0.955,模型的参数R2Y表示模型的解释率,Q2cum表示模型的预测率;空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛素瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图中的每一个点代表一个变量,变量对分类的重要程度由变量重要性投影的大小来衡量,并依据其对变量进行筛选;采用SPSS16.0软件进行统计学处理,选择变量重要性投影值>1且具有统计学意义的变量作为潜在生物标志物;基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图表示主成分分析PCA得分图,图中每一个点代表一个样品,如图2所示,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用;按基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图的结果,使用SPSS统计软件进行偏最小方差分析PLS-DA得到空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛细胞瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图,如图3所示,能够突显出空白组和棕榈酸诱导组差异的最大化合物,可被认为是与脂毒性相关的潜在标志物。
6.潜在生物标志物的鉴定:根据变量对应的保留时间和分子量,检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN等对潜在生物标志物进行鉴定,并与文献进行比较,最终鉴定了十二个与脂毒性相关的差异代谢产物:溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、神经酰胺、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂,其中溶血卵磷脂、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2和磷脂酰乙醇胺上调,磷脂酰丝氨酸、心磷脂、神经酰胺、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂下调,经甜茶素干预后,扰乱的标志物回调,如表1所示。
表1对照组、棕榈酸诱导组和甜茶素组的大鼠胰岛素瘤细胞差异代谢产物和含量变化趋势
(*P<0.05vs空白对照组,﹟P<0.01vs甜茶素组)
7.差异代谢物的分析:将筛选鉴定出的差异代谢产物上传到metaboanalyst在线分析软件,采用细胞代谢物数据库进行代谢物匹配,对甜茶素干预后的大鼠胰岛细胞瘤细胞受影响显著的代谢通路进行富集分析和拓扑分析,构建分析代谢通路图;如图4所示,在构建的代谢通路图中,四条代谢通路上的基因和酶形成相互交错的网络。通过代谢通路分析后所得影响值,当影响值大于0.5时,认为该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响。在使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图中,如图5所示,依据代谢通路的p值和通路重要值确定甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路和花生四烯酸代谢通路和磷脂酶D通路均与脂毒性相关,甜茶素干预大鼠胰岛细胞瘤细胞后起效最为相关的是甘油磷脂代谢通路。在四个代谢通路中所涉及的酶和基因网络联系图中,如图6和表2所示,在四个代谢通路所涉及的酶和基因网络图中有二十三个酶和二十八个基因参与了脂毒性的形成。
表2根据代谢标志物结果搜索KEGG查询到与甜茶素抗脂毒性相关的酶和基因
①甘油磷脂代谢通路所涉及的相关基因和酶分析及相关差异代谢物在对照组、棕榈酸诱导组和甜茶干预组间的相对含量变化趋势
磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂是细胞膜结构的重要组成部分,参与细胞各种重要的生理功能。磷脂酰胆碱是甘油磷脂家族中重要的一员,参与细胞双层膜的构成,在细胞代谢、细胞信号转导中起重要作用。在把鉴定的内源性代谢物输入metaboanalyst平台进行在线分析所构建的代谢通路图中,磷脂酰胆碱被细胞内的磷脂酶A2水解成溶血卵磷脂,后者是许多病理生理改变的特征性代谢物,同时脂肪酸的氧化能促进溶血卵磷脂的合成。如表1所示,棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺升高,磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰甘油磷脂降低,甜茶素干预后的溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺相对含量较之诱导组的降低,磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰甘油磷脂相对含量升高,推测甜茶素可能是抑制了磷脂酰胆碱的水解和脂肪酸的氧化作用从而保护大鼠胰岛素瘤细胞,甘油磷脂代谢通路是甜茶素改善细胞脂毒性的重要通路,Crls1、PLA2G4B、Ptdss1、Pisd、PCS和PGS1基因参与了上述差异代谢物的相互转化。
②鞘脂代谢通路所涉及的相关基因和酶分析及相关差异代谢物在对照组和棕榈酸诱导组间的相对含量变化趋势
在把鉴定的内源性代谢物输入metaboanalyst平台进行在线分析所构建的代谢通路图中,SPT、DHSR、LAG1、DEGS、UGCG、NAHA基因参与了神经酰胺、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GA2和鞘氨醇的相互转化。鞘脂类属于脂质第二信使家族,在细胞的凋亡过程中起重要作用,神经酰胺作为鞘脂的一种,是生物活性中间体,作为脂质介质能促进细胞凋亡。神经酰胺能通过SPT、DHSR、LAG1、DEGS、UGCG、NAHA等基因转化为神经节苷脂GA2和神经节苷脂GM2。在胰岛β细胞中脂性凋亡的主要原因是饱和脂肪酸和脂毒性相关的神经酰胺代谢,神经酰胺通过两个途径参与细胞凋亡,一个是外在途径,通过激活启动细胞死亡受体如肿瘤坏死因子,另一个是内在途径,介导线粒体通过bcl-2家族蛋白的参与引起线粒体释放细胞色素C,诱导细胞凋亡。如表1所示,在棕榈酸诱导组里神经酰胺和鞘氨醇降低和神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2较对照组升高,经甜茶素干预后,扰乱的神经酰胺代谢产物相对含量趋于正常,推测甜茶素可能抑制了参与神经酰胺代谢的SPT、DHSR、LAG1、DEGS、UGCG、NAHA等基因和酶使大鼠胰岛素瘤细胞存活率上升。
③磷脂酶D信号通路所涉及的相关基因和酶分析及相关差异代谢物在对照组和棕榈酸诱导组间的相对含量变化趋势
磷脂酸作为细胞膜合成的中间代谢物,有稳定生物膜和加强细胞间信号转导和激活细胞膜相关激酶活性的作用。在把鉴定的内源性代谢物输入metaboanalyst平台进行在线分析所构建的代谢通路图中,磷脂酸通过鞘氨醇激酶1水解生成S1P,其是细胞膜磷脂的重要合成代谢产物,而且有协调多种生物学功能的作用,S1P信号影响细胞生长、增殖和分化。如表1所示,与对照组比较,棕榈酸诱导组大鼠胰岛素瘤细胞磷脂酸降低,经甜茶素干预后磷脂酸升高,表明甜茶素通过调节相关基因和酶PLD1_2、DGKA、AGPAT1-2、SPHK1影响磷脂酸的合成和水解从而提高细胞生存率。
④花生四烯酸代谢通路所涉及的相关基因和酶分析及相关差异代谢物在对照组和棕榈酸诱导组间的相对含量变化趋势
前列腺素J2是一种内生的炎症代谢产物,也是过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂,对于调节炎症尤其是细胞的增殖、分化和凋亡起着重大作用。糖尿病是一种炎症性疾病,临床上过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂常用于治疗糖尿病,降低血糖和血脂。在把鉴定的内源性代谢物输入metaboanalyst平台进行在线分析所构建的代谢通路图中,磷脂酰胆碱水解生成花生四烯酸,继而通过PLA2G酶,PTGS1酶、PTGDS酶和AKR1C3酶的相互作用生成前列腺素J2。花生四烯酸是视神经和人体大脑发育的重要物质,具有增加血管弹性、酯化胆固醇、调节血细胞功能、降低血液粘度等一系列生理活性。花生四烯酸对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效。如表1所示,与正常对照组相比,前列腺素J2在棕榈酸诱导组中降低,甜茶素干预后前列腺素J2升高,表明甜茶素能通过花生四烯酸代谢通路改善前列腺素J2的不足,提高细胞的生存率。
本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
睐了以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法,其特征在于:采用基于超高液相色谱-串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物,获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出十二个潜在脂毒性相关的生物标志物并进行鉴定,通过metaboanalyst在线分析软件筛选出甜茶素抗脂毒性的四个代谢通路和代谢通路上相关酶和基因;
所述获得代谢指纹图谱的具体实现步骤如下:
(1)所需细胞样品的采集:取生长状态良好的大鼠胰岛素瘤细胞接种于96孔培养板,按随机原则分为对照组、棕榈酸模型组和甜茶素干预组,每组三个样品,把收集到细胞的离心管放到液氮和37℃水浴箱中反复冻融五个周期,每个周期为液氮5min,37℃水浴5min,进行淬灭;
(2)细胞样品的预处理和保存:在离心管中加入1mL乙腈,在温度4℃条件下离心10min,离心转速为13000g·min-1,进行细胞代谢物的提取;
(3)样品质谱分析:对收集的各组大鼠胰岛素瘤细胞样品进行方法学考察,建立超高液相色谱-串联质谱技术检测分析大鼠胰岛素瘤细胞样品指纹图谱分析方法,对细胞样品依次进行超高液相色谱-质谱分析;
超高液相色谱分析条件:采用Waters公司超高压液相色谱系统进行检测,HSS T3色谱柱,色谱柱规格为100mm×2.1mm,固定相粒径1.8μm,柱温37℃,流动相A乙腈,B 0.1%甲酸水,梯度洗脱:0~3min,3%A;3~8min,3~13%A;8~12min,13~20%A;12~17min,20~35%A;17~22min,35~60%A;22~30min,60~95%A;30~32min,95%A;32~34min,95~3%A;34~36min,3%A。流速为0.4mL·min-1,进样量3μL;
质谱条件:应用Waters MS公司高精度的三重四级杆质谱进行检测,其条件为电喷雾离子ESI源,正离子模式下扫描:毛细管电压3.0kV,离子源温度120℃,脱溶剂气温度350℃,锥孔电压40V,离子能量1.0V锥孔气流量50L·h-1,脱溶剂流量600L·h-1,在碰撞能量为4eV情况下扫描时间为0.5s,间隔扫描时间0.02s;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液;扫描范围m/z 50~1000,以Centriod模式进行数据采集,对九个样品重复进样六针,考察重现性,确保获得可靠数据;
(4)数据预处理:采用Waters公司的Masslynx软件进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理,得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间等数据;
(5)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物:在获得超高液相色谱-串联质谱数据后,采用SIMCA-P12.0软件对导入的数据对对照组、棕榈酸模型组、甜茶素干预组三组样本进行主成分分析和偏最小方差判别分析;主成分分析作为无监督式学习方法,可以真实反映样本的聚类情况,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用;进一步采用有监督式方法进行建模分析,所建模型变量的拟合能力指数R2Y为0.974,模型的预测指数Q2cum为0.955,模型的参数R2Y表示模型的解释率,Q2cum表示模型的预测率;空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛素瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图中的每一个点代表一个变量,变量对分类的重要程度由变量重要性投影的大小来衡量,并依据其对变量进行筛选;采用SPSS16.0软件进行统计学处理,选择变量重要性投影值>1且具有统计学意义的变量作为潜在生物标志物;基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图表示主成分分析PCA得分图,图中每一个点代表一个样品,棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好,无交叉和重叠,说明两组代谢模式存在明显的差异;甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间,更靠近空白组,提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变,表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用;按基于超高液相色谱-串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS-DA得分图的结果,使用SPSS统计软件进行偏最小方差分析PLS-DA得到空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛细胞瘤细胞的偏最小方差分析PLS-DA载荷图,能够突显出空白组和棕榈酸诱导组差异的最大化合物,可被认为是与脂毒性相关的潜在标志物;
(6)潜在生物标志物的鉴定:根据变量对应的保留时间和分子量,检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定,并与文献进行比较,最终鉴定了十二个与脂毒性相关的差异代谢产物:溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、神经酰胺、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂,其中溶血卵磷脂、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2和磷脂酰乙醇胺上调,磷脂酰丝氨酸、心磷脂、神经酰胺、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂下调;
(7)差异代谢物的分析:将筛选鉴定出的差异代谢产物上传到metaboanalyst在线分析软件,采用细胞代谢物数据库进行代谢物匹配,对甜茶素干预后的大鼠胰岛细胞瘤细胞受影响显著的代谢通路进行富集分析和拓扑分析,构建分析代谢通路图;在构建的代谢通路图中,四条代谢通路上的基因和酶形成相互交错的网络,通过代谢通路分析后所得影响值,当影响值大于0.5时,该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响,在使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图中,依据代谢通路的p值和通路重要值确定甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路和花生四烯酸代谢通路和磷脂酶D通路均与脂毒性相关,甜茶素干预大鼠胰岛细胞瘤细胞后起效最为相关的是甘油磷脂代谢通路;在四个代谢通路中所涉及的酶和基因网络联系图中,有二十三个酶和二十八个基因参与了脂毒性的形成。
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