CN104280477A

CN104280477A - 内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用

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Publication number: CN104280477A
Application number: CN201410607892.1A
Authority: CN
Inventors: 李遇伯; 张艳军; 王磊
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104280477B

Abstract

本发明公开了基于代谢组学的内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用。其中内源性小分子物质指12个肝毒性生物标记物L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-肉碱、L-肉碱棕榈酰、色氨酸、花生四烯酸、胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、溶血磷脂酰胆碱(16:1)、溶血磷脂酰胆碱(18:2)、溶血磷脂酰胆碱(20:3)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)；同时也指3个肝毒性专属生物标记物L-肉碱、胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)。本发明筛选得到的肝毒性生物标记物使肝损伤的发现与诊断较现有生化检测指标有所提前，能够更好的用于肝脏毒性的预防、发现和治疗，弥补现有指标的局限性，及时提供准确的检测信息。

Description

内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用

技术领域

本发明涉及到使用代谢组学技术寻找肝毒性生物标记物，然后对其进行专属性考察，接着使用支持向量机（SVM）对它们进行验证与优化。更具体地说是内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用。

背景技术

肝脏在物质代谢的过程发挥着重要作用，因此它成为毒性物质损害的主要靶器官。肝毒性是药物开发中面临的重大安全性问题，同时也是临床前试验失败和药物撤回的常见原因。目前，血液天冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）是常用于检测肝功能的两项指标，但其由于缺乏特异性和敏感性而不能及时的发现肝损伤状况。因此，目前亟需我们建立一种能够早期、准确的肝毒性评价方法，以弥补现有指标的局限性。代谢组学是系统生物学的重要分支，它作为一种新兴技术在毒性评价、药物代谢分析、疾病诊断等方面取得了突破性的进展。代谢组学作为一种理想的毒性评价手段，不仅能够反映毒性物质本身的代谢变化，同时还能够有效的表现出毒性物质对机体代谢网络的影响。代谢组学在毒性评价上具有灵敏度高、分析简便快捷的特点。如今，超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）以其精确、灵敏、高通量等优点为代谢组学的更广泛应用提供了强大的技术支持，与此同时却带来了庞杂的数据处理过程。因此，我们需要寻找更为有效的数据处理方法。机器学习能够从数据里提取规则或模式来把数据转换成信息，找到内在的相互依赖关系，对未知数据进行预测和判断。支持向量机作为机器学习的一种，其基于非线性计算的统计学习理论，能够弥补主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）无法诊断或区分以及提供量化的评估信息的缺点，能有效的对特征代谢物的联合诊断进行评估，同时在解决小样本、非线性及高维模式识别数据上表现出特有的优势。因此，将SVM与代谢组学技术相结合，用于生物标志物的筛选、验证与优化以及潜在生物标志物对疾病的预测方面，能为代谢组学的进一步发展提供更广阔的思路。

发明内容

本发明通过代谢组学技术与SVM相结合发现肝毒性生物标记物使肝损伤的发现与诊断较现有生化检测指标有所提前，能够更好的用于肝脏毒性的预防、发现和治疗，弥补现有指标的局限性。及时提供准确的检测信息。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用，特别是在快速判断肝脏是否受到损伤方面的应用。其中所述的内源性小分子物质指肝毒性生物标记物，它们是基于代谢组学技术筛选出来的，包括L-丙氨酸（L-alanine）、L-肉碱（L-carnitine）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、色氨酸（Tryptophan）、花生四烯酸（Arachidonic acid）、左旋肉碱棕榈酰（L-Palmitoyl carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]、溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LysoPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(18:2)[LysoPC(18:2)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LysoPC(20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)[LysoPE(18:2)]，它们能够快速检测肝毒性。在肝毒性生物标记物的基础上经过SVM验证与优化的内源性小分子物质指肝毒性专属生物标记物，包括L-肉碱（L-carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]，它们能够快速判断肝脏是否受到损伤。由于体内内源性小分子物质在肝脏受到毒性或者损伤作用时代谢发生变化，我们研究表明以L-肉碱（L-carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]专属性最强。所以更具体地说是内源性小分子物质在快速检测肝毒性以及肝脏疾病方面的应用。

本发明进一步公开了基于代谢组学技术结合SVM的肝毒性生物标志物的筛选方法，包括样品前处理、数据采集、数据处理（多元统计分析）、生物标记物的专属性考察、专属生物标记物的验证与优化等步骤。其特征在于：在数据采集中使用梯度洗脱的条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流动相A指0.1％甲酸的水，流动相B指0.1％甲酸的乙腈；在专属生物标记物的验证与优化中使用MATLAB R2010a软件（USA）基于肝毒性生物标记物建立SVM预测模型，该过程如下：将生物标记物在生理盐水组和各个药物组中的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g），然后以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度，分析准确度，对其是否与肝毒性密切相关进行区分。

我们经过代谢组学技术筛选出肝毒性生物标记物，具体是L-丙氨酸（L-alanine）、L-肉碱（L-carnitine）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、色氨酸（Tryptophan）、花生四烯酸（Arachidonic acid）、左旋肉碱棕榈酰（L-Palmitoyl carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]、溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LysoPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(18:2)[LysoPC(18:2)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LysoPC(20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)[LysoPE(18:2)]。肝毒性生物标记物经过专属性考察、验证与和优化后得到肝毒性专属生物标记物，具体是L-肉碱（L-carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]。

本发明更加详细的技术方案如下：

1、样品前处理：样品处理前将血浆在室温下解冻。然后，将300μL乙腈加入到100μL血浆中，并涡旋混合1分钟。接着将混合物在冰水浴中超声10分钟，然后以13000转在4℃下离心15分钟。收集上清液用于UPLC/Q-TOF-MS分析。

2、数据采集：使用UPLC/Q-TOF-MS系统（美国Waters公司）对大鼠血浆样品进行信息采集。色谱柱用ACQUITY UPLC HSS C₁₈（2.1×100 mm，1.7μm，美国Waters公司），柱温为40℃，流速为0.3mL/min，进样量为5μL。UPLC分离系统包括二元溶剂系统，用流动相A（0.1％甲酸的水）和流动相B（0.1％甲酸的乙腈）。采用梯度洗脱，具体洗脱条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%。质谱采用电喷雾电离（ESI）源，在正离子电离模式下进行质谱分析。MS参数如下：干燥气流速为10mL/min，干燥气体温度为325℃，雾化气气压为350 psi，脱溶剂气流量600L/h，毛细管电离电压3.5 kV，四极杆扫描范围m/z50-1000。蒸发气体和辅助气体是高纯度氮。用（[M+H]⁺= 556.2771, [M-H]^-= 554.26）作为参考离子来确保光谱采集过程中的精度。为了确保代谢组学数据采集的可靠性，我们从每个样品中吸取等量的血浆混合成为QC样品，用它们对仪器的稳定性、方法精密度进行监控，直到整个系统在一个良好稳定的状态下才能开始样品信息采集。同时在24小时之内，QC样品每4个小时检测一次，用来监测整个采集过程中样品与系统的稳定性。

3、数据处理：本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术对大鼠的血浆样本信息进行无靶向分析。具体的数据处理过程如下：原始数据经工作站中的Masslynx (Waters, USA) 软件采集后，由Makerlynx software (Version 4.1)数据处理系统对采集得到的谱图进行离子对的提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作。然后将80%修约后的数据（Excel格式）导入SIMCA-P12.0统计软件（瑞典Umetrics公司）进行多元统计分析。在UV模式下进行PLS-DA分析，并验证模型的可靠性，进而将筛选得到的对分类有显著贡献的化合物（VIP>1）作为候选标记物。接着我们使用SPSS软件对获得潜在变量进行T检验，将P<0.05的物质作为显著性差异的标记物。然后我们将它们进行整合化分析，筛选出四氯化碳组和柴胡组共有的生物标记物，利用维恩图谱（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）直观地反映它们之间的关系。此外，与非肝毒性组数据进行比较，初步确定肝毒性专属标记物。接着，我们随机选取数据（肝毒性组和非肝毒性组中生物标志物的峰面积）作为训练集和预测集，通过采用MATLAB R2010a（ USA）对其建立SVM模型，将模型预测准确性高的物质最终视为肝毒性的专属性生物标志物。继而利用标记物的质量数（m/z值）在HMDB（http://www.hmdb.ca/）数据库和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）数据库中查找可能的物质。最后，通过比较标准品和样品之间的指纹图谱来鉴定物质。如果没有标准品，我们分析它们的MS/MS信息以及参考文献等信息来确认候选的生物标记物。最后对专属标记物利用MetPA（http://metpa.metabolomics.ca./MetPA/faces/Home.jsp）数据库进行代谢通路分析。

本发明的有益效果在于：

当肝脏的肝细胞膜受损或细胞坏死时，血液中的酶才会发生变化，且ALT并非肝损伤发生时所特有的，因此传统的血清免疫检测会存在时效性差和特异性低的缺点。本发明筛选出的肝毒性生物标志物具有较强的灵敏性和特异性。它们可以在肝脏组织病理尚未出现明显损伤的情况下表现出显著性差异，即毒性发现时间较现有生化检测指标有所提前，能够更好的用于肝脏毒性的预防、发现和治疗，弥补现有指标的局限性。这也是我们利用代谢组学技术发现肝毒性专属生物标记物的目的所在。

附图说明：

图1：肝毒性各药物组多元统计分析的PLS-DA得分图；

图2：用维恩图显示整合化分析筛选得到48个共同的碎片离子；

图3：筛选得到的14个肝毒性共有的且含量变化趋势相同的碎片离子信息；

图4：支持向量机模型的预测准确率；

图5：3个肝毒性专属生物标记物在肝毒性组和非肝毒性组中的PLS-DA模型得分图；

图6：各个组的肝毒性生化指标AST和ALT含量变化。

具体实施方式：

下面结合说明书和具体实施方式对做进一步说明。但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用本发明的相似变化，均应列入本发明的保护范围。本发明所用到的试剂、药品均有市售。

实施例1

1、试剂：乙腈购自Oceanpak（瑞典哥德堡），甲酸购自ROE（美国），均为分析纯。纯净水购自娃哈哈公司（中国杭州）。生理盐水购自齐都药业有限公司（中国山东）。庆大霉素，依替米星，异丙肾上腺素，5-氟尿嘧啶，柴胡和四氯化碳购自士兰科技有限公司（中国天津）。药品分别用生理盐水配置后给予动物。

2、动物实验：动物实验在中国医学科学院生物医学工程研究所（中国天津）进行。70只雄性Wistar大鼠（200±20克）保持在SPF级实验室。大鼠购入后置12小时昼夜更替，环境温度为25±1℃，环境湿度为50±5％的控制环境条件下饲养。经过一周的适应后，将大鼠随机分为7组，分别为空白组、庆大霉素组、依替米星组、异丙肾上腺素组、5-氟尿嘧啶组、柴胡组和四氯化碳组。

3、样品收集：样品收集之前，所有动物禁食12小时。大鼠轻微麻醉后从腹主动脉搜集血液。一部分血样置肝素化试管中，3500转离心15 分钟，分离血浆，置-80℃冰箱中储存，用于代谢组学研究。另一部分血样置于普通炮弹管中，500转离心15 分钟，分离血清，置-80℃冰箱中储存，用于临床生化检测。

4、我们将上述血浆样品按照本发明的技术方案进行分析研究。多元统计分析中，首先进行PLS-DA 分析，结果表明给药组和对照组之间呈现出很好的区分，说明了药物引起了体内内源性代谢物的改变，且表明两组在代谢水平上有明显的区分，见图1。在此基础上，我们进一步挖掘数据潜在信息，将VIP>1的变量认为是潜在标记物。继而通过T-test检验，进一步的筛选肝毒性生物标记物。其中，四氯化碳组共筛选得到74个碎片离子，柴胡组筛选得到135个碎片离子。继而采用维恩图谱对找到的碎片离子进行整合化分析，发现48个共同的碎片离子，见图2。最终得到14个共有的且含量变化趋势相同的碎片离子，我们认为这些离子为肝毒性共有的生物标记物，见图3。为了进一步确定14个碎片离子的专属性和准确性，我们应用支持向量机对生物标志物的专属性进行进一步评估。在用于SVM优化的数据中以76个作为训练集、以30个作为测试集建立模型，最终获得预测准确率为96.00%。然后，逐一删除这14个标记物，可得到相应的模型准确率，见图4。结果表明当分别剔除左旋肉碱（L-carnitine），胆酸（cholic acid）和LysoPC(14:0)后，模型预测准确率都不同程度的下降，说明左旋肉碱，胆酸和LPC(14:0)这三个物质对模型具有贡献度，可见与药物肝毒性具有较高的专属性。最后，我们在肝毒性组和非肝毒性组中基于这3个物质建立PLS-DA模型，见图5，结果显示这三个物质的肝毒性组与非肝毒性组分布在不同区域。

5、我们经过物质鉴定得到的12个肝毒性生物标志物的生物学意义：

（1）肝脏的主要功能是脂类的吸收与合成和中性脂肪、磷脂、蛋白质的分解。在正常的生理状态下，肝脏能够维持脂质新陈代谢的动态平衡，但当肝脏受到损害时，出现大量肝细胞坏死，超出了肝脏的代偿能力，导致脂质代谢发生障碍。磷脂酰胆碱类（PC）是细胞膜的重要组成部分，PC在磷脂酶A2（PLA2）或卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）的作用下水解生成LPC。目前，LPC类物质已经作为一类可靠的生物标志物被广泛报道。LPCs是一类具有生物活性的脂类物质，具有调节多种细胞的功能。LPCs与炎症反应和自身免疫有关。LPC含量的升高显示机体已经发生了炎症反应。同时，血液中LPCs水平还反映出机体的免疫抑制功能，LPCs含量的升高使受损的肝脏难以进行自我修复。因此，血浆中LPCs含量的升高提示炎症反应和免疫力降低已经发生。

（2）胆汁酸作为胆汁的重要成分，主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用，同时也在脂肪代谢中起着重要作用。而胆酸是是胆汁酸中含量最丰富的一类固醇成分，胆酸含量的下降，可能会导致脂类代谢的异常，脂质代谢的异常会扰乱正常的生理功能，例如花生四烯酸主要来源于质膜的磷脂，是不同炎症因子的前体物质。花生四烯酸代谢主要发生在肝脏，我们认为引起花生四烯酸含量下降的原因一方面可能是由于脂质氧化引起了花生四烯酸的消耗加快，另一方面可能抑制了肝脏中亚油酸代谢成花生四烯酸。并且有文献报道称脂质中肝细胞的过氧化作用增强会加重肝脏损伤。因此我们推断花生四烯酸含量的下降可能与肝损伤有关。

（3）左旋肉碱属于脂肪酸的β氧化代谢通路。在脂肪酸氧化(FAO)过程中，左旋肉碱的主要功能是携带、转运活化的脂肪酸，特别是与长链饱和及不饱和脂肪酸结合，穿越线粒体膜，进入线粒体内，进行β氧化和三羧酸循环反应，为机体的代谢活动提供能量。左旋肉碱的消耗，可能是肝脏损伤导致能量代谢发生异常。

（4）苯丙氨酸和色氨酸是机体中的必需氨基酸。苯丙氨酸作为一个具有生理活性的芳香族氨基酸，是由葡萄糖和脂肪酸代谢生成。苯丙氨酸代谢生成酪氨酸主要是在肝脏中进行的。色氨酸作为蛋白质合成的原料物质，绝大部分代谢发生在肝脏。因此，苯丙氨酸和色氨酸发生变化可能是肝脏发生损伤后，影响的相应的代谢酶，导致氨基酸代谢收到干扰。

实施例2

基于代谢组学技术结合SVM的肝毒性生物标志物的筛选方法，包括：样品前处理、数据采集、数据处理（多元统计分析）、生物标记物的专属性考察、专属生物标记物的验证与优化等步骤。其特征在于：在数据采集中使用梯度洗脱的条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流动相A指0.1％甲酸的水，流动相B指0.1％甲酸的乙腈；在专属生物标记物的验证与优化中使用MATLAB R2010a软件（USA）基于肝毒性生物标记物建立SVM预测模型，该过程如下：将生物标记物在生理盐水组和各个药物组中的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g），然后以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度，分析准确度，对其是否与肝毒性密切相关进行区分。

实施例3

实际应用：

我们将收集起来的血清在室温下解冻，用于检测血清中的天冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）。结果显示与对照组相比，柴胡组和四氯化碳组中的生化指标均出现显著性变化（P<0.05），但是非肝毒性ISO组的ALT值也出现升高的情况，见图6。出现这种状况是由于ALT并非肝脏所特有的物质，它同时也存在于心脏组织中，因此当心脏组织受损时，表现出ALT值升高。由此可见，ALT对于肝脏的检测不具有专属性。相比较之下，我们通过代谢组学结合SVM发现的肝毒性专属生物标记物具有较强的灵敏性和专属性。能够更好的用于肝脏毒性的预防、发现和治疗，弥补现有指标的局限性，及时提供准确的检测信息。

具体的数据比较如下：

--：表示含量未见显著性变化 ↓*：表示含量显著下降 ↑*：表示含量显著上升

结论：

本发明以肝毒性评价为切入点，利用代谢组学无靶向分析手段，寻找肝毒性引起体内代谢异常的内源性代谢物，并且对它们进行整合化分析发现14个含量变化一致的标记物。接着经过物质鉴定，初步确定了12个与肝毒性有关的生物标志物。然后利用机器学习对肝毒性潜在生物标记物进行验证与优化，确定了3个肝毒性专属的生物标记物。得到的专属性生物标志物可以用于肝毒性的评价，并且还可以通过它们相关的代谢途径和生物学意义，可以为解释肝毒性机制提供参考。基于代谢组学与机器学习相结合的毒性评价方法，用于生物标记物的筛选、分类预测、验证与优化，为物质毒性评价提供一种新的模式。

Claims

1.内源性小分子物质在快速检测肝毒性方面的应用；其中所述的内源性小分子物质指12个肝毒性生物标记物，它们是基于代谢组学技术筛选出来的，包括L-丙氨酸（L-alanine）、L-肉碱（L-carnitine）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、色氨酸（Tryptophan）、花生四烯酸（Arachidonic acid）、左旋肉碱棕榈酰（L-Palmitoyl carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]、溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LysoPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(18:2)[LysoPC(18:2)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LysoPC(20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)[LysoPE(18:2)]。

2.内源性小分子物质在快速判断肝脏是否受到损伤方面的应用；其中所述的内源性小分子物质指的是3个肝毒性专属生物标记物，它们是在肝毒性生物标记物的基础上经过专属性考察和SVM验证与与优化筛选出来的，包括L-肉碱（L-carnitine）、胆酸（cholic acid）、溶血磷脂酰胆碱(14:0)[LysoPC(14:0)]。

3.权利要求1-2任一项所述的应用，其中基于代谢组学技术结合SVM的肝毒性生物标志物的筛选方法，包括样品前处理、数据采集、数据处理（多元统计分析）、生物标记物的专属性考察、专属生物标记物的验证与优化步骤，其特征在于：在数据采集中使用梯度洗脱的条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流动相A指0.1％甲酸的水，流动相B指0.1％甲酸的乙腈；在专属生物标记物的验证与优化中使用MATLAB R2010a软件（USA）基于肝毒性生物标记物建立SVM预测模型，该过程如下：将生物标记物在生理盐水组和各个药物组中的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g），然后以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度，分析准确度，对其是否与肝毒性密切相关进行区分。