CN109738530A - 一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析技术领域，具体为一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法。本发明步骤包括：干血斑样本代谢物提取；干血斑全局性非靶向代谢组学分析；其中，采用UHPLC‑QTOF‑MS对DBS样本进行非靶向代谢表型分析；采用RPLC和HILIC色谱分离模式及电喷雾离子化（ESI）正负离子质谱检测模式，对干血斑代谢物组成进行分析。本发明极大程度降低了样品在前处理等过程中代谢物损失及金属离子对分析物的影响，具有高通量、高灵敏度及代谢物高覆盖的特点，可应用于分子流行病学病因筛查及致病机制等分析研究。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种干血斑及其它微量生物样品的代谢组分析方法。该方法适用于分子流行病学病因筛查及致病机制等分析研究。
背景技术
干血斑(Dried Blood Spot，DBS)是将全血样品收集在卡纸上，经溶剂萃取后通过检测其中待检测组分的信息来反应病患诊断结果的样本采集方式。相比于其他血样采集方法，DBS具有采样量少、采集简单、方便运输等优势，特别适合应用于偏远及资源匮乏区域的血液样品收集工作。因此近年被越来越多的人所接受。目前在国际许多大规模疾病筛查中，DBS已有广泛的应用，如新生儿遗传代谢疾病筛查、大型体育赛事兴奋剂检测、艾滋病(HIV)及丙型肝炎筛查等。另外，这种微量的取血技术还可应用于生物医药行业中治疗药物监测、药物研发及药物代谢动力学的研究中。但由于缺乏优化的分析方法，DBS样品在分子流行病学中的应用仍十分有限。
代谢组学(Metabolomics)可以对生物样品内小分子代谢物进行定性定量分析，从而监测生物系统受疾病或外界环境影响后的代谢扰动，已有的对DBS样品的代谢组学研究主要是基于靶向质谱分析技术。然而到目前为止，还没有针对DBS样品的全局性非靶向代谢表型检测的应用实践。
发明内容
本发明的目的在于针对现有DBS前处理提取方案与分析方法的不足，提供一种适用于DBS及其它微量生物样品的高通量、高灵敏、全覆盖代谢组检测分析方法，以用于分子流行病学病因筛查及致病机制等研究中。
本发明提供的DBS及其它微量生物样品的代谢组检测分析方法，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法(记为UHPLC-QTOF-MS)，对样本进行非靶向代谢表型分析；采用反相液相色谱(RPLC)和电喷雾离子化(ESI)正负离子模式质谱(记为RPLC+及RPLC-)，进行代谢组分析；采用亲水作用液相色谱(HILIC)和电喷雾离子化(ESI)正负离子模式质谱(记为HILIC+及HILIC-)进行代谢组分析。具体步骤为：
步骤1、DBS或其它微量生物样本代谢物提取；
步骤2、DBS或其它微量生物样本全局性非靶向代谢组分析。
本发明中，所述其他微量样本包括生物体液(如血液、尿液、透析液、唾液等)、细胞样品(如提取物和培养液等)和生物组织等。
本发明方法各步骤的具体流程如下：
对于测试样品为DBS，步骤1的流程为：血滤纸样品使用3～6mm打孔机打孔，将2张面积相同的干血斑放置于2mL离心管中，精确加入80～150μL含2～3％甲酸(FA)的70～80％(体积比)预冷甲醇水(于-20～4℃冰箱中冷藏24h以上)，涡旋振荡混合均匀10～30s，在冰水中超声，超声步骤为1min超声，1min停止，共10～15个循环，并在室温下静置10～30min。进行5～15min离心(4℃，10000～16000g)，将上清液使用孔径0.22μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20℃～-80℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测。从所有待测样品中各取5～10μL混合，作为质控样品(qualitycontrol，QC)，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
对于测试样品为生物体液，步骤1的流程为：将生物体液样本于冰上或4℃冰箱中解冻摇匀，用移液枪精确吸取10～20μL生物体液样本于1.5mL离心管中，精确加入3～5倍于生物体液体积含2～3％甲酸(FA)的预冷甲醇(于-20～4℃冰箱中冷藏24h以上)，涡旋振荡混合均匀1～3min，进行5～15min离心(4℃，10000～16000g)，将上清液使用孔径0.22μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20℃～-80℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测。从所有待测样品中各取5～10μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
对于测试样品为细胞，步骤1的流程为：准确称取10～20mg的细胞样品(细胞数为106～107个)加入到2mL EP管中。加入500μL的70～80％(体积比)预冷甲醇水溶液，使用液氮反复冻融三次，涡旋振荡混合均匀1～3min，在冰水中超声，超声步骤为1min超声，1min停止，共10～15个循环，进行5～15min离心(4℃，10000～16000g)。取上清液于EP管中暂存，将下层细胞样品沉淀重复进行以上提取步骤2～3次，将每次的上清液混合并去除溶剂(通过离心浓缩、氮气吹干或冷冻干燥等方式)，最后使用100～150μL的70～80％(体积比)预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20℃～-80℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测。从所有待测样品中各取5～10μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
对于测试样品为生物组织，步骤1的流程为：准确称取10～20mg的组织样品加入到2mLEP管中，并逐个放入研磨珠。加入600μL的70～80％(体积比)预冷甲醇水溶液。在组织破碎仪中以10～20Hz进行破碎1～2min，取出样品在冰水中超声，超声步骤为1min超声，1min停止，共10～15个循环，进行5～15min离心(4℃，10000～16000g)。取上清液于EP管中暂存，将下层组织样品沉淀重复进行以上提取步骤2～3次，将每次的上清液混合并去除溶剂(通过离心浓缩、氮气吹干或冷冻干燥等方式)，最后使用100～150μL的70～80％(体积比)预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20℃～-80℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测。从所有待测样品中各取5～10μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
步骤2，DBS或其它微量样品全局性非靶向代谢组分析，其中：
所述的色谱条件如下：
反相色谱柱使用亚2μmC18填料的色谱柱，保护柱使用在线过滤器(如2μm)，流动相由含0.1％甲酸的超纯水(记为A相)和含0.1％甲酸的乙腈(记为B相)组成，梯度程序为：0min，1％B；1min，1％B；3min，15％B；6min，50％B；9min，95％B；14.0min，95％B。每次进样前在初始条件下平衡5～10min。流速0.4～0.5mL/min，柱温25～45℃，进样量1～3μL；
亲水作用色谱柱使用亚2μm亲水作用色谱柱，保护柱使用在线过滤器(如2μm)，流动相由含0.3％甲酸+2mM甲酸铵的超纯水(记为C相)和含0.3％甲酸+2mM甲酸铵的体积比95％色谱纯乙腈水溶液(记为D相)组成，梯度程序为：0min，100％D；1min，100％D；12min，50％D；17min，50％D。每次进样前在初始条件下平衡5～10min。流速0.4～0.5mL/min，柱温25～45℃，进样量1～3μL。
所述的质谱条件如下：
质谱在ESI+和ESI-两种采样模式下分别进行分析测定，质谱仪鞘气温度为250～400℃，流速为7～12L/min；干燥气流速为250～400℃，流速为7～12L/min；采集频率为2～4质谱图/秒。正离子检测模式下，毛细管电压为2000～4000V，喷嘴电压为200～500V，雾化器压力为30～50psi(1psi＝6895Pa)；负离子检测模式下，毛细管电压为-2000～-3500V，喷嘴电压为-1000～-1500V，雾化器压力为20～50psi。为了对代谢物进行鉴定，本发明还分别采集了质控QC样品(即各组的平均化样本)在碰撞能为10、20和40V条件下的质谱数据，所得母离子及碎片离子可作为代谢物定性依据。
所述反相色谱柱优选为Waters AcquityHSS T3(1.8μm，2.1mm×100mm)，保护柱优选为Waters AcquityHSS T3VanGuard Pre-Column(1.8μm，2.1mm×5mm)。
所述亲水色谱柱优选为Waters AcquityBEH Amide(1.7μm，2.1mm×100mm)，保护柱优选为WatersBEH Amide VanGuard Pre-Column(1.7μm，2.1mm×5mm)。
本发明方法中，还通过大量筛选实验，得到如下优选条件：
1、提取方法考察
DBS的提取方法考察了提取溶剂的种类与配比，尝试了水与甲醇或乙腈不同比例下的提取效率，最终确定(优选)80％甲醇水对样品的提取效率最高。另外，由于血液中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等二价、三价金属阳离子会与血液中具有多个离子化基团的代谢物(如柠檬酸)结合，从而影响测定。本发明测试了EDTA、100树脂、甲酸等作为金属螯合剂，优选2％甲酸处理可以通过诱导脱螯作用来消除代谢物阳离子络合作用，同时不会有其他干扰信号产生。本发明还比较了组织破碎提取法与超声提取法的提取效率，发现与组织破碎提取法相比，在冰浴中进行间歇超声处理可以避免提取过程中温度升高导致代谢物的降解。
2、亲水作用色谱流动相添加剂考察
使用亲水色谱柱进行色谱分析时常在流动相中加入易挥发的酸、碱或者盐来调节流动相的pH值，可以控制分析物的电离状态。选择合适的流动相添加剂不仅对物质分离的选择性有影响，还会改善分析的灵敏度。本发明使用氨基酸标准品混合溶液进行测试，首先通过调节流动相中添加甲酸的含量，尝试了不同PH环境下的离子响应，当加入0.15％甲酸(PH＝2.53)时，图谱响应强度最高。进一步优化，发现在等PH情况下，在流动相中添加挥发性缓冲盐(如甲酸铵)，可以增强流动相的缓冲能力，提高分析稳定性。在进行大批量样品分析时，可以降低色谱保留时间的漂移现象。最终确定0.3％甲酸及2mM甲酸铵(pH＝2.53)作为亲水作用色谱流动相添加剂。
3、色谱质谱参数优化
本发明将氨基酸、酰基肉碱、胆碱和多不饱和脂肪酸等多类性质各异的代谢物标准品制备成混合标准品样品，并使用混合标准品调整各分析模式下的液相色谱梯度程序，以优化色谱峰的峰形及分离度。此外，本发明还优化了鞘气温度、鞘气流速、喷嘴电压、毛细管电压、雾化气压力、干燥气温度、干燥气流速等离子源参数，以使大多代谢物获得最佳的灵敏度。
本发明提供的方法具有以下优点：
1.方法重现性高。做大批量分析时，三天内大部分代谢物变异系数CV值可保持在15％以内。质控样品在主成分分析得分图中聚集明显；
2.检测代谢物范围广。包含氨基酸、酰基肉碱、胆碱和多不饱和脂肪酸等多种代谢物，可覆盖糖酵解、酮生成以及三羧酸循环等多条代谢途径。
本发明方法极大程度降低了样品在转移前处理等过程中代谢物损失及金属离子对分析物的影响，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-QTOF-MS)对干血斑代谢表型进行全局性分析，具有高通量、高灵敏度及代谢物高覆盖的特点，可应用于分子流行病学病因筛查及致病机制等分析研究。
附图说明
图1：QC样本在不同模式下的典型基峰色谱图。其中，(A)为RPLCESI+模式，(B)为RPLC ESI-模式，(C)HILICESI+模式，(D)为HILICESI-模式。
图2：RPLC ESI+模式下的PCA得分图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验仪器和材料
1.仪器
色谱仪使用Agilent Technologies 1290Infinity色谱仪(AgilentTechnologies Co.Ltd.)包括G4220A二元梯度泵、G4226A自动进样器、G1330A自动进样器恒温装置、G1316C柱温控制单元、G4212A DAD检测器等模块。质谱检测器为AgilentTechnologies 6530Accurate-Mass Q-TOFMS质谱仪(Agilent Technologies Co.Ltd.)，配有双喷Jet Stream ESI离子源。
2.试剂和药品
色谱纯甲酸、甲醇和乙腈全部购买于Sigma-Aldrich(中国)试剂有限公司。样品处理与色谱流动相时所用的超纯水均取自于Elix Advantage System(德国Merck Millipore有限公司)超纯水系统(电阻率>18.2MΩ/cm)。分析纯标准品购买于Sigma-Aldrich试剂有限公司(中国)、百灵威科技有限公司(中国)或阿拉丁化学试剂有限公司(上海)。
实施例1：DBS标本代谢组分析技术在空气污染流行病学研究的应用
1.样品提取
使用6mm打孔机打孔获得2张面积相同的血斑，放置于2mL离心管中，精确加入120μL含2％甲酸(FA)的80％(体积比)预冷甲醇水(于4℃冰箱冷藏24h)，涡旋振荡混合均匀10s，在冰水中超声，超声步骤为1min超声，1min停止，共10个循环，并在室温下静置30min。进行10min离心(4℃，16000g)，将上清液使用0.22μm PTFE滤膜(Ф13mm，津腾)过滤后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20℃冰箱等待UHPLC-QTOF-MS检测。从所有样品中各取5μL混合作为质控样品(quality control，QC)，可用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
2.色谱条件和质谱条件
2.1色谱条件
反相色谱柱使用Waters AcquityHSS T3(1.8μm，2.1mm×100mm)，保护柱使用Waters AcquityHSS T3VanGuard Pre-Column(1.8μm，2.1mm×5mm)。流动相分别为含有0.1％甲酸的超纯水(A相)和含有0.1％甲酸的色谱纯乙腈(B相)。柱温为40℃，流速为0.5mL/min，进样量为1μL。色谱分离过程采用逐段线性洗脱梯度，梯度程序为：0min，1％B；1min，1％B；3min，15％B；6min，50％B；9min，95％B；14.0min，95％B。每次进样前在初始条件下平衡5min。
亲水作用色谱柱使用WatersBEH Amide(1.7μm，2.1mm×100mm)，保护柱使用WatersBEH Amide VanGuard Pre-Column(1.7μm，2.1mm×5mm)。流动相分别为含0.3％甲酸+2mM甲酸铵的超纯水(A相)和含有0.3％甲酸+2mM甲酸铵的95％色谱纯乙腈水(B相)。柱温为40℃，流速为0.4mL/min，进样量为1μL。色谱分离过程采用逐段线性洗脱梯度，梯度程序为：0min，100％B；1min，100％B；12min，50％B；17min，50％B。每次进样前在初始条件下平衡5min。
2.2质谱条件
质谱在ESI+和ESI-两种采样模式下分别进行分析测定，数据采样频率为3spectra/sec，数据存储类型为centroid棒状图。质谱仪鞘气温度为350℃，流速为9L/min；干燥气流速为350℃，流速为8L/min。正离子检测模式下，质量数检测范围为m/z 30～1000，毛细管电压为4000V，喷嘴电压为500V，雾化器压力为40psi(1psi＝6895Pa)；负离子检测模式下，质量数检测范围为m/z 40～1050，毛细管电压为-3500V，喷嘴电压为-1000V，雾化器压力为40psi。分析过程中通过在线质量矫正来获得精确的质量准确度，内参校准正离子使用m/z 121.0509(protonated purine)和m/z 922.0098(protonated hexakis(1H，1H，3H-tetrafluoropropoxy)phosphazine or HP-921)，负离子使用m/z 112.9856(TFA anion)和m/z 1033.9881(hexakis(1H，1H，3H-tetrafluoropropoxy)phosphazine or HP-0921)。
3.样品分析顺序
分析正式样品前测试空白溶剂样品，保证色谱柱及系统中无残留污染物干扰。连续进样十次QC样品以充分平衡色谱柱，所有样品采样顺序随机打乱，每隔6个样品插入一个QC样品，可作为评估分析批中稳定性的依据。
4.分析方法学验证
使用质控QC样品(所有研究样本的混合样本)评价整个分析批中样品测定的稳定性，通过对分析批中随行QC样本数据进行主成分分析，得分图显示QC样本会紧密地聚拢在一起。进一步通过提取已鉴定代谢物峰面积，并计算三天内变异系数(coefficient ofvariation，CV)，发现大部分代谢物CV值在15％以内，说明分析方法重复性高，样品在分析过程中稳定性良好，适合于进行大批量代谢组学实验。
5.数据信息挖掘
将测试样本及QC样品数据使用MSConverter转件转换成mzXML格式，并使用R语言下XCMS包进行基线校正、峰识别、峰对齐等处理，以获得各样品中全部离子峰数据集矩阵。参数设置如下：peak picking process：method“CentWave”，ppm 20，snthresh 6，peakwidth from 8to 20；peak grouping process：mzwid＝0.05，bw＝6；filteringprocess：minFrac.val＝0.5，cv.threshold＝0.3。
Claims (7)
1.一种DBS及其它微量生物样品的代谢组检测分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1、DBS或其它微量生物样本代谢物提取；
步骤2、DBS或其它微量生物样本全局性非靶向代谢组分析：采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法，记为UHPLC-QTOF-MS，对DBS样本进行非靶向代谢表型分析；采用反相液相色谱和电喷雾离子化正负离子模式质谱进行代谢组分析；采用亲水作用液相色谱和电喷雾离子化正负离子模式质谱进行代谢组分析；
这里，DBS表示干血斑，所述其他微量生物样本包括生物体液、细胞样品和生物组织。
2. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于DBS测试样品，步骤1流程为：血试纸样品使用3~6mm打孔机打孔，将2张面积相同的干血斑放置于2 mL离心管中，精确加入80~150μL含2~3%甲酸的体积比70~80%预冷甲醇水，涡旋振荡混合均匀10~30s，在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环；在室温下静置10~30min；在4℃，10000~16000 g条件下离心5~15 min；将上清液使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为质控样品QC，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
3. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于生物体液测试样品，步骤1流程为：将生物体液样本于冰上或4 ℃冰箱中解冻摇匀，用移液枪吸取10~20 μL生物体液样本于1.5 mL离心管中，加入3~5倍于生物体液体积含2~3% 甲酸FA的预冷甲醇，涡旋振荡混合均匀1~3 min，进行5~15 min离心，将上清液使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
4. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于细胞测试样品，步骤1的流程为：称取10~20 mg的细胞样品加入到2mL EP管中；加入500 μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液，使用液氮反复冻融三次，涡旋振荡混合均匀1~3 min，在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环，进行5~15 min离心；取上清液于EP管中暂存，将下层细胞样品沉淀重复进行以上提取步骤2~3次，将每次的上清液混合并去除溶剂，最后使用100~150μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
5. 根据权利要求1所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，对于生物组织测试样品，步骤1流程为：准确称取10~20 mg的组织样品加入到2mL EP管中，并逐个放入研磨珠；加入600μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液；在组织破碎仪中以10~20 Hz进行破碎1~2min，取出样品在冰水中超声，超声步骤为1 min超声，1 min停止，共10~15个循环，进行5~15min离心；取上清液于EP管中暂存，将下层组织样品沉淀重复进行以上提取步骤2~3次，将每次的上清液混合并去除溶剂，最后使用100~150 μL的体积比70~80%预冷甲醇水溶液复溶，并使用孔径0.22 μm以下的PTFE滤膜过滤，然后装进配有内衬管的色谱样品瓶里，放入样品盒保存在-20 ℃~-80 ℃冰箱中，等待UHPLC-QTOF-MS检测；从所有待测样品中各取5~10 μL混合，作为QC样品，用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
6.根据权利要求1~5之一所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，步骤2中，所述的色谱条件如下：
反相色谱柱使用亚2 μm C18填料的色谱柱，保护柱使用在线过滤器，流动相由记为A相的含0.1%甲酸的超纯水和记为B相的含0.1%甲酸的乙腈组成，梯度程序为：0 min，1% B；1min，1% B；3 min，15% B；6 min，50% B；9 min，95% B；14.0 min，95% B；每次进样前在初始条件下平衡5~10 min，流速0.4~0.5 mL/min，柱温25~45℃，进样量1~3 μL；
亲水作用色谱柱使用亚2 μm 亲水作用色谱柱，保护柱使用在线过滤器，流动相由记为C相的含0.3%甲酸+2 mM甲酸铵的超纯水和记为D相的含0.3%甲酸+2mM甲酸铵的95%色谱纯乙腈水组成，梯度程序为：0 min，100% D；1 min，100% D；12 min，50% D；17 min，50% D；每次进样前在初始条件下平衡5~10 min，流速0.4~0.5 mL/min，柱温25~45℃，进样量1~3 μL；
所述的质谱条件如下：
质谱在ESI+和ESI-两种采样模式下分别进行分析测定，质谱仪鞘气温度为250~400℃，流速为7~12L/min；干燥气流速为250~400℃，流速为7~12L/min；采集频率为2~4质谱图/秒；正离子检测模式下，毛细管电压为2000~4000 V，喷嘴电压为200~500 V，雾化器压力为20~50psi；负离子检测模式下，毛细管电压为-2000~-3500 V，喷嘴电压为-1000~-1500 V，雾化器压力为20~50psi；
还分别采集质控样品在碰撞能为10、20和40 V条件下的质谱数据，所得母离子及碎片离子作为代谢物定性依据。
7. 根据权利要求6所述的DBS的代谢组检测分析方法，其特征在于，所述反相色谱柱可选用Waters Acquity UPLC® HSS T3，保护柱可选用Waters Acquity UPLC® HSS T3VanGuard Pre-Column；
所述亲水色谱柱可选用Waters Acquity UPLC® BEH Amide，保护柱可选用WatersAcquityUPLC® BEH Amide VanGuard Pre-Column。
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2018
- 2018-12-22 CN CN201811575739.XA patent/CN109738530A/zh active Pending
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