CN106198784A - 一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法 - Google Patents

一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法。该方法包括对照品溶液的制备、待测样品溶液的制备和高效液相色谱‑串联质谱检测的步骤。本发明检测芍药中的褪黑素所得色谱峰与其它组分色谱峰能达到基线分离，呈对称的高斯峰，峰型良好，能满足定性和定量要求；本发明所提供的芍药中褪黑素含量检测方法操作简便、灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠。

Description

一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法
技术领域
本发明涉及一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法。
背景技术
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是芍药科芍药属多年生宿根草本植物，具有很高的观赏和药用价值。芍药的药用主要是针对其根系进行提取，而其地上部分除了用于观赏之外，别无它用，尤其是花瓣部分，每年花期过后，花瓣凋落满地，这无形中造成了资源的巨大浪费。褪黑素(melatonin)是近年来倍受人们关注的一种吲哚类神经内分泌激素，对人体具有许多重要的生理功能，如能够提高睡眠质量、增强机体免疫能力、减缓机体衰老、抗肿瘤、抗氧化和调节生理节律等。前人研究表明，在食用富含褪黑素的水果、蔬菜后，人体内褪黑素分泌水平呈上升趋势，从而提高人体的抗氧化能力、有效改善人体的免疫调节功能。因此，挖掘和开发富含褪黑素的植物材料吸引了越来越多科学家的关注。目前，植物褪黑素主要在金丝桃、拟南芥、水稻、葡萄等植物中被报道，芍药在此方面目前并没有得到应有的开发和利用。
植物中褪黑素的检测方法主要色谱法、电化学分析法、免疫分析法等，其中对于电化学分析法和免疫分析法这些快速检测方法，优点在于前处理要求相对较低，速度快，但多数是针对人体血液或其他动物器官中的褪黑素检测，专门针对植物中褪黑素检测的参考方法较少。与之相比，色谱法中的高效液相色谱法(HPLC)最为普遍，其具有灵敏度高、回收率高、线性范围好、准确度高的优点，在此基础之上又延伸出高效液相色谱与荧光检测器联用法(HPLC-FD)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)等检测方法。这些方法应用的范围依据植物的种类、检测的精确度和特异性要求并不一致。HPLC-FD是植物中褪黑素定量研究的较常用方法，但其对仪器设备要求较高，且荧光检测器的灵敏度不高、选择性差，对于与褪黑素结构相似的物质很难区分开。质谱可以大大提高褪黑素检测的准确度和灵敏度，具有高灵敏度和检测特异性的HPLC-MS可以作为检测褪黑素含量的精确手段。与HPLC-MS相比，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)具有更高的特异性和准确性，而目前关于这一方法的应用报道较少，在芍药上暂未查找到相关资料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测芍药中褪黑素含量的方法，该方法灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠。
本发明采用的技术方案是：一种检测芍药中褪黑素含量的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品褪黑素2mg，置于100mL容量瓶中，加80％的甲醇水溶液充分溶解，并稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液。
(2)待测样品溶液的制备：将芍药样品用研钵研磨均匀，取1g样品置于10mL试管中，加入5mL甲醇溶液，4℃冰箱避光静置1h。在黑暗中超声处理(45Hz，45℃，35min)，随后在4℃下10,000g离心15min。收集上清并用0.22μm微孔滤膜过滤，置于新的2mL试管，真空浓缩仪浓缩(30℃，4h)，将浓缩后的物质用0.8mL、80％甲醇水溶液复溶，振荡15min，通过0.22μm滤膜过滤后作为待测样品溶液。
(3)高效液相色谱-串联质谱检测。
所述高效液相色谱-串联质谱中的色谱及质谱条件如下
色谱条件：
色谱柱：Thermo AQ-C18(2.1mm×5mm，2.6μm)；
流动相：乙腈和0.5％甲酸水溶液，采用梯度洗脱(表1)；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
流速0.4mL/min；
UV灯关，MS分时段设置流路，在0～2.5min和15～25min时间段设置成To waste，在
2.5～15min时间段设置成MRM。
表1 梯度洗脱表
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：MRM；
离子检测方式：正离子；
干燥器温度：300℃；
干燥气流速：10L/min；
雾化气压力：15psi；
鞘气温度：250℃；
鞘气流速：7L/min；
毛细管电压：4000V；
喷雾电压：500V；
检测离子：母离子为m/z233.2，子离子为m/z174.2、m/z159.2。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用的方法和实验条件是经过筛选获得的，能够达到精确测定的目的。
(2)本发明检测芍药中的褪黑素所得色谱峰与其它组分色谱峰能达到基线分离，呈对称的高斯峰，峰型良好，能满足定性和定量要求；
(3)本发明所提供的芍药中褪黑素含量检测方法操作简便、灵敏度高、专一性强、稳定性好、结果准确可靠。
附图说明
图1 HPLC-MS/MS测定褪黑素标准品
A.褪黑素标准品色谱图；B.褪黑素标准品质谱图。
图2 HPLC-MS/MS测定芍药花瓣中褪黑素
A.芍药花瓣色谱图；B.芍药花瓣质谱图。
图3芍药不同组织中褪黑素含量。
具体实施方式
实施例1
1、仪器与试剂：Agilent6460液质联用仪(美国Agilent公司)，Syncronis AQ-C18色谱柱(美国THERMO公司)，真空离心浓缩仪(德国Eppendorf公司)，KQ-200VDB超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)，HC-2518离心机(科大创新股份有限公司)；分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；微孔滤膜(0.22μm)(上海安普实验科技股份有限公司)。
褪黑素标准品(纯度≥98％，美国Sigma公司)，甲醇(HPLC级，美国Tedia试剂公司)，乙腈(HPLC级，美国Tedia试剂公司)，去离子水由Millipore超纯水系统制备。
2、待测样品溶液的制备：以田间栽植于扬州大学园艺与植物保护学院芍药种质资源圃(32°30′N，119°25′E)中的芍药品种‘红峰’为试材，采集其花瓣、叶片和根系，其中花瓣用于方法分析，所采集的样品带回实验室后立即用液氮冷冻处理，保存于-80℃冰箱中。
将芍药样品用研钵研磨均匀，取1g样品置于10mL试管中，加入5mL甲醇溶液，4℃冰箱避光静置1h。在黑暗中超声处理(45Hz，45℃，35min)，随后在4℃下10,000g离心15min。收集上清并用0.22μm微孔滤膜过滤，置于新的2mL试管，真空浓缩仪浓缩(30℃，4h)，将浓缩后的物质用0.8mL、80％甲醇水溶液复溶，振荡15min，通过0.22μm滤膜过滤后作为待测样品溶液。
3、色谱条件：
色谱柱：Thermo AQ-C18(2.1mm×5mm，2.6μm)；
流动相：乙腈和0.5％甲酸水溶液，采用梯度洗脱(表1)；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
流速0.4mL/min；
UV灯关，MS分时段设置流路，在0～2.5min和15～25min时间段设置成To waste，在
2.5～15min时间段设置成MRM。
表1 梯度洗脱表
4、质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：MRM；
离子检测方式：正离子；
干燥器温度：300℃；
干燥气流速：10L/min；
雾化气压力：15psi；
鞘气温度：250℃；
鞘气流速：7L/min；
毛细管电压：4000V；
喷雾电压：500V；
检测离子：母离子为m/z233.2，子离子为m/z174.2、m/z159.2。
5、对照品溶液的制备及标准曲线绘制
取对照品褪黑素2mg，置于100mL容量瓶中，加80％的甲醇水溶液充分溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，在此基础之上，再分别将其用80％的甲醇水溶液稀释成质量浓度为200、100、50、20、10、5、2ng/mL，在进行HPLC-MS/MS测定时，上述不同质量浓度的标准品溶液分别测定峰面积，用于绘制标准曲线。
6、检测方法确认
(1)线性关系实验分析
外标峰面积法测定：将2.5mg/mL储备液用80％的甲醇水溶液稀释成质量浓度为200、100、50、20、10、5、2ng/mL的系列浓度标准品溶液，分别重复进样3次。按照各标准品平均峰面积对浓度作标准曲线。
(2)精确度实验分析
精密吸取褪黑素标准品5μL(30ng/mL)，平行进样5次，根据测定结果峰面积积分值计算相对标准RSD，考察测定方法的精确度。
(3)重复性实验分析
精确称取5份1g的同一批芍药花瓣，按上述方法制备成样品溶液，进样测定，根据测定结果峰面积积分值，考察测定方法的可重复性。
(4)稳定性实验分析
精确吸取褪黑素标准品5μL(50ng/mL)，在色谱条件下分别于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h进样测定，根据测定结果峰面积积分值，考察测定方法的稳定性。
(5)回收率实验分析
精确称取已知含量的1g芍药花瓣5份，加入1mg/mL褪黑素标准品70μL，按上述方法制备成样品溶液，进样测定，计算回收率。
加样回收率(％)＝(A－B/C)×100％收率。
式中：A.是加入标样后检测到的含量；B.是没有加标样时检测到的含量；C.是加入标样的量。
(6)样品测定
将芍药花瓣、叶片、根系处理好的溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用外标法定量，测定芍药花瓣、叶片、根系中褪黑素含量。
7、结果
(1)HPLC-MS/MS鉴定褪黑素
由图1可以看出，在乙腈和0.5％甲酸水溶液作为缓冲液、采用梯度洗脱时，褪黑素标准品能够被检测到，其出峰保留时间为11.70min，并且在质谱条件下，褪黑素标准品在母离子m/z233.2下能够有效地检测到离子碎片m/z174.2和m/z159.2。这种检测方法应用于芍药样品中能够成功地鉴定褪黑素，其出峰保留时间为11.58min，在母离子m/z233.2下同样能检测到离子碎片m/z174.2和m/z159.2(图2)。
(2)检测方法确认
①线性关系
以平均峰面积为纵坐标(Y)、标准品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得出回归方程和相关系数分别为Y＝30.162X+202.23，R2＝0.9994(表2)，结果表明，褪黑素进样量在2～200ng/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，可用于定量分析。
表2 褪黑素线性关系分析
②精确度和重复性
以浓度30ng/mL的褪黑素标准品来分析检测的精确度，重复进样5次，最终相对标准偏差(RSD)为6.9％(表3)，表明该方法的精确性良好，符合分析要求。
表3 褪黑素精确度分析
取5份芍药花瓣，每份1g，测定结果平均峰面积为957.6，重复性测定值的RSD为4.2％(表4)，表明该检测方法具有良好的可重复性，符合分析要求。
表4 褪黑素重复性分析
③稳定性
取褪黑素标准品50ng/mL，于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h进样测定，稳定性测定值的RSD值为1.46％(表5)，表明该方法具有良好的稳定性，符合分析要求。
表5 褪黑素稳定性分析
④回收率
取5份芍药花瓣，每份1g，加入1000ng/mL褪黑素标准品70μL，测得样品平均回收率为87.94％，RSD为3.24％(表6)，表明该方法准确率较高，回收效果良好。
表6 褪黑素加标回收率分析
(3)芍药不同组织器官褪黑素含量分析
从图3可以看出，采用该检测体系在芍药花瓣、根系、叶片中均能检测到褪黑素，其中花瓣中褪黑素含量最高，达到了62.61±3.23ng/g FW，其次为根系31.97±1.34ng/g FW，而叶片中褪黑素含量最低，仅为12.44±1.12ng/g FW，并且花瓣中褪黑素含量分别是根系和叶片的1.96和5.03倍。

Claims (2)

1.一种检测芍药中褪黑素含量的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品褪黑素2mg，置于100mL容量瓶中，加80％的甲醇水溶液充分溶解，并稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液。
(2)待测样品溶液的制备：将芍药样品用研钵研磨均匀，取1g样品置于10mL试管中，加入5mL甲醇溶液，4℃冰箱避光静置1h，在黑暗中超声处理，随后在4℃下10,000g离心15min。收集上清并用0.22μm微孔滤膜过滤，置于新的2mL试管，真空浓缩仪浓缩，将浓缩后的物质用0.8mL、80％甲醇水溶液复溶，振荡15min，通过0.22μm滤膜过滤后作为待测样品溶液；
(3)高效液相色谱-串联质谱检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱-串联质谱中的色谱及质谱条件如下，
色谱条件为：
色谱柱：Thermo AQ-C18(2.1mm×5mm，2.6μm)；
流动相：乙腈和0.5％甲酸水溶液，采用梯度洗脱；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
流速0.4mL/min；
UV灯关，MS分时段设置流路，在0～2.5min和15～25min时间段设置成To waste，在2.5～15min时间段设置成MRM；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描模式：MRM；
离子检测方式：正离子；
干燥器温度：300℃；
干燥气流速：10L/min；
雾化气压力：15psi；
鞘气温度：250℃；
鞘气流速：7L/min；
毛细管电压：4000V；
喷雾电压：500V；
检测离子：母离子为m/z233.2，子离子为m/z174.2、m/z159.2。
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