CN107941951A - 一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,包括以下步骤:(1)标准品溶液的配制;(2)供试品溶液的配制:将烘干至恒重的铁皮石斛样品研磨成粉末,加入到乙醇水溶液中进行提取,得到铁皮石斛提取液,将铁皮石斛提取液中的溶剂除干,剩余物复溶于色谱级甲醇中,之后充分震荡混合,再经过过滤处理,得到供试品溶液;(3)标准品溶液与供试品溶液的测定。与现有检测方法相比,本发明工艺简单、准确性高、重复性好,为铁皮石斛中槲皮素的检测提供了快速、准确的方法,有助于提高铁皮石斛槲皮素利用效率,对铁皮石斛实际生产加工有一定的意义。
Description
技术领域
本发明涉及物质检测领域,具体地说涉及一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法。
背景技术
铁皮石斛,多年生草本植物,是我国传统中药材中最为珍惜名贵的一种。铁皮石斛有很高的药用价值,具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖和提高免疫等作用。铁皮石斛的化学成分主要含有多糖、生物碱、菲类、联苄、类黄酮等。
铁皮石斛中的黄酮类物质有一定的药效,具有研究的价值。其中槲皮素(Quercetin),又名栎精,化学名3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮,是铁皮石斛中含有的一种天然的黄酮类化合物。槲皮素具有一定的药用价值,有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血压、抗肿瘤、止咳祛痰等功效。
当前对铁皮石斛中黄酮类物质少有研究,尤其是缺少检测铁皮石斛中槲皮素含量的方法,不利于铁皮石斛槲皮素的利用,槲皮素的化学结构式如下式1所示:
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种回收率高,准确性好的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,包括以下步骤:
(1)标准品溶液的配制
称取槲皮素标准品,溶于色谱级甲醇中,充分混匀,制成两组以上不同浓度的标准品溶液;
(2)供试品溶液的配制
将烘干至恒重的铁皮石斛样品研磨成粉末,加入到乙醇水溶液中进行提取,得到铁皮石斛提取液,将铁皮石斛提取液中的溶剂除干,剩余物复溶于色谱级甲醇中,之后充分震荡混合,再经过过滤处理,得到供试品溶液;
(3)标准品溶液与供试品溶液的测定
采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测。
进一步地,步骤(2)中,研磨成粉末的铁皮石斛样品与乙醇水溶液的料液比为1g~2g:25mL~26mL,乙醇水溶液的体积浓度为40%~60%。在实施本发明的过程中,发明人发现,采用以上配比,提取效果较好,从而保证槲皮素检测的准确性。
进一步地,步骤(2)中,提取的具体过程为:在40℃~60℃条件下超声处理15min~60min,然后离心处理,取上清液,即为铁皮石斛提取液。在实施本发明的过程中,发明人发现,采用以上提取工艺,能够让铁皮石斛中的槲皮素充分析出,从而保证对槲皮素检测的准确性。
进一步地,步骤(2)中,复溶时每3ml铁皮石斛提取液使用200μL~500μL色谱级甲醇。
进一步地,步骤(2)中,过滤处理采用微孔滤膜过滤,滤膜的孔径为0.22μm~0.45μm。
进一步地,步骤(2)中,将铁皮石斛提取液中的溶剂除干的方式为用氮吹仪吹干。
进一步地,铁皮石斛中的槲皮素在19.3min~19.4min,360nm~384nm处有最大吸收峰。
进一步地,步骤(3)中,HPLC-DAD应用的色谱条件为:色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um,柱温20℃~35℃,进样量10μL~25μL,流速1.0mL/min,流动相为乙腈和甲酸水溶液,梯度洗脱条件为在0min~60min,有机相在流动相里的比例从5%~20%升至80%~95%。
进一步地,甲酸水溶液的体积浓度为0.01%~0.1%。
本发明的有益效果体现在:
1.与现有检测方法相比,本发明工艺简单、准确性高、重复性好,为铁皮石斛中槲皮素的检测提供了快速、准确的方法,有助于提高铁皮石斛槲皮素利用效率,对铁皮石斛实际生产加工有一定的意义。
2.本发明的提取过程采用超声能够破碎细胞,简化了操作工艺,操作方便、高效,并降低了工艺成本;并使提取更充分,重复提取可以使铁皮石斛中的槲皮素充分溶解于乙醇中,由于槲皮素含量较低,浓缩复溶可以提高溶液中槲皮素的浓度,便于检测。
3.本发明确定了铁皮石斛槲皮素在19.3min~19.4min,360nm~384nm处有最大吸收峰。
附图说明
图1是实施例1得到的槲皮素的液相色谱图。
图2是实施例1得到的槲皮素标品标准曲线图。
图3是实施例2得到的槲皮素的液相色谱图。
图4是实施例3得到的槲皮素的液相色谱图。
图5是实施例5得到的槲皮素的液相色谱图。
图6是实施例6得到的槲皮素的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例所使用的各种原料,如未作特别说明,均为本领域公知的市售产品。为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案,在下面的详细描述中,只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑,本领域的普通技术人员可以认识到,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。
实施例1
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,包括以下步骤:
(1)标准品溶液的配制
分别精密称取槲皮素标准品,溶于色谱级甲醇中,涡旋仪震荡,充分混匀,制成浓度分别为500μg/mL、25μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL的标准品溶液;
(2)供试品溶液的配制
精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品,通过球磨仪充分研磨成粉末,按照料液比1g:26mL的比例加入到体积浓度为51%的乙醇水溶液中进行提取,提取的具体过程为:在60℃条件下超声处理30min,然后5000rpm的转速下离心处理10min,取上清液,即为铁皮石斛提取液;
取3mL铁皮石斛提取液,用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干,剩余物再复溶于300μL色谱级甲醇中,然后摇床放置12小时,最后进行过滤处理,过滤处理采用微孔滤膜过滤,滤膜的孔径为0.22μm,所得的滤液即为供试品溶液;
(3)标准品溶液与供试品溶液的测定
采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测,应用的色谱条件为:色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um,柱温25℃,进样量10μL,流速1.0mL/min,流动相为乙腈和体积浓度为0.02%的甲酸水溶液,梯度洗脱条件为在0min~40min,有机相在流动相里的比例从5%升至80%。
(4)结果解析
首先从对槲皮素25μg/mL标准品进行HPLC-DAD的检测结果中,得到槲皮素的液相色谱图,参见图1。经过分析得知,槲皮素在19.3min~19.4min,360nm~384nm处有最大吸收峰。
通过对标准品溶液的测定,绘制出标准曲线,参见图2,得到槲皮素含量计算公式如下:y=0.6324x-0.3724,x为浓度(μg/mL),y为峰面积,R2=0.9997。根据所作出的标准曲线计算供试品溶液的浓度为0.703±2μg/mL。
实施例2
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,包括以下步骤:
(1)标准品溶液的配制
分别精密称取槲皮素标准品,溶于色谱级甲醇中,涡旋仪震荡,充分混匀,制成浓度分别为500μg/mL、25μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL的标准品溶液;
(2)供试品溶液的配制
精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品,通过球磨仪充分研磨成粉末,按照料液比2g:25mL的比例加入到体积浓度为60%的乙醇水溶液中进行提取,提取的具体过程为:在40℃条件下超声处理60min,然后4000rpm的转速下离心处理15min,取上清液,即为铁皮石斛提取液;
取3mL铁皮石斛提取液,用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干,剩余物再复溶于200μL色谱级甲醇中,然后摇床放置12小时,最后进行过滤处理,过滤处理采用微孔滤膜过滤,滤膜的孔径为0.45μm,所得的滤液即为供试品溶液;
(3)标准品溶液与供试品溶液的测定
采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测,应用的色谱条件为:色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um,柱温20℃,进样量15μL,流速1.0mL/min,流动相为乙腈和体积浓度为0.01%的甲酸水溶液,梯度洗脱条件为在0min~50min,有机相在流动相里的比例从10%升至85%。
(4)结果解析
解析手段同实施例1,对槲皮素25μg/mL标准品进行HPLC-DAD的检测结果中,得到槲皮素的液相色谱图,参见图3,经过分析,本实施例结果与实施例1相似,槲皮素在18.5min~18.8min,360nm~384nm处有最大吸收峰,得到槲皮素含量计算公式如下:y=0.6473x-0.3656,x为浓度(μg/mL),y为峰面积,R2=0.9993。供试品溶液的浓度为0.537±2μg/mL。
实施例3
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,包括以下步骤:
(1)标准品溶液的配制
分别精密称取槲皮素标准品,溶于色谱级甲醇中,涡旋仪震荡,充分混匀,制成浓度分别为500μg/mL、25μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL的标准品溶液;
(2)供试品溶液的配制
精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品,通过球磨仪充分研磨成粉末,按照料液比1.5:25.5mL的比例加入到体积浓度为40%的乙醇水溶液中进行提取,提取的具体过程为:在50℃条件下超声处理15min,然后6000rpm的转速下离心处理5min,取上清液,即为铁皮石斛提取液;
取3mL铁皮石斛提取液,用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干,剩余物再复溶于500μL色谱级甲醇中,然后摇床放置12小时,最后进行过滤处理,过滤处理采用微孔滤膜过滤,滤膜的孔径为0.30μm,所得的滤液即为供试品溶液;
(3)标准品溶液与供试品溶液的测定
采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测,应用的色谱条件为:色谱柱参数C18Column 250×4.6mm 5um,柱温35℃,进样量25μL,流速1.0mL/min,流动相为乙腈和体积浓度为0.08%的甲酸水溶液,梯度洗脱条件为在0min~60min,有机相在流动相里的比例从20%升至95%。
(4)结果解析
解析手段同实施例1,对槲皮素25μg/mL标准品进行HPLC-DAD的检测结果中,得到槲皮素的液相色谱图,参见图4,经过分析,本实施例结果与实施例1相似,槲皮素在19.3min~19.4min,360nm~384nm处有最大吸收峰,得到槲皮素含量计算公式如下:y=0.6531x-0.3672,x为浓度(μg/mL),y为峰面积,R2=0.9987。供试品溶液的浓度为0.254±2μg/mL。
实施例4
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法
本实施例的具体步骤与实施例1相似,区别仅在于本实施例在步骤(2)进行提取时,没有采用超声处理,仅在60℃条件下浸泡了30min。
经过测定和解析后,得到槲皮素含量计算公式如下:y=0.6324x-0.3724,x为浓度(μg/mL),y为峰面积,R2=0.9997。根据所作出的标准曲线计算供试品溶液的浓度为0.626±3μg/mL。较之实施例1的结果,本实施例未经过超声处理,槲皮素的提取效率较低。
实施例5
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法
本实施例的具体步骤与实施例1相似,区别仅在于本实施例在步骤(3)中,流动相为乙腈和体积浓度为0.1%的甲酸水溶液。
经过测定,从对槲皮素25μg/mL标准品进行HPLC-DAD的检测结果中,得到槲皮素的液相色谱图,参见图5,对谱图进行分析,结果为槲皮素在18.6min~18.8min,360nm~384nm处有最大吸收峰,从峰型的对称度和物质的保留时间来看,本实施例较之实施例1,检测效果较差。
实施例6
一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法
本实施例的具体步骤与实施例1相似,区别仅在于本实施例在步骤(3)中,流动相为乙腈和体积浓度为1%的乙酸水溶液。
经过测定,从对槲皮素25μg/mL标准品进行HPLC-DAD的检测结果中,得到槲皮素的液相色谱图,参见图6,对谱图进行分析,结果为槲皮素在4.4min~4.6min,360nm~384nm处有最大吸收峰,从峰型的对称度和物质的保留时间来看,本实施例较之实施例1,检测效果较差。
实施例7
精密度实验
制6份浓度相等的槲皮素标准品溶液,按实施例1的方法检测槲皮素标准品溶液的中槲皮素含量,检测结果见下表1。
表1精密度实验数据
试验结论:6份槲皮素标准溶液含量的RSD为0.9845%,表明本发明有较好的精密度,符合GB/T 27404-2008质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(%)≤1.3%】。
实施例8
回收率试验
精密称取槲皮素标准品一份,溶于色谱级甲醇,制得槲皮素标准品溶液一份,按实施例1的方法检测槲皮素含量;再精密称取铁皮石斛样品一份,按实施例1的方法制得供试品溶液,并检测其槲皮素含量。将已知含量的标准品溶液与供试品溶液各取100μL混合,共制6组,按实施例1的方法检测槲皮素含量。计算每组的回收率,回收率(%)=(混合液所测含量-已知标准品含量)/已知标准品含量,检测结果见下表2。
表2回收率实验数据
试验结论:槲皮素加标平均回收率为:99.61%,相对标准偏差(RSD)分别为0.875%,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求回收率为95%~105%】
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明,并不用于限制本发明,本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)标准品溶液的配制
称取槲皮素标准品,溶于色谱级甲醇中,充分混匀,制成两组以上不同浓度的标准品溶液;
(2)供试品溶液的配制
将烘干至恒重的铁皮石斛样品研磨成粉末,加入到乙醇水溶液中进行提取,得到铁皮石斛提取液,将铁皮石斛提取液中的溶剂除干,剩余物复溶于色谱级甲醇中,之后充分震荡混合,再经过过滤处理,得到供试品溶液;
(3)标准品溶液与供试品溶液的测定
采用HPLC-DAD检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测。
2.如权利要求1所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(2)中,研磨成粉末的铁皮石斛样品与乙醇水溶液的料液比为1g~2g:25mL~26mL,乙醇水溶液的体积浓度为40%~60%。
3.如权利要求1或2所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(2)中,提取的具体过程为:在40℃~60℃条件下超声处理15min~60min,然后离心处理,取上清液,即为铁皮石斛提取液。
4.如权利要求1或2所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(2)中,复溶时每3ml铁皮石斛提取液使用200μL~500μL色谱级甲醇。
5.如权利要求1或2所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(2)中,过滤处理采用微孔滤膜过滤,滤膜的孔径为0.22μm~0.45μm。
6.如权利要求1或2所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(2)中,将铁皮石斛提取液中的溶剂除干的方式为用氮吹仪吹干。
7.如权利要求1或2所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,步骤(3)中,HPLC-DAD应用的色谱条件为:色谱柱参数C18 Column 250×4.6mm 5um,柱温20℃~35℃,进样量10μL~25μL,流速1.0mL/min,流动相为乙腈和甲酸水溶液,梯度洗脱条件为在0min~60min,有机相在流动相里的比例从5%~20%升至80%~95%。
8.如权利要求7所述的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法,其特征在于,甲酸水溶液的体积浓度为0.01%~0.1%。
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CN117705971B (zh) * | 2023-12-12 | 2024-05-07 | 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 | 一种鉴别铁皮石斛和水草石斛的方法 |
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