CN113354610B - 一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法 - Google Patents

一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法，以养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率为评价指标，在单因素试验的基础上采用Box‑Benhnken Design确定试验方案，利用高效液相色谱法测定3种黄酮类成分的并计算出总提取率。最后结合响应面模型进行提取工艺参数优化，并进行试验验证。本发明采用的天然低共熔溶剂较传统有机溶剂更高效、经济、环保，可用于养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的提取，是一种可持续的提取介质，同时为其他方药的提取工艺提供新的参考。

Description

一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法
技术领域
本发明属于化学成分提取技术领域，具体涉及一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法。
背景技术
养阴益气活血方药是由生地黄、黄芪、葛根、川芎按比例1:1:1.2:0.67进行水煎醇提，旋转蒸发至一定体积，加入赋形剂制成颗粒。养阴益气活血方药具有阻止血栓形成、防止组织细胞损伤、提高细胞抗氧化能力等功效，在心脑血管疾病的治疗过程中有明显的疗效。
葛根素具有舒张血管、改善血管微环境、抗氧化等作用，并且葛根素的药材资源丰富、无副作用、效果显著，是临床中治疗心脑血管疾病的关键药物。芒柄花素具有预防脑中卒、调节血脂代谢、防治大脑缺氧等作用。毛蕊异黄酮对缺血性脑损伤和高脂饮食大鼠的心脑血管具有保护作用及抗氧化等作用。这三种成分都有活血、抗氧化、抗血栓等功效，在治疗心脑血管疾病方面有突出的功效。
溶剂提取法作为一种常用中药提取方法，用合适的溶解介质，将目标成分按溶解度、亲和性、极性等特性进行分离提取。常用的无机溶剂包括水、盐溶液、酸碱溶液、液态二氧化碳等；常用的有机溶剂包括醇类、醚类、卤代烃、芳香烃等。但溶剂提取法存在杂质多、不易溶、不环保等问题。Abbott和其同事提出低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DES)拥有特殊的理化性质和溶剂可回收的特点，可以作为一种有效的提取溶剂。低共熔溶剂由氢键受体(Hydrogen Bond Acceptor，HBA)(季铵盐或金属盐类物质)和氢键供体(HydrogenBond Donor，HBD)(尿素、羧酸、醇等)组成，具有离子液体的一般特性(溶解性能好、蒸气压低等)。天然低共熔溶剂(nature deep eutectic solvents，NADES)将化学提取的技术与概念和生物领域中细胞组分的性质相结合，提出一种将生物分子，例如糖、胆碱、醇等作为组分合成的天然、绿色提取溶剂。近年来，天然低共熔溶剂已经广泛应用于各种领域，如天然低共熔溶剂作为离子液体的天然替代品用于改善碳糊电极(carbon paste electrodes，CPE)的粘合性、天然低共熔溶剂提取葡萄果渣中的花青素等。
目前对养阴益气活血方药与低共熔溶剂提取已分别有相关报道，但是将低共熔溶剂应用于养阴益气活血方药提取的研究还未见报道。本研究在前期研究基础上，设计合成6种实验室常用的NADES，提取养阴益气活血方药中3种黄酮类成分(葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素)，筛选出提取效果最佳的NADES；根据单因素实验确定较佳水平，利用响应面法对各因素的提取条件进行优化并验证优化工艺。为今后养阴益气活血方药的深入研发提供参考，也为该药物的进一步临床应用夯实基础，促进其生产与发展。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法及其工艺优化方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)黄酮类成分原料的准备：精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管；
2)天然低共熔溶剂的配制；
3)将步骤1)称取的养阴益气活血方药按照150:1mg/mL料液比加入到步骤2)制备的甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂中混合提取3种黄酮类成分；
4)利用高效液相色谱法测定3种黄酮类成分并计算总提取率。
进一步地，步骤2)的配制过程为：准确称取一定质量的氢键受体甜菜碱和氢键供体乳酸试剂，并按照摩尔比甜菜碱：乳酸＝1:1进行混合，混合后于80-90℃的油浴加热条件下不断搅拌，直至形成澄清透明的液体，即为甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂，冷却至室温后待用。
进一步地，步骤3)中3种黄酮类成分分别为葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素。
进一步地，步骤4)的具体步骤为：
步骤一：准确称取葛根素标准品1.15mg、毛蕊异黄酮标准品0.6mg、芒柄花素标准品0.31mg，分别加入1.15、1.5、1.55mL的1:1甲醇水溶解，配制成1、0.4、0.2mg/mL的标准品溶液，再将标准品溶液按比例加入离心管中得到1号混合溶液；
步骤二：精密吸取步骤一制得的1号混合溶液适量，进行倍比稀释，得到2-7号混合溶液。即，得到葛根素浓度为0.5000、0.2500、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mg/mL，毛蕊异黄酮浓度为0.200、0.100、0.050、0.025、0.0125、0.006mg/mL，芒柄花素浓度为0.100、0.050、0.025、0.013、0.006、0.003mg/mL，进行高效液相色谱分析；
步骤三：以标准品溶液浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，得到葛根素标准曲线为：Y＝14376X+61394，R2＝0.9993，表明葛根素在15.60-500μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系；毛蕊异黄酮标曲为：Y＝655.64X+215.25，R2＝0.9994，表明毛蕊异黄酮在6.0-200μg/mL浓度范围内线性关系良好；芒柄花素标准曲线为：Y＝321.8X+87.167，R2＝0.9996，表明芒柄花素在3.0-100μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法的工艺条件优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)根据上述的天然低共熔溶剂提取黄酮类成分的方法，筛选出5个影响黄酮类成分提取率的因素；
b)以养阴益气活血方药中3种黄酮类成分的总提取率为评价指标，根据步骤a)筛选出的5个因素进行单因素多水平实验；
c)根据步骤b)的单因素多水平实验结果，采用Box-Benhnken Design确定试验方案，利用高效液相色谱法测定养阴益气活血方药中3种黄酮类成分并计算总共提取率，结合响应面模型对采用天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中的3种黄铜类成分的提取工艺进行参数优化。
进一步地，步骤a)筛选出的5个影响黄酮类成分提取率的因素为：天然低共熔溶剂种类的筛选、天然低共熔溶剂配制时水分的添加量、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间、养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取温度。
进一步地，步骤b)的具体步骤为：
天然低共熔溶剂筛选：精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管，按150：1mg/mL料液比分别加入Pro-Ur、ChCl-Ur、Bet-Gly、Pro-Mu、ChCl-La与Bet-Lac，将混合物用离心机4500pm下离心10min，取上清，HPLC对各提取物中三种有效分的提取率进行分析、计算并筛选出最佳提取溶剂，其中，Pro-Ur为脯氨酸与尿素按摩尔比1:1配制而成，ChCl-Ur为氯化胆碱与尿素按摩尔比1:2配制而成，Bet-Gly为甜菜碱与甘油按摩尔比1:2配制而成，Pro-Mu为脯氨酸与1-甲基脲按摩尔比1:1配制而成，ChCl-La为氯化胆碱与乙酰丙酸按摩尔比1:2配制而成，Bet-Lac为甜菜碱与乳酸按摩尔比1:1配制而成；
天然低共熔溶剂配制时水分的添加量的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂配制水分添加量的单因素实验：固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL，提取温度50℃，提取时间30min，高效液相色谱条件不变，检测在将天然低共熔溶剂配成含水量分别为30％、40％、50％、60％、70％时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的单因素实验，固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL、含水量30％的Bet-Lac、提取温度50℃不变，检测在提取时间分别为15、30、45、60、75min时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的筛选：选取5个水平进行养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的单因素实验，固定含水量30％的Bet-Lac、提取温度50℃、提取时间45min不变，检测在提取料液比分别为50:1、100:1、150:1、200:1、250:1时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分是的提取温度的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分是的提取温度的单因素实验，固定料液比150:1、含水量30％的Bet-Lac、提取时间45min不变，检测在提取温度分别为40、50、60、70、80℃时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量。
进一步地，步骤c)的具体步骤为：
步骤c1：选取对养阴益气活血方药中3种黄酮类成分提取率影响较为显著的四个因素：含水量X1、料液比X2、提取时间X3、提取温度X4为自变量，以养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率为响应值，采用Box-Behnken Design组合设计法设计四因素三水平的响应面分析试验；
步骤c2：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对步骤c1得到的所述响应面分析试验的试验数据进行回归拟合分析，得到养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总含量Y的二次多项回归方程预测模型
Y＝158.28+4.76X1+64.81X2-49.92X3+20.90X4+10.90X1X2+20.71X1X3+1.14X1X4-40.47X2X3+40.88X2X4-10.37X3X4-19.62X1 2-4.09X2 2-6.90X3 2-5.30X4 2；
步骤c3：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并根据所得最佳提取工艺进行验证试验。
进一步地，步骤c3中最佳提取工艺条件为：含水量29％、料液比200：1、提取温度70℃、提取时间30min，养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率预测值为：369.54mg/g。本发明通过采用天然低共熔溶剂对养阴益气活血方药中的3种黄酮类成分进行提取，避免传统有机溶剂的使用，实现低成本、低风险、低污染的目的，提取方法绿色环保，提取工艺简单稳定可靠。
附图说明
图1为不同NADESs提取养阴益气活血方药中葛根素、芒柄花素和毛蕊异黄酮的影响；
图2为含水量对提取率的影响；
图3为提取时间对提取率的影响；
图4为料液比对提取率的影响；
图5为提取温度对提取率的影响；
图6为标准品色谱图(1-葛根素2-毛蕊异黄酮3-芒柄花素)；
图7为供试品色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，以便更好地理解本技术方案。
本发明一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法，包括以下步骤：1)黄酮类成分原料的准备：精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管；2)天然低共熔溶剂的配制，具体为准确称取一定质量的氢键受体甜菜碱和氢键供体乳酸试剂，并按照摩尔比甜菜碱：乳酸＝1:1进行混合，混合后于80-90℃的油浴加热条件下不断搅拌，直至形成澄清透明的液体，即为甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂，冷却至室温后待用；3)将步骤1)称取的养阴益气活血方药按照150:1料液比mg/mL加入到步骤2)制备的甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂中混合提取3种黄酮类成分，3种黄酮类成分分别为葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素；4)利用高效液相色谱法测定3种黄酮类成分并计算总提取率，其具体步骤为步骤一：准确称取葛根素标准品1.15mg、毛蕊异黄酮标准品0.6mg、芒柄花素标准品0.31mg，分别加入1.15、1.5、1.55mL的1:1甲醇水溶解，配制成1、0.4、0.2mg/mL的标准品溶液，再将标准品溶液按比例加入离心管中得到1号混合溶液；步骤二：精密吸取步骤一制得的1号混合溶液适量，进行倍比稀释，得到2-7号混合溶液。即，得到葛根素浓度为0.5000、0.2500、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mg/mL，毛蕊异黄酮浓度为0.200、0.100、0.050、0.025、0.0125、0.006mg/mL，芒柄花素浓度为0.100、0.050、0.025、0.013、0.006、0.003mg/mL，进行高效液相色谱分析；步骤三：以标准品溶液浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，得到葛根素标准曲线为：Y＝14376X+61394，R2＝0.9993，表明葛根素在15.60-500μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系；毛蕊异黄酮标曲为：Y＝655.64X+215.25，R2＝0.9994，表明毛蕊异黄酮在6.0-200μg/mL浓度范围内线性关系良好；芒柄花素标准曲线为：Y＝321.8X+87.167，R2＝0.9996，表明芒柄花素在3.0-100μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
上述提取方法的工艺条件优化方法，包括以下步骤：
a)根据上述的天然低共熔溶剂提取黄酮类成分的方法，筛选出5个影响黄酮类成分提取率的因素；该5个因素为：天然低共熔溶剂种类的筛选、天然低共熔溶剂配制时水分的添加量、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间、养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取温度。
b)以养阴益气活血方药中3种黄酮类成分的总提取率为评价指标，根据步骤a)筛选出的5个因素进行单因素多水平实验，具体步骤为：天然低共熔溶剂筛选：精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管，按150：1mg/mL料液比分别加入Pro-Ur、ChCl-Ur、Bet-Gly、Pro-Mu、ChCl-La与Bet-Lac，将混合物用离心机4500pm下离心10min，取上清，HPLC对各提取物中三种有效分的提取率进行分析、计算并筛选出最佳提取溶剂，其中，Pro-Ur为脯氨酸与尿素按摩尔比1:1配制而成，ChCl-Ur为氯化胆碱与尿素按摩尔比1:2配制而成，Bet-Gly为甜菜碱与甘油按摩尔比1:2配制而成，Pro-Mu为脯氨酸与1-甲基脲按摩尔比1:1配制而成，ChCl-La为氯化胆碱与乙酰丙酸按摩尔比1:2配制而成，Bet-Lac为甜菜碱与乳酸按摩尔比1:1配制而成；
天然低共熔溶剂配制时水分的添加量的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂配制水水分添加量的单因素实验：固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL，提取温度50℃，提取时间30min，高效液相色谱条件不变，检测在将天然低共熔溶剂配成含水量分别为30％、40％、50％、60％、70％时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的单因素实验，固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL、含水量30％的Bet-Lac、提取温度50℃不变，检测在提取时间分别为15、30、45、60、75min时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的筛选：选取5个水平进行养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的单因素实验，固定含水量30％的Bet-Lac、提取温度50℃、提取时间45min不变，检测在提取料液比分别为50:1、100:1、150:1、200:1、250:1mg/mL时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分是的提取温度的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分是的提取温度的单因素实验，固定料液比150:1mg/mL、含水量30％的Bet-Lac、提取时间45min不变，检测在提取温度分别为40、50、60、70、80℃时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量。
c)根据步骤b)的单因素多水平实验结果，采用Box-Benhnken Design确定试验方案，利用高效液相色谱法测定养阴益气活血方药中3种黄酮类成分并计算总共提取率，结合响应面模型对采用天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中的3种黄铜类成分的提取工艺进行参数优化，具体步骤为：
步骤c1：选取对养阴益气活血方药中3种黄酮类成分提取率影响较为显著的四个因素：含水量X1、料液比X2、提取时间X3、提取温度X4为自变量，以养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率为响应值，采用Box-Behnken Design组合设计法设计四因素三水平的响应面分析试验；
步骤c2：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对步骤c1得到的所述响应面分析试验的试验数据进行回归拟合分析，得到养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总含量Y的二次多项回归方程预测模型
Y＝158.28+4.76X1+64.81X2-49.92X3+20.90X4+10.90X1X2+20.71X1X3+1.14X1X4-40.47X2X3+40.88X2X4-10.37X3X4-19.62X1 2-4.09X2 2-6.90X3 2-5.30X4 2；
步骤c3：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并根据所得最佳提取工艺进行验证试验，该最佳提取工艺条件为：含水量29％、料液比200：1mg/mL、提取温度70℃、提取时间30min，养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率预测值为：369.54mg/g。
具体实验例
色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18(300mm×4.6mm，5μm)；进样体积：10μL；流速：1mL/min；柱温：22℃；检测波长：280nm；流动相：乙腈(A)、0.05％甲酸水溶液(B)；线性洗脱梯度：0-10min，2％-10％ A；10-29min，10％-12％ A；29-35min，12％-15％ A；35-50min，15％-25％ A；50-65min，25％-60％ A；65-70min，60％-90％ A。
实验例1：NADESs的制备与筛选
准确称取一定质量的氢键受体与氢键供体试剂，并按摩尔比混合，在80-90℃油浴加热下不断搅拌，直至形成澄清透明的液体。本试验所制备的NADESs如表1所示。
表1实验室制备的不同类型的NADESs
Figure GDA0004110261070000121
Figure GDA0004110261070000131
本试验考察NADES的类型对养阴益气活血方药中三种目标成分的提取率的影响，寻找最佳的NADES类型。精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管，按150：1mg/mL料液比分别加入Pro-Ur、ChCl-Ur、Bet-Gly、Pro-Mu、ChCl-La与Bet-Lac，将混合物用离心机4500rpm下离心10min，取上清，HPLC对各提取物中三种有效分的提取率进行分析、计算并筛选出最佳提取溶剂，不同NADESs提取率如图1所示。
由于NADES溶液含有不同种类的组分，氢键受体、供体不同，摩尔比不同。因此不同的NADES溶液具有不同的理化性质。低共熔溶剂的粘度受组分结构、混合比例、温度等因素影响而改变，并且目标产物的溶解度也会改变。此外，组分的种类可改变低共熔溶剂对产物的亲和性来影响提取的结果。综合考虑NADESs对不同黄酮的提取率，在Pro-Ur，Chcl-Ur，Bet-Gly，Pro-Mu，Chcl-La，Bet-Lac六种NADESs中选择Bet-Lac作为提取溶剂，其对于养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素三个目标提取物的提取效果均优，故选用Bet-Lac作为提取溶剂，进行后续的条件优化。
供试品溶液的制备：按比例精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管中，加入一定体积Bet-Lac天然低共熔溶剂，密塞，摇匀，在一定温度下提取一定的时间。将混合物用离心机在4500rpm下离心10min，取上清后加入等体积甲醇水稀释后抽滤，用于HPLC分析。
对照品溶液的制备：准确称取葛根素标准品1.15mg、毛蕊异黄酮标准品0.6mg、芒柄花素标准品0.31mg，分别加入1.15、1.5、1.55mL的1:1甲醇水溶解，配制成1、0.4、0.2mg/mL的标准品溶液。再将标准品溶液按比例加入离心管中得到1号混合溶液。
实验例2：单因素试验
含水量对提取率的影响：将NADES配成含水量30、40、50、60、70％的溶剂，准确称取养阴益气活血方药配方100mg，置于1.5mL离心管中，按照100的料液比加入天然低共熔溶剂，密塞，摇匀，在50℃条件下提取30min。提取后，将混合物用离心机在4500rpm下离心10min，取上清加入1:1甲醇水稀释后抽滤，用于HPLC检测不同含水量下葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量，提取率如图2所示。
NADES的含水量(水比例)是影响溶剂理化性质的关键因素，能改变NADES的极性与黏性。在NADES中加入水可以增加其流动性，而过多的水分可能导致分子间氢键的断裂，导致超分子结构的丢失，最终导致提取率下降。图2结果显示，在含水量在30％时，芒柄花素的提取率达到最大值，而葛根素和毛蕊异黄酮的提取率在30％与40％条件下呈下降趋势，故选取30％含水量为的Bet-Lac的最佳含水量，确定水平范围为20％-40％。
提取时间对提取率的影响：准确称取养阴益气活血方药配方100mg，置于1.5mL离心管中，根据100的料液比加入含水量30％的Bet-Lac，密塞，摇匀，分别在50℃条件下，分别提取15、30、45、60、75min。提取后，将混合物用离心机在4500rpm下离心10min，取上清加入1:1甲醇水稀释后抽滤，用于HPLC检测，提取率如图3所示。
图3结果显示，当提取时间为45min时，毛蕊异黄酮提取率最大，葛根素提取率较优，到达最大提取率后，随着时间的增加，活性成分的溶出量逐渐水解，综合考虑，故选择45min的作为提取时间，确定水平范围为30-60min。
料液比对提取率的影响：按照料液比50:1、100:1、150:1、200:1、250:1mg/mL准确称取养阴益气活血方药配方50、100、150、200、250mg，置于1.5mL离心管中，加入定量的含水量为30％的Bet-Lac，密塞，摇匀，在50℃条件下提取45min。提取后，将混合物用离心机在4500rpm下离心10min，取上清加入1:1甲醇水稀释后抽滤，用于HPLC分析，提取率如图4所示。
由图4可知，随着料液比的上升，NADES的提取率呈先上升后下降的趋势，在150:1的料液比时，葛根素、毛蕊异黄酮的提取率都达到最大值，芒柄花素提取率较优。因此，选择150:1为最佳料液比，确定水平范围为100:1-200:1。
提取温度对提取率的影响：准确称取养阴益气活血方药配方150mg，置于1.5mL离心管中，根据150:1的料液比加入含水量30％的NADES，密塞，摇匀，分别在40、50、60、70、80℃条件下，提取45min。提取后，将混合物用离心机在4500rpm下离心10min，取上清加入1:1甲醇水稀释后抽滤，用于HPLC分析，提取率如图5所示。
由图5可知，温度可以破坏分子间作用力、增加扩散系数、改变NADES的粘度，从而影响其提取效果。此外，随着温度的升高，方药中的黄酮苷类化合物可以与其他化合物发生水解，糖苷键断裂。结果表明，该低共熔溶剂60℃温度下，毛蕊异黄酮提取率最大，葛根素为较大提取率。芒柄花素在50-70℃条件下提取率相差不大，综合考虑选择60℃为提取温度，确定水平范围为50-70℃。
实验例3：方法学考察
专属性试验：分别精密吸取混合对照品溶液和养阴益气活血方药供试品适量，按照前述色谱条件进行测定，样品与混合标准品中葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰形均较好，分离度大于1.5，见图6与图7。表明该方法专属性良好。
线性关系的考察：精密吸取1号混合溶液适量，进行倍比稀释，得到2-7号混合溶液。即，得到葛根素浓度为0.5000、0.2500、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mg/mL，毛蕊异黄酮浓度为0.200、0.100、0.050、0.025、0.0125、0.006mg/mL，芒柄花素浓度为0.100、0.050、0.025、0.013、0.006、0.003mg/mL，根据“2.1”项中的色谱条件进行HPLC分析。以标准品溶液浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，得到葛根素标准曲线为：Y＝14376X+61394，R2＝0.9993，表明葛根素在15.60-500μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系；毛蕊异黄酮标曲为：Y＝655.64X+215.25，R2＝0.9994，表明毛蕊异黄酮在6.0-200μg/mL浓度范围内线性关系良好；芒柄花素标准曲线为：Y＝321.8X+87.167，R2＝0.9996，表明芒柄花素在3.0-100μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
精密度试验：精密吸取线性关系考察步骤中的3号混合对照品溶液，在前述色谱条件下重复进样6次，记录色谱图中各成分的峰面积，并计算得到葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的相对标准偏差分别为0.66、0.57、0.55％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：精密吸取供试品溶液1份，在前述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12h进行色谱分析，记录色谱图中各成分的峰面积，并计算得到三者的相对标准偏差分别为1.13、1.21、1.10％，表明该供试品溶液在12h内稳定性良好。
重复性试验：按照供试品溶液制备方法制备6份供试品，在前述色谱条件下，进行色谱分析，记录色谱图中各成分的峰面积，并计算得到三者的相对标准偏差分别为2.34、2.17、2.23％，表明该方法的重复性良好。
加样回收率试验：采用加样回收试验方法，精密称取同一批次供试品6份，分别精密加入葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，按照“2.3”项供试品制备方法制备供试品，按照前述色谱条件测定，计算3个成分的回收率分别为98.73、99.22、100.21％，RSD分别为2.02、2.72、1.82％。
响应面试验：根据单因素试验结果，选取含水量、料液比、提取温度、提取时间的三个水平，得到四因素三水平，见表2。以养阴益气活血方药中三种目标成分的总提取率为响应值，使用到Design-Expert8.0.6软件，根据BBD原理，得到四因素三水平组合设计试验，并按NADESs的筛选方法提取，结果见表3。
表2因素水平表
Figure GDA0004110261070000181
表3响应面设计及结果
Figure GDA0004110261070000182
Figure GDA0004110261070000191
以养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率为响应值，利用Design-Expert8.0.6软件对“表3”中数据进行分析，得到回归方程为：Y＝158.28+4.76X1+64.81X2-49.92X3+20.90X4+10.90X1X2+20.71X1X3+1.14X1X4-40.47X2X3+40.88X2X4-10.37X3X4-19.62X1 2-4.09X2 2-6.90X3 2-5.30X4 2。模型整体显著，液料比与提取时间两个因素对总提取率影响较大(P<0.01)。得到养阴益气活血方药中三种目标成分的最佳提取工艺为：含水量29％、料液比200：1、提取温度70℃、提取时间30min。此条件下养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率预测值为：369.54mg/g。
实验例4：验证试验
按照上述响应面优化方法得到的提取工艺条件，平行提取5次，测定葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率。工艺优化条件下的总提取率平均值为365.98mg/g，相对误差为1.26％，表明所得结果准确可靠，见表4。
表4验证结果
Figure GDA0004110261070000201
天然低共熔溶剂作为一种绿色的溶剂，目前已经广泛用于电化学、有机合成、生物催化等领域，在中草药成分提取过程中的应用有待挖掘，在工业中有很广阔的应用前景。将天然低共熔溶剂与养阴益气活血方药等中药的提取研究相结合，对中药资源的合理利用有一定促进作用，可以不断巩固和增强中国中医药文化的地位。
考察多种低共熔溶剂与传统溶剂用于养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素三种有效成分的提取，HPLC分析发现Bet-Lac(甜菜碱-乳酸)最适合作为养阴益气活血方药提取介质。其中，葛根素的提取率为166.33mg/g，毛蕊异黄酮的提取率为20.10mg/g，芒柄花素的提取率为9.67mg/g。采用单因素法考察低共熔溶剂的含水量、料液比、提取时间、提取温度、等参数，综合实际情况，最终得到的较佳提取条件为：含水量30％、料液比150:1mg/mL、提取温度60℃、提取时间45min。在上述单因素试验结果结果上，选取适当步长，设计四因素三水平表，进行响应面分析实验研究。
以养阴益气活血方药中三种有效成分的总提取率为响应值，四个条件为因素，采用Box-Benhnken Design设计优化提取条件，得到的最佳提取工艺为：含水量29％、料液比200：1mg/mL、提取温度70℃、提取时间30min，预测值为369.54mg/g。与传统有机溶剂对比后发现，NADES具有天然绿色、高效、廉价等优点。最佳工艺的预测值与理论值的偏差仅为0.96％，说明拟合性良好，可用于养阴益气活血方药中黄酮类成分的提取工艺。研究结果发现NADES作为一种新型的介质，在中草药提取领域有发展前景，可用于养阴益气活血方药中黄酮类成分的提取，同时，该方法有望成为一种高效、绿色、可持续的提取工艺，应用于其他中药活性成分的提取研究。

Claims (2)

1.一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）黄酮类成分原料的准备：精密称取养阴益气活血方药100mg于1.5mL离心管；该养阴益气活血方药是由生地黄、黄芪、葛根、川芎按质量比1: 1: 1.2: 0.67进行水煎醇提，旋转蒸发浓缩后加入赋形剂制成颗粒；
2）天然低共熔溶剂的配制：准确称取一定质量的氢键受体甜菜碱和氢键供体乳酸试剂，并按照摩尔比甜菜碱：乳酸=1:1进行混合，混合后于80-90℃的油浴加热条件下不断搅拌，直至形成澄清透明的液体，即为甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂，冷却至室温后待用；
3）将步骤1）称取的养阴益气活血方药按照150:1料液比mg/mL加入到步骤2）制备的甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂中混合提取3种黄酮类成分，3种黄酮类成分分别为葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素；
4）利用高效液相色谱法测定3种黄酮类成分并计算总提取率；
该提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法的工艺条件优化方法，具体包括以下步骤：
a）根据步骤1）-步骤4）所述的天然低共熔溶剂提取黄酮类成分的方法，筛选出5个影响黄酮类成分提取率的因素，分别为天然低共熔溶剂种类的筛选、天然低共熔溶剂配制时水分的添加量、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间、养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比、天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取温度；
b）以养阴益气活血方药中3种黄酮类成分的总提取率为评价指标，根据步骤a）筛选出的5个因素进行单因素多水平实验；具体为：天然低共熔溶剂筛选：精密称取养阴益气活血方药100 mg于1.5mL离心管，按150：1mg/mL料液比分别加入Pro-Ur、ChCl-Ur、Bet-Gly、Pro-Mu、ChCl-La与Bet-Lac，将混合物用离心机4500 pm下离心10min，取上清，HPLC对各提取物中三种有效分的提取率进行分析、计算并筛选出最佳提取溶剂，其中，Pro-Ur为脯氨酸与尿素按摩尔比1:1配制而成，ChCl-Ur为氯化胆碱与尿素按摩尔比1:2配制而成，Bet-Gly为甜菜碱与甘油按摩尔比1:2配制而成，Pro-Mu为脯氨酸与1-甲基脲按摩尔比1:1配制而成，ChCl-La为氯化胆碱与乙酰丙酸按摩尔比1:2配制而成，Bet-Lac为甜菜碱与乳酸按摩尔比1:1配制而成；
天然低共熔溶剂配制时水分的添加量的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂配制时水分添加量的单因素实验：固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL，提取温度50℃，提取时间30min，高效液相色谱条件不变，检测在将天然低共熔溶剂配成含水量分别为30%、40%、50%、60%、70%时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取时间的单因素实验，固定养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的料液比100：1mg/mL、含水量30%的Bet-Lac、提取温度50℃不变，检测在提取时间分别为15、30、45、60、75min时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的筛选：选取5个水平进行养阴益气活血方药与天然低共熔溶剂的提取料液比的单因素实验，固定含水量30%的Bet-Lac、提取温度50℃、提取时间45min不变，检测在提取料液比分别为50:1、100:1、150:1、200:1、250:1时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取温度的筛选：选取5个水平进行天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分时的提取温度的单因素实验，固定料液比150:1、含水量30%的Bet-Lac、提取时间45min不变，检测在提取温度分别为40、50、60、70、80℃时葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量；
c）根据步骤b）的单因素多水平实验结果，采用Box-Benhnken Design确定试验方案，利用高效液相色谱法测定养阴益气活血方药中3种黄酮类成分并计算总共提取率，结合响应面模型对采用天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中的3种黄铜类成分的提取工艺进行参数优化；具体步骤为：步骤c1：选取对养阴益气活血方药中3种黄酮类成分提取率影响较为显著的四个因素：含水量X1、料液比X2、提取时间X3、提取温度X4为自变量，以养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率为响应值，采用Box-Behnken Design组合设计法设计四因素三水平的响应面分析试验；
步骤c2：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对步骤c1得到的所述响应面分析试验的试验数据进行回归拟合分析，得到养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总含量Y的二次多项回归方程预测模型Y=158.28+4.76X 1 +64.81X 2 -49.92X 3 +20.90X 4 + 10.90X 1 X 2 +20.71X 1 X 3 +1.14X 1 X 4 -40.47X 2 X 3 +40.88X 2 X 4 -10.37X 3 X 4 -19.62X 1 2 -4.09X 2 2 - 6.90X 3 2 -5.30X 4 2 ；
步骤c3：应用响应面软件Design-Expert8.0.6对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并根据所得最佳提取工艺进行验证试验；该最佳提取工艺条件为：含水量29%、料液比200：1、提取温度70 ℃、提取时间30 min，养阴益气活血方药中葛根素、毛蕊异黄酮、芒柄花素的总提取率预测值为：369.54mg/g。
2.如权利要求1所述的一种天然低共熔溶剂提取养阴益气活血方药中黄酮类成分的方法，其特征在于步骤4）的具体步骤为：
步骤一：准确称取葛根素标准品1.15mg、毛蕊异黄酮标准品0.6mg、芒柄花素标准品0.31mg，分别加入1.15、1.5、1.55mL的1:1甲醇水溶解，配制成1、0.4、0.2mg/mL的标准品溶液，再将标准品溶液按比例加入离心管中得到1号混合溶液；
步骤二：精密吸取步骤一制得的1号混合溶液适量，进行倍比稀释，得到2-7号混合溶液，即，得到葛根素浓度为0.5000、0.2500、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mg/mL，毛蕊异黄酮浓度为 0.200、0.100、0.050、0.025、0.0125、0.006 mg/mL，芒柄花素浓度为0.100、0.050、0.025、0.013、0.006、0.003 mg/mL，进行高效液相色谱分析；
步骤三：以标准品溶液浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，得到葛根素标准曲线为：Y=14376X + 61394，R2=0.9993，表明葛根素在15.60-500μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系；毛蕊异黄酮标准曲线为：Y= 655.64X + 215.25，R2 = 0.9994，表明毛蕊异黄酮在6.0-200μg/mL浓度范围内线性关系良好；芒柄花素标准曲线为：
Y =321.8X + 87.167，R2=0.9996，表明芒柄花素在3.0-100μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
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