CN114307235B

CN114307235B - 一种高含量黄酮的蜂胶及其超临界萃取工艺

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Publication number: CN114307235B
Application number: CN202111504294.8A
Authority: CN
Inventors: 张勇; 弓敏; 金秀丽; 丁文富
Original assignee: Jiangsu Feng Ao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Feng Ao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114307235A

Abstract

本发明公开了一种高含量黄酮的蜂胶及其超临界萃取工艺。包括以下步骤：步骤1：蜂胶原胶除杂冷冻，得到蜂胶A；步骤2：将蜂胶A依次通过橙皮精油、三元低共熔溶剂出萃取，加入β‑葡萄糖苷酶溶液酶解，得到蜂胶B；步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，得到高含量黄酮的蜂胶。有益效果：(1)利用三元低共熔溶剂中析出的赖氨酸和后加入的赖氨酸，显著增加萃取后蜂胶中的黄酮含量。(2)利用三元低共熔溶剂对二氧化碳的吸收性，提高超临界萃取过程中的传质效率，并利用水的极性，提高弱极性和极性组分的萃取。(3)利用三元低共熔溶剂对β‑葡萄糖苷酶的活化作用，提高酶活性，从而促进更多糖苷键的水解有效提高黄酮类活性组分的含量。

Description

一种高含量黄酮的蜂胶及其超临界萃取工艺

技术领域

本发明涉及蜂胶深加工技术领域，具体为一种高含量黄酮的蜂胶及其超临界萃取工艺。

背景技术

蜂胶是一种由蜂蜜生产的包括55％树脂、30％蜂蜡、10％芳香挥发油、5％花粉成分的复杂性天然树脂。其中，由于蜂胶含有酚类、黄酮类化合物等生物活性组分使其具有抗氧化、抗菌、抗病毒等生物学功能，被广泛应用在食品、制药、化妆品等行业中。市面上的蜂胶分为四个等级：当黄酮含量小于11％时为低品质蜂胶；当黄酮含量在11％～14％之间时为合格蜂胶；当黄酮含量在14～17％时为上等蜂胶；当黄酮含量大于17％时为优质蜂胶。因此，制备越高含量黄酮的蜂胶是行业追求的目标。

近年来，关于提高蜂胶中黄酮等活性组分的研究越来越多，有效的萃取工艺对活性组分的最终收率至关重要。传统工艺中，通常使用乙醇、甲醇等有机溶剂进行萃取，但是该方式除去过程缓慢，活性组分损失多，最终产物中存在溶剂残留。而新兴的超临界CO₂萃取是一种比传统萃取方法更快萃取活性组分的技术，其低萃取温度、高选择性、快速传质性、高产率性等独特优点以及超临界流体特性而备受关注。但是，由于二氧化碳是非极性物质，对于弱极性和极性物质无法萃取得到，因此，一般需要通过极性溶剂作为携带剂，可以显著提高萃取效率、降低萃取时间，最常用的极性溶剂为乙醇、乙二醇、乙酸乙酯等，但是部分有机溶剂具有毒性，而乙醇对部分敏感人群的使用受到了限制。

另一方面，由于酚类、黄酮类活性组分一般通过疏水和氢键的相互作用于多糖相连，形成糖苷键，使得活性组分的溶出性低，利用度低；因此需要优化提高黄酮类活性组分的萃取率。现有工艺中通常使用碱性或酸性溶液进行萃取，但是存在溶剂残留的问题，影响蜂胶的质量和应用。

综上，解决上述问题，萃取制备一种高含量黄酮的蜂胶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高含量黄酮的蜂胶及其超临界萃取工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，包括以下步骤：

步骤1：蜂胶原胶预选分级除杂，冷冻破碎，过筛，得到蜂胶A；

步骤2：将蜂胶A加入至橙皮精油中，低温超声；依次加入三元低共熔溶剂、β-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，酶解，冷冻干燥，得到蜂胶B；

步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，以二氧化碳为流体，辅助以携带剂，超临界萃取得到高含量黄酮的蜂胶。

较为优化地，步骤2中，所述蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:(5～6)，低温温度为5～8℃，超声时间为1～2小时。

较为优化地，步骤2中，所述蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:(4～5)；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.5～2.8％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.5～5.8；酶解温度为42～48℃，酶解时间为60～90min。

较为优化地，步骤2中，所述三元低共熔溶剂的制备方法为：将甜菜碱和甘油在室温下，设置搅拌速度为150～400rmp，搅拌至透明；加入赖氨酸，设置温度为78～85℃，搅拌至透明，得到三元低共熔溶剂。

较为优化地，所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:(0.1～0.2)。

较为优化地，步骤3中，二氧化碳的流速为5～7g/min，携带剂的流速为0.1～0.5mL/min，萃取压力为250～450bar，萃取温度为40～50℃，萃取时间为3～5小时。

较为优化地，步骤3中，所述携带剂的浓度为0.5％～1％的赖氨酸溶液。

较为优化地，所述赖氨酸溶液是浓度为3～5wt％的赖氨酸水溶液。

本技术方案中，利用冷冻处理，破坏原料的细胞壁，促进黄酮类化合物的释放；利用橙皮精油、三元低共熔溶剂进行预先蜂胶萃取；再通过三元低共熔溶剂与β-葡萄糖苷酶之间的协同作用，促进黄酮糖苷的酶解，提高黄酮类活性组分的溶解，并利用赖氨酸与黄酮之间的作用，利用水的溶性，提高二氧化碳的溶解，从而在提高萃取效率。以此，在不使用乙醇的情况下，达到相似的提取效率。

(1)关于橙皮精油：乙醇无疑是蜂胶提取的最佳溶剂，但是，部分人群对乙醇的过敏性，使其在食品、化妆品配方中的产生局限性；因此需要新的可替代的溶剂进行萃取。而植物油的使用就是其中一种手段。相较于如大豆油、菜籽油等大部分植物油，橙皮精油一方面的粘度较低，溶解度好，与二氧化碳的混溶性较好，当然为了增强萃取效率，增加与二氧化碳的混溶性，进一步加入了低共熔溶剂，辅助橙皮精油进行初萃取；另一方面，橙皮精油中含有90～95％的d-柠檬烯，而柠檬烯是一种天然的绿色溶剂，这也使得其在萃取效率优于其他植物油。同时，在后续的超临界工艺中，在250～450bar和40～50℃工艺条件下，由于存在橙皮精油，使得溶剂密度增加，而携带剂导致溶质膨胀，从而协同促进了黄酮的含量。

(2)关于三元低共熔溶剂：低共熔溶剂已被用于萃取活性组分，但是由于其相较于一般溶剂的粘性较大，会降低流动相，且蜂胶中含有蜂蜡使得超临界二氧化碳萃取过程中结块。因此方案会预先加入橙皮精油，其可以部分溶解，帮助增加流动性，而后期加入的携带剂是水溶液，由于水具有较强的氢键能力，可以破坏三元低共熔溶剂的氢键能力，降低粘度，促进超临界萃取过程。

方案中，三元低共熔溶剂使用的是摩尔比为1:2:(0.1～0.2)的甜菜碱、甘油、赖氨酸的混合物。其中由于甘油的加入粘度增加，方案中竟可能少加入了甘油，同时随着加入的赖氨酸加入量增加，使得大量氢键的形成，使得粘度增加。后续水的加入会破坏该氢键能力，使得赖氨酸溶于水。其中由于三元低共熔溶剂对二氧化碳的高效吸收性，显著增加了蜂胶B与二氧化碳的传质性，增强了萃取效率。

此外，三元低共熔溶剂与β-葡萄糖苷酶具有良好的相容性，低共熔溶剂可以作为β-葡萄糖苷酶的生物催化剂，显著提高酶活性，促进酶对糖苷键的水解，从而有效提高黄酮类活性组分的含量；同时其可以保护冷冻后β-葡萄糖苷酶部分活性，利于后续超临界二氧化碳萃取过程中二次酶解，直至酶活性消失。

(3)关于携带剂为3～5wt％的赖氨酸水溶液，首先水的介电常数高于乙醇，具有更高的极性，其可以增加物质的密度，使得溶质膨胀，改善扩散过程，而破坏三元低共熔溶剂产生的精氨酸，以及携带剂中的精氨酸作为一种赋形剂，会与弱酸性的黄酮类活性组分，如5,7-二羟基-3,4二甲黄酮等形成盐，从而促进其溶于水，增强黄酮类活性组分的溶解，增加黄酮类物质的含量，增强萃取效率。

此外，由于低共熔溶剂和橙皮精油的存在，使得活性组分的稳定性和活性增加。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：(1)联合使用橙皮精油和三元低共熔溶剂进行初萃取，两者协同辅助后续超临界二氧化碳萃取工艺进行，提高萃取效率，提高黄酮的含量。(2)三元低共熔溶剂在后续超临界萃取过程中夹带剂的作用下，析出赖氨酸，以及夹带剂中的赖氨酸，显著增加萃取后蜂胶中的黄酮含量。(3)利用三元低共熔溶剂对二氧化碳的吸收性，提高超临界萃取过程中的传质效率，并利用水的极性，提高弱极性和极性组分的萃取。(4)利用三元低共熔溶剂对β-葡萄糖苷酶的活化作用，提高酶活性，从而促进更多糖苷键的水解有效提高黄酮类活性组分的含量。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，包括以下步骤：

步骤1：蜂胶原胶预选分级除杂，-20℃下冷冻破碎，过筛，得到15目蜂胶A；

步骤2：(1)将甜菜碱和甘油在室温下，设置搅拌速度为320rmp，搅拌至透明；加入赖氨酸，设置温度为80℃，搅拌至透明，得到三元低共熔溶剂，备用；(2)将蜂胶A加入至橙皮精油中，设置温度为5℃，低温超声2小时；依次加入三元低共熔溶剂、β-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，设置温度为45℃酶解90min，在-35℃下冷冻干燥，得到蜂胶B；

步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，以二氧化碳为流体设置流速为6g/min；辅助以1％的赖氨酸溶液作为携带剂，流速为0.4mL/min；设置萃取压力为350bar，萃取温度为40℃，超临界二氧化碳萃取5小时，得到高含量黄酮的蜂胶。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:6；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:4；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.6％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.8；所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:0.15。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为4wt％的赖氨酸水溶液。

实施例2：

一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，包括以下步骤：

步骤1：蜂胶原胶预选分级除杂，-25℃下冷冻破碎，过筛，得到10目蜂胶A；

步骤2：(1)将甜菜碱和甘油在室温下，设置搅拌速度为400rmp，搅拌至透明；加入赖氨酸，设置温度为85℃，搅拌至透明，得到三元低共熔溶剂，备用；(2)将蜂胶A加入至橙皮精油中，设置温度为8℃，低温超声1小时；依次加入三元低共熔溶剂、β-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，设置温度为42℃酶解60min，在-35℃下冷冻干燥，得到蜂胶B；

步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，以二氧化碳为流体设置流速为5g/min；辅助以0.5％的赖氨酸溶液作为携带剂，流速为0.1mL/min；设置萃取压力为250bar，萃取温度为45℃，超临界二氧化碳萃取3小时，得到高含量黄酮的蜂胶。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:5；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:5；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.5％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.5；所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:0.1。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为5wt％的赖氨酸水溶液。

实施例3：

一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，包括以下步骤：

步骤1：蜂胶原胶预选分级除杂，-18℃下冷冻破碎，过筛，得到20目蜂胶A；

步骤2：(1)将甜菜碱和甘油在室温下，设置搅拌速度为150rmp，搅拌至透明；加入赖氨酸，设置温度为78℃，搅拌至透明，得到三元低共熔溶剂，备用；(2)将蜂胶A加入至橙皮精油中，设置温度为5℃，低温超声2小时；依次加入三元低共熔溶剂、β-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，设置温度为48℃酶解80min，在-35℃下冷冻干燥，得到蜂胶B；

步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，以二氧化碳为流体设置流速为7g/min；辅助以0.8％的赖氨酸溶液作为携带剂，流速为0.4mL/min；设置萃取压力为450bar，萃取温度为50℃，超临界二氧化碳萃取4小时，得到高含量黄酮的蜂胶。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:6；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:4；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.8％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.8；所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:0.15。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为3wt％的赖氨酸水溶液。

对比例1：按照专利CN201510129680中的萃取方式，萃取制备蜂胶。

对比例2：将降低橙皮油的加入量：蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:2；提高三元低共熔溶剂的溶剂量：蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:8。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:8；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:8；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.6％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.8；所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:0.15。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为4wt％的赖氨酸水溶液。

对比例3：将三元低共熔溶剂中，甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为更换为1:4:0.15。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:6；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:4；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.6％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.8；甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为更换为1:4:0.15。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为4wt％的赖氨酸水溶液。

对比例4：将三元低共熔溶剂中，甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为更换为1:2:0.5。

本方案中，步骤2中，蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:6；蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:4；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.6％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.8；所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为更换为1:2:0.5。步骤3中，所述赖氨酸溶液的浓度为4wt％的赖氨酸水溶液。

对比例5：将方案中的橙皮油更换为大豆油，其余与实施例1相同。

实验1：将实施例和对比例中制备的一种高含量黄酮的蜂胶进行总黄酮含量的测定。以芦丁作为对照品，使用紫外分光光度计在波长为200～800nm下，测定最大吸收波长，得到最大吸收波长在525～530nm内，因此，选择528nm作为黄酮含量的测定的波长。所得结果如下表所示，其中分级萃取中，以最高含量黄酮的蜂胶计。

实施例1

实施例2

实施例3

对比例1

对比例2

对比例3

对比例4

对比例5

黄酮含量

22.89％

22.75％

22.69％

18.53％

20.36％

21.86％

22.09％

21.35％

结论：由实施例1～3与对比例1对比可知，本申请中的萃取工艺优于普通的超临界二氧化碳萃取工艺。当然橙皮精油中同样含有部分黄酮组分，但其含量较低，大约占蜂胶黄酮含量的3％左右。所制备的无乙醇的蜂胶，其黄酮含量与对比例1相当且略高，属于优质蜂胶。

将对比例2～5与实施例1对比，可以发现：对比例2中橙皮精油和三元低共熔溶剂的调换，使得黄酮含量略有降低，原因是：一方面橙皮精油自带的黄酮含量降低，另一方面三元低共熔溶剂的粘度较大，使得在后续超临界工艺中结块性增加，增加了工艺难度。对比例3～4中，同样是由于甘油、赖氨酸含量的增加，使得三元低共熔溶剂粘度增加，使得黄酮萃取效率降低。对比例5中由于更换为大豆油使得萃取率下降，原因在于：橙皮精油一方面的粘度较低，溶解度好，与二氧化碳的混溶性较好；另一方面，橙皮精油中含有90～95％的d-柠檬烯，而柠檬烯是一种天然的绿色溶剂，这也使得其在萃取效率优于其他植物油。

实验2：将实施例1和实施例2制备的一种高含量黄酮的蜂胶，将其置于乙醇溶液中形成含有黄酮醇溶液，与含有DPPH的乙醇溶液混合，测定吸光度，计算DPPH的清除率。

结论：实施例1中的清除率为86.5％，对比例1中的清除率为84.1％，本申请中活性更高。原因在于：低共熔溶剂和橙皮精油增加了活性组分的稳定性和活性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：包括以下步骤：

步骤3：将蜂胶B进行超临界萃取，以二氧化碳为流体，辅助以携带剂，超临界萃取得到高含量黄酮的蜂胶；

所述三元低共熔溶剂的制备方法为：将甜菜碱和甘油在室温下，设置搅拌速度为150～400rmp，搅拌至透明；加入赖氨酸，设置温度为78～85℃，搅拌至透明，得到三元低共熔溶剂；

所述携带剂的浓度为0.5％～1％的赖氨酸溶液。

2.根据权利要求1所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：步骤2中，所述蜂胶A与橙皮精油的液固比为1:(5～6)，低温温度为5～8℃，超声时间为1～2小时。

3.根据权利要求1所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：步骤2中，所述蜂胶A与三元低共熔溶剂的液固比为1:(4～5)；β-葡萄糖苷酶溶液为浓度为2.5～2.8％的β-葡萄糖苷酶-磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝5.5～5.8；酶解温度为42～48℃，酶解时间为60～90min。

4.根据权利要求1所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：所述甜菜碱、甘油、赖氨酸的摩尔比为1:2:(0.1～0.2)。

5.根据权利要求1所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：步骤3中，二氧化碳的流速为5～7g/min，携带剂的流速为0.1～0.5mL/min，萃取压力为250～450bar，萃取温度为40～50℃，萃取时间为3～5小时。

6.根据权利要求1所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺，其特征在于：所述赖氨酸溶液是浓度为3～5wt％的赖氨酸水溶液。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种高含量黄酮的蜂胶的超临界萃取工艺制备得到的高含量黄酮的蜂胶。