CN105348364B

CN105348364B - 一种从女贞子中提取齐墩果酸的方法

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Publication number: CN105348364B
Application number: CN201510745839.2A
Authority: CN
Inventors: 黄新苹; 王武朝
Original assignee: Zhengzhou Normal University
Current assignee: Zhengzhou Normal University
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: CN105348364A

Abstract

本发明涉及从女贞子中提取齐墩果酸的方法，可有效解决现有提取方法提取效率低、污染环境、提取物纯度低的问题，方法是，将女贞子用超微粒粉碎成粒度10‑5μm的细粉，加入乙醇，超声提取，离心除去沉淀，得上清液，上清液用NaOH调节至pH=11‑13，搅拌10‑14小时，过滤，滤液用HCl调节pH=2.5‑3.5，搅拌10‑14小时，浓缩至50℃相对密度1.1‑1.2，将浓缩液通过D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度90%的乙醇，洗脱液用量为柱体积的6‑8倍，收集洗脱液，浓缩成浸膏，将浸膏用Sephadex LH‑20凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。本发明操作简单，提取率高，纯度高，不破坏活性组分、无溶剂残留、后处理工艺简单，经济实用。

Description

一种从女贞子中提取齐墩果酸的方法

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种从女贞子中提取齐墩果酸的方法。

背景技术

女贞子为木犀科常绿乔木女贞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果实，味甘苦、性凉，归肝、肾经，具有补益肝肾、滋阴清热、凉血明目等功效。作为中药应用已有2000多年的历史，始载于《神农本草经》，是中医常用扶正固本药物。《中国药典》2005版记载其功能与主治“滋补肝肾，明目乌发。用于眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目睛不明。”现代药理研究证实，女贞子具有治疗急性黄疽型肝炎和慢性病毒性肝炎、提高机体免疫力、抗衰老、降血糖、升高白细胞作用和抗炎抑菌等作用。本研究主要女贞子主要化学成分进行提取，分离和纯化，并对相应的提取工艺进行研究，为中药女贞子的进一步研究开发提供可靠的数据支持。女贞子中三萜类化合物的量为5.61%，其中齐墩果酸的量较高，后又发现了熊果酸以及二者的衍生物。

齐墩果酸 (oleanolic acid，简称OA，分子式 C₃₀H₄₈O₃，分子量：456.71) 别名士当归酸，是女贞子的主要有效成分，是从我国首次从植物中发掘出来的、临床治疗急性黄疸性肝炎和慢性病毒性肝炎比较理想的药物。现代临床药理研究发现OA不仅具有护肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生物活性，还具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖、抗氧化和利尿作用。

由于OA结构复杂，难以用化学合成方法获得，目前主要从天然植物中提取得到。提取工艺主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法、超声波提取法和大孔树脂吸附法。溶剂提取法是从女贞子中提取齐墩果酸的传统方法，所用溶剂通常为乙醇，以不同质量浓度的乙醇为溶剂，通过单因素试验和正交试验，研究齐墩果酸的最佳提取工艺，一般采用70%的乙醇，液固比15︰1来提取，该法需要溶剂量大，提取效率不高。超临界流体萃取法常以超临界CO₂为萃取剂，但对环境有污染，不易推广应用；而超声波提取法利用超声波所产生的空话效应、热效应和机械效应，以加速提取速率，缩短提取时间，减少溶剂用量，但提取率低，纯度低。

大孔树脂法是利用大孔树脂是一类新型的高聚物吸附剂，其特点是吸附容量大，利用大孔树脂可选择性地吸附液体混合物中的有效成分，从而达到提纯和精制的目的，同样存在效率低，产品纯度低，因此，从女贞子中提取齐墩果酸上的改进和创新势在必行。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种从女贞子中提取齐墩果酸的方法，可有效解决现有提取方法提取效率低、污染环境、提取物纯度低的问题。

本发明解决的技术方案是，将女贞子用超微粒粉碎成粒度10-5μm的细粉，按照液固比为6-10︰1的比例加入体积浓度70%的乙醇，35-45℃下超声提取65-75小时，6000-10000r/min离心10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度2%的NaOH调节至pH=11-13，搅拌10-14小时，过滤，滤液用质量浓度4%的HCl调节pH=2.5-3.5，搅拌10-14小时，浓缩至50℃相对密度1.1-1.2，将浓缩液通过D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度90%的乙醇，洗脱液用量为柱体积的6-8倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为1.3-1.5的浸膏，将浸膏用Sephadex LH-20凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

本发明操作简单，提取率高，不破坏活性组分、无溶剂残留、后处理工艺简单，经济实用，提取物纯度高等优点，经济和社会效益显著。

附图说明

图1为本发明齐墩果酸的标准曲线图。

图2为本发明齐墩果酸的紫外光谱图。

图3为本发明齐墩果酸标准红外光谱图。

图4为本发明齐墩果酸标准品的高效液相色谱图。

图5为本发明齐墩果酸样品的高效液相色谱图。

图6为本发明齐墩果酸的H谱图。

图7为本发明齐墩果酸的碳谱。

图8为本发明齐墩果酸标准品的HPLC图。

图9为本发明齐墩果酸样品品的HPLC图。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。

实施例1

本发明在具体实施中，其方法是，将女贞子用超微粒粉碎成粒度10μm的细粉，按照液固比为8︰1的比例加入体积浓度70%的乙醇，40℃下超声提取72小时，6000-10000r/min离心10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度2%的NaOH调节至pH=12，搅拌12小时，过滤，滤液用质量浓度4%的HCl调节pH=3，搅拌12小时，浓缩至50℃相对密度1.1-1.2，将浓缩液通过D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度90%的乙醇，洗脱液用量为柱体积的6-8倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为1.3-1.5的浸膏，将浸膏用SephadexLH-20凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

实施例2

本发明在具体实施中，其方法是，将女贞子用超微粒粉碎成粒度5μm的细粉，按照液固比为6︰1的比例加入体积浓度70%的乙醇，35℃下超声提取75小时，6000-10000r/min离心10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度2%的NaOH调节至pH=11，搅拌10小时，过滤，滤液用质量浓度4%的HCl调节pH=2.5，搅拌10小时，浓缩至50℃相对密度1.1-1.2，将浓缩液通过D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度90%的乙醇，洗脱液用量为柱体积的6-8倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为1.3-1.5的浸膏，将浸膏用SephadexLH-20凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

实施例3

本发明在具体实施中，其方法是，将女贞子用超微粒粉碎成粒度8μm的细粉，按照液固比为10︰1的比例加入体积浓度70%的乙醇，45℃下超声提取65小时，6000-10000r/min离心10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度2%的NaOH调节至pH=13，搅拌14小时，过滤，滤液用质量浓度4%的HCl调节pH=3.5，搅拌14小时，浓缩至50℃相对密度1.1-1.2，将浓缩液通过D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度90%的乙醇，洗脱液用量为柱体积的6-8倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为1.3-1.5的浸膏，将浸膏用Sephadex LH-20凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

本发明与现有技术相比，有以出突出的实质性特点和显著的进步：

本发明的主要目的是通过对现有提取方法的进行分析研究，进一步优化女贞子中齐墩果酸的提取生产工艺。

经采用超微粒粉碎技术对女贞子进行处理，使其粒度更加细微均匀，空隙率增大，提高了药物的溶出速度和生物利用度；传统的粉碎生药材粒径为2000-75μm，即200目以下粉末，本发明细化至粒度10-5μm，使原药材细胞的破壁率≥95%，中药的有效成分的溶出速度和溶出率提高，从而提高生物利用度大大提高。采用半仿生提取技术模仿口服药物在胃肠道的运转过程，采取选定碱性水或酸性水调pH值，调上清液pH值11-13，调滤液pH值为2.5-3.5，在40℃左右的反应釜中，多次反复提取女贞子提取液，得到含指标成分高的“活性混合物”，能显著提高OA的提取率，并能减少乙醇的消耗，经济简便；大孔树脂是一类新型的高聚物吸附剂，其特点是吸附容量大，再生简单，效果可靠，省时省力，不污染环境。利用大孔树脂可选择性地吸附液体混合物中的有效成分，从而达到提纯和精制的目的。用大孔树脂吸附纯化处理女贞子预处理得到的浸膏，结果表明，齐墩果酸的含量可提高5倍左右，纯度98%以上。超声提取可充分利用超声波所产生的空话效应、热效应和机械效应，以加速提取速率，缩短提取时间，减少溶剂用量。经实验和实践总结，用无水乙醇为溶剂、液固比为6-10：1、超声时间25-35分钟时，提取率高，并经检测表明产品质量好，纯度高，有关实验资料如下：

实验一化学显色法

薄层层析法(中国药典1977年版一部附录38页)试验，取本品用氯仿制成每lml中含lmg的溶液，点于硅胶G薄层板上，以氯仿:丙酮(10:1)为展开剂。展开后，取出挥散溶剂，喷以5％磷钼酸乙醇液显色，置120℃加热数分钟，除主斑点外，无其他斑点显示，表明质量好，纯度高。

实验二紫外分光光度法

（1）齐墩果酸的标准溶液的配制和标准曲线测定

取不同浓度的齐墩果酸标准品，用紫外分光光度法测定，在紫外-可见区扫描，结果表明在203 nm处有最大吸收。因此，选203nm作为测定波长。精密称取齐墩果酸标准品10mg，以无水乙醇溶解，定容至10mL，得浓度为1.0 mg /mL的标准溶液，并配制0.004，0.008，0.010，0.015，0.020，0.030，0.040mg /mL等系列浓度标准溶液。

在203nm处，测定标准溶液系列，在所测浓度范围0.004-0.03mg /mL内有良好的线性关系（如图1）。

对齐墩果酸进行紫外检测，得图2齐墩果酸的紫外光谱图，结果表明齐墩果酸在203 nm处有最大吸收。

（2）齐墩果酸含量的测定

将女贞子提取浸膏用无水乙醇溶解，并定容至25mL，稀释一定倍数后，进行紫外光谱分析。与标准曲线对比，测定含量。

实验三红外光谱法

通过红外光谱法（仪器为尼高力 Nicolet iS10 傅立叶变换红外光谱仪），对比标准图谱，对齐墩果酸进行产物结构的表征。如图3为齐墩果酸标准红外光谱图：

对比产品的红外光谱图和标准谱图（图3）可知，两者具有基本相同的吸收峰。羧基在红外谱图中显示OH及C=O特征吸收峰，OH在3200~3500cm^-1间有一个相当宽的峰， ν_C-H在2927cm^-1左右有中等强度峰，C=O在1716 cm^-1有一中强峰，通过对比确定该产品为齐墩果酸。

实验四高效液相色谱（HPLC）

色谱条件：

色谱柱：Kromasil KR100-5C₁₈ 柱[250nm×4.6mm×5μm]；

流动相：乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（70：30）；

流速：0.5 mL/min；

检测波长：210 nm；

柱温：室温；

进样量：10 μL。

分别得到齐墩果酸标准品的HPLC图（图4）和齐墩果酸样品品的HPLC图（图5）

实验五核磁数据测定

¹H NMR、¹³C NMR用Bruker AVANCE DPX- 400 超导核磁共振仪（四甲基硅TMS 作为内标）测定(瑞士Bruker 公司)。

得到齐墩果酸的H谱图（图6）和齐墩果酸的碳谱（图7）。

对齐墩果酸进行HPLC检测，得到齐墩果酸标准品的HPLC图（图8）和齐墩果酸样品品的HPLC图（图9）。

本发明通过实地试验应用，结果表明：本发明方法易操作，稳定可靠，生产效率和提取率比现有方法平均提高5倍以上，产品符合质量要求的标准。制备过程中所用的有机溶剂均可在反应后处理中予以回收，产品纯度98%以上，对环境不会造成污染。而且提取后的残渣还可用作饲料或肥料，实现废物利用，节约资源，节能环保，有巨大的经济和社会效益。

Claims

1.一种从女贞子中提取齐墩果酸的方法，其特征在于，将女贞子用超微粒粉碎机粉碎成粒度10-5μm 的细粉，按照液固比为 6-10：1 的比例加入体积浓度 70% 的乙醇，35-45℃下超声提取 65-75 小时，6000-10000r/min 离心 10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度 2% 的 NaOH 调节至 pH=11-13，搅拌 10-14 小时，过滤，滤液用质量浓度 4%的 HCl 调节pH=2.5-3.5，搅拌 10-14 小时，浓缩至 50℃相对密度 1.1-1.2，将浓缩液通过 D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度 90% 的乙醇，洗脱液用量为柱体积的 6-8倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为 1.3-1.5 的浸膏，将浸膏用 SephadexLH-20 凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

2.根据权利要求 1 所述的从女贞子中提取齐墩果酸的方法，其特征在于，将女贞子用超微粒粉碎机粉碎成粒度10μm 的细粉，按照液固比为 8：1 的比例加入体积浓度 70% 的乙醇，40℃下超声提取 72 小时，6000-10000r/min 离心 10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度 2% 的 NaOH 调节至 pH=12，搅拌 12 小时，过滤，滤液用质量浓度 4%的 HCl 调节 pH=3，搅拌 12 小时，浓缩至 50℃相对密度 1.1-1.2，将浓缩液通过 D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度 90% 的乙醇，洗脱液用量为柱体积的 6-8 倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为 1.3-1.5 的浸膏，将浸膏用 Sephadex LH-20 凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

3.根据权利要求 1 所述的从女贞子中提取齐墩果酸的方法，其特征在于，将女贞子用超微粒粉碎机粉碎成粒度5μm 的细粉，按照液固比为 6：1 的比例加入体积浓度 70% 的乙醇，35℃下超声提取 75 小时，6000-10000r/min 离心 10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度 2% 的 NaOH 调节至 pH=11，搅拌 10 小时，过滤，滤液用质量浓度 4% 的HCl 调节 pH=2.5，搅拌 10 小时，浓缩至 50℃相对密度 1.1-1.2，将浓缩液通过 D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度 90% 的乙醇，洗脱液用量为柱体积的 6-8 倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为 1.3-1.5 的浸膏，将浸膏用 Sephadex LH-20 凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。

4.根据权利要求 1 所述的从女贞子中提取齐墩果酸的方法，其特征在于，将女贞子用超微粒粉碎机粉碎成粒度8μm 的细粉，按照液固比为 10：1 的比例加入体积浓度 70% 的乙醇，45℃下超声提取 65 小时，6000-10000r/min 离心 10-15min，除去沉淀，得上清液，上清液用质量浓度 2% 的 NaOH 调节至 pH=13，搅拌 14 小时，过滤，滤液用质量浓度 4%的 HCl 调节pH=3.5，搅拌 14 小时，浓缩至 50℃相对密度 1.1-1.2，将浓缩液通过 D₁₀₁大孔树脂柱洗脱纯化，洗脱液为体积浓度 90% 的乙醇，洗脱液用量为柱体积的 6-8 倍，收集洗脱液，90-110℃浓缩干燥至相对密度为 1.3-1.5 的浸膏，将浸膏用 Sephadex LH-20 凝胶进一步纯化，即得齐墩果酸。