CN106226415B

CN106226415B - 一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法

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Publication number: CN106226415B
Application number: CN201610542872.XA
Authority: CN
Inventors: 王岱杰; 赵恒强; 王晓; 耿岩玲; 于金倩; 刘峰; 王涛
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2036-07-11
Also published as: CN106226415A

Abstract

本发明公开了一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，首次基于DSPE‑HPLC法同时检测金银花中六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，使用该方法线性相关系数均大于0.999，检出限为0.026‑0.057μg/mL，各目标成分回收率在90.5‑102.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.85‑1.74％范围内，具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、目标物回收率高、灵敏度高易操作等特点。本发明发展了一套适合对金银花等药材中环烯醚萜苷类成分的快速、高效的提取、净化和分析方法，为对进一步研究其作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。

Description

一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法。

背景技术

金银花，别名双花、二花、土银花、忍冬花等，是忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或初开的花，广泛分布在我国各省，应用历史悠久，是我国常用的大宗中药材之一，首次记载于梁代陶弘景的《名医别录》，味甘、性寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热的功能，主要用于治疗痈肿疔、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症。

影响金银花质量的因素有很多，主要有产地、种植环境、采收期、加工干燥、施肥等，而对于金银花成品质量的评价，传统认为绿原酸和黄酮类成分是金银花的有效成分，对于金银花的质量评价研究则多围绕这两种成分进行，2015版《中国药典》金银花药材的质量评价和含量测定除水分、灰分、酸不溶性灰分和重金属及有害元素含量之外，就是围绕绿原酸和木犀草苷进行。对于金银花质量评价的研究报道，也多参照药典进行，评价标准成分较单一。但是绿原酸和木犀草苷并不能代表金银花中的所有成分。同时，该两种成分并非金银花所特有。近年来研究发现，作为金银花的主要成分之一的环烯醚萜苷类具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等多种活性，因此开展金银花药材中环烯醚萜苷类成分的高效提取和分析方法研究，对进一步研究其作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。

由于金银花中所含化学成分种类较多、极性差异大，包含黄酮、有机酸、环烯醚萜苷、皂苷等多种化学成分；同时，金银花提取物中还存在色素、糖等干扰成分，基质复杂。而环烯醚萜苷类化合物在金银花中属于量相对较低且极性较强的一类成分，采用单一的回流或超声提取技术易造成提取物组成复杂，分离难度大。因此，结合环烯醚萜苷类成分的结构特点，发展适合金银花药材中环烯醚萜苷类成分的快速、高效的提取、净化和分析方法亟待解决。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的方法，该方法操作简便、样品净化效果好，分析结果准确且重复性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，测定的六种环烯醚萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，具体步骤如下：

(1)将金银花粉碎，过筛，称取一定量金银花粉待用；

(2)向步骤(1)中的金银花粉中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液；

(3)向步骤(2)中的上清液中加入净化剂，涡流振荡；

(4)经步骤(3)处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液；

(5)分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品，加甲醇溶解，制成混合标准溶液；使用时，按一定比例逐级稀释，待用。

(6)将步骤(4)得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流速：0.5-1.0mL/min；检测波长：200-250nm；柱温：25-30℃；流动相：0.4％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱；

(7)以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得金银花中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。

优选的，所述步骤(1)中过筛目数为20-40目，进一步优选的，所述过筛目数为40目；

优选的，所述步骤(2)中提取溶剂为50％乙醇；所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比1g:100-150ml，进一步优选的，所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比为1g:100ml；

优选的，所述步骤(2)中超声提取时间为15-25min，进一步优选的，超声提取时间为15min；

优选的，所述步骤(3)中加入的净化剂为硅藻土；所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g:1ml；进一步优选的，所述净化剂与上清液的质量体积比为50g:1ml；

优选的，所述步骤(3)中涡流振荡时间为0.5-2min；进一步优选的，所述涡流振荡时间为1min；

优选的，所述步骤(4)中微孔滤膜规格为0.22mm；

优选的，所述步骤(6)中流速为0.8mL/min；检测波长为240nm；柱温：25℃；

优选的，所述步骤(6)中梯度洗脱程序如下：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈。

本发明还公开了上述方法在对金银花进行质量评价中的应用。

本发明首次建立了分散固相萃取-高效液相色谱(DSPE-HPLC)法同时检测金银花中六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，使用该方法线性相关系数均大于0.999，检出限为0.026-0.057μg/mL，各目标成分回收率在90.5-102.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.85-1.74％范围内，具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、目标物回收率高、灵敏度高易操作等特点。

本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对样品前处理方法和仪器检测条件进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：

(1)本发明将六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛经过分散固相处理的前处理方式，同时使用高效液相色谱仪进行测定，大大节约了仪器设备与成本，可以满足不同条件实验室的工作需求。

(2)本发明样品前处理流程简单，大大缩短了每个测试样品的检测时间，降低了分析成本，有效避免死吸附现象发生，本发明采用分散固相萃取(DSPE)作为前处理技术，减少了有机溶剂的使用量，缩短了前处理时间，使实验操作更加简便、快捷。

(3)本发明具有检测灵敏度高、准确及重现性好等优点。

附图说明

图1为混合对照品(A)、金银花提取物(B)的HPLC图；

其中，1为马钱酸色谱峰，2为莫诺苷色谱峰，3为马钱苷色谱峰，4为当药苷色谱峰，5为断氧化马钱子苷色谱峰，6为开联番木鳖苷二甲基乙缩醛色谱峰。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法：

1仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KQ2400KDE型高功率数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；R201型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；BSA1245-CW型精密天平，德国Sartorius公司；Milli-Q(18.2MΩ)超纯水处理系统，美国Millipore公司。

甲醇(色谱纯)购于美国Tedia公司；乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购于德国Riedel公司；其余试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2MΩ)。硅藻土(分析纯)购置于天津大茂化学试剂厂；聚酰胺(30～60目，柱色谱)均购置于国药集团化学试剂有限公司。

本实验所采用的金银花Lonicera japonica Thunb.药材购于山东省济南市漱玉平民大药房，并经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定。6种环烯醚萜苷化合物对照品(马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛)均由实验室分离制备，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。

2.样品提取液制备

金银花药材粉碎，过40目筛，准确称取0.3g置于具塞三角瓶中，加30mL50％乙醇，超声提取15min，取2mL上清液，加硅藻土100mg，涡流振荡1min，0.22μm微孔滤膜过滤得样品提取液。

3.对照品溶液的制备

分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品2.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加50％甲醇溶解，定容，摇匀，制成浓度为200μg/mL混合标准溶液。使用时，按比例逐级稀释，待用。

4.高效液相色谱条件

HPLC分析，进样体积3μL。具体色谱条件为：Kromasil C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.3％甲酸水和乙腈，梯度洗脱程序：0～15min，10％～14％乙腈；15～35min，14％～25％乙腈；35～45min，25％～50％乙腈；45～50min，50％～100％乙腈；50～65min，100％乙腈。检测波长240nm，流速0.8mL/min，进样量3μL，柱温25℃。

5.测定结果计算

以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。实验结果如表1所示。

表1样品中环烯醚萜苷的测定结果

6.方法学考察

在本研究优化的测定条件下，以金银花提取物中各环烯醚萜苷类成分的保留时间和峰面积为考察指标，对该方法的精密度、重复性、稳定性和加标回收率分别进行了考察。精密度试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于0.95％，峰面积的RSD值均低于1.51％，结果表明仪器精密度良好。6次重复性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值均低于1.23％，峰面积的RSD值均低于4.21％，结果表明方法的重复性良好。24h内稳定性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值在0.08％～0.65％，峰面积的RSD值在0.85％～1.74％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。精密称取已知各目标化合物量的金银花样品0.30g，分别准确加入对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理6份，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率，结果表明，各目标成分加标回收率在90.5％～102.1％，RSD值在0.67％～2.27％。以上数据说明，该方法具有较好的精密度、稳定性和重现性，可以用于金银花中环烯醚萜苷类成分的准确测定。

实施例2

检测方法同实施例1，选择另一金银花样品2，实验结果见表2。

表2样品中环烯醚萜苷的测定结果

实施例3

检测方法同实施例1，选择另一金银花样品3，实验结果见表3。

表3样品中环烯醚萜苷的测定结果

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，测定的六种环烯醚萜苷类成分分别是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，测定步骤如下：

（1）将金银花粉碎，过筛，称取一定量金银花粉待用；

（2）向步骤（1）中的金银花粉中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液；

（3）向步骤（2）中的上清液中加入净化剂，涡流振荡；

（4）经步骤（3）处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液；

（5）分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛对照品，加甲醇溶解，制成混合标准溶液；使用时，按一定比例逐级稀释，待用；

（6）将步骤（4）得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱：KromasilC₁₈，4.6×250 mm，5μm；流速：0.8 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：25℃；流动相：流动相为0.3%甲酸水和水，梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序如下：0～15 min，10%～14%乙腈；15～35 min，14%～25%乙腈；35～45 min，25%～50%乙腈；45～50 min，50%～100%乙腈；50～65 min，100%乙腈；

（7）以外标法进行金银花中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得金银花中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。

2.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（1）中过筛目数为20-40目。

3.如权利要求2所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述过筛目数为40目。

4.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（2）中提取溶剂为50%乙醇；所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比1g:100-150ml。

5.如权利要求4所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述金银花粉与提取溶剂的质量体积比为1g:100ml。

6.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声提取时间为15-25min。

7.如权利要求6所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（2）中超声提取时间为15min。

8.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入的净化剂为硅藻土；所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g:1ml。

9.如权利要求8所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述净化剂与上清液的质量体积比为50 g:1ml。

10.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（3）中涡流振荡时间为0.5-2 min。

11.如权利要求10所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述涡流振荡时间为1 min。

12.如权利要求1所述的一种同时测定金银花中六种环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤（4）中微孔滤膜规格为0.22mm。

13.权利要求1-12任意一项所述方法在对金银花进行质量评价中的应用。