CN102964404A - 一种合欢皮有效单体的分离纯化制备技术及定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以合欢皮为原料，通过比较WondaSilTM C18液相色谱柱与InnovationTM RTP Amide液相色谱柱分离此组分中合欢皮木脂素苷化合物-(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷的能力，确定了最适分离色谱条件为：InnovationTM RTP Amide(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相：乙腈-水，梯度洗脱，流速：1mL/min，检测波长：210nm，进样10μL，温度：30℃，最终得到了一种适用于分离合欢皮有效组分中木脂素苷化合物的HPLC法，并将此方法应用于合欢皮木脂素苷化合物的分离纯化、定量分析及相关产品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及以合欢皮为原料，通过实验得到了一种适用于分离合欢皮有效单体-(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷组分的HPLC色谱技术方法，并将该方法应用于此化合物的分离纯化、定量分析及相关产品的制备。
背景技术
合欢皮为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮，是中国药典一部收录的一味常用中药，具有解郁安神、活血消肿的作用，用于心神不安，忧郁失眠，跌扑伤痛[1、国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：134.]。前期实验研究已经发现，合欢皮的乙醇提取-正丁醇萃取相具有高效低毒的抑制血管新生的活性，并在进一步的实验中表明了该组分对HMEC-1细胞的IC50为4.18μg/mL[2、刘玲燕，杜芳芳，冯磊，邱丽颖.合欢皮不同提取组分对HEMC细胞和3B11细胞的作用研究[J].时珍国医国药.2011，22(3)：762-764.]。关于合欢皮物质含量的测定，中国药典一部采用的是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18液相色谱柱，以乙腈-0.04％磷酸溶液(18∶82)为流动相，以(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(以下简称合欢皮木脂素苷化合物)为对照品，计算合欢皮干燥品中此化合物的含量。而本专利采用InnovationTM RTP Amide液相色谱柱，对合欢皮木脂素苷化合物进行分析与制备，不但解决了极性较大的合欢皮高效低毒组分在普通C18柱上分离困难的问题，而且此技术能够应用于从合欢皮中分离制备木脂素苷类化合物以及对合欢皮中的木脂素苷化合物进行定量分析等领域。
InnovationTM RTP Amide是酰胺极性嵌入式键合相，键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个酰胺。不同于普通C18键合相，这种键合相的选择性独特，一些在C18键合相上分离困难的物质，可以在极性嵌入式键合相上获得很好的解决。它是在类似C18链长度的硅烷试剂中嵌入极性酰胺，使得键合相亲水，在100％水相条件下稳定。因此可以选用此种类型的色谱柱，通过改变分离色谱条件，能够很好的将中药天然化合物中亲水性物质分开，从而可以为中药指纹图谱的建立以及单体化合物的分离纯化提供实验依据。
因此，本技术研究先比较了InnovationTM RTP Amide液相色谱柱(无锡科奥美萃生物科技有限公司)与WondaSilTM C18液相色谱柱(戴安中国有限公司)分离合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相的能力，确定了一种适用于合欢皮木脂素苷化合物的分离纯化技术。
发明内容
本发明的目的是使用液相色谱分离技术从合欢皮中分离得到合欢皮木脂素苷化合物，并将此技术应用于合欢皮木脂素苷化合物的定量分析与制备。
本发明的技术方案：
所述合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相的制备方法：取合欢皮，粉碎，加10倍量75％乙醇溶液，加热回流，冷却过滤，旋转蒸发至干，去离子水复溶，等体积水饱和正丁醇萃取至正丁醇相无色，合并正丁醇相，旋转蒸发至干，加水复溶，60℃真空干燥，得合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相样品。
所述供试品溶液的制备方法：取上述所得样品，制备成浓度为1mg/mL的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤， 备用。
所述对照品溶液的制备方法：精密称取合欢皮木脂素苷化合物对照品适量，制备成浓度为1mg/mL的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
所述色谱分离技术：选用WondaSilTM C18液相柱与InnovationTM RTP Amide液相柱，以乙腈-水为流动相，流速为1mL/min，进行梯度洗脱，并比较两者的分离效果。
本发明的有益效果：
本发明得到了一种分离合欢皮中木脂素苷化合物的HPLC法，并可将此方法用于合欢皮中木脂素苷化合物的定量分析、制备以及用来建立合欢皮药材的质量标准。
附图说明
图1为WondaSilTM C18液相色谱柱分离合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相的HPLC图；图2为InnovationTM RTP Amide液相色谱柱分析对照品的HPLC图；图3为InnovationTM RTP Amide液相色谱柱分离合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相的HPLC图。
具体实施方式
实施例1：合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相的制备方法
称取100g合欢皮于2L圆底烧瓶中，加入75％乙醇1L加热回流两次，每次2～2.5h，冷却后合并提取液，过滤。旋转蒸发至干，去离子水复溶至400mL，用等体积水饱和正丁醇萃取至正丁醇相无色，合并正丁醇相，旋转蒸发至干，再用去离子水复溶，置60℃真空干燥箱中干燥，得合欢皮乙醇提取-正丁醇相样品。
实施例2：供试品溶液的制备
取上述制备的干粉10mg，用去离子水溶解，定容至10mL，得1mg/mL供试品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
实施例3：对照品溶液的制备
精密称取合欢皮木脂素苷化合物对照品适量，用去离子水溶解，定容至5mL，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
实施例4：WondaSilTM C18液相色谱柱分离合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相
(1)色谱条件：WondaSilTM C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相：乙腈-水，流速：1mL/min，检测波长：210nm，进样10μL，温度：30℃。
(2)流动相梯度洗脱条件：0～5min 100％H2O；5～35min 0～25％CH3CN；35～50min 25％～40％CH3CN；50～60min 40～100％CH3CN。
WondaSilTM C18色谱柱分离合欢皮有效组分的能力较差，分离度较差(图1)。
实施例5：InnovationTM RTP Amide液相色谱柱分析对照品溶液及合欢皮乙醇提取-正丁醇萃取相
(1)色谱条件：InnovationTM RTP Amide(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相：乙腈-水，流速：1mL/min，检测波长：210nm，进样10μL，温度：30℃。
(2)流动相梯度洗脱条件：0～5min 100％H2O；5～35min 0～25％CH3CN；35～50min 25％～40％CH3CN；50～60min 40～100％CH3CN。
分析对照品谱图(图2)，(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷化合物在此分析条件下的保留时间为33.380min。
分析供试品谱图(图3)发现，InnovationTM RTP Amide液相色谱柱能够将合欢皮有效组分中的主要峰分离开，具有较好的分离度，而且此色谱图中33～34min处只有一个分离度为3.90，保留时间为33.140min的单峰，此峰保留时间与对照品一致，可以确定此单个色谱峰即为合欢皮中木脂素苷化合物。因此，此分 离方法适用于从合欢皮中分离纯化制备得到合欢皮木脂素苷化合物，以及利用此技术可以实现对合欢皮中木脂素苷化合物进行定量分析检测。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同样落于本发明的权利要求书所限定的范围。运用本分离方法或者在此方法基础上进行的色谱条件的改变和变动所获得的相同或类似的科研结果，都属于本发明的权利要求范围内。
Claims (4)
1.一种采用InnovationTM RTP Amide液相色谱柱用于合欢皮中有效单体-(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷化合物的分离技术方法。
2.根据权利要求1所述，其具体的分离色谱条件为：InnovationTM RTP Amide(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长：210nm，温度：30℃，流速：1mL/min，流动相：乙腈-水，梯度洗脱：0～5min 100％H2O；5～35min 0～25％CH3CN；35～50min 25％～40％CH3CN；50～60min 40～100％CH3CN。
3.根据权利要求1、2，将此技术手段应用于合欢皮中(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷化合物的制备、定量分析以及建立合欢皮药材的质量标准。
4.根据权利要求1、2，将此技术应用于此种合欢皮有效单体的药品、食品、保健品等不同形式产品的开发制备和质量分析以及鉴定。
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| CN109298101A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-02-01 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种小麦粉及其制品中间苯二酚的高效液相色谱测定方法 |
| CN110229202A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-09-13 | 南京曼赫医疗科技有限公司 | 合欢皮中一种木脂素的制备方法 |
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