CN110320305A - 蒲公英多种活性成分的同时检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蒲公英多种活性成分的同时检测方法，所述活性成分包括咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚，所述检测方法包括以下步骤：1)将蒲公英晒干，磨成粉末，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，取出，冷却，摇匀，过滤，获得滤液A；2)所述滤液A蒸发浓缩后用乙醇溶解，过滤，获得滤液B，滤液B上大孔树脂，用水洗脱至溶液澄清，再用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸发浓缩，获得浸膏，使用甲醇溶解所述浸膏，过滤，获得供试品溶液；3)使用液相色谱对供试品溶液进行上机检测，根据对照品的检测结果计算获得蒲公英中咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚的含量。本发明具有提取方法简单、检测结果重复性好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及中药成分检测领域。更具体地说，本发明涉及一种蒲公英多种活性成分的同时检测方法。
背景技术
蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)别名黄花地丁、婆婆丁、华花郎等，为菊科多年生草本植物，全草入药。主要多分布于北半球，主产于我国东北、华北、华东、华中、西北、西南各地、东北等地区，广泛生于中、低海拔地区的山坡草地、路边、田野、河滩。蒲公英具有非常高的中医药学价值，在我国古代《本草经疏》《本草述》《本草新编》《本草图经》等中医药学著作中都有所记载。其为常用中草药，具有清热解毒、凉血、散结、杀菌等功效。主治慢性胃炎、支气管炎、肝炎、淋巴结核及尿路感染等多种疾病。现代研究表明，蒲公英中含有丰富生物活性物质，包括黄酮类物质、多糖、酚类化合物、甾醇、萜类、糖蛋白、低聚糖等，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、调节激素水平、降血糖血脂、保护肝脏和前列腺等功能，在保健品领域广受欢迎。《中国药典》(2015年版)仅以咖啡酸为指标成分对其进行质量控制，不能全面的反应蒲公英的质量情况。研究发现咖啡酸、山奈酚、芹菜素、芦丁、槲皮素是蒲公英中含量较高的主要成分，本发明旨在以咖啡酸、山奈酚、芹菜素、芦丁、槲皮素为指标成分建立一种简单，快捷的蒲公英质量控制方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其能够同时对蒲公英中的咖啡酸、山奈酚、芹菜素、芦丁、槲皮素五种活性成分进行检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种蒲公英多种活性成分的同时检测方法，所述活性成分包括咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚，其所述检测方法包括以下步骤：
1)将蒲公英晒干，磨成粉末，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，取出，冷却，摇匀，过滤，获得滤液A；
2)所述滤液A蒸发浓缩后用乙醇溶解，过滤，获得滤液B，滤液B上大孔树脂，用水洗脱至溶液澄清，再用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸发浓缩，获得浸膏，使用甲醇溶解所述浸膏，过滤，获得供试品溶液；
3)使用液相色谱对供试品溶液进行上机检测，根据对照品的检测结果计算获得蒲公英中咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚的含量。
优选的是，对照品工作液的配置方法为：称取咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.1mg/mL的混合对照品母液，将所述混合对照品母液逐级稀释，配成所述混合对照品工作液。
优选的是，所述液相色谱的条件为色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，柱温35℃；流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液，流速为1mL/min；吸收波长：323nm；梯度洗脱。
优选的是，梯度洗脱的方法为：0-10min，甲醇在流动相中的体积比为15％增加到20％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为85％下降到80％；10-25min，甲醇在流动相中的体积比为20％增加到35％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为80％下降到65％；25-30min，甲醇在流动相中的体积比为35％增加到40％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为65％下降到60％；30-45min，甲醇在流动相中的体积比为40％增加到50％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为60％下降到50％；45-60min，甲醇在流动相中的体积比为50％增加到65％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为50％下降到35％；60-70min，甲醇在流动相中的体积比为65％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为35％；70min测试结束。
优选的是，所述滤液A蒸发浓缩后用体积分数为20％的乙醇溶液溶解。
优选的是，滤液B上大孔树脂，用水洗脱至溶液澄清，再用体积分数为80％的乙醇溶液洗脱。
优选的是，超声波处理的时间为30-40min。
优选的是，往步骤1)中的滤液A添加无水碳酸钠，搅拌60min，加入羧基化聚苯乙烯微球，震荡30min，过滤，收集滤液，将羧基化聚苯乙烯微球添加到甲醇中，震荡10min，过滤，收集滤液，将滤液合并，以备进行蒸发浓缩。
本发明至少包括以下有益效果：本发明通过使用甲醇对蒲公英中的活性成分进行提取，蒸发浓缩，然后使用乙醇进行溶解后经大孔树脂纯化，通过液相色谱进行梯度洗脱，实现了对蒲公英中五种活性成分咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚的同时检测；通过往滤液A中添加无水碳酸钠，能够增加脂肪酸的水溶性，促使酯类物质分解，以减少提取物中的杂质；通过添加羧基化聚苯乙烯微球，一方面具有调节提取物pH的作用，另一方面具有吸附氨基酸、蛋白质等的作用。本发明具有提取方法简单、检测结果重复性好等特点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的蒲公英样品的HPLC图；
图2为本发明对照品工作液的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
仪器与材料
仪器
WKH-1.7-A型热风循环烘箱(青州市精诚医药装备制造有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器，Waters公司)；BSA124S电子分析天平(万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；超纯水机(广西南宁博美生物科技有限公司)；JP-060ST型超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；AnkeGL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)；EYELA CCA-1111型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。
材料
对照品咖啡酸(批号Y19M8C36143)、芹菜素(批号Z02M8S35084)、芦丁(批号Y21A9H59553)、槲皮素(批号X27F8C30162)、山奈酚(批号P28M9F54631)，纯度均≥98％；磷酸二氢钠为分析纯，甲醇(Fisher Chemical)及磷酸均为色谱纯。
蒲公英材收集于江苏省海安市白芍基地，联系人：叶海军。经南京中医药大学严辉副教授鉴定，样品为菊科蒲公英(拉丁学名：Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)的干燥全草。
实验例
对照品制备
精密称取咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.1mg/mL的混合对照品溶液。并且逐级稀释，配成6份不同浓度的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备
取本品粉末(过二号筛)约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，超声处理(频率360w)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，用旋转蒸发仪回收甲醇，醇提物用30％乙醇20ml溶解，滤过，滤液上大孔树脂(型号AB-8)，用水洗脱至溶液澄清，再用80％乙醇洗脱100ml，收集80％乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，干燥物用色谱甲醇溶解并稀释至25ml量瓶刻，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm 5-Micron)；柱温35℃；流动相为甲醇(A)-磷酸盐缓冲液(B)(磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠1.56g加水溶解至1000ml，再加入1％磷酸溶液调PH3.8-4.0)；流速为1mL/min；吸收波长：323nm；梯度洗脱，如下表所示
精密吸取以上对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，蒲公英样品的HPLC如图1以及对照品的HPLC图如图2，其中，A：咖啡酸 B：山奈酚 C：槲皮素 D：芦丁 E：芹菜素。
方法学考察
线性关系
分别精密吸取1～6混合对照品溶液，按色谱条件进样测定，以各对照品的峰面积为Y，浓度为X，进行线性关系考察，结果见表1。各待测成分r在0.9990～0.9999之间，表明其线性关系良好。
表1线性关系及范围
精密度试验
取同一混合对照品溶液，按色谱条件连续进样6次，每次进样10.0μL，记录各成分峰面积，具体结果见表2。结果显示，各待测成分的RSD值均小于3.00％，表明仪器的精密度良好。
表2精密度试验结果
稳定性试验
取同一份供试品溶液，按色谱条件进样，分别记录0、4、8、12、16、24小时各待测成分的峰面积，具体结果见表3。结果显示，待测成分的峰面积的RSD值小于3.00％，表明样品在24h内稳定性良好。
表3稳定性试验结果
重复性试验
精密称取同一样品粉末6份，制备成供试品溶液，按色谱条件，进样10μL，记录待测成分峰面积，具体结果见表4。结果显示，各待测成分含量的RSD值均小于3.00％，表明该方法的重复性良好。
表4重复性试验结果
加样回收率试验
精密称定已知含量的样品粉末6份，分别加入与已知成分含量相同的各对照品，按上述条件进行供试品溶液的制备，结果显示，各待测成分的加样回收率依次为98.65％、98.41％、99.83％、98.38％、99.58％，RSD值依次为2.57％、1.95％、1.81％、2.08％、1.82％。
蒲公英药材样品含量测定结果
取3份蒲公英样品按以上样品处理方法处理后进样，按外标法计算含量取平均值。得到咖啡酸、山奈酚、芹菜素、芦丁、槲皮素的平均含量分别为0.38、0.48、0.21、0.18、0.30mg/g，其中咖啡酸含量为0.038％，符合药典规定，不低于0.02％的含量限定(为药典标准的190％)，具体测定结果见下表。
蒲公英药材活性成分含量测定结果表
实施例1
将蒲公英晒干，磨粉(过二号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，超声处理(频率360w)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，用旋转蒸发仪回收甲醇，醇提物用30％乙醇20ml溶解，滤过，滤液上大孔树脂(型号AB-8)，用水洗脱至溶液澄清，再用80％乙醇洗脱100ml，收集80％乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，干燥物用色谱甲醇溶解并稀释至25ml量瓶刻，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
精密称取咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚对照品，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.1mg/mL的混合对照品母液，并且逐级稀释，配成混合对照品工作液；
使用高效液相色谱对供试品溶液和混合对照品工作液进行上机检测，色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm 5-Micron)；柱温35℃；流动相为甲醇(A)-磷酸盐缓冲液(B)(磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠1.56g加水溶解至1000ml，再加入1％磷酸溶液调PH3.8-4.0)；流速为1mL/min；吸收波长：323nm；梯度洗脱，如下表所示
精密吸取以上混合对照品工作液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算获得蒲公英中咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚的含量。
实施例2
将蒲公英晒干，磨粉(过二号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，超声处理(频率360w)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，获得滤液A，往滤液A中添加无水碳酸钠，搅拌60min，加入羧基化聚苯乙烯微球，震荡30min，过滤，收集滤液，将羧基化聚苯乙烯微球添加到甲醇中，震荡10min，过滤，收集滤液，将滤液合并，用旋转蒸发仪回收甲醇，醇提物用30％乙醇20ml溶解，滤过，滤液上大孔树脂(型号AB-8)，用水洗脱至溶液澄清，再用80％乙醇洗脱100ml，收集80％乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，干燥物用色谱甲醇溶解并稀释至25ml量瓶刻，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
精密称取咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚对照品，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.1mg/mL的混合对照品母液，并且逐级稀释，配成混合对照品工作液；
使用高效液相色谱对供试品溶液和混合对照品工作液进行上机检测，色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6*250mm 5-Micron)；柱温35℃；流动相为甲醇(A)-磷酸盐缓冲液(B)(磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠1.56g加水溶解至1000ml，再加入1％磷酸溶液调PH3.8-4.0)；流速为1mL/min；吸收波长：323nm；梯度洗脱，如下表所示
精密吸取以上混合对照品工作液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算获得蒲公英中咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚的含量。
对比试验
精密称定已知含量的样品粉末6份，分别加入与已知成分含量相同的各对照品，按实施例2进行供试品溶液的制备，结果显示，各待测成分的加样回收率依次为99.63％、98.95％、99.03％、99.35％、99.12％，RSD值依次为1.87％、2.15％、1.86％、1.98％、2.02％。可见，使用无水碳酸钠和羧基化聚苯乙烯微球处理后，蒲公英中的活性成分咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素、山奈酚的损失了＜1.5％，而信噪比由5提高了到了11。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.一种蒲公英多种活性成分的同时检测方法，所述活性成分包括咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
1)将蒲公英晒干，磨成粉末，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，取出，冷却，摇匀，过滤，获得滤液A；
2)所述滤液A蒸发浓缩后用乙醇溶解，过滤，获得滤液B，滤液B上大孔树脂，用水洗脱至溶液澄清，再用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸发浓缩，获得浸膏，使用甲醇溶解所述浸膏，过滤，获得供试品溶液；
3)使用液相色谱对供试品溶液进行上机检测，根据对照品的检测结果计算获得蒲公英中咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚的含量。
2.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，对照品工作液的配置方法为：称取咖啡酸、芹菜素、芦丁、槲皮素和山奈酚，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.1mg/mL的混合对照品母液，将所述混合对照品母液逐级稀释，配成所述混合对照品工作液。
3.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，柱温35℃；流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液，流速为1mL/min；吸收波长：323nm；梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，梯度洗脱的方法为：0-10min，甲醇在流动相中的体积比为15％增加到20％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为85％下降到80％；10-25min，甲醇在流动相中的体积比为20％增加到35％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为80％下降到65％；25-30min，甲醇在流动相中的体积比为35％增加到40％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为65％下降到60％；30-45min，甲醇在流动相中的体积比为40％增加到50％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为60％下降到50％；45-60min，甲醇在流动相中的体积比为50％增加到65％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为50％下降到35％；60-70min，甲醇在流动相中的体积比为65％，磷酸盐缓冲液在流动相中的体积比为35％；70min测试结束。
5.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，所述滤液A蒸发浓缩后用体积分数为20％的乙醇溶液溶解。
6.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，滤液B上大孔树脂，用水洗脱至溶液澄清，再用体积分数为80％的乙醇溶液洗脱。
7.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，超声波处理的时间为30-40min。
8.根据权利要求1所述的蒲公英多种活性成分的同时检测方法，其特征在于，往步骤1)中的滤液A添加无水碳酸钠，搅拌60min，加入羧基化聚苯乙烯微球，震荡30min，过滤，收集滤液，将羧基化聚苯乙烯微球添加到甲醇中，震荡10min，过滤，收集滤液，将滤液合并，以备进行蒸发浓缩。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yan Bingxiong Inventor after: Song Zhijun Inventor after: Miao Jianhua Inventor after: Liu Xihui Inventor after: Guo Xiaoyun Inventor after: Yao Caiyun Inventor before: Miao Jianhua Inventor before: Song Zhijun Inventor before: Yan Bingxiong Inventor before: Liu Xihui Inventor before: Guo Xiaoyun Inventor before: Yao Caiyun |
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| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20191011 Assignee: Guangxi Guinong Precision Farming Machinery Service Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS Contract record no.: X2023980045319 Denomination of invention: Simultaneous detection of multiple active ingredients in dandelion Granted publication date: 20220415 License type: Common License Record date: 20231101 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |