CN107998166A - 蒲公英提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蒲公英提取物的制备方法。具体方法包含以下步骤：蒲公英破碎→微波提取→丙酮萃取→层析柱纯化；各步骤具体为：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过30‑40目筛的粗粉；取蒲公英粗粉，加入70‑80％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率500‑600w，以提取时间50‑60秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩获得浸膏；将以上浸膏以丙酮萃取3‑4次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去溶剂后获得浸膏；将以上浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物，其中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量≥70％，以上蒲公英提取物制备方法工艺简单，易于工业生产，并且活性成分含量高。

Description

蒲公英提取物的制备方法
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种蒲公英提取物的制备方法。
背景技术
蒲公英为菊科植物蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)、碱地蒲公英(Taraxacum borealisinese Kitam)或同属数种植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，无毒，用于疗疮肿毒、乳痈、咽痛、湿热黄疽、热淋涩痛。蒲公英同时含有蛋白质、脂肪、碳水化合物等，有丰富的营养价值，是药食兼用的中药材。蒲公英在临床上常用于治疗急性气管炎、尿路感染，具有抗肿瘤、保肝利胆、降血糖、血脂作用。由于含有丰富的矿物质，蒲公英也作为保健品应用，用于预防缺铁引起的贫血症；同时蒲公英能美白肌肤，能对抗自由基对人体的伤害，增强免疫力，起到延缓衰老的作用。
赵守训等人(赵守训等.蒲公英化学成分和药理作用.中国野生植物资源.20(3):1)对蒲公英所含化学成分进行了大量的研究发现，蒲公英根中含有蒲公英甾醇醇、蒲公英赛醇、菊糖、咖啡酸、棕搁酸、亚油酸、亚麻酸、苦味素B、果糖及少量挥发油和苦杏仁酶类成分。其叶中含有木犀草素-7-葡萄糖甙及氨基酸，花中有蒲公英黄素、毛莫黄素、菊黄素、棕桐酸、亚油酸。孟志云等人(孟志云等.蒲公英研究进展.人民军医药学专刊.1997,13(2):84)对蒲公英全草的研究发现，其主要成分有：黄酮类、三菇类、植物多醇类、倍半萜内酯类、香豆素类、酚酸类、脂肪酸类等。
蒲公英中主要药理活性成分包括木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸等。
木犀草素是一种天然四羟基黄酮化合物，广泛存在于蔬菜和水果中，如芹菜、西兰花、菊花、胡萝卜、胡椒、卷心菜、苹果皮和洋葱的叶子等。在芹菜、青椒、紫苏属和甘菊中，木犀草素常以糖基化形式存在。木犀草素具有多种药理活性，富含木犀草素的植物常常被用作中药治疗疾病。随着对木犀草素研究的深入，发现它具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡以及增敏抗癌药物活性等抗肿瘤作用，而且还具有抗炎、抗氧化以及对神经系统的保护等作用。
槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮，具有多种生物学活性及很高的药用价值。槲皮素广泛存在于植物的花、叶、果实中，已知有100多种中草药中含有槲皮素，如槐米、槐花、丹皮、菊花、田基黄、车前子、桑寄生、仙鹤草、杠板归、绞股蓝、山楂、贯叶连翘、菟丝子、银杏叶、刺五加、白花蛇舌草、鸡冠花、鱼腥草、余甘子、三白草、番石榴叶、蜜柑草、紫花地丁、垂盆草等。槲皮素不仅在自然界中广泛分布，其药理作用也很广泛，它具有抗氧化及清除自由基的作用，还具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护作用等。
绿原酸是植物体有氧呼吸代谢的产物，是许多中药材以及水果蔬菜中的主要有效成分，具有多种生物活性，如：心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药、化工和食品等领域都具有广泛的应用。因此绿原酸的研究和利用越来越受到人们的重视。
咖啡酸结构中含有两个酚羟基，是天然的自由基淬灭剂，具有优异的抗氧化特性，已有的药理学研究表明，咖啡酸具有广谱抗菌、消炎利胆、利尿通淋、活血化淤、镇咳、祛痰、抗氧化、抗肿瘤等功效，用于高血压以及癌症的治疗。据报道，咖啡酸可以降低进食各种碳水化合物引起的正常小鼠的餐后血糖升高，并对葡萄糖苷酶的活性有较强的抑制作用。
现有技术中对于蒲公英制备方法有多处记载。如公开号为CN101112409(公开日期：20080130)的中国专利申请记载了蒲公英提取方法：a)用溶剂提取经粉碎或切成小段的蒲公英植物，浓缩提取回收溶剂；b)将步骤a得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用醇溶剂洗脱；c)将步骤b得到的洗脱液减压浓缩至无醇味，干燥，粉碎得产品。
又如公开号CN101982184(公开日：20110302)的中国专利申请也记载了蒲公英提取方法：采用螺旋榨汁机进行细胞破壁；用酸水浸提；丙酮溶解沉析；大孔树脂柱层析填料采用罗姆哈斯XAD-8树脂等，流动相为乙酸乙酯溶剂；色谱精制纯化采用C18反相硅胶为固定相，乙醇水为流动相。
又如公开号CN104095896(公开日：20141015)也记载了蒲公英提取物的制备方法：将蒲公英粉碎成粗粉，用石油醚回流提取脱脂，弃去石油醚液；蒲公英药渣挥干石油醚，加乙醇，用闪式提取器提取，提取液抽滤，滤液旋蒸浓缩至无醇味，用水混悬，调整溶液浓度为含生药量1g/ml的提取液，再加等体积乙醚萃取，除去乙醚，浓缩，干燥，粉碎，得蒲公英提取物，蒲公英提取物中蒲公英总黄酮质量含量65％以上，本发明具有降糖作用，可有效用于制备降糖药物，实现蒲公英提取物在制备降糖药物中的应用。
CN104940265(公开日：20150930)记载了蒲公英经乙醇回流提取获得；将蒲公英全草用体积浓度为30％～95％的乙醇加热回流提取2～3次、每次加热回流时间为1～2h，加热回流温度为60～90℃，然后过滤合并滤液，滤液再减压浓缩、干燥得提高ALP活性的蒲公英提取物；其中乙醇用量为蒲公英质量的6～12倍。
CN105265575(公开日：20160127)记载了蒲公英提取物制备方法：(a)称取干燥的蒲公英用60～70％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味得到浓缩液；(b)对步骤(a)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用5～15％乙醇冲洗8～12个柱体积除去大极性物质，再用65～75％乙醇洗脱10～14个柱体积，收集65～75％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。本发明提供的蒲公英提取物黄酮含量高，且大极性物质含量非常低，防霉抗氧化效果非常好，可以用于制备防霉抗氧化的保鲜剂。
蒲公英提取物中主要活性成分为木犀草素，槲皮素，绿原酸以及咖啡酸等。以上现有技术仅提供了蒲公英提取物的制备方法，并没有记载提取物中主要活性成分的含量，活性成分高含量的蒲公英提取物有助于实现蒲公英治疗急性气管炎、尿路感染，抗肿瘤、保肝利胆、降血糖、血脂的作用。因此有必要提供一种蒲公英提取物的制备方法，该方法工艺简单，易于工业生产；更主要的是以该方法制备蒲公英提取物，可以实现蒲公英的高效提取，以木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸作为活性成分的检测指标，活性成分的总含量在70％以上。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种蒲公英提取物的新制备方法。通过该方法制备的蒲公英提取物，活性成分含量高，工艺简单，易于生产，显著优于现有技术。
本发明蒲公英提取物制备方法具有如下显著优于现有技术的技术效果：
1.采用微波萃取对蒲公英粗粉进行初步提取，提取效率高，耗费时间短，有利于工业生产。
2.采用本发明方法制备的蒲公英提取物，指标活性成分，如木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸含量较高，显示出较高的提取效率，因此以本发明蒲公英提取物制备的药物应具有较好的临床治疗效果。
为实现上述发明目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种新的蒲公英提取物的制备方法，包含以下步骤：
蒲公英破碎→微波提取→丙酮萃取→层析柱纯化；
本发明的具体制备方法为：
1.蒲公英破碎：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过30-40目筛的粗粉；
2.微波提取：取蒲公英粗粉，加入70-80％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率500-600w，以提取时间50-60秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩获得浸膏；
3.丙酮萃取：将步骤2获得的浸膏以丙酮萃取3-4次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去溶剂后获得浸膏；
4.层析柱纯化：步骤3获得的浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物。
本发明所得蒲公英提取物中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量≥70％。
其中，步骤1中优选蒲公英粉碎后过30目筛；
其中，步骤2中优选溶剂为70％乙醇溶液；
其中，步骤3中优选丙酮萃取3次或4次。
其中，步骤4中柱层析介质为大孔树脂、葡聚糖凝胶或反相硅胶。
在一个实施方案中，步骤2中对提取液进行浓缩是指在50～60℃下减压浓缩至1/5～1/3体积。
另一方面，本发明还提供了一种蒲公英提取物的质量检测方法。
中国药典(2010版)仅记载了以HPLC法测定蒲公英中咖啡酸含量，本发明还提供了一种蒲公英提取物的质量控制方法，即以HPLC法测定蒲公英提取物中咖啡酸和绿原酸含量；以RP-HPLC法测定蒲公英提取物中木犀草素和槲皮素含量。
色谱条件分别为：
RP-HPLC法：，色谱柱为安捷伦HC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm),柱温:30℃；流动相:甲醇-0.4％磷酸(50∶50)，流速:1.2ml/min，检测波长：360nm。
HPLC法：安捷伦C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-磷酸氢二钠缓冲液(30:70)，检测波长323nm，流速1.2ml/min，柱温为30℃。
以上方法检测准确，快速，结果可靠；其中RP-HPLC法可同时检测木犀草素和槲皮素含量，HPLC法可同时检测咖啡酸和绿原酸含量。
另外，根据本发明蒲公英提取物的制备方法，特别是出人意料的发现，在步骤2中对提取液进行浓缩的过程中，添加少量的白陶土与丙二醇二者组合，可以显著的使上述典型活性化学物质(木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸)得以在本发明提取物中富集，并且特别是可以使所得提取物中木犀草素和槲皮素二者在本发明蒲公英提取物长期保存过程中呈现显著更优的稳定性。由于白陶土本身是一种常规的药用辅料并且其不溶于水也不溶于乙醇同时也不溶于丙酮，因此在本发明方法中通过简单的后续萃取手段即可将其除净；而丙二醇由于其添加量小，并且是一种极其安全且常用的药用辅料，即使其在本发明提取物中有残余，这种少量的残余完全不会对身体造成任何不利的影响。例如，在本发明的第一补充试验中，分别参照实施例1-3的方法，不同的仅是向步骤2所得提取液中加入白陶土(其量为提取液液量的0.75％)和丙二醇(其量为提取液量的0.4％)，搅拌均匀，接着进行后续的浓缩过程；本第一补充试验所得三种蒲公英提取物经检测，其中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸总含量为93.2％、94.1％、92.7％。在本发明的第二补充试验中，分别参照第一补充试验的方法，不同的仅是步骤2中不添加白陶土，所得三批蒲公英提取物经检测，其中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸总含量在72.2～75.6％范围内。在本发明的第三补充试验中，分别参照第一补充试验的方法，不同的仅是步骤2中不添加丙二醇，所得三批蒲公英提取物经检测，其中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸总含量在70.7～74.9％范围内。另外，在本发明的第四补充试验中，将本发明所得的各种蒲公英提取物分别密封，置于40℃避光条件下放置6月，测定0月时和6月时各提取物中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸的含量，对于某一提取物中的四种化学物质，各其以其6月含量除以0月含量再乘以100％所得的百分数，作为6月时该提取物中某物质在经此40℃-6月处置后的残余百分量，此残余百分量越接近100％表明该提取物中该物质的稳定性越好，在制药领域通常残余百分量大于90％是必要的，大于95％是优选的。经测定，本发明实施例1～3、第二补充试验所得三批蒲公英提取物和第三补充试验所得三批蒲公英提取物中，木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸四者的残余百分量分别在91.6～92.3％范围内、90.3～92.7％范围内、91.1～93.4％范围内、92.2～93.7％范围内，表明这些提取物中四种化学物质的稳定性尚能满足一般的技术要求；本发明第一补充试验所得三批蒲公英提取物中，木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸四者的残余百分量分别在99.1～99.7％范围内、98.6～99.3％范围内、91.4～92.7％范围内、92.0～93.4％范围内，表明这些提取物中绿原酸和咖啡酸的稳定性尚能满足一般的技术要求，但是木犀草素、槲皮素的稳定性显著的提高。一般地讲，改变提取物制备方法的工艺可能改变提取物中化学物质含量，这种情形是可以理解的，但是在本发明中改变提取物的工艺条件还可以显著提高提取物中物质的稳定性，这是现有技术完全无法预见的。因此，在本发明蒲公英提取物的制备方法的一个实施方案中，向步骤2所得提取液中加入白陶土(其量为提取液液量的0.5～1％(g/100ml)，例如0.75％)和丙二醇(其量为提取液量的0.2～0.6％(g/100ml)，例如0.4％)，搅拌均匀，接着进行所述浓缩。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的原料、试剂，包括药材等，如无特殊说明，均购自公开的商业渠道。下述实施例和试验例所用的试验方法，如果没有特别说明，均采用本领域的常规方法。
实施例1：蒲公英提取物的制备方法
包含以下步骤：
1.蒲公英破碎：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过35目筛的粗粉；
2.微波提取：取蒲公英粗粉，加入75％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率550w，以提取时间55秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩(在55℃下减压浓缩至1/4体积)获得浸膏；
3.丙酮萃取：将步骤2获得的浸膏以丙酮萃取3次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去溶剂后获得浸膏；
4.层析柱纯化：步骤3获得的浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物，其中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量为73.8％，其中层析介质可以选自大孔树脂。
实施例2：蒲公英提取物的制备方法
包含以下步骤：
1.蒲公英破碎：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过30目筛的粗粉；
2.微波提取：取蒲公英粗粉，加入70％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率500w，以提取时间50秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩(在50℃下减压浓缩至1/5体积)获得浸膏；
3.丙酮萃取：将步骤2获得的浸膏以丙酮萃取4次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去溶剂后获得浸膏；
4.层析柱纯化：步骤3获得的浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物，其中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量为76.6％，其中层析介质为大孔树脂。
实施例3：蒲公英提取物的制备方法
包含以下步骤：
1.蒲公英破碎：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过40目筛的粗粉；
2.微波提取：取蒲公英粗粉，加入80％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率600w，以提取时间60秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩(在60℃下减压浓缩至1/3体积)获得浸膏；
3.丙酮萃取：将步骤2获得的浸膏以丙酮萃取3次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去溶剂后获得浸膏；
4.层析柱纯化：步骤3获得的浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物，其中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量为73.1％，其中层析介质为大孔树脂。
实施例4：蒲公英提取物质量控制方法：
1.以RP-HPLC法测定蒲公英提取物中木犀草素和槲皮素含量。
色谱条件为：
色谱柱为安捷伦HC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm),柱温:30℃；流动相:甲醇-乙腈-0.5％磷酸水(50：2：48)，流速:1.2ml/min，检测波长：360nm。
对照品溶液的制备：取木犀草素和槲皮素对照品适量，精密称定，以流动相溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.156mg/ml的槲皮素溶液和0.144mg/ml的木犀草素溶液，作为对照品溶液使用；
供试品溶液的制备：取本发明制备的蒲公英提取物适量，研细，取其中0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加流动相至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)，作为供试品溶液备用；
测定法：精密吸取木犀草素和槲皮素对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算木犀草素和槲皮素的含量。
2.以HPLC法测定蒲公英提取物中绿原酸和咖啡酸含量。
色谱条件为：安捷伦C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-磷酸氢二钠缓冲液(30:70)，检测波长323nm，流速1.2ml/min，柱温为30℃。
对照品溶液的制备：取绿原酸和咖啡酸对照品适量，精密称定，以流动相溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0.202mg/ml的绿原酸溶液和0.216mg/ml的咖啡酸溶液，作为对照品溶液使用；
供试品溶液的制备：取本发明制备的蒲公英提取物适量，研细，取其中0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，加流动相至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)，作为供试品溶液备用；
测定法：精密吸取绿原酸和咖啡对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算绿原酸和咖啡酸的含量。
按以上方法测定，通过计算本发明蒲公英提取物中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸总含量≥70％。

Claims (10)

1.一种蒲公英提取物的制备方法，包含以下步骤：
步骤1蒲公英破碎：将蒲公英切成小段并粉碎，使成为过30-40目筛的粗粉；
步骤2微波提取：取蒲公英粗粉，加入70-80％乙醇溶液，微波萃取仪中设置微波功率500-600w，以提取时间50-60秒进行提取，获得提取液；将以上提取液浓缩获得浸膏；
步骤3丙酮萃取：将步骤2获得的浸膏以丙酮萃取3-4次，获得丙酮萃取液，经旋蒸除去丙酮后获得浸膏；
步骤4层析柱纯化：步骤3获得的浸膏以柱层析法进行分离纯化，先经水洗后以乙酸乙酯为洗脱液继续进行洗脱，收集洗脱液，经干燥获得蒲公英提取物；例如该蒲公英提取物中木犀草素，槲皮素，绿原酸和咖啡酸总含量≥70％。
2.如权利要求1所述的蒲公英提取物的制备方法，其特征在于步骤1中优选蒲公英粉碎后过30目筛。
3.如权利要求1所述的蒲公英提取物的制备方法，其特征在于步骤2中优选溶剂为70％乙醇溶液。
4.如权利要求1所述的蒲公英提取物的制备方法，其特征在于步骤3中优选丙酮萃取4次。
5.如权利要求1所述的蒲公英提取物的制备方法，其特征在于：
步骤4中柱层析介质优选为大孔树脂、葡聚糖凝胶或反相硅胶其中之一；
向步骤2所得提取液中加入白陶土(其量为提取液液量的0.5～1％(g/100ml)，例如0.75％)和丙二醇(其量为提取液量的0.2～0.6％(g/100ml)，例如0.4％)，搅拌均匀，接着进行所述浓缩；和/或
步骤2中对提取液进行浓缩是指在50～60℃下减压浓缩至1/5～1/3体积。
6.一种药物组合物，其特征在于包含以权利要求1方法制备的蒲公英提取物。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于剂型为片剂，颗粒剂，胶囊，注射剂或口服液。
8.一种如权利要求1所述蒲公英提取物的质量检测方法，其特征在于以蒲公英提取物中木犀草素和槲皮素为质量检测指标，以RP-HPLC法测定，色谱条件为：色谱柱为安捷伦HC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm),柱温:30℃；流动相:甲醇-0.4％磷酸(50∶50)，流速:1.2ml/min，检测波长：360nm。
9.一种如权利要求1所述蒲公英提取物的质量检测方法，其特征在于以蒲公英提取物中绿原酸和咖啡酸为质量检测指标，以HPLC法测定，色谱条件为：安捷伦C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-磷酸氢二钠缓冲液(30:70)，检测波长323nm，流速1.2ml/min，柱温为30℃。
10.一种如权利要求1所述蒲公英提取物的质量检测方法，其特征在于以蒲公英提取物中木犀草素、槲皮素、绿原酸和咖啡酸为质量检测指标；其中木犀草素和槲皮素以RP-HPLC法测定，色谱条件为：色谱柱为安捷伦HC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm),柱温:30℃；流动相:甲醇-0.4％磷酸(50∶50)，流速:1.2ml/min，检测波长：360nm；绿原酸和咖啡酸以HPLC法测定，色谱条件为：安捷伦C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-磷酸氢二钠缓冲液(30:70)，检测波长323nm，流速1.2ml/min，柱温为30℃。
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